人源化抗表皮生長因子受體抗體及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及人源化抗表皮生長因子受體抗體。本發(fā)明還涉及編碼所述抗體的核酸分子，含有所述核酸分子的載體、宿主細(xì)胞和組合物，以及檢測試劑和試劑盒。本發(fā)明還涉及所述抗體用于制備預(yù)防/治療表皮生長因子或表皮生長因子受體相關(guān)疾病的藥物中的用途以及用于制備檢測試劑或試劑盒中的用途。本發(fā)明的抗體分子具有更低的免疫原性和更高的的靶點結(jié)合活性，從而有更強的生物學(xué)活性和體內(nèi)外抗腫瘤活性，可以預(yù)期臨床應(yīng)用副作用更低，療效更好。
【專利說明】人源化抗表皮生長因子受體抗體及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及人源化抗體，具體涉及人源化抗表皮生長因子受體抗體，本發(fā)明還涉及所述抗體在制備預(yù)防或治療與表皮生長因子高活性或高表達(dá)相關(guān)疾病的藥物中的用途。與人鼠嵌合抗體相比，本發(fā)明所涉及的人源化抗表皮生長因子抗體進(jìn)一步降低了抗體的免疫原性，同時增強了其抗原識別活性和體內(nèi)體外抗瘤功能，有更好的臨床應(yīng)用前景。
【背景技術(shù)】
[0002]表皮生長因子受體(EpidermalGrowth Factor Receptor, EGFR,也稱為 HERl,c-ErbBl)是表皮生長因子家族的細(xì)胞表面受體，是由1186個氨基酸殘基構(gòu)成，分子量為170kD 的一種跨膜糖蛋白(Jorissen RN, Walker F, Pouliot N, et al.Epidermal growthfactor receptor !mechanisms of activation and signaling.Exp Cell Res，2003 ;284:31-53)。EGFR屬于I型酪氨酸激酶受體ErbB亞族(ErbB 1-4)，具有酪氨酸激酶的活性。EGFR穩(wěn)定的表達(dá)于許多上皮組織，包括皮膚和毛囊。表皮生長因子受體異常表達(dá)或因受體突變而活化會導(dǎo)致癌變。有很多實體瘤發(fā)現(xiàn)高表達(dá)表皮生長因子受體，如直結(jié)腸癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌和食管癌等(Olayioye MA, Neve RM, Lane HA, etal.The EerbB Signaling network:receptor heterodimerzation in development andcancer.The EMBO J，2000 ; 19:3159-3167)。轉(zhuǎn)化生長因子α和表皮生長因子等生長因子是表皮生長因子受體的內(nèi)源性配體。這些配體與表皮生長因子受體結(jié)合，激活受體胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶的活性，啟動下游多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的生長和分化，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲力、促進(jìn)血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡(Ciardiello F, Tortora G.Anovel approach in the treatment of cancer:targeting the epidermal growth factorreceptor.Clin Cancer Res，2001 ;7:2958-2970)。表皮生長因子受體在腫瘤中的高度表達(dá)及其在腫瘤細(xì)胞生長、分化中起重要作用的這些特點，使表皮生長因子受體成為具有良好前景的腫瘤治療靶點。
[0003]抗表皮生長因子受體的治療性抗體，最早來自由表皮生長因子受體高表達(dá)表皮癌A431免疫小鼠而得到的鼠源抗體M2250M225與表皮生長因子受體特異結(jié)合，阻斷其與配體結(jié)合，從而抑制表皮生長因子受體酪氨酸蛋白激酶的活性(Goldstein et al, 1995, Clin.Cancer.Res.1:1311-1318)。鼠源抗體作為外源蛋白，反復(fù)刺激人體，可引起超敏反應(yīng)，被稱為人抗鼠抗體反應(yīng)。鼠源抗體在體內(nèi)可能被抗抗體中和，進(jìn)而被快速清除，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的過敏反應(yīng)而致死。另外，鼠源單克隆抗體缺乏人抗體具有的免疫效應(yīng)功能，如抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)和補體依賴的細(xì)胞毒(CDC)作用，因而療效不佳。因此人鼠嵌合抗體C225抗體(愛必妥，Erbitux或Cetuximab, ImClone (現(xiàn)在Eli Lilly)公司)采用人IgGlK和鼠抗M225的可變區(qū)，降低了鼠源單抗的免疫原性，保留了與表皮生長因子受體的特異親和性，可阻斷EGF和TGFa等配體與表皮生長因子受體的結(jié)合，抑制其磷酸化和下游信號傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)凋亡，減少基質(zhì)金屬蛋白酶和血管上皮生長因子的產(chǎn)生。2004年美國FDA批準(zhǔn)愛必妥治療結(jié)直腸癌，2006批準(zhǔn)治療頭頸部癌，目前有更多臨床試驗用于其它腫瘤適應(yīng)癥。與其他化療藥相比，抗體藥物特異性強，副作用小，在臨床上取得了較好的療效。然而，人鼠嵌合愛必妥單抗仍有免疫原性，臨床報道其免疫原性為5%，容易產(chǎn)生人抗抗體反應(yīng)而導(dǎo)致免疫復(fù)合物介導(dǎo)的抗體清除，和皮膚及粘膜的副作用(An Z，et al.,2009, Therapeutic Monoclonal Antibody,p313)。
[0004]帕尼單抗(panitumumab, Amgen公司)是采用轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)制備的全人化單克隆抗體，無鼠源蛋白序列，靶向作用于表皮生長因子受體(EGFR)，2006年9月被FDA批準(zhǔn)上市，與氟嘧啶、奧沙利鉬和伊立替康合用或在化療后用于治療EGFR陽性的轉(zhuǎn)移性直結(jié)腸癌。2006年FDA批準(zhǔn)其單藥治療化療耐受的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(mCRC)。然而帕尼單抗是IgG2亞型抗體，與IgGl相比，IgG2的⑶C活性及ADCC等生物學(xué)活性明顯減低；另外，IgG2亞型抗體穩(wěn)定性較差，這可能是臨床效果上全人抗體帕尼單抗與嵌合抗體愛必妥相比沒有明顯優(yōu)勢的主要原因。
[0005]因此，本領(lǐng)域亟需具有更低免疫原性和更高生物學(xué)活性的人源化抗表皮生長因子受體抗體，以進(jìn)一步提高療效，降低副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明人在鼠源抗體的基礎(chǔ)上，利用抗體人源化技術(shù)，令人驚奇地獲得了一種具有更低免疫原性和更高生物學(xué)活性的人源化抗表皮生長因子受體抗體，本發(fā)明基于以上發(fā)現(xiàn)而完成。具體包括以下幾個方面:
[0007]本發(fā)明第一方面涉及抗表皮生長因子受體抗體或其抗原結(jié)合部分，其重鏈CDRl的序列選自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:39所示序列或其衍生序列，CDR3的序列選自SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:40所示序列或其衍生序列；和/或
[0008]其輕鏈CDR3 的序列選自 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10 和 SEQ ID NO:41 所示序列或其衍生序列。`
[0009]根據(jù)本發(fā)明第一方面的抗體或其抗原結(jié)合部分，其重鏈⑶R2和輕鏈⑶R1XDR2的序列可以為鼠源或人源或人鼠嵌合的抗表皮生長因子受體抗體的相應(yīng)部分。
[0010]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分，其重鏈和輕鏈FR的序列可以為鼠源或人源或人鼠嵌合的抗表皮生長因子受體抗體的相應(yīng)部分。
[0011]在本發(fā)明的實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈可變區(qū)CDR的序列選自以下(I)~(4)所示序列或其衍生序列:
[0012](I) CDRl的序列為SEQ ID NO:1所不序列，CDR2的序列為SEQ ID NO:4所不序列，CDR3的序列為SEQ ID NO:2所不序列；
[0013](2)CDRl的序列為SEQ ID NO:1所示序列,CDR2的序列為SEQ ID NO:4所示序列，CDR3的序列為SEQ ID NO:40所不序列；
[0014](3)CDR1的序列為SEQ ID NO:39所示序列，CDR2的序列為SEQ ID NO:4所示序列，CDR3的序列為SEQ ID NO:3所不序列；
[0015](4)CDR1的序列為SEQ ID NO:39所示序列，CDR2的序列為SEQ ID NO:4所示序列，CDR3的序列為SEQ ID NO:40所不序列；和/或
[0016]其輕鏈可變區(qū)⑶R的序列選自以下(5)~⑶所示序列或其衍生序列:
[0017](5) CDRl的序列為SEQ ID NO: 11所不序列，CDR2的序列為SEQ ID NO: 12所不序列，CDR3的序列為SEQ ID NO:9所不序列；
[0018](6) CDRl的序列為SEQ ID NO:11所示序列，CDR2的序列為SEQ ID NO:12所示序列，CDR3的序列為SEQ ID NO:41所不序列；
[0019](7) CDRl的序列為SEQ ID NO:11所示序列，CDR2的序列為SEQ ID NO:12所示序列，CDR3的序列為SEQ ID NO:41所不序列；
[0020](8) CDRl的序列為SEQ ID NO: 11所不序列，CDR2的序列為SEQ ID NO: 12所不序列，CDR3的序列為SEQ ID NO: 10所不序列。
[0021]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分，其重鏈FRl的序列選自SEQ ID NO:19~SEQ ID NO:22所示序列或其衍生序列，F(xiàn)R2的序列選自SEQ ID NO:23~SEQ ID NO:25所示序列或其衍生序列，F(xiàn)R3的序列選自SEQ ID NO:26~SEQ ID N0:29所示序列或其衍生序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:30所示序列或其衍生序列；和/或
[0022]其輕鏈FRl的序列選自SEQ ID NO:31~SEQ ID NO:32所示序列或其衍生序列，F(xiàn)R2的序列選自SEQ ID NO:33~SEQ ID NO:34所示序列或其衍生序列，F(xiàn)R3的序列選自SEQ ID NO:35~SEQ ID NO:36所示序列或其衍生序列，F(xiàn)R4的序列選自SEQ ID NO:37~SEQ ID NO:38所示序列或其衍生序列。
[0023]在本發(fā)明的實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈可變區(qū)FR的序列選自以下(9)~(12)所示序列或其衍生序列:
[0024](9)FRl的序列為SEQ ID NO: 19所不序列，F(xiàn)R2的序列為SEQ ID NO:23所不的序列，F(xiàn)R3的序列為SEQ ID NO:26所不的序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:30所不的序列；
[0025](IO)FRl的序列為SEQ ID NO:20所示序列，F(xiàn)R2的序列為SEQ ID NO:24所示的序列，F(xiàn)R3的序列為SEQ ID NO:27所示的序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:30所示的序列；
[0026](Il)FRl的序列為SEQ ID NO:21所示序列，F(xiàn)R2的序列為SEQ ID NO:23所示的序列，F(xiàn)R3的序列為SEQ ID NO:28所不的序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:30所不的序列；
[0027](12)FRl的序列為SEQ ID NO:22所示序列，F(xiàn)R2的序列為SEQ ID NO:25所示的序列，F(xiàn)R3的序列為SEQ ID NO:29所不的序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:30所不的序列；和/或
[0028]其輕鏈可變區(qū)FR的序列選自以下(13)~(16)所示序列或其衍生序列:
[0029](13)FRl的序列為SEQ ID NO:31所示序列，F(xiàn)R2的序列為SEQ ID NO:33所示的序列，F(xiàn)R3的序列為SEQ ID NO:35所示的序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:37所示的序列；
[0030](14)FRl的序列為SEQ ID NO:31所示序列，F(xiàn)R2的序列為SEQ ID NO:33所示的序列，F(xiàn)R3的序列為SEQ ID NO:35所不的序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:38所不的序列；
[0031](15) FRl的序列為SEQ ID NO:32所示序列，F(xiàn)R2的序列為SEQ ID NO:34所示的序列，F(xiàn)R3的序列為SEQ ID NO:36所不的序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:38所不的序列；
[0032](16)FRl的序列為SEQ ID NO:31所示序列，F(xiàn)R2的序列為SEQ ID NO:33所示的序列，F(xiàn)R3的序列為SEQ ID NO:35所示的序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:37所示的序列。
[0033]在本發(fā)明的具體實 施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈可變區(qū)序列為SEQ ID NO:5所示的序列，輕鏈可變區(qū)序列為SEQ ID N0:13所示的序列。
[0034]在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈可變區(qū)序列為SEQ ID NO:6所示的序列，輕鏈可變區(qū)序列為SEQ ID N0:14所示的序列。[0035]在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈可變區(qū)序列為SEQ ID NO:7所示的序列，輕鏈可變區(qū)序列為SEQ ID NO:15所示的序列。
[0036]在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈可變區(qū)序列為SEQ ID NO:8所示的序列，輕鏈可變區(qū)序列為SEQ ID N0:16所示的序列。
[0037]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分，其還包含人IgGl重鏈恒定區(qū)和人K輕鏈恒定區(qū)。
[0038]在本發(fā)明中，所述IgGl重鏈恒定區(qū)包括各種同種異型，如Glm(f)、Glm(z)、Glm(z，a)或Glm(z,a, x)。在本發(fā)明的實施方案中，所述IgGl重鏈恒定區(qū)為Glm(z)型。
[0039]在本發(fā)明中，所述K輕鏈恒定區(qū)包括各種同種異型，如Kml、Kml，2或Km3，在本發(fā)明的的實施方案中，所述K輕鏈恒定區(qū)為Km3型。
[0040]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗原結(jié)合部分包括單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙抗體、scFv-Fc 二價分子、dAb和互補決定區(qū)(CTR)片段、Fab片段、Fd片段、Fab'片段、Fv和F (ab' )2片段。
[0041]本發(fā)明第二方面涉及分離的核酸分子，其編碼本發(fā)明第一方面任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合部分。
[0042]本發(fā)明第三方面涉及載體，其含有本發(fā)明第二方面任一項的核酸分子。
[0043]在本發(fā)明中，所述載體可以為克隆載體或表達(dá)載體。所述表達(dá)載體例如為原核表達(dá)載體，真核表達(dá)載體，噬菌體載體或病毒載體，均為本領(lǐng)域常用的載體。其中所述原核表達(dá)載體例如為PET28a、pGEM ExU pGEM7ZF(+)或pBAD24等，所述真核表達(dá)載體例如為pBudCE4.1、pcDNA3.1、pC`MV_Tag2B或pGL3 basic等,在本發(fā)明的實施方案中，所述真核表達(dá)載體為PCDNA3.1，所述病毒載體例如為逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒。在本發(fā)明的實施方案中，所述病毒載體為腺病毒載體。
[0044]本發(fā)明第四方面涉及宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明第二方面的核酸分子或第三方面的載體。
[0045]在本發(fā)明中，所述宿主細(xì)胞可以為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。所述真核細(xì)胞例如為哺乳動物細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以通過向原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中引入/轉(zhuǎn)染上述的核酸分子或載體而得到。
[0046]在本發(fā)明中，所述原核細(xì)胞例如可以為大腸桿菌，所述真核細(xì)胞例如可以為酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞(如Sf21)、哺乳動物細(xì)胞，所述哺乳動物例如可以為NSO細(xì)胞、CHO細(xì)胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述真核細(xì)胞為CHO-S細(xì)胞。
[0047]在本發(fā)明中，可以利用本領(lǐng)域所知的任何種類的轉(zhuǎn)染方法獲得轉(zhuǎn)染有特定核酸或載體的宿主細(xì)胞。例如，可通過電穿孔或顯微注射將核酸引入細(xì)胞中?；蛘?，可使用脂轉(zhuǎn)染試劑如FuGENE6、X-tremeGENE和LipofectAmine?；蛘撸赏ㄟ^基于逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒的適當(dāng)病毒載體將核酸引入細(xì)胞中。
[0048]本發(fā)明第五方面涉及組合物，其含有本發(fā)明第一方面任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分，以及任選的一種或多種藥學(xué)可接受的輔料；優(yōu)選地，所述輔料選自蛋白水解酶抑制劑、藥用載體、稀釋劑和佐劑。
[0049]本發(fā)明第六方面涉及本發(fā)明第一方面任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分、或第二方面的核酸分子、或第三方面的載體、或第四方面的宿主細(xì)胞在制備預(yù)防/治療表皮生長因子或表皮生長因子受體相關(guān)疾病的藥物中的用途。
[0050]在本發(fā)明中，所述表皮生長因子或表皮生長因子受體相關(guān)疾病是指由于表皮生長因子高表達(dá)或表皮生長因子受體高表達(dá)而引起的疾病。在本發(fā)明的實施方案中，所述表皮生長因子或表皮生長因子受體相關(guān)疾病是指惡性腫瘤，其主要是指發(fā)生于上皮組織的惡性腫瘤，其包括但不限于直結(jié)腸癌、肝癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、陰道癌、膀胱癌、食管癌、口腔癌、皮膚癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌等。
[0051]本發(fā)明第七方面涉及檢測試劑或試劑盒，其含有本發(fā)明第一方面任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分；
[0052]優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結(jié)合部分還可包含可檢測的標(biāo)記；或者
[0053]優(yōu)選地，所述檢測試劑或試劑盒還可包含第二抗體，其特異性識別所述抗體或其抗原結(jié)合部分；或者
[0054]優(yōu)選地， 所述第二抗體還可包含可檢測的標(biāo)記。
[0055]本發(fā)明第八方面涉及本發(fā)明第一方面任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分在制備檢測試劑或試劑盒中的用途，其中所述檢測試劑或試劑盒用于檢測表皮生長因子或表皮生長因子受體，或者用于診斷表皮生長因子或表皮生長因子受體相關(guān)疾病。
[0056]以下對本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
[0057]本發(fā)明的目的是針對已有的抗表皮生長因子受體抗體，利用去免疫原性的抗體人源化技術(shù)改變抗體的CDR區(qū)和/或框架區(qū)，以獲得具有更低免疫原性和更高生物學(xué)活性的抗表皮生長因子受體抗體。
[0058]在本發(fā)明的一個實施方案中，首先分析鼠抗M225的重鏈可變區(qū)的序列，根據(jù)其重鏈可變區(qū)FRl，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列對人抗體基因序列庫進(jìn)行比較，找出與鼠抗M225重鏈可變區(qū)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗體(比成熟抗體免疫原性更低)可變區(qū)相對應(yīng)序列。然后經(jīng)過insilicon方法,分析相似序列與HLA-DR分子結(jié)合的親和性，選出親和性最低的框架序列，從而最終確立重鏈可變區(qū)的FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的人源化序列。在此框架結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用計算機分子模型分析鼠M225抗體的可變區(qū)立體空間結(jié)構(gòu)，分析出支持CDR構(gòu)型所需保留的鼠M225抗體對應(yīng)框架氨基酸殘基。對HLA-DR分子結(jié)合的親和性較高的CDRl和CDR3的去免疫原化，則應(yīng)用分子對接，分析表皮生長因子受體抗原鼠M225抗體靶位及其周邊氨基酸殘基與人源化重鏈可變區(qū)的立體空間結(jié)合方式，通過計算靜電力，溶液媒合(salvation)，范德華引力和熵值，選擇CDRl和CDR3序列中可以優(yōu)化的氨基酸，以降低于HLA-DR分子結(jié)合的親和性，并改善抗體CDR3區(qū)域與表皮生長因子受體抗原表位的結(jié)合。
[0059]在本發(fā)明的另一個實施方案中，分析鼠抗M225抗體的輕鏈可變區(qū)的序列，根據(jù)其輕鏈可變區(qū)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列對人抗體基因序列庫(NCBI Ig BLAST)進(jìn)行比較，找出與鼠抗M225輕鏈可變區(qū)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗體可變區(qū)相對應(yīng)序列，然后經(jīng)過in silicon分析相似序列與HLA-DR分子結(jié)合的親和性,選出親和性最低的框架序列，從而最終確立輕鏈可變區(qū)的FRl，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的人源化序列。在此框架結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用計算機分子模型分析鼠225抗體的可變區(qū)立體空間結(jié)構(gòu)，分析出支持CDR構(gòu)型所需保留的鼠M225抗體對應(yīng)框架氨基酸殘基。對HLA-DR分子結(jié)合的親和性較高的CDRl和CDR3的去免疫原化，則應(yīng)用分子對接，分析表皮生長因子受體抗原鼠M225抗體靶位及其周邊氨基酸殘基與人源化重鏈可變區(qū)的立體空間結(jié)合方式，通過計算靜電力，溶液媒合(salvation)，范德華引力和熵值，選擇CDRl和CDR3序列中可以優(yōu)化的氨基酸，以 口 ?
[0060]在本發(fā)明的實施方案中，從正常人B細(xì)胞中分別獲得人IgGl重鏈恒定區(qū)Fe片段和輕鏈恒定區(qū)K片段，并分別和上述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接，構(gòu)建抗體重鏈和輕鏈表達(dá)載體。將所述表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)、純化，得到人源化抗表皮生長因子受體抗體 BA03、BB03、BC03 和 BD03。
[0061]在本發(fā)明的實施方案中，所述抗體在與細(xì)胞表面表皮生長因子受體的親和性、阻斷EGF配體與細(xì)胞表面表皮生長因子受體結(jié)合的活性、抑制細(xì)胞表面表皮生長因子受體磷酸化的活性和ADCC作用方面，與愛必妥相比均具有更高的活性，同時具有更低的免疫原性。
[0062]在本發(fā)明的實施方案中，所述抗體對多種腫瘤細(xì)胞的生長都具有抑制作用，例如表皮癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和乳腺癌，并且在動物水平具有明顯的抑制腫瘤生長的作用。
[0063]在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞和組織培養(yǎng)、微生物學(xué)、免疫學(xué)相關(guān)術(shù)語和實驗室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的術(shù)語和常規(guī)步驟。同時，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。
[0064]在本發(fā)明中，術(shù)語“抗體”是指通常由兩對相同的多肽鏈(每對具有一條“輕”(L)鏈和一條“重”(H)鏈)組成的免疫球蛋白分子?？贵w輕鏈可分類為K和λ輕鏈。重鏈可分類為μ、δ、Y、α或ε ,并`且分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過大約12或更多個氨基酸的“J”區(qū)連接，重鏈還包含大約3個或更多個氨基酸的“D”區(qū)。各重鏈由重鏈可變區(qū)(Vh)和重鏈恒定區(qū)(Ch)組成。重鏈恒定區(qū)由3個結(jié)構(gòu)域((^、(^和^^)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)(Q)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域Q組成?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(Clq)的結(jié)合。Vh和'區(qū)還可被細(xì)分為具有高變性的區(qū)域(稱為互補決定區(qū)(CDR))，其間散布有較保守的稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的區(qū)域。各Vh和Vl由按下列順序:FRU CDRU FR2、CDR2、FR3、⑶R3、FR4從氨基末端至羧基末端排列的3個⑶R和4個FR組成。各重鏈/輕鏈對的可變區(qū)(vn和vl)分別形成抗體結(jié)合部位。氨基酸至各區(qū)域或結(jié)構(gòu)域的分配遵循Kabat Sequencesof Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda,Md.(1987 and 1991))，或 Chothia& Lesk (1987) J.Mol.Biol.196:901-917 ;Chothia 等人(1989)Nature342:878-883的定義。術(shù)語“抗體”不受任何特定的產(chǎn)生抗體的方法限制。例如，其包括，特別地，重組抗體、單克隆抗體和多克隆抗體?？贵w可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgGl, IgG2，IgG3 或 IgG4 亞型)，IgAl, IgA2，IgD, IgE 或 IgM 抗體。
[0065]在本發(fā)明中，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”是指全長抗體的一個或多個部分，所述部分保持結(jié)合抗體所結(jié)合的相同抗原(例如，ERCC1)的能力，與完整抗體競爭對抗原的特異性結(jié)合。通常參見，F(xiàn)undamental Immunology,Ch.7 (Paul,W., ed.,第 2 版,Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通過引用合并入本文，用于所有目的?？赏ㄟ^重組DNA技術(shù)或通過完整抗體的酶促或化學(xué)斷裂產(chǎn)生抗原結(jié)合部分。在一些情況下，抗原結(jié)合部分包括Fab、Fab'、F(ab' ) 2、Fd、Fv、dAb和互補決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(例如，scFv)、嵌合抗體、雙抗體(diabody)和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結(jié)合能力的抗體的至少一部分。
[0066]在本發(fā)明中，術(shù)語“Fd片段”意指由Vh和ChI結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段；術(shù)語“Fv片段”意指由抗體的單臂的 '和Vh結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段；術(shù)語“dAb片段”意指由Vh結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段(Ward等人，Nature341:544-546(1989));術(shù)語“Fab片段”意指由\、VH、Q和ChI結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段；術(shù)語“F(ab' )2片段”意指包含通過鉸鏈區(qū)上的二硫橋連接的兩個Fab片段的抗體片段。
[0067]在一些情況下，抗體的抗原結(jié)合部分是單鏈抗體(例如，scFv),其中Vlj和Vh結(jié)構(gòu)域通過使其能夠產(chǎn)生為單個多肽鏈的連接體配對形成單價分子(參見，例如，Bird等人，Science 242:423-426(1988)和 Huston 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-5883 (1988))。此類 scFv 分子可具有一般結(jié)構(gòu)=NH2-Vf 接頭-Vh-COOH 或 NH2-Vh-接頭-'-C00H。合適的現(xiàn)有技術(shù)接頭由重復(fù)的GGGGS氨基酸序列或其變體組成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接頭，但也可使用其變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:6444-6448)?？捎糜诒景l(fā)明的其他接頭由 Alfthan 等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi 等人(2001)，Eur.J.1mmunol.31:94-106, Hu 等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov 等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56 和 Roovers等人(2001), Cancer Tmmunol.描述。
[0068]在一些情況下，抗體是雙抗體，即，雙價抗體，其中V1^P \結(jié)構(gòu)域在單個多肽鏈上表達(dá)，但使用太短的連接體以致不允許在相同鏈的兩個結(jié)構(gòu)域之間配對，從而迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對并且產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合部位(參見，例如，Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448(1993)，和 Poljak R.J.等人，Structure 2:1121-1123(1994))。
[0069]在本發(fā)明中，術(shù)語“衍生序列”是指與本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分相應(yīng)片段的序列高度同源且仍保留與本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分相應(yīng)片段具有相似的EGFR結(jié)合活性和免疫原性的序列。
[0070]可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)(例如，重組DNA技術(shù)或酶促或化學(xué)斷裂法)從給定的抗體(例如單克隆抗體2E12)獲得抗體的抗原結(jié)合部分(例如，上述抗體片段)，并且以與對于完整抗體的方式相同的方式就特異性篩選抗體的抗原結(jié)合部分。
[0071]在本發(fā)明中，20種常規(guī)氨基酸和其縮寫遵從常規(guī)用法。參見Immunology-ASynthesis (第 2 版，E.S.Golub^PD.R.Gren,Eds., Sinauer Associates, Sunderland,Mass.(1991))，其通過引用合并入本文。
[0072]在本發(fā)明中，所述核酸包括DNA和RNA。
[0073]發(fā)明的有益效果
[0074]本發(fā)明針對已經(jīng)上市的人鼠嵌合愛必妥單抗，利用去免疫原性的抗體人源化技術(shù)改變抗體的框架區(qū)和部分引起免疫原性的CDR區(qū)，形成全新序列的人源化抗表皮生長因子受體IgGl亞型抗體分子，所得抗體具有比愛必妥單抗更低的免疫原性和更高的的靶點結(jié)合活性，從而有更強的生物學(xué)活性和體內(nèi)外抗腫瘤活性，可以預(yù)期臨床應(yīng)用副作用更低，療效更好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0075]圖1所示為抗體與細(xì)胞表面表皮生長因子受體親和力的比較。
[0076]圖2所示為抗體阻斷EGF配體與細(xì)胞表面表皮生長因子受體結(jié)合的比較，其中縱坐標(biāo)為0D450值。
[0077]圖3所示為抗體抑制A431細(xì)胞表面表皮生長因子受體磷酸化的比較。
[0078]圖4所示為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)活性測定。
[0079]圖5所示為樹突狀細(xì)胞-T細(xì)胞激活實驗測定抗體體外免疫原性。
[0080]圖6所示為抗體對人表皮癌A431小鼠腫瘤模型的生長抑制作用。
【具體實施方式】
[0081]下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0082]實施例1、抗表面表皮生長因子受 體人源化單克隆抗體重鏈可變區(qū)序列的設(shè)計
[0083]以下為鼠抗M225的重鏈可變區(qū)的序列，下劃線部分為FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4框架序列:QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEffLGVIffSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQYFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYffGQGTLYTYSA(SEQ ID NO:17)。
[0084]根據(jù)其重鏈可變區(qū)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列對人抗體基因序列庫進(jìn)行比較，找出與鼠抗M225重鏈可變區(qū)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗體可變區(qū)相對應(yīng)序列。然后用NetMHCIIpan軟件或自編軟件,經(jīng)過in silicon方法,分析相似序列與HLA-DR分子結(jié)合的親和性，選出親和性最低的框架序列，從而最終確立人源化重鏈可變區(qū)的FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的序列。在此框架結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用計算機分子模型分析鼠225抗體的可變區(qū)立體空間結(jié)構(gòu)，分析出支持CDR構(gòu)型所需保留的鼠225抗體對應(yīng)框架氨基酸殘基L29，L48和L67。對HLA-DR分子結(jié)合的親和性較高的⑶Rl和⑶R3的去免疫原化，則應(yīng)用分子對接，分析表皮生長因子受體鼠源M225抗體靶位及其周邊氨基酸殘基與人源化重鏈可變區(qū)的立體空間結(jié)合方式，通過計算靜電力，溶液媒合(salvation)，范德華引力和熵值(Sircar et al, SnugDock:paratope structural optimization duringantibody-antigen docking compensates for errors in antibody homology models,PLoS Comput Biol.2010 Jan 22 ;6)，選擇CDRl和CDR3序列中可以優(yōu)化的氨基酸，將CDRl中的33位點GLy優(yōu)化為氨基酸Asp，將⑶R3中的100位點Thr優(yōu)化為氨基酸Asp，以降低與HLA-DR分子結(jié)合的親和性，并改善抗體CDR3區(qū)域與表皮生長因子受體抗原表位的結(jié)合。新設(shè)計的重鏈⑶Rl為:N Y D V H (SEQ ID NO:1);新設(shè)計的重鏈⑶R3序列為A LDYYDYEFA Y (SEQ ID NO:2)和 A L T Y Y D Y D F A Y (SEQ ID NO:3)，由于 CDR2 對 HLA-DR分子結(jié)合的親和性較低，保留原鼠抗M225的⑶R2序列(其序列為VIWSGGNTDYNTPFTS，SEQID NO:4) 0因此，整合優(yōu)化的框架序列和⑶R序列，得到的4個新型抗表皮生長因子受體人源化單克隆抗體重鏈可變區(qū)序列為:
[0085]
【權(quán)利要求】
1.抗表皮生長因子受體抗體或其抗原結(jié)合部分，其重鏈⑶Rl的序列選自SEQID NO:1和SEQ ID NO:39所示序列或其衍生序列，CDR3的序列選自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:40所示序列或其衍生序列；和/或 其輕鏈CDR3的序列選自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:41所示序列或其衍生序列。
2.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分，其重鏈可變區(qū)CDR的序列選自以下(I)~(4)所示序列或其衍生序列: (1)CDRl的序列為SEQID NO:1所示序列，CDR2的序列為SEQ ID NO:4所示序列，CDR3的序列為SEQ ID NO:2所不序列； (2)CDRl的序列為SEQ ID NO:1所示序列，CDR2的序列為SEQ ID NO:4所示序列，CDR3的序列為SEQ ID NO:40所不序列； (3)CDRl的序列為SEQID NO:39所不序列，CDR2的序列為SEQ ID NO:4所不序列，CDR3的序列為SEQ ID NO:3所不序列； (4)CDRl的序列為SEQ ID NO:39所不序列，CDR2的序列為SEQ ID NO:4所不序列，CDR3的序列為SEQ ID NO:40所不序列；和/或 其輕鏈可變區(qū)CDR的序列選自以下(5)~(8)所示序列或其衍生序列: (5)CDRl的序列為SEQ ID NO: 11所不序列，CDR2的序列為SEQ ID NO: 12所不序列，CDR3的序列為SEQ ID NO:9所不序列； (6)CDRl的序列為SEQ ID NO: 11所不序列，CDR2的序列為SEQ ID NO: 12所不序列，CDR3的序列為SEQ ID NO:41所不序列； (7)CDRl的序列為SEQ ID NO: 11所不序列，CDR2的序列為SEQ ID NO: 12所不序列，CDR3的序列為SEQ ID NO:41所不序列； (8)CDRl的序列為SEQ ID NO: 11所不序列，CDR2的序列為SEQ ID NO: 12所不序列，CDR3的序列為SEQ ID NO: 10所不序列。
3.權(quán)利要求1或2的抗體或其抗原結(jié)合部分，其重鏈FRl的序列選自SEQID NO: 19~SEQ ID NO:22所示序列或其衍生序列，F(xiàn)R2的序列選自SEQ ID NO:23~SEQ ID NO:25所示序列或其衍生序列，F(xiàn)R3的序列選自SEQ ID NO:26~SEQ ID NO:29所示序列或其衍生序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:30所示序列或其衍生序列；和/或 其輕鏈FRl的序列選自SEQ ID NO:31~SEQ ID NO:32所示序列或其衍生序列，F(xiàn)R2的序列選自SEQ ID NO:33~SEQ ID NO:34所示序列或其衍生序列，F(xiàn)R3的序列選自SEQID NO:35~SEQ ID NO:36所示序列或其衍生序列，F(xiàn)R4的序列選自SEQ ID NO:37~SEQID NO:38所示序列或其衍生序列。
4.權(quán)利要求3的抗體或其抗原結(jié)合部分，其重鏈可變區(qū)FR的序列選自以下(9)~(12)所示序列或其衍生序列: (9)FRl的序列為SEQID NO: 19所不序列，F(xiàn)R2的序列為SEQ ID NO:23所不的序列，F(xiàn)R3的序列為SEQ ID NO:26所不的序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:30所不的序列； (10)FRl的序列為SEQID NO:20所不序列，F(xiàn)R2的序列為SEQ ID NO:24所不的序列，F(xiàn)R3的序列為SEQ ID NO:27所不的序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:30所不的序列； (11)FRl的序列為SEQID NO:21所不序列，F(xiàn)R2的序列為SEQ ID NO:23所不的序列，F(xiàn)R3的序列為SEQ ID NO:28所不的序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:30所不的序列； (12)FRl的序列為SEQID NO:22所示序列，F(xiàn)R2的序列為SEQ ID NO:25所示的序列，F(xiàn)R3的序列為SEQ ID NO:29所不的序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:30所不的序列；和/或 其輕鏈可變區(qū)FR的序列選自以下(13)~(16)所示序列或其衍生序列: (13)FRl的序列為SEQID NO:31所不序列，F(xiàn)R2的序列為SEQ ID NO:33所不的序列，F(xiàn)R3的序列為SEQ ID NO:35所不的序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:37所不的序列； (14)FRl的序列為SEQID NO:31所不序列，F(xiàn)R2的序列為SEQ ID NO:33所不的序列，F(xiàn)R3的序列為SEQ ID NO:35所不的序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:38所不的序列； (15)FRl的序列為SEQID NO:32所示序列，F(xiàn)R2的序列為SEQ ID NO:34所示的序列，F(xiàn)R3的序列為SEQ ID NO:36所不的序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:38所不的序列； (16)FRl的序列為SEQID NO:31所不序列，F(xiàn)R2的序列為SEQ ID NO:33所不的序列，F(xiàn)R3的序列為SEQ ID NO:35所示的序列，F(xiàn)R4的序列為SEQ ID NO:37所示的序列。
5.權(quán)利要求1-4任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分，其還包含人IgGl重鏈恒定區(qū)和人K輕鏈恒定區(qū)。
6.權(quán)利要求1-4任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗原結(jié)合部分為單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙抗體、scFv-Fc 二價分子、dAb和互補決定區(qū)(CTR)片段、Fab片段、Fab'片段、Fv或F(ab' )2片段。
7.分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-6任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合部分。
8.載體,其含有權(quán)利要求7的核`酸分子。
9.宿主細(xì)胞,其含有權(quán)利要求7的核酸分子或權(quán)利要求8的載體。
10.組合物，其含有權(quán)利要求1-6任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分，以及任選的一種或多種藥學(xué)可接受的輔料；優(yōu)選地，所述輔料選自蛋白水解酶抑制劑、藥用載體、稀釋劑和佐劑。
11.權(quán)利要求1-6任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分、或權(quán)利要求7的核酸分子、或權(quán)利要求8的載體、或權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞在制備預(yù)防/治療表皮生長因子或表皮生長因子受體相關(guān)疾病的藥物中的用途；優(yōu)選地，所述表皮生長因子或表皮生長因子受體相關(guān)疾病是指由于表皮生長因子高表達(dá)或表皮生長因子受體高表達(dá)而引起的疾??；更優(yōu)選地，所述由于表皮生長因子高表達(dá)或表皮生長因子受體高表達(dá)而引起的疾病是指惡性腫瘤。
12.檢測試劑或試劑盒，其含有權(quán)利要求1-6任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分； 優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結(jié)合部分還可包含可檢測的標(biāo)記；或者 優(yōu)選地，所述檢測試劑或試劑盒還可包含第二抗體，其特異性識別所述抗體或其抗原結(jié)合部分；或者 優(yōu)選地，所述第二抗體還可包含可檢測的標(biāo)記。
13.權(quán)利要求1-6任一項的抗體或其抗原結(jié)合部分在制備檢測試劑或試劑盒中的用途，其中所述檢測試劑或試劑盒用于檢測表皮生長因子或表皮生長因子受體，或者用于診斷表皮生長因子或表皮生長因子受體相關(guān)疾病。
【文檔編號】C12N15/13GK103772504SQ201210406288
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月17日
【發(fā)明者】劉劼 申請人:上海津曼特生物科技有限公司