專利名稱：利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備重組人神經(jīng)生長因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備重組人神經(jīng)生長因子的方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor, NGF)是最早發(fā)現(xiàn)和最典型的神經(jīng)營養(yǎng)因子，同時也是神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的生物活性分子之一。它由α、β、Y三個亞基組成,其中β亞基(β-NGF)是唯一具有生物學(xué)活性的亞基，它對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。目前β-NGF已被開發(fā)成治療外周神經(jīng)損傷的藥物應(yīng)用于臨床，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)損傷、偏癱、卒中、顱腦損傷、小兒腦癱等神經(jīng)性疾病領(lǐng)域。但商品化的NGF為鼠源性的神經(jīng)生長因子(mNGF)。這類動物源性的蛋白制品常常具有較高的免疫原性，容易引起人體內(nèi)的抗原反應(yīng)，嚴(yán)重者甚至?xí)＜吧６烊坏娜松窠?jīng)生長因子(hNGF)分布于人體的腦、神經(jīng)節(jié)、虹膜、心臟、脾、胎盤等組織，原料有限，且其中hNGF含量低，分離純化極其困難，無法直接提取獲得。利用基因工程技術(shù)制備重組人神經(jīng)生長因子是解決上述問題的一個主要途徑。在各大表達(dá)系統(tǒng)中，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)因其表達(dá)水平高、生產(chǎn)成本低、便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢成為制備重組人神經(jīng)生長因子的首選?？墒?，部分真核基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)量極低，甚至不表達(dá)，原因在于真核生物和原核生物所偏好的密碼子不一樣。此夕卜，大腸桿菌缺少真核生物蛋白質(zhì)合成后的加工修飾系統(tǒng)，因此，表達(dá)的蛋白常常無生物學(xué)活性。研究者們發(fā)現(xiàn)，人β-NGF在大腸桿菌中的表達(dá)量不高，而且生物活性極低，經(jīng)分析主要是由于β -NGF基因及其蛋白特殊的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其難于在大腸桿菌系統(tǒng)中有效表達(dá)。一方面β-NGF基因中使用了較多的大腸桿菌稀有密碼子，導(dǎo)致β-NGF基因在大腸桿菌中表達(dá)量不高。另一方面β-NGF蛋白結(jié)構(gòu)特殊，難于在缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng)的大腸桿菌中形成正確的結(jié)構(gòu)，致使表達(dá)出的β -NGF蛋白生物活性極低，甚至沒有活性。天然的β -NGF是由兩條118個氨基酸組成的單鏈通過非共價鍵結(jié)合而成的二聚體，其中每條單鏈內(nèi)含有由6個半胱氨酸相互配對形成的3對二硫鍵，這3對二硫鍵構(gòu)成神經(jīng)營養(yǎng)因子家族典型的
結(jié)構(gòu)模式-“胱氨酸結(jié)”模式(the cystine knot),即兩個二硫鍵橋(Cys58_Cysl08和
Cys68-Cysll0)形成一個含有14個殘基的環(huán)(loop), Cysl5和Cys80穿過這個環(huán)形成第三個二硫鍵橋。這種特殊結(jié)構(gòu)模式在神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中高度保守，對維持β-NGF的正常生物學(xué)功能至關(guān)重要。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的β-NGF往往由于上述6個半胱氨酸不能正確配對，形成上述“胱氨酸結(jié)”結(jié)構(gòu)，即不能形成正確的蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其生物活性極低。針對上述問題，通用的做法是對需表達(dá)的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，同時構(gòu)建分子伴侶與目標(biāo)蛋白的融合蛋白，通過分子伴侶幫助目標(biāo)蛋白體外折疊成為正確的結(jié)構(gòu)。針對基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，需考慮大腸桿菌密碼子偏好性，還應(yīng)考慮基因序列及其轉(zhuǎn)錄的mRNA序列結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性以及核糖體結(jié)合序列的結(jié)合效率等因素，是一項復(fù)雜、技術(shù)難度較高的工作。融合蛋白的構(gòu)建，分子伴侶的選擇是關(guān)鍵。為了改善β-NGF的折疊及復(fù)性效率，部分研究者構(gòu)建了硫氧還蛋白及二硫鍵形成蛋白與β-NGF的融合蛋白。例如HE Ling-bing 等(HE Ling-bing, WANG Yanz, WANG Ge, CHEN Chao, and CAO Shu-gui,Expression and Purification of Active Recombinant Human Nerve Growth Factorfrom Escherichiu coli. CHEM. RES. CHINESEU，2007 年，Vol. 23，No. 2)將硫氧還蛋白及組氨酸標(biāo)簽蛋白與hNGF β亞基融合，利用對標(biāo)簽蛋白特異吸附的親和層析來分離純化β -NGF,同時利用硫氧還蛋白來幫助β -NGF以可溶性表達(dá)的方式進(jìn)行表達(dá)，但原核細(xì)胞較小，只有當(dāng)表達(dá)量較小時，蛋白才能以可溶性方式存在，當(dāng)外源蛋白大量表達(dá)時，絕大多數(shù)的蛋白仍然會聚集變性；孫衛(wèi)國等(孫衛(wèi)國，劉農(nóng)樂，丁紅梅，陳留存，趙強，徐華，沈倍奮，邵寧生，重組人神經(jīng)生長因子β亞基的原核融合表達(dá)及其活性研究.生物技術(shù)通訊，2009 年，Vol. 20, No. 4)將二硫鍵形成蛋白家族(Dsb)中的DsbA、DsbC蛋白及硫氧還蛋白(Trx)為融合分子，與hNGF β亞基在原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)打融合表達(dá)，雖然_■硫鍵形成蛋白能輔助β -NGF體外復(fù)性，但不能識別β -NGF的3對二硫鍵準(zhǔn)確位置，因此也很難達(dá)到理想的復(fù)性效果，且該研究的終產(chǎn)物攜帶有標(biāo)簽蛋白，與天然β-NGF不一致，無法用于藥物生產(chǎn)。因此，本領(lǐng)域中迫切需要開發(fā)以低成本、高產(chǎn)率及高活性為目的制備重組人神經(jīng)生長因子的方法。所述的制備包括對人神經(jīng)生長因子進(jìn)行的基因修飾、分子伴侶的融合表達(dá)以及重組蛋白的分離、純化。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供了一種重組人神經(jīng)生長因子β亞基基因，其含有6組氨酸純化位點、腸激酶切割位點以及經(jīng)過修飾的人神經(jīng)生長因子β亞基成熟肽段基因和分子伴侶基因，其中所述人神經(jīng)生長因子β亞基成熟肽段基因為經(jīng)過原核生物高頻密碼子改造后的基因，其堿基序列如SEQ ID NO :1所示；所述分子伴侶基因為經(jīng)過修飾的人神經(jīng)生長因子β亞基前導(dǎo)肽基因，其堿基序列如SEQ ID Ν0:2所示。本發(fā)明的目的之二在于提供了利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備重組人神經(jīng)生長因子的方法。根據(jù)本發(fā)明的一方面，經(jīng)修飾的人神經(jīng)生長因子β亞基成熟肽基因的堿基序列如 SEQ ID NO 1 所示(共 357bp)。該序列中的堿基序列是進(jìn)行了密碼子改造的序列，其密碼子是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的高頻密碼子，能在不改變氨基酸序列的前提下，最大限度的提高目的基因的表達(dá)量。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，經(jīng)修飾的作為分子伴侶的前導(dǎo)肽基因的堿基序列如SEQID NO 2 所示(共 309bp)。該序列位于本發(fā)明的人神經(jīng)生長因子β亞基成熟肽基因序列上游，兩序列由腸激酶切割位點(GATGATGATGATAAA)連接。該分子伴侶可幫助以包涵體形式表達(dá)的人神經(jīng)生長因子β亞基在體外形成正確的構(gòu)象，并且能在復(fù)性后通過腸激酶的切割去除，從而釋放出與天然β -NGF氨基酸序列完全一致的，且具有較高生物學(xué)活性的成熟肽。本發(fā)明所述的利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備重組人神經(jīng)生長因子(rhi3NGF)的方法包括下述步驟(I)利用化學(xué)合成法合成經(jīng)原核生物高頻密碼子改造后的人神經(jīng)生長因子β亞基成熟肽段基因及分子伴侶基因，并將其克隆入pET28a(+)表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體；
(I. D將上述基因片段用BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶雙酶切后插入原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)的 BamHI (846)和 XhoI (159)位點(參見 Novagen 公司質(zhì)粒圖譜)；
(I. 2)獲得重組表達(dá)載體pET28a(+) + [rhi3 NGF]，經(jīng)PCR與酶切鑒定插入正確后，測序驗證其序列正確性；
(2)將步驟(I)所得重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌株BL21UDE3)中，構(gòu)建含有重組表達(dá)載體的基因工程菌；
(3)培養(yǎng)步驟(2)所得基因工程菌至A550=0.6時，加入誘導(dǎo)劑IPTG，誘導(dǎo)重組人神經(jīng)生長因子rh β NGF在該基因工程菌中表達(dá)；
(4)離心收集菌體，重懸菌體，_80°C凍存；
(5)解凍菌體重懸液，破碎菌體，分離純化包涵體蛋白(洗滌分離包涵體，8M尿素溶解包涵體蛋白)；
(6)體外復(fù)性包涵體蛋白，透析后超濾濃縮；
(7)經(jīng)腸激酶切割去除分子伴侶；
(8)純化獲得所述重組人神經(jīng)生長因子。優(yōu)選地，其中所述步驟(3)中誘導(dǎo)的時間為3-4小時。優(yōu)選地，其中所述步驟(3)中誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為lmmol/L。優(yōu)選地，其中所述步驟(4)中的重懸液為20mM Tris-HCl (ρΗ8· O)，使用量為菌體濕重的20倍體積。優(yōu)選地，其中所述步驟(5)中破碎菌體的方法為超聲破碎法，其中超聲破碎菌體所用功率為400W，超聲15秒，間隔15秒，作用30分鐘。優(yōu)選地，其中所述步驟出)中復(fù)性包涵體蛋白的方法為體外稀釋復(fù)性法，其中體外稀釋復(fù)性液中，精氨酸的濃度范圍是O. 75-1. Ommol/L, pH值是8. 0-9. 5。優(yōu)選地，其中所述步驟(6)使用的體外稀釋復(fù)性液中精氨酸的濃度為O. 75mM, pH值為9. 5 ;氧化還原體系-還原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽(GSH-GSSG)濃度為O. 5mMGSSG-5mM GSH，復(fù)性時間為3小時；透析液為50 mM Tris-HCl緩沖液。優(yōu)選地，其中所述步驟(7)中的腸激酶為帶6組氨酸純化位點的重組牛腸激酶。優(yōu)選地，其中所述步驟(7)中的腸激酶作用溫度為21°C，作用時間為16h ；
優(yōu)選地，其中所述步驟(8)中純化的方法為鎳柱親和層析法。優(yōu)選地，其中所述步驟(8)中鎳柱親和層析的填料為Ni Sepharose Fast Flow,層析過程中使用含50 mM咪唑-O. 5 M NaCl-20mMTris-HCl (pH8. O)的緩沖液平衡層析柱，上樣過程中收集的流穿峰為含rh β NGF的組分，經(jīng)透析和超濾濃縮得到純度大于99%，生物比活性高于500000AU/mg的重組人神經(jīng)生長因子。本發(fā)明對β-NGF基因進(jìn)行了分析，根據(jù)大腸桿菌對同義密碼選擇的偏好性，在消除了稀有密碼子、不穩(wěn)定序列，優(yōu)選了最佳密碼子的基礎(chǔ)上，對β-NGF基因進(jìn)行了重新設(shè) 計，從而最大限度提高了 β-NGF在大腸桿菌中的表達(dá)量。本發(fā)明根據(jù)天然β-NGF的結(jié)構(gòu)特點，選擇了 β-NGF的前導(dǎo)肽作為其分子伴侶，此肽段能有效識別天然β-NGF中的二硫鍵形成位點，并能使其在正確位置形成二硫鍵，從而保證β -NGF的正確折疊和復(fù)性。此外，為方便目的蛋白的分離純化及保證終產(chǎn)物的單一性，本發(fā)明在前導(dǎo)肽上游引入了 6組氨酸純化位點，在前導(dǎo)肽與成熟肽之間設(shè)計了腸激酶切割位點。該設(shè)計方案使表達(dá)產(chǎn)物可通過親和層析分離純化，操作便捷，且純化效率高，同時通過腸激酶切割可釋放出與天然β-NGF氨基酸序列完全一致的，且具有較高生物學(xué)活性的目的蛋白。本發(fā)明通過對人神經(jīng)生長因子β亞基前導(dǎo)肽及成熟肽段基因進(jìn)行原核生物高頻密碼子改造后，在大腸桿菌表達(dá)菌株BL21UDE3)中獲得了 rhi3 NGF的高效表達(dá)。借助前導(dǎo)肽的分子伴侶功能，以包涵體形式表達(dá)的rh β NGF可在體外高效復(fù)性，復(fù)性后的rh β NGF經(jīng)腸激酶切割可釋放出rh β NGF成熟肽，經(jīng)鎳柱親和層析可獲得純度大于99%，生物比活性高于500000AU/mg的重組人神經(jīng)生長因子，該制備方法簡便易行，便于實施。


圖I為IPTG誘導(dǎo)濃度對蛋白表達(dá)影響的SDS-PAGE圖，其中I為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白； 2為BL21空菌；3為未加IPTG的工程菌；4為IPTG濃度O. I mmol/L ；5為IPTG濃度O. 5mmol/L ；6 為 IPTG 濃度 I. O mol/L ；7 為 IPTG 濃度 I. 5 mmol/L ；8 為 IPTG 濃度 2. O mmol/L ;9 為 IPTG 濃度 3. O mmol/L ；10 為 IPTG 濃度 4. O mmol/L ;11 為 IPTG 濃度 5. O mmol/L ；
圖2為誘導(dǎo)時間對蛋白表達(dá)影響的SDS-PAGE圖，其中I為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；2為BL21空菌；3為未加IPTG的工程菌；4為誘導(dǎo)O小時；5為誘導(dǎo)2小時；6為誘導(dǎo)4小時；7為誘導(dǎo)6小時；8為誘導(dǎo)8小時；9為誘導(dǎo)12小時；
圖3為培養(yǎng)液pH值對蛋白表達(dá)影響的SDS-PAGE圖，其中I為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；2為BL21 空菌；3 為未加 IPTG 的工程菌；4 為 pH=5. O ;5 為 pH=5. 5 ;6 為 pH=6. O ;7 為 pH=6. 5 ；8為 ρΗ=7· O ;9 為 ρΗ=7· 5 ;10 為 ρΗ=8· O ；
圖4為本發(fā)明獲得的包涵體蛋白SDS-PAGE圖，其中M為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，包涵體蛋白分子量大小為32kDa ；
圖5為本發(fā)明獲得的包涵體蛋白Western blot圖,其中M為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，包涵體蛋白分子量大小為32kDa ；
圖6為本發(fā)明獲得的復(fù)性后的融合蛋白及經(jīng)腸激酶切割后的目的蛋白SDS-PAGE圖，其中M為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，I泳道為復(fù)性后的融合蛋白，分子量大小為32kDa ；2泳道為經(jīng)腸激酶切割后的目的蛋白，分子量大小為13. 2kDa；
圖7為本發(fā)明獲得純化的目的蛋白SDS-PAGE圖，其中M為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，純化的目的蛋白分子量大小為13. 2kDa ；
圖8為本發(fā)明獲得純化的目的蛋白Western blot圖，其中M為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，純化的目的蛋白分子量大小為13. 2kDa。
具體實施例方式應(yīng)該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。在本說明書中，除非特別指明，否則所用技術(shù)術(shù)語為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員常用術(shù)語；本說明書中未注明具體條件的實驗方法是按常規(guī)實驗方法；本說明書中所用的試驗材料如無特別說明均為市售購買產(chǎn)品，各種試劑和培養(yǎng)基的成分和配制方法可參見常規(guī)實驗手冊中的操作。實施例I :獲得表達(dá)經(jīng)修飾的人神經(jīng)生長因子β亞基的基因工程菌
I.參照原核生物偏愛密碼子表，在不改變氨基酸序列的前提下，對天然人神經(jīng)生長因子β亞基前導(dǎo)肽和成熟肽的堿基序列進(jìn)行了修飾，并在兩序列間設(shè)計了腸激酶切割位點，通過化學(xué)合成的方式合成了該序列(堿基序列如SEQ ID NO :3所示，其表達(dá)的氨基酸序列如 SEQ ID NO 4 所示)
該序列中的堿基形成的密碼子全部為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的高頻密碼子，能在不改變氨基酸序列的前提下，最大限度地提高目的基因的表達(dá)量。序列中5 ’端GGATCC和3 ’端CTCGAG分別為BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶位點，可方便目的基因插入pET28a(+)原核表達(dá)載體。 其中GATGATGATGATAAA為腸激酶切割位點。腸激酶是一種絲氨酸蛋白酶，它能特異性地識別肽鏈中N-Asp- Asp- Asp- Asp-Lys-C五個氨基酸殘基,切割點在Lys的羧基端，因此切割下來的目的蛋白在氨基端無額外氨基酸，從而使目的蛋白的氨基酸序列與天然蛋白完全一致。腸激酶還具有識別特異性強，切割效率高，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點。本發(fā)明中，腸激酶切割位點上游為人神經(jīng)生長因子β亞基前導(dǎo)肽基因序列，該序列在天然β-NGF表達(dá)過程中充當(dāng)了分子伴侶的角色，在β-NGF的翻譯后修飾過程中能幫助成熟肽折疊形成具有生物學(xué)活性的空間構(gòu)象，并能在成熟肽轉(zhuǎn)運至胞外前被切割去除。本發(fā)明在設(shè)計原核表達(dá)的rhi3 NGF基因序列時保留了其前導(dǎo)肽序列，有利于以包涵體形式表達(dá)的融合蛋白在體外形成具有生物學(xué)活性的正確構(gòu)象。同時通過腸激酶的切割可將復(fù)性后的rh β NGF與前導(dǎo)肽準(zhǔn)確分離，從而釋放具有高生物學(xué)活性的rh β NGF。該序列被克隆到pET28a(+)表達(dá)載體多克隆位點區(qū)的BamHI (846)和XhoI (159)位點，利用載體的T7啟動子啟動基因的表達(dá)，起始密碼子ATG位于載體294位，其下游有一載體自帶的6組氨酸純化位點(具體可參見Novagen公司的質(zhì)粒圖譜)。組氨酸能提供配位電子和一些金屬離子如Ni2+螯合，6個組氨酸能使蛋白吸附于含金屬如Ni2+的層析填料上，因此可以利用金屬螯合層析來純化目的蛋白。2. rh PNGF基因工程菌的構(gòu)建
用于構(gòu)建的載體pET28a(+)，宿主菌DH5a和BL21UDE3)均購于Novagen公司，BamHI和XhoI酶購于寶生物工程(大連)有限公司。2. I rh β NGF基因插入pET28a(+)質(zhì)粒將化學(xué)合成的人神經(jīng)生長因子β亞基基因片段用BamHI、XhoI雙酶切后通過Τ4 DNA連接酶連接到同樣經(jīng)酶切的pET28a(+)表達(dá)載體上，構(gòu)建pET28a(+) + [rhβNGF]重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株DH5 α，在含有50μδ/πι1卡那霉素(Kana)的LB培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)篩選重組子，經(jīng)PCR與酶切鑒定正確后，測序驗證其序列正確性。2.2將上述鑒定正確的pET28a(+) + [rhβNGF]重組表達(dá)載體從克隆菌DH5α中提取出來，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 ( λ DE3)感受態(tài)，在含有5(^g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)篩選重組子，此時獲得重組子為rhi3NGF基因工程菌。實施例2 rh β NGF基因工程菌的誘導(dǎo)條件的篩選
將甘油管凍存的重組工程菌按O. 2%接種于新鮮LB抗性培養(yǎng)基(含Kana 5(^g/ml)，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)過夜，活化工程菌。I、IPTG濃度對蛋白表達(dá)的影響將活化的工程菌分別接種于2ml LB抗性培養(yǎng)基(含Kana 5(^g/ml)中，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)至A550=0. 6時加入IPTG，使其終濃度分別為O. I mmol/L、0. 5 mmol/LU. O mmol/L、1.5 mmol/L、2. O mmol/L、3. 0 mmol /1,.4. 0 mmol/L、5. 0 mmol/L,誘導(dǎo)培養(yǎng) 3 小時后離心取沉淀，用O. 5ml,20mmol/L Tris-HCl (pH8. O)重懸菌體，_80°C反復(fù)凍融三次，離心取沉淀用O. Iml蛋白電泳上樣緩沖液重懸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，SDS-PAGE電泳掃描后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，確定目的蛋白占總蛋白的比例。實驗結(jié)果表明(圖1)，IPTG 濃度在 O. I mM、0.5 mMU. O mM、1.5 mM、2. O mM、3. OmM、4. 0 mM、5. 0 mM的條件下， 目的蛋白占總蛋白的比例分別為31. 46%、35. 23%、40. 78%、40. 82%%,41. 33%,40. 95%,41. 25%,40. 66%。說明在 IPTG 濃度小于 I. O mM 時，目的蛋白占總蛋白比例隨IPTG濃度的升高而上升，當(dāng)IPTG濃度大于1.0 mM時，目的蛋白占總蛋白比例不再隨IPTG濃度升高而顯著上升，因此確立I. O mM為誘導(dǎo)的最佳IPTG濃度。2、誘導(dǎo)時間對蛋白表達(dá)的影響
將活化的工程菌接種于IOml LB抗性培養(yǎng)基(含Kana 5(^g/ml)，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)至A550=0. 6時加入I. O mM IPTG，分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)的O小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時取Iml菌液,離心取沉淀,用O. 5ml, 20mmoI /L Tris-HCl (pH8. O)重懸菌體，_80°C反復(fù)凍融三次，離心取沉淀用O. Iml蛋白電泳上樣緩沖液重懸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，SDS-PAGE電泳掃描后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，確定目的蛋白占總蛋白的比例。實驗結(jié)果表明(圖2)，誘導(dǎo)時間O小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時的條件下，目的蛋白占總蛋白的比例分別為I. 25%,36. 74%,39. 87%,38. 62%,37. 55%,33. 33%。說明誘導(dǎo)時間為4小時左右，目的蛋白占總蛋白比例最高，因此確立3. 5小時為最佳誘導(dǎo)時間。3、培養(yǎng)液pH值對蛋白表達(dá)的影響
在 pH 分別為 5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. O 的 2ml LB 抗性培養(yǎng)基(含 Kana 50μδ/ml)中接種活化的工程菌，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)至A550=0. 6時加入1.0 mM IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)3. 5小時后離心取沉淀，用O. 5ml,20mmol/L Tris-HCl (pH8. O)重懸菌體，_80°C反復(fù)凍融三次，離心取沉淀用O. Iml蛋白電泳上樣緩沖液重懸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，SDS-PAGE電泳掃描后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，確定目的蛋白占總蛋白的比例。實驗結(jié)果表明(圖3)，pH值分別為5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. O的條件下，目的蛋白占總蛋白的比例分別為 12. 5%,20. 36%,25. 78%,34. 33%,39. 49%,32. 61%,31. 55%。在pH值小于7. O時，目的蛋白占總蛋白比例隨pH升高而上升，當(dāng)pH值大于7. O時，目的蛋白占總蛋白比例隨PH值升高而降低，因此確立pH 7. O為誘導(dǎo)的最佳pH值。實施例3 rh β NGF基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及包涵體的分離純化
1.挑取單克隆基因工程菌落接種于50mLLB液體培養(yǎng)基，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)14h ;
2.將上述菌液種于3L液體LB培養(yǎng)基中，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)至A550=0.6時(約3h)，根據(jù)對誘導(dǎo)條件的摸索結(jié)果(如圖I、圖2、圖3)，加入終濃度為ImM的IPTG，維持培養(yǎng)基pH值7. 0，37 °C誘導(dǎo)3. 5小時；
3.離心(4°C,8000rpm,IOmin),收集菌體，按每克菌體濕重20ml的比例加入20mMTris-HCl (pH=8. O)裂解緩沖液重懸，于-20° C凍存；
4.37°C溶解菌體懸液，進(jìn)行超聲裂菌，功率400W，超聲15秒，間隔15秒，作用30分鐘。
5.離心(4°C，12000rpm, IOmin)，收集沉淀，用含有 1% TritonX-IOO 的 Tris-HCl洗漆液洗漆二次；
6.用含有2M尿素的Tris-HCl洗滌液洗滌一次；
7.離心(4°C，12000rpm，IOmin)，收集沉淀(為包涵體蛋白)，用含有8M尿素的溶解液溶解，于_80°C保存，并取樣進(jìn)行S·DS-PAGE電泳純度分析和免疫印跡鑒定(Western Blot)。實驗結(jié)果表明，包涵體蛋白純度大于95%(圖4);經(jīng)Western blot鑒定為人神經(jīng)生長因子(圖5)。實施例4 :h β NGF融合蛋白的復(fù)性條件的摸索
rh β NGF融合蛋白的復(fù)性采用體外稀釋復(fù)性法。在rh β NGF包涵體蛋白溶液中緩慢滴加復(fù)性緩沖液(流速I. 66ml/min)，復(fù)性溫度為10°C，復(fù)性緩沖液的精氨酸濃度和pH以及復(fù)性時間對復(fù)性效率有一定影響。I、精氨酸濃度對復(fù)性效率的影響
配制精氨酸濃度分別為O. 65mM、0. 75 mM、0. 85 mM、0. 95 mMU. 05 mM的復(fù)性緩沖液，pH值為9. 5 ;氧化還原體系為還原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽(GSH-GSSG)系統(tǒng)，GSSG濃度為O. 5mM, GSH濃度為5mM，10°C，復(fù)性3小時，離心取上清液，用Lowry法測定蛋白濃度，計算蛋白總量，用該蛋白總量與加入復(fù)性體系的包涵體蛋白總量的比值表示復(fù)性率。實驗結(jié)果顯示，精氨酸濃度為O. 65mM、0. 75 mM、0. 85 mM、0. 95 mMU. 05 mM時蛋白復(fù)性率分別為31. 36%,40. 58%,35. 12%,34. 98%,33. 71%。說明在精氨酸濃度為O. 75 mM時，復(fù)性率最高，因此確立復(fù)性緩沖液中精氨酸濃度O. 75mM為最佳濃度。 2、復(fù)性緩沖體系pH值對復(fù)性效率的影響
配制PH值分別為8. 0,8. 5,9. 0,9. 5、10. O的復(fù)性緩沖液，精氨酸濃度為O. 75 mM ;氧化還原體系為還原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽(GSH-GSSG)系統(tǒng)，GSSG濃度為O. 5mM, GSH濃度為5mM，10°C，復(fù)性3小時，離心取上清液，用Lowry法測定蛋白濃度，計算蛋白總量，用該蛋白總量與加入復(fù)性體系的包涵體蛋白總量的比值表示復(fù)性率。實驗結(jié)果顯示，pH值分別為8. O、8. 5、9. O、9. 5、10. O時蛋白復(fù)性率分別為33. 67%、36. 88%,38. 32%,40. 53%,31. 64%。在pH值為9. 5時，復(fù)性率最高，因此確立pH 9. 5為最佳復(fù)性緩沖液PH值。3、復(fù)性時間對復(fù)性效率的影響
在精氨酸濃度為O. 75 mM，pH值為9. 5，氧化還原體系為還原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽(GSH-GSSG)系統(tǒng)，GSSG濃度為O. 5mM，GSH濃度為5mM，10°C條件下進(jìn)行復(fù)性，分別于復(fù)性I小時、3小時、5小時、7小時、9小時取樣離心收集上清，用Lowry法測定蛋白濃度，計算蛋白總量，用該蛋白總量與加入復(fù)性體系的包涵體蛋白總量的比值表示復(fù)性率。實驗結(jié)果顯示，復(fù)性時間分別為I小時、3小時、5小時、7小時、9小時時蛋白復(fù)性率分別為12. 67%,40. 74%,39. 32%,40. 21%,38. 25%。在復(fù)性時間大于3小時后，隨復(fù)性時間的延長，復(fù)性率沒有明顯提高，因此確立3小時為最佳復(fù)性時間。實施例5 h β NGF融合蛋白的復(fù)性與腸激酶切割
rh^NGF融合蛋白的復(fù)性采用體外稀釋復(fù)性法，使用的復(fù)性緩沖液中精氨酸濃度為
O.75mM, pH值為9. 5 ;氧化還原體系為還原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽(GSH-GSSG)系統(tǒng)，GSSG濃度為O. 5mM, GSH濃度為5mM ;復(fù)性時將復(fù)性緩沖液緩慢滴加入包涵體溶液中(I. 66ml/min)，復(fù)性溫度為10°C，復(fù)性時間為3小時；
2.收集復(fù)性蛋白溶液，于4°C用50mM Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液透析24小時，每8小時更換一次透析液；
3.收集透析后蛋白溶液，用截留分子量為5kDa的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮；
4.按lU/5(^g的比例用腸激酶切割上述復(fù)性的融合蛋白，酶切溫度21°C，酶切時間16小時。同時取酶切前后的樣品，采用SDS-PAGE電泳檢測。檢測結(jié)果表明(圖6)，按上述條件復(fù)性的蛋白經(jīng)腸激酶切割后可釋放出分子量大小為13. 2kDa的目的蛋白。
實施例6 rh β NGF的親和層析分離純化及生物學(xué)活性檢測
以 50 mM 咪唑-0.5MNaCl-20mMTris-HCl(pH8.0)的緩沖液平衡 Ni Sepharose FastFlow層析柱，上樣過程中收集流穿峰，其為含rh β NGF的組分，經(jīng)透析和超濾濃縮得到純化的rh^NGF。取樣，采用還原性SDS-PAGE電泳檢測純度，并進(jìn)行免疫印跡(Western blot)鑒定；同時采用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法檢測生物活性。實驗結(jié)果表明，制備的rh β NGF經(jīng)還原性SDS-PAGE電泳檢測為單一條帶，其純度達(dá)99%以上(圖7);經(jīng)抗人神經(jīng)生長因子單克隆抗體Western blot鑒定其為人神經(jīng)生長因子(圖8);以中國藥品生物制品檢定所分發(fā)的鼠頜下腺神經(jīng)生長因子參考品為參照，采用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法檢測該樣品生物活性，結(jié)果顯示比活性高于500000AU/mg。以上所述，僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)中的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的核心技術(shù)特征的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些潤飾和改進(jìn)也應(yīng)屬于本發(fā)明的專利保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種重組人神經(jīng)生長因子β亞基基因，其含有6組氨酸純化位點、腸激酶切割位點以及經(jīng)過修飾的人神經(jīng)生長因子β亞基成熟肽段基因和分子伴侶基因，其中所述人神經(jīng)生長因子β亞基成熟肽段基因為經(jīng)過原核生物高頻密碼子改造后的基因，其堿基序列如SEQ ID NO :1所示；所述分子伴侶基因為經(jīng)過修飾的人神經(jīng)生長因子β亞基前導(dǎo)肽基因，其喊基序列如SEQ ID NO 2所不。
2.一種利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備重組人神經(jīng)生長因子的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)利用化學(xué)合成法合成經(jīng)點突變優(yōu)化的權(quán)利要求I所述的人神經(jīng)生長因子β亞基成熟肽段基因及分子伴侶基因，并將其克隆入ΡΕΤ28 a (+)表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體； (2)將步驟(I)所得重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21UDE3)中，構(gòu)建含有重組表達(dá)載體的基因工程菌； (3)培養(yǎng)步驟(2)所得基因工程菌至A550=0.6時，加入誘導(dǎo)劑IPTG，誘導(dǎo)重組人神經(jīng)生長因子rh β NGF在該基因工程菌中表達(dá)； (4)離心收集菌體，重懸菌體，_80°C凍存； (5)解凍菌體重懸液，破碎菌體，分離純化包涵體蛋白； (6)體外復(fù)性包涵體蛋白，透析后超濾濃縮； (7)經(jīng)腸激酶切割去除分子伴侶； (8)純化獲得所述重組人神經(jīng)生長因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述步驟(3)中誘導(dǎo)的時間為3-4小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述步驟(3)中誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為lmmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述步驟(4)中所用的重懸液為20mMTris-HCl(pH8. O)，使用量為菌體濕重的20倍體積。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述步驟(5)中破碎菌體的方法為超聲破碎法，其中超聲破碎菌體所用功率為400W，超聲15秒，間隔15秒，作用30分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述步驟￠)中復(fù)性包涵體蛋白的方法為體外稀釋復(fù)性法，其中體外稀釋復(fù)性液中，精氨酸的濃度范圍是O. 75-1. OmmoI/L, pH值是8. O-9. 5 ο
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述步驟(J)中的腸激酶為帶6組氨酸純化位點的重組牛腸激酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述步驟(8)中純化的方法為鎳柱親和層析法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備重組人神經(jīng)生長因子的方法。該重組人神經(jīng)生長因子β亞基基因含有6組氨酸純化位點、腸激酶切割位點以及經(jīng)過修飾的人神經(jīng)生長因子β亞基成熟肽段基因及分子伴侶基因。該重組人神經(jīng)生長因子β亞基基因在大腸桿菌中表達(dá)量高；所產(chǎn)生的包涵體蛋白在分子伴侶的輔助下高效復(fù)性；用腸激酶準(zhǔn)確切割分子伴侶后，經(jīng)鎳柱親和層析獲得的重組人神經(jīng)生長因子純度大于99%，生物學(xué)活性大于500000AU/mg。
文檔編號C12N15/70GK102839182SQ201210278039
公開日2012年12月26日 申請日期2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月7日
發(fā)明者李佳楠, 湯華東, 陳亞, 李汝霖, 陳煌 申請人:武漢海特生物制藥股份有限公司