專利名稱：一種真菌發(fā)酵生產(chǎn)恩鐮孢菌素類化合物的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體公開了一種固體發(fā)酵生產(chǎn)恩鐮孢菌素類化合物(Enniatins)的工藝。
背景技術：
恩鐮孢菌素類化合物(Enniatins)是一類非典型的環(huán)肽化合物，結構頗為奇特，分子有3個D-2-羥基異戊酸(HylV)和3個N-甲基氨基酸交替地連接構成十八元環(huán)肽骨架，已報道的這類化合物大都是在Fasarium屬真菌中找到，迄今為止人們發(fā)現(xiàn)了約10個這類化合物(其中EnniatinA，Al，Bl，B比較常見，其它還有Enniatin B2、B3、B4、E、F、G等)。[參見Tetrahedron 59(2003) :1015-1020]·
恩鐮孢菌素類化合物(Enniatins)具有以下通式EnniatinA, Al, BI, B四種化合物中Rl、R2、R3的取代基分別為
ElR2RB
EnniatinA= -CH(CH3)CH2CH3 -CH(CH3)CH2CH3 -CH(CH3)CH2CH3
EnnIatinAi= -CH(CH3)CH2CH3 -CH(CH3)CH2CH3 -CH(CH3)2 EnniatinBl= -CH(CH3)2-CH(CH3)2-CH(CH3)CH2CH3
EnniatinB = ~CH(CH3)2柳 CH(CH3)2響 CH(CH3)2Enniatins類化合物有很好的抗菌、殺蟲、植物毒素活性和膽固醇?；D移酶(ACAT)抑制作用，近幾年這一類化合物的抗HIV和選擇性抗腫瘤活性都得到了很多的關注。[參見Toxicon 56(2010) :418-424]關于enniatins類抗生素的作用機制，目前認為enniatins是一類離子傳導劑,能形成一價離子的“Sandiwich”絡合物，穿過細胞膜，尤其是線粒體膜，阻斷呼吸鏈上的氧化磷酸化反應。P. Zavge等認為十八元環(huán)狀的骨架與一價離子的絡合物的親和カ是其支鏈骨架的100倍。它們的抗菌活性則是來源于這類物質對ー價鉀離子或鈉離子的高度選擇性絡
ム
ロ o1992年Tomoda等發(fā)現(xiàn)enniains有抑制脂酰輔酶A :膽固醇脂酰轉移酶(Acyl-CoA cho lestero lacy I transferase ACAT)的活性，IC5tl = 22 110 U M。ACAT 在生物體內催化膽固醇3位羥基，由長鏈脂酰CoA將?；鶎肷赡懝檀伎?，在膽固醇代謝過程中起著重要作用；因此ACAT被認為是降低膽固醇和防治動脈硬化藥物的靶酶。1997年，MaKee等發(fā)現(xiàn)enniatins有抗HIV病毒的作用，體外試驗顯示enniains B,B1和Al混合物的 anti_HIVEC50 = 0. 01 u g -mじ1, IC50 = I. 9 u g -mじ1,其中 enniain B 的 anti-HIV EC50 =·0.16 u M, IC50 = 0. 78 u M0Enniain G是林永成等從海洋真菌Halosarpheia sp.培養(yǎng)液中分離到的ー個新化合物，據(jù)初步的藥理實驗表明，新化合物enniain G具有抗肝癌Heps7402活性，ED5tl = 12 ii g mじ1。Dometshuber R.等報道了 enniains發(fā)揮p53依賴性抑制細胞生長，對人體的癌細胞和P53依賴的細胞毒活性[參見Toxicon 56(2010) :418-424]。目前國內外極少有關于enniatins生產(chǎn)的報道，僅有少量產(chǎn)品在實驗室條件下獲得，且主要是通過微生物菌種發(fā)酵產(chǎn)生，但是發(fā)酵水平普遍不高(0. lg/kg培養(yǎng)基)，而且沒有提取純化工藝方面的報道[參見J Agric Food Chem 40(1992) : 1976-1982]。因此提供ー種新的制備enniatins的方法是非常必要的。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了ー種利用錸孢菌屬(Fusarium)真菌固體發(fā)酵生產(chǎn)恩錸孢菌素類化合物(Enniatins)的生產(chǎn)エ藝。本發(fā)明共涉及三方面的內容，即固體發(fā)酵培養(yǎng)、提取エ藝和純化工藝。(I)固體發(fā)酵培養(yǎng)菌種錸孢菌屬產(chǎn)恩錸孢菌素類化合物的任何真菌；培養(yǎng)基組成0 5重量份的氨基酸或蛋白胨、100 2000重量份的水、1000重量份的豆類，PH值為4 8。接種量按質量百分比，將生長好的菌種按1% 20%的比例接種；發(fā)酵培養(yǎng)條件于16 32°C,光照培養(yǎng)或暗培養(yǎng)或明暗交替培養(yǎng),培養(yǎng)周期為4 24天。(2)提取エ藝采用I 30倍體積的有機溶劑提取，收集溶劑部分；回收溶劑后的干膏備用；將上述干膏溶散到體積比為20% 80%醇/水中，以0. 5 20倍體積的正已烷萃取，收集正已烷部位，回收溶劑，干燥備用；(3)純化工藝以適當?shù)娜軇┤芙馍鲜鎏崛∥锖?，采用無機基質為填料的色譜柱，以合適的流動相沖柱，收集高純度的恩錸孢菌素洗脫部分，干燥后即可得到高純度的恩錸孢菌素類化合物干粉。本發(fā)明的優(yōu)點只需豆類、氨基酸或蛋白胨等簡單培養(yǎng)基，繁殖周期4 24天，最終恩錸孢菌素類化合物的濃度可達2. Og/kg培養(yǎng)基，比當前文獻報道的產(chǎn)率提高了近20倍，因此，具有成本低，繁埴周期短，提純エ藝簡單等優(yōu)點[參見JAgric Food Chem40(1992) :1976-1982]。


圖I本發(fā)明所獲得的恩錸孢菌素化合物的ESI-MS圖譜(示EnniainA，Al，Bl，B)；圖2本發(fā)明所獲得Enniain B的1H-NMR譜；圖3本發(fā)明所獲得的Enniain B的13C-NMR譜；圖4本發(fā)明所獲得的Enniain B的1H-1HCOSY譜；圖5本發(fā)明所獲得的Enniain BI的1H-NMR譜；圖6本發(fā)明所獲得的Enniain BI的13C-NMR譜；圖7本發(fā)明所獲得的Enniain BI的1H-1HCOSY譜；圖8本發(fā)明所獲得的Enniatin Al的1H-NMR譜；圖9本發(fā)明所獲得的Enniatin Al的13C-NMR譜；圖10本發(fā)明所獲得的Enniatin Al的1H-1HC0SY譜；圖11本發(fā)明所獲得的Enniatin A的1H-NMR譜；圖12本發(fā)明所獲得的Enniatin A的13C-NMR譜；圖13本發(fā)明所獲得的Enniatin A的1H-1HC0SY譜。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進ー步的說明，但本發(fā)明的技術方案并不限于如下實施例。實施例I錸孢菌屬真菌三線錸刀菌(Fusarfumtricinctum)的純化三線錸刀菌(Fusarfumtricinctum)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌株保藏編號:CCTCC AF 93240菌種的純化采用劃線平板法，將保藏的原始菌種斜面用接種針接種到新鮮PDA平板上，在28°C下培養(yǎng)5-7d，挑出與記載中菌株表觀特征描述相符的單菌落，傳入兩支PDA斜面，一支用于發(fā)酵培養(yǎng)和樣品初篩，另ー支用于菌種的冷凍保藏。菌株特征在PDA培養(yǎng)基上，菌落乳白色，邊緣整齊，兩周后直徑達到9cm，氣生菌絲不發(fā)達，短絨狀，菌絲淺色，分枝，偶有隔，光滑。分生孢子梗淺色，直立，無隔，偶瓶梗狀，頂端鋭，簡單，側生，少有分枝，分生孢子頂生。分生孢子大小兩型，大分生孢子淺色，光滑，彎曲，3-4隔有時分隔不清，有足細胞，24-35. 5 X 3. 5-4. 5 u m,小分生孢子淺色，不成鏈，光滑，0-1隔，梨形或棍棒形，4.5-13.5X1.5-3i!m。厚垣孢子淺色，球形，單生或成串，直徑11. 5-13. 5 u nio符合三線錸刀菌(Fusarfumtricinctum)的菌株特征與特性。實施例2 250mL三角瓶的固體發(fā)酵三線錸刀菌(Fusarfumtricinctum)接種于斜面培養(yǎng)基上,25°C下培養(yǎng)5天。接著，斜面菌種接種于含IOOg大豆培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，靜止避光，25°C下培養(yǎng)10天。各種培養(yǎng)基配方如下斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10，蛋白胨5，牛肉膏3，酵母膏l(xiāng)，pH7.0。大豆培養(yǎng)基大豆(soybean) 100g，加水lOOmL，靜置4小時后，115°C滅菌30min。實施例330L固態(tài)發(fā)酵
生產(chǎn)
以三線錸刀菌(Fusarfumtricinctum)為出發(fā)菌株,菌種來源及斜面培養(yǎng)方式同實施例I。發(fā)酵參數(shù)發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為白豆(white bean) 10kg、水10L，發(fā)酵罐內直接通入蒸汽，輔助以特殊攪拌系統(tǒng)，達到在位高溫滅菌的目的。接種量10%，攪拌均勻后，25°C發(fā)酵培養(yǎng)，罐壓0. 05MPa,通氣量0. 6 I. 2vvm,發(fā)酵時間8天。實施例4恩錸孢菌素類化合物的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)以三線錸刀菌(Fusarfumtricinctum)為出發(fā)菌株,菌種來源及斜面培養(yǎng)方式同實施例I。發(fā)酵參數(shù)發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為白豆(white bean) 10kg、水8L，發(fā)酵罐內直接通入蒸汽，輔助以特殊攪拌系統(tǒng)，達到在位高溫滅菌的目的；待溫度達25°C吋，加入氨基酸適
量，攪拌均勻后，按10%接入菌株，攪拌均勻，25°C發(fā)酵培養(yǎng)，罐壓0. 05MPa，通氣量0. 6
I.2vvm,發(fā)酵時間8天。所說的氨基酸是L_纈氨酸(L-valine)、L-亮氨酸(L-leucine)或/和L-異亮氨酸(L-isoleucine),加入前以水溶解,并經(jīng)0. 2 y m孔徑的濾膜過濾。實施例5恩錸孢菌素類化合物的提取純化以10倍體積的こ酸こ酯分2次振蕩提取實施例I或實施例2的發(fā)酵物，減壓回收后，將干膏以10倍體積的こ醇水=I I溶解分散后，以20倍體積的正已烷分2次液-液萃取，合并正已烷萃取液，回收溶剤，即得灰白色粉末狀粗提物(恩錸孢菌素類化合物粗品)。將上述粗品，以甲醇按體積比I : I溶解，過RP-18反相色譜柱，以甲醇/水沖柱洗脫，分段收集，真空干燥或冷凍干燥，獲得類白色粉末(恩錸孢菌素類化合物干粉)。實施例6恩錸孢菌素類化合物的純化取實施4之恩錸孢菌素類化合物粗品，以甲醇按體積比I : I溶解，過半制備高效液相色譜柱，以70-80%甲醇/水沖柱洗脫，分段收集，真空干燥或冷凍干燥，獲得類白色粉末(恩錸孢菌素類化合物干粉)。所獲得的恩錸孢菌素類化合物中，EnniatinB約占43%, EnniatinBl約為37%,EnniatinAl 約占 12% , EnniatinA 約占 7% (W/W)。實施例7恩錸孢菌素類化合物(EnniatinA, Al, BI, B)的結構表征應用質譜、一維和ニ維核磁譜等對本發(fā)明所獲得的恩錸孢菌素類化合物的結構進行表征，并與文獻報道的數(shù)據(jù)進行比對[參見J Agric Food Chem 40(1992) =1976-1982],確證本發(fā)明所獲得的4個主要恩錸孢菌素類化合物為EnniatinA，Al，BI, B，本發(fā)明所獲得的恩錸孢菌素化合物(EnniatinA, Al, BI, B)的質譜圖見圖I ;本發(fā)明所獲得的Enniatin B的 1H-NMR, 13C-NMR, il^HCOSY 譜見圖 2-4 ;本發(fā)明所獲得的 Enniatin BI 的 1H-NMR, 13C-NMR,1H-1HCOSY 譜見圖 5-7 ;本發(fā)明所獲得的 EnniatinAl 的 1H-NMR, 13C-NMR, 1H-1HCOSY 譜見圖8-10 ;本發(fā)明所獲得的 EnniatinA 的 1H-NMR, 13C-NMR, 1H-1HCOSY 譜見圖 11-13。
權利要求
1.一種利用鐮孢菌屬(Fusarium)真菌固體發(fā)酵生產(chǎn)恩鐮孢菌素類化合物(Enniatins)的方法,包括以下步驟 步驟一固體發(fā)酵培養(yǎng) 菌種鐮孢菌屬產(chǎn)恩鐮孢菌素類化合物的真菌(可以是從其寄主中分離純化得到，也可以從菌種保藏中心等機構獲得)； 培養(yǎng)基組成0 5重量份的蛋白胨、500 1500重量份的水、1000重量份的大豆，PH值為5 8 ; 接種量將生長好的菌種按質量百分比1% 20%的比例接種； 普通發(fā)酵培養(yǎng)條件于16 32°C，光照培養(yǎng)或暗培養(yǎng)或明暗交替培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為4 24天； 發(fā)酵罐中的條件罐壓O. 05MPa，通氣量O. 6 I. 2vvm，發(fā)酵時間5_10天； 步驟二 目標產(chǎn)物的分離純化 發(fā)酵物的預處理采用I 30倍體積的乙酸乙酯提取，收集溶劑部分；回收溶劑后得干膏； 分離工藝將所得干膏溶散到體積比為20% 80%醇/水中，以O. 5 20倍體積的正已烷萃取，收集正已烷部位，回收溶劑，經(jīng)干燥得灰白色粉末狀粗提物； 純化工藝以適當?shù)娜軇┤芙馍鲜龃痔嵛?，采用無機基質為填料的色譜柱，以反相流動相沖柱，收集恩鐮孢菌素洗脫部分，干燥后即得到恩鐮孢菌素類化合物干粉。
2.根據(jù)權利要求I所述的利用鐮孢菌屬(Fusarium)真菌固體發(fā)酵生產(chǎn)恩鐮孢菌素類化合物(Enniatins)的方法，其特征在于，培養(yǎng)基組成中的大豆可以是其它豆類或豆類的加工品，蛋白胨也可以替換為氨基酸。
3.如權利要求I所述的利用鐮孢菌屬(Fusarium)真菌固體發(fā)酵生產(chǎn)恩鐮孢菌素類化合物(Enniatins)的方法，其特征在于，在分離工藝中，是將所得干膏溶散到醇/水(體積比I 1)中。
4.如權利要求I所述的利用鐮孢菌屬(Fusarium)真菌固體發(fā)酵生產(chǎn)恩鐮孢菌素類化合物(Enniatins)的方法,其特征在于,所述的無機基質為填料的色譜柱是反相色譜柱。
5.根據(jù)權利要求I所述的利用鐮孢菌屬(Fusarium)真菌固體發(fā)酵生產(chǎn)恩鐮孢菌素類化合物(Enn i at ins )的方法,其特征在于,所述的鐮孢菌屬產(chǎn)恩鐮孢菌素類化合物的真菌是鐮孢菌屬真菌三線鐮刀菌(Fusarfumtricinctum)。
6.根據(jù)權利要求5所述的利用鐮孢菌屬(Fusarium)真菌固體發(fā)酵生產(chǎn)恩鐮孢菌素類化合物(Enniatins)的方法,其特征在于,所述的三線鐮刀菌(Fusarfumtricinctum)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其菌株保藏編號為CCTCCAF 93240。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體公開了一種固體發(fā)酵生產(chǎn)恩鐮孢菌素類化合物(Enniatins)的工藝。該方法以鐮孢菌屬(Fusarium)真菌為出發(fā)菌株，主要涉及發(fā)酵培養(yǎng)基的新配方、發(fā)酵條件控制及分離純化工藝等步驟。通過本發(fā)明所述的方法，恩鐮孢菌素類化合物在前期對數(shù)生長期內(10天)能迅速地獲得目的產(chǎn)物，最終恩鐮孢菌素類化合物的濃度可達2.0g／lkg培養(yǎng)基，具有極高的發(fā)酵效價；提取純化工藝簡單，質量可控，樣品穩(wěn)定好，通用性強，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P17/14GK102787148SQ20121027794
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月7日 優(yōu)先權日2012年8月7日
發(fā)明者張勇慧, 汪建平 申請人:華中科技大學