專利名稱：微生物催化法制備2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及菌株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種微生物催化法制備2-氨基-2，3-ニ甲基丁酰胺的方法，以及在生產過程中用到的新菌株。
(ニ)
背景技術：
2-氨基-2，3-ニ甲基丁酰胺,英文名 2-amino_2，3_dimethylbutyamide,外觀為白色片狀晶體，熔點為84°C，能溶于水和大多數有機溶剤。是咪唑啉酮類超高效除草劑如咪唑 こ煙酸、咪唑喹啉酸和甲氧咪草煙等的通用中間體，市場需求廣闊。其中味唑こ煙酸和咪唑喹啉酸曾占據美國大豆除草劑市場主導地位達10年之久；而我國自從1990年大批量進ロ咪唑こ煙酸并在黑龍江省大面積應用以來，用量持續(xù)增加。特別是在國內該除草劑產品問世以后，由于其價格低廉，除草效果良好，故而被大范圍使用，成為黑龍江與內蒙古地區(qū)大豆田除草劑的主導品種。2-氨基-2，3-ニ甲基丁酰胺目前主要通過化學法生產。其生產過程可分為兩個部分3_甲基-2-丁酮通過斯特雷克(Strecker)反應得到氨基腈，后者在酸或堿催化下水解
得到產物(見下式)。
NH2NH2O
NaCN 卜H2S°4 ‘ /T^axNH2
NH4ClNH4OH孫曉紅等(西北大學學報，1994，24 (3) :227_234)報道了該氨基腈的合成方法，先將氯化銨溶于水后，加入氰化鈉和氨水，攪拌均勻后，加少量芐基三こ基氯化銨，滴加甲基異丙基甲酮，攪拌回流4飛小時，用ニ氯甲烷提純后，得無色透明液體，純度為95%，收率為90%。Peter J.等(US 6339158)報道了由2_氨基_2，3_ ニ甲基丁腈制備2_氨基-2，3- ニ甲基酰胺的方法，首先加入29. 7ml濃硫酸，慢慢加入11. 8g2_氨基-2，3- ニ甲基丁腈，保證反應體系溫度不超過25°C，加熱至100°C并在該溫度下反應lh，反應結束后冷卻，加入85ml濃氨水，過程中控制體系溫度不超過75°C，然后用ニ氯甲烷萃取、結晶，最終得到11. 2g2-氨基-2，3-ニ甲基酰胺，收率為81.7%。呂曉東等(遼寧化工，2001，30 (10)455-456)報道將2-氨基-2，3- ニ甲基丁腈在一定的溫度下滴加入95%的濃硫酸中，升溫，反應數小吋。反應完畢后，冷卻至室溫，滴加濃氨水中和至弱堿性，加萃取劑，攪拌一定時間，過濾，濾出物用萃取劑洗滌，并將洗液合并入濾液。濾液相分離，有機層蒸出萃取劑，釜底物加入石油醚，冷凍結晶，濾出的固體干燥后得到2-氨基-2，3-ニ甲基酰胺，最終收率為95%，產物純度達到96%。由上可知，化學法生產2-氨基-2，3-ニ甲基酰胺的主要缺點是反應需要高溫、強酸等條件，能耗原料消耗高，產品易受副產物污染，提純步驟繁瑣，周期長，收率低，產生大量含腈污水，不符合環(huán)保要求等。腈水合酶(Nitrile Hydratase)是ー種在自然界中廣泛存在的微生物酶，它可催化多種腈化合物水解生成酰胺。微生物腈水合酶可廣泛地應用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。1980 年，Asano 等(Agricultural and Biological Chemistry,1982,46(5) :1183-1189)首次發(fā)現微生物 Rhodocococcus sp. N-774 可降解有毒的 ZJ青，不久即被成功地應用于エ業(yè)生產丙烯酰胺。近年來，腈水合酶也被用于制備手性藥物，如Gilligan 等(Applied Microbiology and Biotechnology, 1993, 39:720-725)成功地用Rhodocococcus equi TG328腈水合酶和酰胺酶催化外消旋2_苯基丙腈立體選擇性水解,生成了非留體類抗炎藥S-(+)_2-苯基丙酸?，F有的研究表明，腈水合酶催化的反應具有高選擇性、高效性、條件溫和、環(huán)境污染小、成本低、產物光學純度高等優(yōu)點，符合原子經濟和綠色化學的發(fā)展方向，有著化學方法無可比擬的優(yōu)越性，從而促進了精細化工產品和手性藥 物的研制和開發(fā)。因此利用腈水合酶的高效性、高選擇性和反應條件溫和等特點來催化生產2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺，將可以提高產率和產品質量、降低生產成本和減小環(huán)境污染。據報道，a -氨基腈在水溶液中極不穩(wěn)定，容易自發(fā)水解生產HCN和酮(醛)等物質(Engineering in Life Sciences, 2004. 4:547-556)。這些副產物特別是 HCN 是臆水合酶的強烈抑制劑，它通過與腈水合酶活性中心的金屬離子Fe2+或Co2+絡合而使腈水合酶失活。Nagasawa 等(European Journal of Biochemistry, 1991. 196:581-589)報道，作為生產丙烯酰胺的高效催化劑Rhodococcus rhodochrous Jl生產的腈水合酶,在氰離子濃度為0. OlmM時即酶活損失62%。因此篩選得到耐受氰離子的腈水合酶，將有利于實現連續(xù)化生產2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺，提高產物濃度。

發(fā)明內容
為克服上述化學合成法的缺陷，本發(fā)明提供了ー種微生物催化水合2-氨基-2，3- ニ甲基丁腈制備2-氨基-2，3- ニ甲基酰胺(ADBA)的方法，及制備過程中所用的新菌株。本發(fā)明采用的技術方案是ー種微生物催化法制備2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺的方法，所述方法包括在以2-氨基-2，3_ ニ甲基丁腈為底物，以慶筌紅球菌(Rhodococcus qingshengii) CCTCC No:M2010050發(fā)酵產生的腈水合酶為催化劑的反應體系中，于pH6. (TlO. 0、2(T40°C下進行催化水合反應，制得所述的2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺。所述腈水合酶存在于菌體細胞中，具體制備時，可直接將發(fā)酵獲得的含菌體細胞的發(fā)酵液作為催化劑參與反應，也可以將菌體細胞分離后，作為催化劑參與反應，所述腈水合酶用于催化2-氨基-2，3- ニ甲基丁腈制備2-氨基-2，3- ニ甲基酰胺的反應原理如下列
反應式所示
權利要求
1.ー種微生物催化法制備2-氨基-2，3-ニ甲基丁酰胺的方法，所述方法包括在以2-氨基-2，3_ ニ甲基丁腈為底物，以慶筌紅球菌(Rhodococcus qingshengii) CCTCC No:M2010050發(fā)酵產生的腈水合酶為催化劑的反應體系中，于pH6. (TlO. 0、2(T40°C下進行催化水合反應，制得所述的2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述反應在水或pH6.(TlO. O的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中進行。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述反應體系中底物初始濃度為0.03、. 3M。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述腈水合酶來自慶笙紅球菌CCTCCNo:M2010050經發(fā)酵獲得的含酶菌體細胞，所述含酶菌體細胞在反應體系中添加量以含酶細胞濕重計為5 50g/L。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述含酶菌體細胞由如下方法制備得到 (1)將經斜面活化的慶笙紅球菌CCTCCNo :M2010050接入種子培養(yǎng)基中，于2(T40°C下培養(yǎng)24 48h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖5 20. Og/L，酵母浸出粉 2 8. Og/L，蛋白胨 I 4. Og/L, KH2PO4O. 5 I. 5g/L, K2HPO4O. 5 I. 5g/L, NaClO. 5 3. Og/L,己內酰胺 0. 5 2. Og/L, MgSO4O. 05 0. 2g/L, CoCl2O. 01 0. 05g/L, FeSO4O. 01 0. 05g/L,溶劑為水，pH6. 0 8. 0 ； (2)將種子液以1 10%體積比接入產酶培養(yǎng)基中，于2(T40°C下培養(yǎng)48 96h，培養(yǎng)得到的發(fā)酵液經離心或膜分離，得所述含酶菌體細胞；所述產酶培養(yǎng)基終濃度組成如下蔗糖5. (TlO. 0g/L,檸檬酸鈉2. 0 5. 0g/L,牛肉膏2. 0 8. 0g/L,酵母粉2. 0 8. 0g/L,氯化鈉0. 5 2. 0g/L,磷酸ニ氫鉀0. 5 2. 5g/L，氯化鈷0. 005 0. 01g/L,氯化鐵0. 005 0. 01g/L,氯化錳0. 005 0. 01g/L，誘導劑I. 0 3. 0g/L，溶劑為水，pH6. 0 8. 0 ;所述誘導劑為下列之一:谷氨酸鈉、2，2-ニ甲基環(huán)丙甲酰胺、己內酰胺、丙烯酰胺、こ酰胺或尿素。
6.如權利要求4或5所述的方法，其特征在于所述方法如下將所述含酶菌體細胞用生理鹽水洗滌后，懸浮于水或pH6. (TlO. 0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中，加入底物2-氨基-2，3-ニ甲基丁腈至底物濃度為0. 03^0. 3M，于15 40°C、10(T200rpm下反應l(T60min ;反應結束后，轉化液經分離純化得到所述2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述分離純化方法如下反應結束后，取轉化液12000rpm離心IOmin,收集上清液；加入粉末活性炭，加熱攪拌脫色30min后轉入真空抽濾裝置抽濾，得到脫色清液；脫色清液轉入旋轉蒸發(fā)儀，在真空度-0. IMpa，水浴加熱溫度4(T60°C、轉速6(Tl00rpm條件下減壓蒸發(fā)除去底物2-氨基-2，3- ニ甲基丁腈和水，冷卻得到2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺粗品；將2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺粗品溶于2(T65°C的こ酸こ酷，加入體積為こ酸こ酯體積10%鹽析劑正己燒，于0 4°C保溫結晶；過濾，取濾渣用正己燒洗漆，干燥得到2-氨基_2，3- ニ甲基丁酰胺晶體。
8.慶筌紅球菌(Rhodococcusqingshengii)ZJB_09153,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏編號CCTCC No :M2010050，保藏日期2010年3月10日。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物法生產咪唑啉酮類超高效除草劑中間體2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及其過程中所用的菌株。本方法以2-氨基-2,3-二甲基丁腈為原料，以通過發(fā)酵培養(yǎng)微生物慶笙紅球菌(Rhodococcus qingshengii)CCTCC NoM2010050生產的腈水合酶為催化劑生產2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。本方法反應條件溫和，廢水排放少，環(huán)境友好；產率高，轉化時間短，成本低，易于實現工業(yè)化生產。
文檔編號C12P13/02GK102776253SQ20121023954
公開日2012年11月14日 申請日期2010年6月21日 優(yōu)先權日2010年6月21日
發(fā)明者林志堅, 沈寅初, 鄭仁朝, 鄭裕國 申請人:浙江工業(yè)大學