專利名稱：微生物催化制備2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物催化法制備2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺的方法，以及在生產(chǎn)過程中用到的新菌株。
背景技術(shù)：
2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺,英文名 2-amino_2, 3_dimethylbutyamide,外觀為白色片狀晶體，熔點(diǎn)為84°C，能溶于水和大多數(shù)有機(jī)溶劑。是咪唑啉酮類超高效除草劑如咪唑乙煙酸、咪唑喹啉酸和甲氧咪草煙等的通用中間體，市場需求廣闊。其中咪唑乙煙酸和咪唑喹啉酸曾占據(jù)美國大豆除草劑市場主導(dǎo)地位達(dá)10年之久；而我國自從1990年大批量進(jìn)口咪唑乙煙酸并在黑龍江省大面積應(yīng)用以來，用量持續(xù)增加。特別是在國內(nèi)該除草劑產(chǎn)品問世以后，由于其價(jià)格低廉，除草效果良好，故而被大范圍使用，成為黑龍江與內(nèi)蒙古地區(qū)大豆田除草劑的主導(dǎo)品種。2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺目前主要通過化學(xué)法生產(chǎn)。其生產(chǎn)過程可分為兩個(gè)部分3-甲基-2-丁酮通過斯特雷克(Strecker)反應(yīng)得到氨基腈，后者在酸或堿催化下水解
得到產(chǎn)物(見下式)。
權(quán)利要求
1.一種微生物催化法制備2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺的方法，所述方法包括在以2-氨基-2，3-二甲基丁腈為底物，以小球諾卡氏菌(Nocardia globerula) CCTCC No:M209214發(fā)酵產(chǎn)生的腈水合酶為催化劑的反應(yīng)體系中，于pH6. (TlO. 0、2(T40°C下進(jìn)行催化水合反應(yīng)，制得所述的2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)在水或pH6.(TlO. O的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中進(jìn)行。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)體系中底物初始濃度為O.03、. 3Μ。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述腈水合酶來自小球諾卡氏菌CCTCCNo:Μ209214經(jīng)發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞，所述含酶菌體細(xì)胞在反應(yīng)體系中添加量以含酶細(xì)胞濕重計(jì)為5 50g/L。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述含酶菌體細(xì)胞由如下方法制備得到 (1)將經(jīng)斜面活化的小球諾卡氏菌CCTCCNo M209214接入種子培養(yǎng)基中，于2(T40°C下培養(yǎng)24 48h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖5 20. Og/L，酵母浸出粉 2 8. Og/L，蛋白胨 Γ4. Og/L, KH2PO4O. 5 I. 5g/L, K2HPO4O. 5 I. 5g/L, NaClO. 5 3. 0g/L,己內(nèi)酰胺 0. 5 2. 0g/L, MgSO4O. 05 0. 2g/L, CoCl2O. θΓθ. 05g/L, FeSO4O. 01 0. 05g/L，溶劑為水，pH 6. 0 8· O ； (2)將種子液以1 10%體積比接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于2(T40°C下培養(yǎng)48 96h，培養(yǎng)得到的發(fā)酵液經(jīng)離心或膜分離，得所述含酶菌體細(xì)胞；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基終濃度組成如下蔗糖5. (TlO. 0g/L,檸檬酸鈉2. 0 5. 0g/L,牛肉膏2. 0 8. 0g/L,酵母粉2. 0 8. 0g/L,氯化鈉0. 5 2. 0g/L,磷酸二氫鉀 0. 5 2. 5g/L，氯化鈷 0. 005^0. 01g/L,氯化鐵 0. 005^0. 01g/L,氯化錳O. 005 O. 01g/L，誘導(dǎo)劑I. 0 3· 0g/L，溶劑為水，ρΗ6· 0 8· O ;所述誘導(dǎo)劑為下列之一谷氨酸鈉、2，2-二甲基環(huán)丙甲酰胺、己內(nèi)酰胺、丙烯酰胺、乙酰胺或尿素。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述方法如下將所述含酶菌體細(xì)胞用生理鹽水洗滌后，懸浮于水或pH6. (TlO. O的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中，加入底物2-氨基-2，3-二甲基丁腈至底物濃度為0. 03 0. 3Μ，于15 40°C、10(T200rpm下反應(yīng)l(T60min ;反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述分離純化方法如下反應(yīng)結(jié)束后，取轉(zhuǎn)化液12000rpm離心IOmin,收集上清液；加入粉末活性炭，加熱攪拌脫色30min后轉(zhuǎn)入真空抽濾裝置抽濾，得到脫色清液；脫色清液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在真空度-0. IMpa，水浴加熱溫度4(T60°C、轉(zhuǎn)速6(Tl00rpm條件下減壓蒸發(fā)除去底物2-氨基-2，3- 二甲基丁腈和水，冷卻得到2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺粗品；將2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺粗品溶于2(T65°C的乙酸乙酯，加入體積為乙酸乙酯體積10%鹽析劑正己燒，于0 4°C保溫結(jié)晶；過濾，取濾渣用正己燒洗漆，干燥得到2-氨基_2，3- 二甲基丁酰胺晶體。
8.小球諾卡氏菌(Nocardiagloberula)ZJB_09141，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCCNo :M209214，保藏日期2009年9月27曰。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物法生產(chǎn)咪唑啉酮類超高效除草劑中間體2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及其過程中所用的菌株。本方法以2-氨基-2,3-二甲基丁腈為原料，以通過發(fā)酵培養(yǎng)微生物小球諾卡氏菌(Nocardia globerula)CCTCC NoM209214生產(chǎn)的腈水合酶為催化劑生產(chǎn)2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。本方法反應(yīng)條件溫和，廢水排放少，環(huán)境友好；產(chǎn)率高，轉(zhuǎn)化時(shí)間短，成本低，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/365GK102776252SQ20121023945
公開日2012年11月14日 申請日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月21日
發(fā)明者林志堅(jiān), 沈寅初, 鄭仁朝, 鄭裕國 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)