專(zhuān)利名稱(chēng)：一種轉(zhuǎn)錄因子基因功能驗(yàn)證的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物技術(shù)和基因工程領(lǐng)域，涉及一種轉(zhuǎn)錄因子基因功能驗(yàn)證的方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)可通過(guò)識(shí)別結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子中特異的順式作用元件而調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子。在模式植物擬南芥的基因組中，有5%的基因編碼1500多個(gè)轉(zhuǎn)錄因 子，它們參與植株各種生物代謝的調(diào)節(jié)過(guò)程，亦是植株適應(yīng)各種生物或非生物脅迫所必需的調(diào)控因子，在生命活動(dòng)中起著不可替代的作用。因此，不同轉(zhuǎn)錄因子基因功能的驗(yàn)證已成為目前研究的熱點(diǎn)，是各種生理機(jī)制解析研究必需做的功課。bHLH (basic helix_loop-helix)蛋白擁有眾多成員，僅在擬南芥中就有160多個(gè)成員，是第二大植物轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控植物果實(shí)開(kāi)裂性狀，心皮、花藥和表皮細(xì)胞的發(fā)育，植物色素信號(hào)，黃酮類(lèi)次生代謝物質(zhì)合成，激素信號(hào)以及脅迫響應(yīng)等。然而僅有擬南芥和玉米中少數(shù)bHLH成員的基因功能得到驗(yàn)證，它們主要分布在III f亞組，功能涉及黃酮類(lèi)化合物合成的調(diào)控、表皮毛和根毛的形成調(diào)控?；ㄇ嘬諏儆邳S酮類(lèi)化合物，廣泛存在于絕大部分陸生植物的液泡中，是紅色、藍(lán)色和紫色果面色澤的主要構(gòu)成物?；ㄇ嘬粘鳛樘烊簧赝?，還具有很強(qiáng)的抗氧化、清除氧自由基的能力，能防治許多疾病，是具有保健功能的天然活性物質(zhì)，被譽(yù)為繼水、蛋白質(zhì)、月旨肪、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)之后的第七大必需營(yíng)養(yǎng)，因而成為天然色素中最具有發(fā)展前景的一類(lèi)色素。果實(shí)因花青苷含量不同而色澤差異較大，多態(tài)性豐富，是探討果實(shí)花青苷代謝的良好試材。另外，楊梅在我國(guó)栽培面積達(dá)30萬(wàn) 40萬(wàn)公頃，總產(chǎn)量達(dá)80 100萬(wàn)噸，年產(chǎn)值達(dá)100億元，有著重要的經(jīng)濟(jì)與生態(tài)價(jià)值。因此，對(duì)楊梅花青苷合成調(diào)控進(jìn)行研究具有重要意義。bHLH轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物花青苷合成的調(diào)控已有所涉及，如矮牽牛bHLH可直接活化花青苷合成基因DFR的表達(dá)；將擬南芥bHLH基因?qū)胱狭_蘭白花突變體可激活花中花青苷合成基因表達(dá)從而促進(jìn)花青苷積累；栽培水稻中bHLH基因突變導(dǎo)致籽粒不能積累花青苷。然而果樹(shù)學(xué)研究中，對(duì)花青苷合成調(diào)控的研究多涉及MYB轉(zhuǎn)錄因子，bHLH的研究相對(duì)薄弱。但是在楊梅上的研究表明，只有與擬南芥或蘋(píng)果的bHLH共表達(dá)時(shí)，楊梅MrMYBl基因?qū)ㄇ嘬蘸铣苫虮磉_(dá)的激活作用才得到充分發(fā)揮。因此bHLH是楊梅花青苷合成中必不可少的轉(zhuǎn)錄因子，研究意義重要。本發(fā)明就以楊梅果實(shí)中可調(diào)控花青苷合成的4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因功能的驗(yàn)證為例，闡述一種適用于多種植物、多種轉(zhuǎn)錄因子的基因功能驗(yàn)證方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)錄因子基因功能驗(yàn)證的方法，以楊梅果實(shí)中已確認(rèn)可調(diào)控花青苷合成的ifr#7S7和#r#7S7t/以及可能參與花青苷合成調(diào)控的和MrbHLH2為例，對(duì)該發(fā)明方法進(jìn)行具體闡述。本發(fā)明方法同樣適用于楊梅以外的植物，以及其他轉(zhuǎn)錄基因。本發(fā)明的具體實(shí)施步驟如下
(I)電子克隆根據(jù)已公布的或者自行構(gòu)建的待測(cè)物種的轉(zhuǎn)錄本信息庫(kù)進(jìn)行電子克隆，自行構(gòu)建該物種的轉(zhuǎn)錄本信息庫(kù)時(shí)，所選樣本要盡可能多且具有代表性，本發(fā)明以楊梅不同成熟度的果實(shí)以及不同組織為樣本，抽提總RNA后進(jìn)行深度測(cè)序，構(gòu)建成楊梅轉(zhuǎn)錄本信息庫(kù)。本發(fā)明以此轉(zhuǎn)錄本信息庫(kù)，根據(jù)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守序列，采用Blast生物信息學(xué)手段，程序中閾值(E-value)設(shè)為I X 10_5，從海量Unigene中篩出屬于bHLH家族的117個(gè)Unigene。利用擬南芥中已確定的可調(diào)控花青苷合成的(AT4G09820)序列信息，進(jìn)一步分析這117個(gè)Unigene,篩出7個(gè)可能與楊梅花青苷合成相關(guān)的Unigene。將這7個(gè)Unigene進(jìn)行序列重疊性分析，得到2條拼接序列，分別命名為1/ 份(SEQ N0. 5)取MrbHLH2 (SEQ N0. 6)。首先采用普通PCR技術(shù)，對(duì)拼接的取MrbHLH2進(jìn)行驗(yàn)證，所用引物分別為SEQ :N0. I和SEQ:N0. 2及SEQ :NO. 3和SEQ :N0. 4。然后再利用在·線blastn算法，分析得到的取MrbHLH2與其他物種中基因序列的同源性。采用Clustal細(xì)rbHLHl和及其他物種中調(diào)控花青苷合成的bHLH進(jìn)行序列比對(duì)，分析MrbHLHl和MrbHLH2是否具有與其他物種中調(diào)控花青苷合成的bHLH相同的結(jié)構(gòu)域。應(yīng)用Mega 5. 0分啄MrbHLHl取MrbHLH2與其他物種中調(diào)控花青苷合成的bHLH的親緣關(guān)系，進(jìn)一步懸MrbHLHl _rbHLH2是否具有調(diào)控花青苷合成的功能。所述步驟(I)中電子克隆的方法為將Blast程序中閾值設(shè)為1X10_5，程序結(jié)束后篩選出117個(gè)相關(guān)Unigene ;進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)庫(kù)中這117個(gè)Unigene信息,根據(jù)功能注釋篩出可能與花青苷合成相關(guān)的7個(gè)Unigene ;將這7個(gè)Unigene進(jìn)行序列重疊性分析,發(fā)現(xiàn)它們中有些首尾存在重復(fù)序列，即可以拼接成兩條完整序列。(2)實(shí)時(shí)定量熒光PCR分析轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)模式根據(jù)已確認(rèn)的份(SEQ NO. b)取MrbHLH2 (SEQ N0. 6)的全長(zhǎng)和3’端非編碼區(qū)序列分別設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR特異引物，序列分別為SEQ N0. 7和SEQ N0. 8及SEQ N0. 9和SEQ N0. 10，PCR產(chǎn)物包含終止密碼子，長(zhǎng)度分別為109bp和162bp。引物的特異性通過(guò)普通PCR和序列測(cè)定雙重手段進(jìn)行驗(yàn)證。提取楊梅不同成熟度的果實(shí)RNA，取I ii I逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后稀釋10倍，再將
所用引物稀釋至2. 5 UM0參照Fermentas公司生產(chǎn)的Maxima SYBR Green/ROX qPCR
Master Mix 試劑盒說(shuō)明書(shū)，配制 PCR 反應(yīng)體系SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 12. 5U 1,2. 5 PM上下游引物各3 iil，cDNA模板6.5 yl，終體積為25 yl。應(yīng)用iCycler iQQ-PCR 儀器(Bio-Rad，USA)，反應(yīng)條件為50 V 2 min ；95 °C預(yù)變性 2 min ；95 °C變性 15sec, 55 °C退火30 sec, 72 °C延伸30 sec，40個(gè)熱循環(huán)；熔解曲線分析65 1到95 °C，每5sec升高I °C ;反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)每個(gè)模板對(duì)應(yīng)的Ct值(Cycle threshold)，以?xún)?nèi)參基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)將各成熟度果實(shí)的cDNA模板原液按照10X2-(et_25)公式進(jìn)行稀釋?zhuān)顾心０錍t值均為25左右。以確認(rèn)完畢的實(shí)時(shí)定量特異引物和內(nèi)參基因的特異引物(SEQ :N0. 11和SEQ:NO. 12)進(jìn)行熒光定量PCR，依據(jù)兩者擴(kuò)增效率的差異判斷轉(zhuǎn)錄因子的相對(duì)表達(dá)量。所述步驟(2)中各發(fā)育階段模板cDNA濃度的調(diào)整方法為首先將I 由RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋10倍，內(nèi)參基因的上下游擴(kuò)增引物(SEQ NO. 11和SEQ NO. 12)分別稀釋至2.5iiM。將適量的SYBR Green/ROX qPCR Master Mix和引物配制成PCR Mix，分裝到每個(gè)反應(yīng)管，最后于相應(yīng)的反應(yīng)管內(nèi)加入對(duì)應(yīng)的cDNA模板,進(jìn)行qPCR。反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)每個(gè)模板對(duì)應(yīng)的Ct值(Cycle threshold)，再次對(duì)模板原液按照10X2_to_25)公式進(jìn)行稀釋?zhuān)顾心０錍t值均為25左右。(3)超表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)已確認(rèn)份(SEQ N0. 5)和(SEQ :N0.6)全長(zhǎng)序列分別設(shè)計(jì)含限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)的引物SEQ N0. 13和SEQ N0. 14及SEQ NO. 15和SEQ:N0. 16，擴(kuò)增兩個(gè)基因的開(kāi)放性閱讀框。以楊梅成熟果實(shí)cDNA為模板，參
照PrimeSTAR HS DNA polymerase說(shuō)明書(shū)加以改 動(dòng)，配制終體積為20 u I PCR體系HS
DNA polymerase (2. 5 U/uI) 0. 2 uI,5XBuffer 4 uI,2.5 mmol/1 dNTP I. 6 u1,10U M/1引物各0.5 u 1,50 ng/u I cDNA模板1.0 yl，加ddH20至終體積20 yl。按照其推薦的PCR程序進(jìn)行產(chǎn)物擴(kuò)增，反應(yīng)條件為98 °C預(yù)變性5 min ；98 °C變性10 sec, 58 V退火5 sec, 72 °C延伸2 min 30 sec，35個(gè)熱循環(huán)；72°C延伸10 min，4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，回收后經(jīng)相應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶處理,酶切產(chǎn)物再次用1%瓊脂糖凝膠電泳，回收，然后連接到同樣經(jīng)相應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶處理的pGreen II 002962-SK表達(dá)載體上。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞中，用不含任何抗生素的LB液體于37 0C 150 rpm培養(yǎng)細(xì)胞I h后，然后將其均勻涂布于含50 U g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，用pGreen II 0029 62-SK表達(dá)載體自帶的檢測(cè)引物(SEQ NO. 17和SEQ:N0. 18)對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，最后選取含目的基因的陽(yáng)性克隆菌液送上海Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。根據(jù)公司測(cè)序結(jié)果，將正確的陽(yáng)性克隆菌液置于37 0C,150 rpm恒溫?fù)u床上過(guò)夜培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒抽提，應(yīng)用相應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶處理抽提到的質(zhì)粒，再次確認(rèn)載體構(gòu)建的正確性。將最終確認(rèn)正確構(gòu)建的表達(dá)載體通過(guò)電擊導(dǎo)入GV3101: :pSoup農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，菌液均勻涂布于含25 u g/ml慶大霉素、5 y g/ml四環(huán)素和50 u g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆。用20%滅菌甘油保存篩選到的陽(yáng)性克隆，存放于_80°C。(4)煙草葉片雙螢光素酶瞬時(shí)表達(dá)分析將存放于_80°C的甘油菌劃線接種于含25 u g/ml慶大霉素、5 u g/ml四環(huán)素和50 u g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48 h,挑取少量菌落涂布到另一個(gè)含相同抗生素的LB固體培養(yǎng)基上,28 °C培養(yǎng)24 h。刮取生長(zhǎng)良好的菌落，用10 mM MgCl2,10 mM MES (生物緩沖液)，150 mM乙酰丁香酮，pH為5. 6的滲透液懸浮，使其OD6tltl為0. 75。含不同轉(zhuǎn)錄因子的菌株滲透液等比例混勻，再加入混合液1/10體積的含結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的菌株滲透液，然后用無(wú)針頭注射器將滲透液注A 6周大的、有6-8片真葉的本氏煙草葉片中，3天后檢測(cè)葉片中兩種熒光素酶的比值應(yīng)
用Promega提供的Dual-Luciferase Reporter Assay System和發(fā)光突光檢測(cè)儀分析
LUC和REN的表達(dá)。將葉片于100 ill I XPBS緩沖液中磨碎，吸取50 ill上清液，加入50 illLuciferase Assay Buffer避光反應(yīng)IOmin后檢測(cè)LUC突光發(fā)光信號(hào)，再加入50 ii I Stop &
Glo Buffer避光反應(yīng)IOmin后檢測(cè)REN突光發(fā)光信號(hào)。據(jù)此可分析不同轉(zhuǎn)錄因子間、轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子間是否存在互作，即可驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子在該代謝途徑中是否具有調(diào)控作用。所述步驟(4)中煙草葉片雙螢光素酶比值檢測(cè)方法為將含結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的pGreen II 0800-LUC質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株和含轉(zhuǎn)錄因子的農(nóng)桿菌菌株同時(shí)注入煙草葉片，3天
后，取樣。應(yīng)用 Promega 提供的 Dual-Luciferase Reporter Assay System 和發(fā)光突光
檢測(cè)儀分析LUC和REN的表達(dá)。將葉片于100 u I IXPBS緩沖液中磨碎，吸取50 U I上清液，加入50 ill Luciferase Assay Buffer避光反應(yīng)IOmin后檢測(cè)LUC突光發(fā)光信號(hào)，再加
入50 ill Stop & Glo Buffer避光反應(yīng)IOmin后檢測(cè)REN熒光發(fā)光信號(hào)。本發(fā)明利用擬南芥中調(diào)控花青苷合成的bHLH于構(gòu)建好的楊梅轉(zhuǎn)錄本信息庫(kù)中進(jìn)行電子克隆，得到可能調(diào)控楊梅花青苷合成的份和化 全長(zhǎng)序列，然后應(yīng)用普通PCR技術(shù)對(duì)電子克隆到的序列進(jìn)行驗(yàn)證，再利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析該基因在楊梅果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式，應(yīng)用煙草葉片雙螢光素酶瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)分析該基因與已確認(rèn)·的可調(diào)控楊梅花青苷合成的MrMYBl和MrMYBld轉(zhuǎn)錄通子的互作,及這四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與花青苷合成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因DFR啟動(dòng)子的互作，根據(jù)互作結(jié)果即可判斷轉(zhuǎn)錄因子是否具有調(diào)控楊梅花青苷合成的功能。本發(fā)明公布了轉(zhuǎn)錄因子基因功能驗(yàn)證的一整套完善體系，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明方法使得快速、準(zhǔn)確驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子的基因功能成為可能。


圖I .MrbHLHl和在楊梅果實(shí)不同發(fā)育階段的表達(dá)模式。圖2 :煙草葉片雙熒光素酶瞬時(shí)表達(dá)分析取MrbHLH2與轉(zhuǎn)錄因子#r#7價(jià)、MrMYBld的互作，以及它們對(duì)花青苷合成基因DFR啟動(dòng)子的調(diào)控效應(yīng)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但實(shí)施例不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例中常規(guī)的基因操作方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)。實(shí)施例I :實(shí)時(shí)定量熒光PCR備MrbHLHl熱MrbHLH2在楊梅果實(shí)不同發(fā)育階段中的表達(dá)模式；
(一)實(shí)驗(yàn)方法 I、楊梅果實(shí)總RNA提取
新鮮果實(shí)樣品去核后迅速用液氮冷凍，保存于-80°C。提取RNA時(shí)，稱(chēng)取Ig凍樣加液氮充分研磨后，分2-3次加入到有4ml 65°C CTAB/P -巰基乙醇提取緩沖液的離心管中，渦旋混合使細(xì)胞徹底破裂，65°C加熱Imin ;然后向離心管中加入4ml氯仿異戊醇(24 :1)抽提液，潤(rùn)旋混合；15°C IOOOOrpm離心IOmin,小心吸取上清液到新的離心管,重新抽提一次；得到的上清液小心吸取到新的離心管中，加入3/10體積的8mol/l的LiCl2,4°C冰箱放置過(guò)夜；4°C IOOOOrpm離心20min，倒掉上清液，將離心管倒置于紙巾上以去除多余的溶液；力口A 500 u I 650C SSTE，溶解沉淀；再加入500 U I氯仿異戊醇(24 :1)抽提液，渦旋混合；將液體徹底吸入I. 5ml離心管中20°C IOOOOrpm離心lOmin，吸上清液到新的離心管中加入2倍體積的_20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻，_80°C放置30min以上；4°C IOOOOrpm離心25min，倒掉上清液，短暫離心后吸出殘余液體，將沉淀在通風(fēng)櫥晾干(約5-10min);每管加A20ul DEPC水溶解沉淀，得到總RNA樣品；用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所得樣品完整性，結(jié)果顯示樣品有兩條帶，亮度為上條下條=2 :1，說(shuō)明RNA樣品完整無(wú)降解；用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所得樣品純度，吸取I Ul RNA樣品用69 u I DEPC水稀釋后，檢測(cè)OD26tl和OD28tl,分析得到OD26tZOD28tl=L 8-2. 0，說(shuō)明RNA純度符合標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)公式0D26(IX40 (RNA濃度系數(shù))X 70 (樣品稀釋倍數(shù))即可計(jì)算出樣品RNA的濃度(ng/yl)，進(jìn)行下一步研究。2、MrbHLHl 和 MrbHLH2 表達(dá)模式分析
首先米用 Fermentas 公司提供的 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 將各樣品RNA進(jìn)行DNA消除后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;然后將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA吸取I yl稀釋10倍，內(nèi)參基因的上下游擴(kuò)增引物SEQ :N0. 11和SEQ:N0. 12分別稀釋至2. 5 y M ;將適量 的 SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (12. 5 U IX 反應(yīng)數(shù))、SEQ N0. 11 (3u IX 反應(yīng)數(shù))和SEQ N0. 12(3 ill X反應(yīng)數(shù))配制成PCR Mix，操作過(guò)程避光；Mix經(jīng)充分混勻后，分裝到每個(gè)反應(yīng)管；再于相應(yīng)的反應(yīng)管內(nèi)加入對(duì)應(yīng)的稀釋10倍的cDNA模板(6 u I);短暫離心將反應(yīng)液收集到管底，進(jìn)行qPCR ;程序?yàn)?0°C 2min ;95°C預(yù)變性2min ;95°C變性15sec，55°C退火30sec，72°C延伸30seC，40個(gè)熱循環(huán)；熔解曲線分析65°C到95°C，每5sec升高1°C;結(jié)束；根據(jù)每個(gè)模板對(duì)應(yīng)的Ct值(Cycle threshold),再次對(duì)模板原液按照10X2_(et_25)公式進(jìn)行稀釋?zhuān)顾心０錍t值均為25左右。洛MrbHLHl和 MrbHLH2 實(shí)時(shí)定量 PCR 弓丨物 SEQ N0. 7 和 SEQ N0. 8 及 SEQ N0. 9和SEQ N0. 10，分別稀釋至2. 5 PM,配制兩種分別含內(nèi)參基因引物和iMrbHLH2特異引物的 PCR Mix，即 PCR Mixl 為 SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (12.5iUX 反應(yīng)數(shù))、SEQ:N0. 11 (3 ill X 反應(yīng)數(shù))和 SEQ :N0. 12 (3 X 反應(yīng)數(shù))，PCR Mix2 為 SYBRGreen/ROX qPCR Master Mix (12. 5 U IX反應(yīng)數(shù))、基因特異引物(3 X反應(yīng)數(shù));充分混勻后后分裝到每個(gè)反應(yīng)管，最后于相應(yīng)反應(yīng)管內(nèi)加入對(duì)應(yīng)的Ct值為25左右的cDNA模板，此時(shí)每個(gè)模板都包含一個(gè)內(nèi)參基因引物反應(yīng)和一個(gè)基因特異引物反應(yīng)，進(jìn)行qPCR，程序與之前一致；反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)每個(gè)模板得到的兩個(gè)Ct值(內(nèi)參基因引物的Ctl，基因特異性弓丨物的Ct2)，運(yùn)用公式2_(et2_etl)即可得到該基因的相對(duì)表達(dá)量。(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
I、楊梅果實(shí)富含糖和多酚類(lèi)物質(zhì)，應(yīng)用該方法提取的樣品總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，顯示兩條帶清晰，說(shuō)明RNA完整無(wú)降解；紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示，所有樣品RNA OD260/OD280均在I. 8-2. 0范圍內(nèi)，說(shuō)明RNA純度符合標(biāo)準(zhǔn)。本方法與其他常用RNA提取手段相比較，更適用于多酚多糖含量的果實(shí)RNA的提取。2、實(shí)時(shí)定量熒光PCR結(jié)果顯示，1/ 份的表達(dá)模式與果實(shí)花青苷合成呈正相關(guān)，即隨著果實(shí)成熟，花青苷合成逐漸積累，MrbHLHl的相對(duì)表達(dá)量逐漸上升，于果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最高表達(dá).MrbHLH2的表達(dá)模式與果實(shí)花青苷合成沒(méi)有較好的相關(guān)性，可能不參與楊梅果實(shí)發(fā)育階段的花青苷合成調(diào)控(圖2)。實(shí)施例2 :煙草葉片雙熒光素酶瞬時(shí)表達(dá)分析 (一)實(shí)驗(yàn)方法
I、煙草種植首先配制煙草種植基質(zhì)，比例為泥炭土 珍珠巖蛭石草木灰=5:1:1:1 ;然后將本氏煙草OVicobenthamiana)種子撒播到基質(zhì)上,與暗中25°C培養(yǎng)I周；待幼苗破土后，將其移至光下培養(yǎng)，條件為光照黑暗=16h:8h，濕度為75%;待煙草生出6-8片真葉時(shí)，即可用于瞬時(shí)表達(dá)分析。2、瞬時(shí)表達(dá)分析
將含有不同轉(zhuǎn)錄因子和基因啟動(dòng)子的GV3101: :pSoup甘油菌株劃線到含25 u g/ml慶大霉素、2. 5 y g/ml四環(huán)素和50 u g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，28 °C培養(yǎng)48 h ；挑取少量菌落涂布到新的含25 ii g/ml慶大霉素、5 ii g/ml四環(huán)素和50 y g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，28 °C培養(yǎng)24 h ;刮取生長(zhǎng)良好的菌落，用10 mM MgCl2,10 mM MES(生物緩沖液)，150 mM乙酰丁香酮，pH為5. 6的滲透液懸浮，使其0D_為0.75，滲透液現(xiàn)用現(xiàn)配；若只分析單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)目的基因啟動(dòng)子的調(diào)控效果時(shí)，將含該轉(zhuǎn)錄因子的菌株滲透液與其1/10體積的含目的基因啟動(dòng)子的菌株滲透液混合，用無(wú)針頭注射器將滲透液注入6周大的、有6-8片真葉的本氏煙草葉片中；若分析不同轉(zhuǎn)錄因子間的互作時(shí)，則先將含不同轉(zhuǎn)錄因子的菌株滲透液等比例混合，再加入混合液1/10體積的含目的基因啟動(dòng)子的菌株·滲透液，然后注入煙草葉片；每次實(shí)驗(yàn)中，都要設(shè)計(jì)嚴(yán)格的陰性對(duì)照，即將含pGreen II 002962-SK空載體的農(nóng)桿菌菌株滲透液與其1/10體積的含目的基因啟動(dòng)子的菌株滲透液混合，然后注入煙草葉片；注射時(shí)，每株煙草注射3-4片幼嫩葉片，同一株煙草注射的滲透液是相同的。注射3天后，用內(nèi)徑直徑為6 mm的打孔器于每片注射過(guò)的葉片上取兩次樣，每株
煙草共計(jì) 6 個(gè)樣；應(yīng)用 Promega 提供的 Dual-Luciferase @ Reporter Assay System,取
下的葉片于100 V- I I XPBS緩沖液中磨碎，吸取50 ill上清液,加入50 V- I LuciferaseAssay Buffer避光反應(yīng)10 min后，與熒光發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)LUC熒光發(fā)光信號(hào)；再加入50
U I Stop & Glo Buffer避光反應(yīng)10 min后檢測(cè)REN熒光發(fā)光信號(hào)；由于REN熒光素酶
編碼基因由35S啟動(dòng)子啟動(dòng)，表達(dá)量相對(duì)恒定，而LUC熒光素酶編碼基因由目的基因啟動(dòng)子啟動(dòng)，當(dāng)所研究的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)目的基因啟動(dòng)子有調(diào)控作用時(shí)，LUC熒光素酶的表達(dá)量會(huì)相應(yīng)的增強(qiáng)或減弱，因此通過(guò)比較注射轉(zhuǎn)錄因子的煙草和空載體的煙草的LUC/REN，即可獲得該轉(zhuǎn)錄因子對(duì)目的基因的啟動(dòng)子是否存在調(diào)控，不同轉(zhuǎn)錄因子間是否存在互作。(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
煙草葉片雙熒光素酶瞬時(shí)表達(dá)分析結(jié)果顯示，四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子#r#7S7、MrMYBId、MrbHLHl 和 MrbHLH2 單獨(dú)作用時(shí)，和 MrMYBl 與 MrbHLH2、MrMYBld 與 MrbHLHl 或 MrMYBld與MrbHLH2兩兩互作時(shí)，對(duì)花青苷合成基因DFR啟動(dòng)子的誘導(dǎo)活性較弱，而當(dāng)#r#7價(jià)與MrbHLHl兩者共同作用時(shí)，DFR啟動(dòng)子活性被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，說(shuō)明'MrMYBl與MrbHLHl兩者間以及#r#7價(jià)、份與DFR啟動(dòng)子間存在相互作用；而對(duì)花青苷合成無(wú)調(diào)控作用的MrMYBld,即使與MrbHLHl混合，也無(wú)法對(duì)DFR啟動(dòng)子起誘導(dǎo)作用。這與他人在花青苷合成調(diào)控中的研究結(jié)果一致，即植物花青苷的合成調(diào)控需要bHLH和MYB兩種轉(zhuǎn)錄因子中的特定成員同時(shí)起作用。應(yīng)用本方法得到的結(jié)果，與MrbHLHl兩考秘VJslMrMYBI、MrbHLHl與DFR啟動(dòng)子間存在相互作用，與前人利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到的結(jié)果相同，說(shuō)明本方法的可行性與可靠性較高。除此之外，與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，本方法在基因功能驗(yàn)證試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)周期大大縮短本方法可在6周內(nèi)驗(yàn)證出基因的功能，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)最短需耗時(shí)3個(gè)月及以上。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍?！?br> 權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)錄因子基因功能驗(yàn)證的方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn) (1)電子克隆根據(jù)已公布的或者自行構(gòu)建待驗(yàn)證物種的轉(zhuǎn)錄本信息庫(kù)進(jìn)行電子克隆，自行構(gòu)建該物種的轉(zhuǎn)錄本信息庫(kù)時(shí)，所選樣本要盡可能多且具有代表性，本發(fā)明以楊梅不同成熟度的果實(shí)以及不同組織為樣本，抽提總RNA后進(jìn)行深度測(cè)序，構(gòu)建成楊梅轉(zhuǎn)錄本信息庫(kù)，以此轉(zhuǎn)錄本信息庫(kù)，根據(jù)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守序列，采用Blast生物信息學(xué)手段，程序中閾值設(shè)為I X 10_5,從海量Unigene中篩出屬于bHLH家族的Unigene,進(jìn)ー步分析Unigene,篩出可能與楊梅花青苷合成相關(guān)的Unigene,將相關(guān)的Unigene進(jìn)行序列重疊性分析，得到2條拼接序列SEQ N0. 5和SEQ N0. 6，分別命名為MrbHLHl和MrbHLH2,首先采用普通PCR技術(shù)，對(duì)拼接的#班和#化 進(jìn)行驗(yàn)證，所用引物分別為SEQ N0. I和SEQ N0. 2及SEQ N0. 3和SEQ N0. 4，然后再利用在線blastn算法，分析得到的#r/yK班和#與其他物種中基因序列的同源性，采用Clustal對(duì)MrbHLHl和#及其他物種中調(diào)控花青苷合成的bHLH進(jìn)行序列比對(duì)，^MrbHLHl _rbHLH2是否具有與其他物種中調(diào)控花青苷合成的bHLH相同的結(jié)構(gòu)域，應(yīng)用Mega 5. O ■ MrbHLHl取MrbHLH2與其他物種中調(diào)控花青苷合成的bHLH的親緣關(guān)系，進(jìn)ー步預(yù)測(cè)#ァ/^ム77 _rbHLH2是否具有調(diào)控花青苷合成的功能； (2)實(shí)時(shí)定量熒光PCR分析轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)模式根據(jù)已確認(rèn)的#份取MrbHLH2的全長(zhǎng)和3’端非編碼區(qū)序列分別設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR特異引物，序列分別為SEQ N0. 7和SEQ N0. 8及SEQ N0. 9和SEQ N0. 10，PCR產(chǎn)物包含終止密碼子，長(zhǎng)度分別為109bp和162bp，引物的特異性通過(guò)普通PCR和序列測(cè)定雙重手段進(jìn)行驗(yàn)證，提取楊梅不同成熟度的果實(shí)RNA，取I 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后稀釋10倍，再將所用引物稀釋至2. 5 y M，參照Fermentas 公司生產(chǎn)的 Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)體系，應(yīng)用iCycler iQQ-PCR 儀器(Bio-Rad，USA)，反應(yīng)條件為50 V 2 min ；95 °C預(yù)變性 2 min ；95 °C變性 15sec, 55 °C退火30 sec, 72 °C延伸30 sec，40個(gè)熱循環(huán)；熔解曲線分析65 °C到95 °C，每5 sec升高Iで;反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)每個(gè)模板對(duì)應(yīng)的Ct值，以?xún)?nèi)參基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)將各成熟度果實(shí)的cDNA模板原液按照10X2_(Gt_25)公式進(jìn)行稀釋?zhuān)顾心０錍t值均為±25，以序列是SEQ N0. 11的實(shí)時(shí)定量特異引物和序列是SEQ N0. 12的內(nèi)參基因的特異引物進(jìn)行熒光定量PCR，依據(jù)兩者擴(kuò)增效率的差異判斷轉(zhuǎn)錄因子的相對(duì)表達(dá)量； (3)超表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)#ァ/^ム77和#全長(zhǎng)序列分別設(shè)計(jì)含限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)的引物序列SEQ :N0. 13和SEQ:N0. 14及SEQ :N0. 15和SEQ :N0. 16，擴(kuò)增兩個(gè)基因的開(kāi)放性閱讀框，以楊梅成熟果實(shí)cDNA為模板,參照PrimeSTAR HS DNA polymerase說(shuō)明書(shū)，配制終體積為 20 u I PCR 體系2. 5 U/ill HS DNA polymerase 0. 2 u I, 5 X Buffer4 u 1,2. 5 mmol/1 dNTP I. 6 u 1,10 U M/1 引物各0.5 u 1,50 ng/u I cDNA模板 I. 0 U I,加ddH20至終體積20 u 1，按說(shuō)明書(shū)推薦的PCR程序進(jìn)行產(chǎn)物擴(kuò)增，反應(yīng)條件為98で預(yù)變性5 min ；98で變性10 sec, 58 °C退火5 sec, 72 °C延伸2 min 30 sec，35個(gè)熱循環(huán)；72°C延伸 10 min，4°C保存； PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，回收后經(jīng)相應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶處理，酶切產(chǎn)物再次用1%瓊脂糖凝膠電泳，回收，然后連接到同樣經(jīng)相應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶處理的pGreen II 0029 62-SK表達(dá)載體上； 將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞中，用不含任何抗生素的LB液體于37·0C 150 rpm培養(yǎng)細(xì)胞I h后，然后將其均勻涂布于含50 U g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，用pGreen II 0029 62-SK表達(dá)載體自帶的SEQ NO. 17和SEQ NO.·18檢測(cè)引物對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，最后選取含目的基因的陽(yáng)性克隆菌液送上海Invitrogen公司 進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，根據(jù)公司測(cè)序結(jié)果，將正確的陽(yáng)性克隆菌液置于37で、150rpm恒溫?fù)u床上過(guò)夜培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒抽提，應(yīng)用相應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶處理抽提到的質(zhì)粒，再次確認(rèn)載體構(gòu)建的正確性，將最終確認(rèn)正確構(gòu)建的表達(dá)載體通過(guò)電擊導(dǎo)入GV3101: : pSoup農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，菌液均勻涂布于含25 u g/ml慶大霉素、5 ii g/ml四環(huán)素和50 u g/ml卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，用20%滅菌甘油保存篩選到的陽(yáng)性克隆，存放于-80 0C ； (4)煙草葉片雙螢光素酶瞬時(shí)表達(dá)分析將存放于_80°C的甘油菌劃線接種于含25U g/ml慶大霉素、5 u g/ml四環(huán)素和50 u g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)·48 h,挑取少量菌落涂布到另ー個(gè)含相同抗生素的LB固體培養(yǎng)基上,28 °C培養(yǎng)24 h,刮取生長(zhǎng)良好的菌落，用10 mM MgCl2,10 mM MES，150 mMこ酰丁香酮，pH為5. 6的滲透液懸浮，使其OD6tltl為0. 75，含不同轉(zhuǎn)錄因子的菌株滲透液等比例混勻，再加入混合液1/10體積的含結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的菌株滲透液，然后用無(wú)針頭注射器將滲透液注入6周大的、有6-8片真葉的本氏煙草葉片中，3天后檢測(cè)葉片中兩種熒光素酶的比值應(yīng)用Promega提供的Dual-Luciferase Reporter Assay System和發(fā)光突光檢測(cè)儀分析LUC和REN的表達(dá)，將葉片于100 ill I XPBS緩沖液中磨碎，吸取50 ii I上清液,加入50 ii I Luciferase AssayBuffer避光反應(yīng)IOmin后檢測(cè)LUC熒光發(fā)光信號(hào)，再加入50 u I Stop &Glo Buffer避光反應(yīng)IOmin后檢測(cè)REN熒光發(fā)光信號(hào)，分析不同轉(zhuǎn)錄因子間、轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子間是否存在互作，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子在該代謝途徑中的調(diào)控作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種轉(zhuǎn)錄因子基因功能驗(yàn)證的方法，其特征在于，所述步驟(2)中各模板cDNA濃度的調(diào)整方法為首先將I 由RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋10倍，內(nèi)參基因的上下游擴(kuò)增引物序列是SEQ N0. 11和SEQ N0. 12，分別稀釋至2. 5 y M，將適量的SYBR Green/ROX qPCR Master Mix和引物配制成PCR Mix，分裝到每個(gè)反應(yīng)管，最后于相應(yīng)的反應(yīng)管內(nèi)加入對(duì)應(yīng)的cDNA模板，進(jìn)行qPCR，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)每個(gè)模板對(duì)應(yīng)的Ct值再次對(duì)模板原液按照10X2_to_25)公式進(jìn)行稀釋?zhuān)顾心０錍t值均為25左右。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種轉(zhuǎn)錄因子基因功能驗(yàn)證的方法，其特征在干，所述步驟(4)中煙草葉片雙螢光素酶比值檢測(cè)方法為將含結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的pGreen II 0800-LUC質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株和含轉(zhuǎn)錄因子的農(nóng)桿菌菌株同時(shí)注入煙草葉片，3天后，取樣，應(yīng)用Promega提供的Dual-Luciferase Reporter Assay System和發(fā)光突光檢測(cè)儀分析LUC和REN的表達(dá)，將葉片于100 ii I IXPBS緩沖液中磨碎,吸取50 ii I上清液,加入50 ii I LuciferaseAssay Buffer避光反應(yīng)IOmin后檢測(cè)LUC熒光發(fā)光信號(hào)，再加入50 Stop &Glo Buffer避光反應(yīng)IOmin后檢測(cè)REN熒光發(fā)光信號(hào)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)錄因子基因功能驗(yàn)證的方法，利用擬南芥中調(diào)控花青苷合成的bHLH于構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本信息庫(kù)，并進(jìn)行電子克隆，得到可調(diào)控楊梅花青苷合成的MrbHLH1和MrbHLH2全長(zhǎng)序列，再對(duì)電子克隆到的序列作驗(yàn)證，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析該基因在楊梅果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式，應(yīng)用煙草葉片雙螢光素酶瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)分析該基因與已確認(rèn)的可調(diào)控楊梅花青苷合成的MrMYB1和MrMYB1d轉(zhuǎn)錄因子的互作，及這四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與花青苷合成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因DFR啟動(dòng)子的互作，根據(jù)互作結(jié)果即可判斷轉(zhuǎn)錄因子是否具有調(diào)控楊梅花青苷合成的功能。本方法同樣適用于楊梅以外的植物，以及其他轉(zhuǎn)錄基因。
文檔編號(hào)C12N15/84GK102787121SQ20121019542
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者劉小芬, 徐昌杰, 殷學(xué)仁, 陳昆松 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)