專利名稱：一種柿子脫澀相關(guān)基因的克隆與瞬時(shí)表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及了柿子脫澀相關(guān)基因的克隆表達(dá)，以及柿葉片基因瞬時(shí)表達(dá)的體系建立。
背景技術(shù)：
柿原產(chǎn)中國(guó)，其味道鮮美，對(duì)人類(lèi)健康良好，是東亞地區(qū)(中國(guó)，日本，韓國(guó)等)最受歡迎的水果之一，柿子的獨(dú)特之處在于其果實(shí)在發(fā)育期間能累積單寧(PAs)，單寧是高分子物質(zhì)，其中可溶性單寧是柿果實(shí)澀味的主要呈現(xiàn)物質(zhì)。
柿子根據(jù)其脫澀類(lèi)型以及種子是否影響果實(shí)的澀味及顏色可以分為四類(lèi)完全甜柿(PCNA);完全澀柿(PCA);非完全甜柿(PVNA);非完全澀柿(PVA)。甜柿果實(shí)發(fā)育早期喪失合成單寧的能力，故其在樹(shù)上能自然脫澀，成熟采收時(shí)果實(shí)不呈澀味，可直接食用；澀柿果實(shí)采后需經(jīng)脫澀處理后方可食用。柿果的脫澀研究已經(jīng)取得了很大的成功，例如樹(shù)上乙醇蒸氣包裹果實(shí)，高濃度的二氧化碳或氮?dú)馓幚?，溫水浸泡或者交替凍融等都能完成脫澀。而且研究表明高濃度的二氧化氮處理能夠使柿果在脫澀的同時(shí)保脆。關(guān)于柿果脫澀的機(jī)制很早以前就有人開(kāi)始研究了。已有研究報(bào)道，脫澀處理過(guò)程中伴隨著大量的乙醛累積。Matsuo和Ito (1977)提出二氧化碳脫澀處理中涉及了兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過(guò)程。首先，果實(shí)在二氧化碳處理?xiàng)l件下通過(guò)無(wú)氧呼吸累積大量的乙醛。其次，乙醛與可溶性單寧結(jié)合成一種不澀的不溶性物質(zhì)，促使果實(shí)脫澀。Matsuo等(1991)也證明了無(wú)氧呼吸中產(chǎn)生的乙醛直接參與了柿子的脫澀。因此乙醛介導(dǎo)的可溶性單寧縮合反應(yīng)是柿果實(shí)脫澀的核心。Yamada等(2002)研究認(rèn)為，ADH和PDC是柿果實(shí)內(nèi)乙醛合成的關(guān)鍵酶，但至今為止，ADH和PDC兩基因在柿果實(shí)脫澀研究中的調(diào)控機(jī)制仍未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種柿子脫澀相關(guān)基因的克隆與瞬時(shí)表達(dá)方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)
I.柿果實(shí)中ADH和PDC基因家族成員3’端序列的獲得
首先進(jìn)行柿子組織(果肉，莖，葉，和花)RNA的提取，3’⑶NA和5’⑶NA逆轉(zhuǎn)錄得到⑶NA模板，通過(guò)查找NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上其他植物上已知的ADH和PDC基因家族成員序列，然后用ClustalX (V 1.81)軟件比對(duì)找到保守區(qū)間并在其間設(shè)計(jì)兼并引物(SEQ ID NO 1 ；SEQ IDNO :2)，克隆 2 個(gè) ADH 基因部分編碼片段(SEQ ID NO :39 ;SEQ ID NO :40);
根據(jù)前面兼并克隆到的ADH編碼區(qū)片段以及NCBI上已公布的ADH和TOC基因家族EST序列，設(shè)計(jì)引物(SEQ ID NO :3 16),利用 3’RACE( rapid ampIi cation of cDNA ends)克隆技術(shù)體系，PCR擴(kuò)增，片段回收，連接，轉(zhuǎn)化，涂板，送測(cè)，最終分別獲得了 3個(gè)ADH和4個(gè)PDC基因家族成員的3’端序列(SEQ ID NO :41 47)。2.柿果實(shí)中ADH和PDC基因家族成員在柿果實(shí)脫澀處理中的基因表達(dá)分析首先完成柿子二氧化碳和乙烯脫澀處理，果肉RNA提取和cDNA合成，用步驟2中得到的3’端序列的UTR區(qū)設(shè)計(jì)特異引物(SEQ ID NO :17 30)，引物特異性檢測(cè)，熔點(diǎn)曲線分析、凝膠電泳分析和定量PCR產(chǎn)物再測(cè)序確認(rèn)序列的正確性。實(shí)時(shí)定量PCR分析ADH和PDC基因家族各成員在處理與對(duì)照中的表達(dá)模式。3、柿果實(shí)中ADH和PDC基因家族成員全長(zhǎng)序列的獲得以及柿葉片瞬時(shí)表達(dá)體系構(gòu)建根據(jù)獲得的3’端序列設(shè)計(jì)5’RACE引物(SEQ ID NO :31 34)，以步驟I中得到的5’RACEQ)NA為模板,利用5’RACE ( rapid ampIi cation of cDNA ends)克隆技術(shù)體系,最終分別獲得了 I個(gè)ADH和I個(gè)TOC 5’端序列。分別設(shè)計(jì)跨起始子和終止子的上游引物和下游引物(SEQ ID NO :35 38)，以步驟2中得到的CDNA為模板，克隆并得到ADH和PDC的全長(zhǎng)基因(SEQ ID NO 48 ；SEQ ID NO 49),選取公司返回的帶有ADH和TOC的全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒用于下面的雙酶切，構(gòu)建表達(dá)載體，電導(dǎo)轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌制備，甘油菌零下80°C保存，將保存的甘油菌接種至LB (kan50)平板，28 0C培養(yǎng)2天，再轉(zhuǎn)移至新的LB (kan50)平
板培養(yǎng)I天(帶至北京)，實(shí)驗(yàn)的前一天，再轉(zhuǎn)移至新LB平板培養(yǎng)，帶至實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)(北京房山磨盤(pán)柿第一村)將LB (kan50)平板上的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到裝有注射的50ml的離心管里(注·射液配制10 mM MgCl2和O. 5 mM乙酰丁香酮)，搖勻。選擇成熟度一致的“磨盤(pán)柿”葉片，葉片背面以葉脈為對(duì)稱軸，兩邊分別注射帶有SK和目的基因(DkADHl (SEQ ID NO 48)或DkPDC2 (SEQ ID NO :49)基因)的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液。三天后采摘葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室，沿葉片注射的邊緣剪下，用液氮速凍分別取樣。樣品保存在零下80°C下供下一步實(shí)驗(yàn)用。每個(gè)基因各注射10片柿葉。對(duì)樣品進(jìn)行可溶性單寧含量測(cè)定，分析葉片瞬時(shí)表達(dá)的效應(yīng)。本發(fā)明利用擬南芥和番茄等其他植物上已知的乙醇脫氫酶和丙酮酸脫氫酶基因堿基序列，在相對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)兼并引物克隆ADH和PDC部分編碼區(qū)，結(jié)合NCBI上公布的柿子ADH和PDC基因的EST序列，再利用3’RACE技術(shù)克隆出ADH和PDC基因的3’端序列，在3’端序列的UTR區(qū)設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行ADH和PDC基因家族各成員的表達(dá)分析，然后利用5’RACE技術(shù)克隆出ADH和PDC基因的全長(zhǎng)序列，表達(dá)載體構(gòu)建，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，進(jìn)而進(jìn)行了柿子葉片的瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證基因功能。本發(fā)明方法是克隆出柿子脫澀相關(guān)的基因家族成員，分析這些家族成員在柿子脫澀處理中的表達(dá)模式，最后通過(guò)柿子葉片的瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證目的基因的功能。這從分子機(jī)制上闡明了柿子采后脫澀的調(diào)控機(jī)制，有利用進(jìn)一步開(kāi)展柿子采后脫澀機(jī)制的功能驗(yàn)證(轉(zhuǎn)基因，基因互作等)研究。


圖I是柿子果實(shí)中ADH基因家族成員在柿果實(shí)二氧化碳脫澀處理中的基因表達(dá)模式。圖2是柿子果實(shí)中PDC基因家族成員在柿果實(shí)二氧化碳脫澀處理中的基因表達(dá)模式。圖3是柿子果實(shí)中ADH基因家族成員在柿果實(shí)乙烯脫澀處理基因表達(dá)模式。圖4是柿子果實(shí)中PDC基因家族成員在柿果實(shí)乙烯脫澀處理基因表達(dá)模式。圖5是柿子葉片瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果柿子葉片可溶性單寧含量分析。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但實(shí)施例不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例中常規(guī)的基因操作方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)。
實(shí)施例I :實(shí)時(shí)定量熒光PCR分析柿子中ADH和PDC家族成員不同處理中的表達(dá)模式；
(一)實(shí)驗(yàn)方法
I、柿子果實(shí)總RNA提取
在設(shè)計(jì)好的取樣點(diǎn)，對(duì)照，乙烯和二氧化碳處理的果實(shí)果肉分別用液氮冷凍，保存于-80°C。提取RNA時(shí),稱取2g凍樣加液氮充分研磨后,分別加入兩管加有4ml β -巰基乙醇/CTAB (80ul/4ml)提取緩沖液的離心管中，65°C加熱，渦旋混合使細(xì)胞徹底破裂，65°C再次加熱l_2min ;然后往離心管中加入4ml氯仿異戊醇(24 :1)抽提液，迅速渦旋混合均勻；15°C IOOOOrpm離心IOmin,吸取上清液到新的離心管,用氯仿異戍醇(24 1)重新抽提一次，吸取上清液約3ml，兩管合一管，加入1/4體積的lOmol/Ι的LiCl2,4°C冰箱過(guò)夜；40C IOOOOrpm離心30min，倒掉上清液，將離心管再次短暫離心一下，吸掉底部多余的溶液，加入400 μ I 65°C SSTE，用手指彈動(dòng)管壁使沉淀充分溶解，將液體轉(zhuǎn)入到I. 5ml離心管中，再加入400 μ I氯仿異戍醇(24 1)抽提液,潤(rùn)旋混合；2(TC IOOOOrpm離心IOmin,吸取 上清液到新的離心管中，加入2倍體積的_20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻，_80°C放置30min-lhour ；4°C IOOOOrpm離心20min，倒掉上清液，短暫離心后吸出殘余液體，將沉淀在通風(fēng)櫥晾干(約IOmin);每管加入15-30 μ I DEPC水溶解沉淀，得到粗RNA樣品；用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所得樣品質(zhì)量，好的RNA結(jié)果顯示樣品有兩條帶，亮度為上條下條 2 :1。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所得樣品純度，吸取1μ I RNA樣品加入69μ I DEPC水混合均勻，檢測(cè)OD26tl和OD28tl,分析得到OD26tZOD28tl=L 8-2. O,說(shuō)明RNA純度符合標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)公式OD26tlX 40(RNA濃度系數(shù))Χ70 (樣品稀釋倍數(shù))即可計(jì)算出樣品RNA的濃度(ng/μ 1)，以備下一步實(shí)驗(yàn)用。2、柿子ADH和PDC家族成員表達(dá)模式分析
首先米用 TURBO DNase (Ambion, Applied Biosystems)去除基因組 DNA 污染，米用iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;然后將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA吸取5 μ I稀釋10倍，內(nèi)參基因的上下游擴(kuò)增引物DkACtin-FP和DkACtin-RP分別稀釋至成 2. 5 μ M ;將 SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (10 μ I/ 每反應(yīng))、DkACtin_FP (I μ I/每反應(yīng))和DkACtin-RP (I μ I/每反應(yīng))，水(6 μ I/每反應(yīng))配制成混合工作液，充分混勻，分裝到每個(gè)反應(yīng)管；再于各反應(yīng)管內(nèi)加入對(duì)應(yīng)的稀釋10倍的cDNA模板(2 μ I);短暫離心將反應(yīng)液收集于管底，進(jìn)行Q-PCR ;反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性3min ;95°C變性10sec，60°C退火30sec，95°C延伸10sec，45個(gè)熱循環(huán)；熔解曲線分析65°C到95°C。根據(jù)每個(gè)模板對(duì)應(yīng)的Ct值(Cycle threshold),再次對(duì)模板原液進(jìn)行調(diào)整，使所有模板Ct值均為23_24之間。將柿子ADH和PDC各家族成員實(shí)時(shí)定量PCR引物分別稀釋至2. 5 μ M，按照前面DkACtin基因的方法配制工作液，⑶NA模板為調(diào)整好的CT值的工作液，每個(gè)模板都要設(shè)置ACtin對(duì)照基因和陰性對(duì)照。Q-PCR程序與之前一致；反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)每個(gè)模板得到的Ct值，運(yùn)用公式2-(et2-etl)即可得到該基因的相對(duì)表達(dá)量。(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2、實(shí)時(shí)定量熒光PCR結(jié)果顯示，在二氧化碳處理和乙烯處理中DkADHl (SEQ ID NO:41)和DkPDCl (SEQ ID NO 44),DkPDC2 (SEQ ID NO :45)與果實(shí)的澀味脫除成正相關(guān)，即隨著柿果實(shí)脫澀處理的進(jìn)行，可溶性單寧逐漸變低，DKADHl (SEQ ID NO :41)和DkPDCl (SEQID NO 44),DkPDC2 (SEQ ID NO :45)的相對(duì)表達(dá)量逐漸上升，處理移除后，再有不同程度的下調(diào)(圖1，圖2，圖3，圖4)。實(shí)施例2 :柿葉片瞬時(shí)表達(dá)體系構(gòu)建。(一)實(shí)驗(yàn)方法柿果實(shí)中ADH和PDC基因家族成員全長(zhǎng)序列的獲得
首先根據(jù)獲得的3’端序列設(shè)計(jì)5’ RACE引物，以5’ RACE CDNA為模板，利用5’ RACE(rapid ampIi cation of cDNA ends)克隆技術(shù)體系，最終獲得了 ADH和F1DC基因家族成員5’端序列。然后以5’端序列為模板，分別設(shè)計(jì)跨起始子和終止子的上游引物和下游引物，以組織CDNA為模板，PCR反應(yīng)體系模板CDNA: lul, DNTP mix (2. 5mM) : I. 6ul，上游引物(IOmM) :O. 8ul,下游引物(IOmM) :O. 8ul, Pyrobest DNA Polymerase: O. lul,IOXpyrobest Buffer: 2. Oul，DEPC 水13. 7ul。通過(guò) PCR 擴(kuò)增94°C 預(yù)變性 5min，35個(gè)循環(huán)(95°C 30 s，55°C 30 s，72V 180s)，最后72°C延伸10m，回收PCR目的產(chǎn)物，回收產(chǎn)物加 A,步驟如下10XA-Tail Buffer 2. 5ul, DNTP mixture (2. 5mM) 2ul, A-TailingEnzyme :0. 25ul。然后把上述回收到的DNA片段2. 5ul，DEPC水17. 25ul混合均勻，72°C·20min,冰上 2min。產(chǎn)物連接到 pGEM-Teasy 載體(Promega, A1360)上，連接體系2XRapidLigation Buffer 5uI,PGEM-T EASY Vetor :lul,上述產(chǎn)物3ul, T4 DNA ligase lul。4°C連接過(guò)夜，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行抗性篩選，菌液檢測(cè)，將連有目的片段的單菌落搖送公司測(cè)序(Invitrogen),序列分析并確認(rèn)ADH和F1DC的全長(zhǎng)基因。柿葉片瞬時(shí)表達(dá)體系構(gòu)建柿葉片瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建選取公司返回的正確的質(zhì)粒用于下面的雙酶切，雙酶切體系Notl lul ；Spel lul ；10XH Buffer 2ul ；0. 1%BSA 2ul ;質(zhì)粒3ul ;DEPC水llul。酶切產(chǎn)物電泳檢測(cè)，回收。連接體系酶切后的pGreenll0029 62-SK :lul，酶切后的質(zhì)粒4ul，Solution :5ul。4°C連接過(guò)夜，產(chǎn)物電導(dǎo)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，涂板，抗性篩選，單菌落菌液檢測(cè)，選擇轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌加1:1的甘油，零下80°C保存，待下一步實(shí)驗(yàn)用。將上述保存的甘油菌接種至LB (kan50)平板，28 0C培養(yǎng)2天，再轉(zhuǎn)移至新的LB(kan50)平板培養(yǎng)I天(帶至北京)，實(shí)驗(yàn)的前一天，再轉(zhuǎn)移至新平板培養(yǎng)，帶至實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)(北京房山磨盤(pán)柿第一村)，將LB(kan50)平板上的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到裝有注射液(10 mM MgCl2 ；0. 5mM acetosyringone 50ml)的離心管里充分搖勻。選擇成熟度一致的磨盤(pán)柿葉片，葉片背面以葉脈為對(duì)稱軸，兩邊分別注射帶有SK和目的基因(DkADHl (SEQ ID NO 48) *DkPDC2SEQ ID NO :49)的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液，每個(gè)基因各注射10片柿葉，三天后采摘葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室，沿葉片注射的邊緣剪下，用液氮速凍分別取樣。樣品保存在零下80°C下，對(duì)樣品進(jìn)行可溶性單寧含量測(cè)定，分析葉片瞬時(shí)表達(dá)的效應(yīng)(參見(jiàn)圖5)。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種柿子脫澀相關(guān)基因的克隆與瞬時(shí)表達(dá)方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn) (1)柿果實(shí)中ADH和PDC基因家族成員3’端序列的獲得首先進(jìn)行柿子組織RNA的提取，3’⑶NA和5’⑶NA逆轉(zhuǎn)錄得到⑶NA模板，通過(guò)查找NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上其他植物上已知的ADH和PDC基因家族成員序列，然后用ClustalX v I. 81軟件比對(duì)找到保守區(qū)間并在其間設(shè)計(jì)兼并引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，克隆2個(gè)ADH基因部分編碼片段SEQ ID NO:39和SEQ ID NO 40 ;根據(jù)前面兼并克隆到的ADH編碼區(qū)片段以及NCBI上已公布的ADH和PDC基因家族EST序列，設(shè)計(jì)引物SEQ ID NO :3 16，利用3，RACE克隆技術(shù)體系，PCR擴(kuò)增，片段回收，連接，轉(zhuǎn)化，涂板，送測(cè)，最終分別獲得了 3個(gè)ADH和4個(gè)PDC基因家族成員的3’端序列 SEQ ID NO :41 47 ； (2)柿果實(shí)中ADH和PDC基因家族成員在柿果實(shí)脫澀處理中的基因表達(dá)分析首先完成柿子二氧化碳和乙烯脫澀處理，果肉RNA提取和cDNA合成，用步驟(2)中得到的3’端序列的UTR區(qū)設(shè)計(jì)特異引物SEQ ID NO : 17 30，引物特異性檢測(cè)，熔點(diǎn)曲線分析、凝膠電泳分析和定量PCR產(chǎn)物再測(cè)序確認(rèn)序列的正確性，實(shí)時(shí)定量PCR分析ADH和PDC基因家族各成 員在處理與對(duì)照中的表達(dá)模式； (3)柿果實(shí)中ADH和PDC基因家族成員全長(zhǎng)序列的獲得以及柿葉片瞬時(shí)表達(dá)體系構(gòu)建根據(jù)獲得的3’端序列設(shè)計(jì)5’ RACE引物SEQ ID NO :31 34，以步驟(I)中得到的5’ RACECDNA為模板，利用5’RACE克隆技術(shù)體系，最終分別獲得I個(gè)ADH和I個(gè)TOC 5’端序列，分別設(shè)計(jì)跨起始子和終止子的上游引物和下游引物，SEQ ID NO :35 38，以步驟(2)中得到的CDNA為模板，克隆并得到ADH和PDC的目的基因SEQ ID N0:48和SEQ ID NO 49,選取公司返回的帶有ADH和roc的全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒用于下面的雙酶切，構(gòu)建表達(dá)載體，電導(dǎo)轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌制備，甘油菌零下80°C保存，將保存的甘油菌接種至kan50的LB平板，28 0C培養(yǎng)2天，轉(zhuǎn)移至kan50的LB平板培養(yǎng)I天，實(shí)驗(yàn)的前一天，再轉(zhuǎn)移至新的LB平板培養(yǎng)，再將kan50的LB平板上的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到裝有注射夜的離心管里，搖勻，選擇成熟度一致的“磨盤(pán)柿”葉片，葉片背面以葉脈為對(duì)稱軸，兩邊分別注射帶有SK和目的基因SEQ ID N0:48或SEQ ID NO:49的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液，三天后采摘葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室，沿葉片注射的邊緣剪下，用液氮速凍分別取樣，樣品保存在零下80°C下供下一步實(shí)驗(yàn)用，每個(gè)基因各注射10片柿葉，對(duì)樣品進(jìn)行可溶性單寧含量測(cè)定，分析葉片瞬時(shí)表達(dá)的效應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種柿子脫澀相關(guān)基因的克隆與瞬時(shí)表達(dá)方法，其特征在于，步驟(I)所述的柿子組織包括果肉，莖，葉，和花。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種柿子脫澀相關(guān)基因的克隆與瞬時(shí)表達(dá)方法，其特征在于，步驟(3)所述注射液由10 mM MgCl2和0.5 mM乙酰丁香酮配制而成。
全文摘要
本發(fā)明提供一種柿子脫澀相關(guān)基因的克隆與瞬時(shí)表達(dá)方法，通過(guò)先獲得基因3’端序列，再通過(guò)3'RACE技術(shù)獲得柿果實(shí)中ADH和PDC基因家族成員3’端序列；采用Q-PCR技術(shù)分析ADH和PDC基因家族成員在柿果實(shí)脫澀處理中的基因表達(dá)；分離得到柿果實(shí)中ADH和PDC基因家族成員全長(zhǎng)序列，然后建立柿葉片瞬時(shí)表達(dá)體系。本發(fā)明方法是克隆出柿子脫澀相關(guān)的基因家族成員，分析這些家族成員在柿子脫澀處理中的表達(dá)模式，最后通過(guò)柿子葉片的瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證目的基因的功能，從分子機(jī)制上闡明了柿子采后脫澀的調(diào)控機(jī)制，有利用進(jìn)一步開(kāi)展柿子采后脫澀機(jī)制的轉(zhuǎn)基因，基因互作等功能驗(yàn)證研究。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102732536SQ20121019542
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者孫崇德, 殷學(xué)仁, 閔婷, 陳昆松 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)