專利名稱：一株功能植物乳桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株功能植物乳桿菌，以及利用該功能植物乳桿菌生產(chǎn)的微生物飼料添加劑、制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微生物飼料添加劑是根據(jù)微生態(tài)平衡與失調(diào)理論、微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)理論和微生態(tài)防治理論選用動(dòng)物體內(nèi)正常微生物成員及其促進(jìn)物質(zhì)經(jīng)微生物發(fā)酵和不同的加工工藝而制成的活菌制劑。它能夠在數(shù)量或種類上補(bǔ)充腸道內(nèi)減少或缺乏的正常微生物，調(diào)整或維持腸道內(nèi)微生態(tài)平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而達(dá)到防病治病、提高飼料轉(zhuǎn)化率和畜禽生產(chǎn)性能之目的。微生物飼料添加劑以其無毒副作用、無耐藥性、無殘留、成本低、效果顯著等特點(diǎn)，逐漸得到人們的肯定并發(fā)展迅速，是抗生素的有效替代品。 植物乳桿菌是人和動(dòng)物腸道的正常菌群，廣泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，已有眾多研究證明植物乳桿菌在抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖，促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，提高機(jī)體免疫力等方面具有重要的生物學(xué)功能。植物乳桿菌通過與病原菌對(duì)限制性營(yíng)養(yǎng)素的能力競(jìng)爭(zhēng)，來抑制病原菌的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的組成，形成生物學(xué)屏障。同時(shí)，通過其代謝所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物乳酸、細(xì)菌素、以及雙乙酰對(duì)其它細(xì)菌的作用，調(diào)整菌群之間的關(guān)系，維持和保證菌群最佳優(yōu)勢(shì)組合以及這種組合的穩(wěn)定，阻止了致病菌的定殖和入侵，拮抗致病菌和有害微生物的生長(zhǎng)及其毒素的粘附，是一種理想的微生物飼料添加劑。同時(shí)植物乳桿菌的中β葡萄糖苷酶具有較高的活性，能降解飼料中的植物性原料常含有毒性和抗?fàn)I養(yǎng)化合物。篩選功能植物乳桿菌對(duì)開發(fā)多功能性的微生物飼料添加劑具有現(xiàn)實(shí)意義，同時(shí)多功能性微生物飼料添加劑也是發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)，提高畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)效益，保障畜產(chǎn)品品質(zhì)和畜產(chǎn)食品安全的重要發(fā)展方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一株功能植物乳桿菌及其應(yīng)用，該菌株可在高溫和低pH條件生存，產(chǎn)生對(duì)多種病原菌和腐敗菌具有廣譜抑制作用的細(xì)菌素。本發(fā)明的一方面在于公開一株功能植物乳桿菌，該菌株是分離自市售東北傳統(tǒng)酸菜發(fā)酵潰物的新菌株，經(jīng)鑒定后確認(rèn)為功能植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)DLH-502，其在2011年10月12日，保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。其保藏編號(hào)為CGMCC No. 5338。本發(fā)明所述的保藏編號(hào)為CGMCC No. 5338的功能植物乳桿菌(LactobaciIIusplantarum) DLH-502經(jīng)形態(tài)鑒定及生物學(xué)特性研究,其具有如下特征菌落形態(tài)乳白色，濕潤(rùn)，表面光滑，中間凸起，邊緣整齊。細(xì)胞形態(tài)革蘭氏染色陽性，短桿菌。無鞭毛，不形成芽胞，兼性厭氧菌。
生理生化特征菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)和碳源發(fā)酵實(shí)驗(yàn)如表I。本發(fā)明所述菌株的16s rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增與堿基序列測(cè)定，其測(cè)序結(jié)果如序列表中的SEQ ID NO lo本發(fā)明的另ー個(gè)目的是上述的功能植物乳桿菌DLH-502在生產(chǎn)微生物飼料添加劑中的應(yīng)用。上述的功能植物乳桿菌DLH-502在生產(chǎn)微生物飼料添加劑中的應(yīng)用，具體是指， 在生產(chǎn)活菌制劑和廣譜抑菌作用的細(xì)菌素方面的應(yīng)用。在上述的應(yīng)用中所述的抑菌作用中，抑菌是指抑制細(xì)菌，所包括的細(xì)菌具體為下述中的一種腸炎沙門氏菌(Salmonella enterica)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapeneumoniae)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、金黃色葡萄球菌(btaphy丄ococcus aureusノ。本發(fā)明下述具體實(shí)施例中，使用用腸炎沙門氏菌(ATCC 13076)為抑菌指示菌，與功能植物乳桿菌DLH-502混合后作為實(shí)驗(yàn)組，證明本發(fā)明所述的功能植物乳桿菌DLH-502在生產(chǎn)廣譜抑菌作用的細(xì)菌素方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供ー種利用上述的功能植物乳桿菌DLH-502制備發(fā)酵活性成分，其制備方法的步驟包括①菌種活化將功能植物乳桿菌DLH-502的菌種接種培養(yǎng)基，在25 38°C培養(yǎng)12 20小時(shí)，菌數(shù)至少達(dá)I. OX 108CFU/mL，獲得活化菌種；②按照體積百分比為O. 025 O. 05%比例向小發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中加入步驟①獲得的活化菌種，在25 38°C培養(yǎng)8 16小時(shí)，菌數(shù)至少達(dá)I. OX 109CFU/mL，得發(fā)酵用種子菌液；③按照體積百分比為O. 05 O. 5%比例向大發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中加入步驟②的獲得的種子菌液，在16 40°C培養(yǎng)12 24小時(shí)，菌數(shù)至少達(dá)I. O X 109CFU/mL，獲得功能植物乳桿菌DLH-502菌的發(fā)酵活性成分；上述步驟①、②、③中使用的培養(yǎng)基均為12%脫脂乳，121 °C高壓滅菌20min。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是利用上述的方法生產(chǎn)的功能植物乳桿菌DLH-502的發(fā)酵活性成分。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是利用上述的功能植物乳桿菌DLH-502的發(fā)酵活性成分，應(yīng)用于生產(chǎn)微生物飼料添加剤。具體的，上述的在生產(chǎn)微生物飼料添加劑中的應(yīng)用，是指生產(chǎn)的微生物飼料添加齊U，用于制備增強(qiáng)免疫的產(chǎn)品中，從而提高腸道總免疫球蛋白水平，同時(shí)起到預(yù)防腹瀉的作用。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是利用上述的功能植物乳桿菌DLH-502的發(fā)酵活性成分在制備食品或飼料添加劑中的應(yīng)用。具體的，上述的在制備食品或飼料添加劑中的應(yīng)用，是指利用上述的功能植物乳桿菌DLH-502的發(fā)酵活性成分提高飼料利用率，改善畜舍環(huán)境，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)畜產(chǎn)品。本發(fā)明中，涉及微生物菌種的分離純化，擴(kuò)增培養(yǎng)及鑒定的各個(gè)步驟中，所用的實(shí)驗(yàn)操作方法均為常規(guī)操作和共知常識(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員均可按照教科書或者工具書等中披露的解決該技術(shù)問題的技術(shù)手段完成。目前有許多研究表明，在動(dòng)物生產(chǎn)體系中，在動(dòng)物飼料中加入有益菌的方法，可以改變腸道菌群的組成和活性的能力，可作為調(diào)節(jié)消化道微生物群和由此提高動(dòng)物生產(chǎn)性能的ー個(gè)機(jī)制，在農(nóng)畜業(yè)中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明所述的該功能植物乳桿菌DLH-502具有很高的耐酸活性，可以耐受胃的酸性，到達(dá)腸道生長(zhǎng)繁殖，從而發(fā)揮功能活性作用。本發(fā)明的實(shí)施例提供了該功能植物乳桿菌DLH-502作為微生物飼料添加劑的應(yīng)用方案，并進(jìn)行了小鼠實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明，其具有增加腸道免疫球蛋白產(chǎn)生，提高免疫反應(yīng)，預(yù)防腹瀉、增強(qiáng)機(jī)體免疫カ的功能。利用本發(fā)明功能植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) DLH-502菌株生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)物作為飼料飼喂豬、雞、肉牛、奶牛，具有提高飼料利用率，增重快；提高機(jī)體免疫力，預(yù)防腹瀉等疾病的發(fā)生；改 善畜舍環(huán)境，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高檔畜產(chǎn)品；從而起到減少并替代抗菌素和生長(zhǎng)劑的使用。


圖I.功能植物乳桿菌DLH-502顯微鏡照片；圖2.功能植物乳桿菌DLH-502的耐酸活性測(cè)定結(jié)果；圖3.功能植物乳桿菌DLH-502對(duì)病原細(xì)菌抑制作用測(cè)定結(jié)果；圖4.功能植物乳桿菌DLH-502對(duì)免疫球蛋白增強(qiáng)作用測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中所用試劑，如無特殊說明，均為商業(yè)途徑獲得，或者以常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法配制；下述實(shí)施例中所用試驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法。MRS培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g，牛肉膏10. Og,酵母膏5. 0g，檸檬酸氫ニ銨[(NH4)2HC6H5O7] 2. Og,葡萄糖(C6H12O6 · H2O) 20. Og,吐溫 80 I. OmL,こ酸鈉(CH3COONa · 3H20) 5. 0g，磷酸氫ニ鉀(K2HPO4 · 3H20) 2. 0g，硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 0. 58g，硫酸錳(MnSO4 · H2O) 0. 25g，瓊脂 18. 0g，蒸餾水 IOOOmL, pH 6. 2 6. 6，121 °C 高壓滅菌 20min。標(biāo)準(zhǔn)人工胃液取濃度為Imol/mL的稀鹽酸，加水稀釋，將pH調(diào)至I. 5。每IOOmL液體中加入Ig胃蛋白酶，混勻，用0. 2μπι的無菌濾頭過濾待用。實(shí)施例I功能植物乳桿菌DLH-502的獲得與形態(tài)及生理學(xué)鑒定菌種來源分離自傳統(tǒng)市售發(fā)酵東北傳統(tǒng)酸菜發(fā)酵潰物。具體方法為在無菌條件下，取發(fā)酵潰物5g，加入到45mL無菌生理鹽水中，充分震蕩5min，以10倍系列稀釋，選合適的梯度，取IOOuL分別涂布于含有MRS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，35°C靜置培養(yǎng)并計(jì)數(shù)。從含MRS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中挑選單菌落，劃線分離純化培養(yǎng)，純化出單菌落，并對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)，經(jīng)過油鏡檢驗(yàn)，結(jié)果如圖I所示，功能植物乳桿菌DLH-502顯微鏡照片。該菌為革蘭氏染色陽性，短桿菌。無鞭毛，不形成芽胞。本發(fā)明功能植物乳桿菌DLH-502為兼性厭氧菌,有無空氣均可生長(zhǎng)。菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)和碳源發(fā)酵實(shí)驗(yàn)(參考文獻(xiàn)凌代文.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M].北京.中國(guó)輕エ業(yè)出版社，1999，117-129)，結(jié)果如表I所示。表I.功能植物乳桿菌DLH-502形態(tài)及生理學(xué)鑒定

權(quán)利要求
1.一株功能植物乳桿菌，其特征在于，該菌株為功能植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) DLH-502,其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC No. 5338。
2.如權(quán)利要求I所述的功能植物乳桿菌DLH-502在生產(chǎn)微生物飼料添加劑中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的功能植物乳桿菌DLH-502在生產(chǎn)活菌制劑和廣譜抑菌作用的細(xì)菌素方面的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利2或3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的抑菌作用中，所指的細(xì)菌為腸炎沙門氏菌(Salmonella enterica)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的ー種。
5.如權(quán)利要求I所述的功能植物乳桿菌DLH-502的發(fā)酵活性成分的制備方法，其特征在于，步驟包括 ①菌種活化將功能植物乳桿菌DLH-502的菌種接種培養(yǎng)基，在25 38°C培養(yǎng)12 20小吋，菌數(shù)至少達(dá)I. OX 108CFU/mL，獲得活化菌種； ②按照體積百分比為O.025 O. 05%比例向培養(yǎng)基中加入步驟①的活化菌種，在25 38°C培養(yǎng)8 16小時(shí)，菌數(shù)至少達(dá)I. OX 109CFU/mL，得發(fā)酵用種子菌液； ③按照體積百分比為0.05 0. 5%比例向培養(yǎng)基中加入步驟②的獲得的種子菌液，在16 40°C培養(yǎng)12 24小時(shí)，菌數(shù)至少達(dá)I. OX 109CFU/mL，獲得功能植物乳桿菌DLH-502菌的發(fā)酵活性成分； 上述步驟①、②、③中使用的培養(yǎng)基均為12%脫脂乳，121 °C高壓滅菌20min。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法生產(chǎn)的功能植物乳桿菌DLH-502的發(fā)酵活性成分。
7.如權(quán)利要求6所述的功能植物乳桿菌DLH-502的發(fā)酵活性成分在生產(chǎn)微生物飼料添加劑中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于制備增強(qiáng)免疫的產(chǎn)品。
9.如權(quán)利要求6所述的功能植物乳桿菌DLH-502的發(fā)酵活性成分在制備食品或飼料添加劑中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于提高飼料利用率，改善畜舍環(huán)境，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)畜產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株功能植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)DLH-502及其應(yīng)用。還公布了利用DLH-502菌株制備的菌劑及其特殊功能。本發(fā)明DLH-502菌株可在廣范圍溫度和低pH條件生存，產(chǎn)生對(duì)多種病原菌和腐敗菌具有抑制作用的細(xì)菌素，增加腸道免疫球蛋白產(chǎn)生和免疫防御功能。利用本發(fā)明DLH-502菌株生產(chǎn)的微生物飼料添加劑飼喂豬、雞、肉牛、奶牛，具有提高飼料利用率，增重快；提高機(jī)體免疫力，預(yù)防腹瀉等疾病的發(fā)生；改善畜舍環(huán)境，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高檔畜產(chǎn)品；減少并替代抗菌素和生長(zhǎng)劑的使用等功能特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/00GK102690771SQ201210193029
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月12日
發(fā)明者崔京春, 胡東良 申請(qǐng)人:大連吉翔農(nóng)業(yè)科技有限公司