專利名稱：熱啟動(dòng)dna聚合酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熱啟動(dòng)DNA聚合酶及其應(yīng)用，具體涉及含有兩種DNA結(jié)合蛋白的熱啟動(dòng)DNA聚合酶，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
PCR已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，基本步驟包括，變性一退火一延伸。具體①模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至94°C左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至引物退火溫度，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。③引物的延伸DNA模板一引物結(jié)合物在耐高溫DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成 一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性一退火一延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。經(jīng)過幾十個(gè)循環(huán)后就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。熱啟動(dòng)PCR是提高擴(kuò)增能力，擴(kuò)增特異性，擴(kuò)增靈敏度最好的一種方法。傳統(tǒng)熱啟動(dòng)PCR技術(shù)主要利用兩種方法抗體封閉法與化學(xué)封閉法。兩種方法分別利用化學(xué)物質(zhì)與抗體在常溫下與DNA聚合酶活性中心結(jié)合以封閉酶活，在高溫條件下化學(xué)物質(zhì)或抗體失活，釋放酶活，從而實(shí)現(xiàn)熱啟動(dòng)?？贵w封閉法是通過抗體特異性封閉酶活性中心，這種方法酶與抗體結(jié)合屬于非化學(xué)鍵結(jié)合，在酶保存過程中，易出現(xiàn)抗體活性降低的風(fēng)險(xiǎn)，而且酶活性中心不是唯一，很難完全封閉酶活。化學(xué)封閉法，是通過化學(xué)物質(zhì)與耐高溫DNA聚合酶肽鏈上氨基形成穩(wěn)定的酰胺鍵，在常溫下可完全封閉酶活性，通過高溫將酰胺鍵水解，釋放酶活。這種方法需要長(zhǎng)時(shí)間高溫(至少15分鐘)，水解酰胺鍵，長(zhǎng)時(shí)間高溫容易使DNA聚合酶活性降低；對(duì)于痕量模板，長(zhǎng)時(shí)間高溫易使模板降解。這兩種方法并非實(shí)現(xiàn)熱啟動(dòng)最理想的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種熱啟動(dòng)DNA聚合酶，該酶極大地提高了 PCR反應(yīng)特異性、靈敏度。本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種熱啟動(dòng)DNA聚合酶在熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案為本發(fā)明提供了一種熱啟動(dòng)DNA聚合酶,該酶包括能夠與引物結(jié)合的單鏈DNA結(jié)合蛋白；能夠與DNA模板結(jié)合的雙鏈DNA結(jié)合蛋白；及DNA 聚合酶。在本發(fā)明所述熱啟動(dòng)DNA聚合酶中，兩種結(jié)合蛋白與DNA序列的結(jié)合是非特異性結(jié)合。單鏈DNA結(jié)合蛋白與PCR體系中單鏈結(jié)構(gòu)的引物結(jié)合，而雙鏈DNA結(jié)合蛋白與雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA模板相結(jié)合。結(jié)合蛋白后的引物與模板無法形成復(fù)合物，也不能與DNA聚合酶相結(jié)合，因此無法被DNA聚合酶所利用，從而避免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，兩種結(jié)合蛋白質(zhì)在預(yù)變性步驟受熱失活，釋放出引物、模板參與PCR反應(yīng)，使PCR反應(yīng)正常進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)熱啟動(dòng)。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的“能夠與引物結(jié)合的單鏈DNA結(jié)合蛋白”，“能夠與DNA模板結(jié)合的雙鏈DNA結(jié)合蛋白”可以是現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報(bào)道的具有該功能的任何單鏈DNA結(jié)合蛋白或雙鏈DNA結(jié)合蛋白，其可以通過購買或按照現(xiàn)有技術(shù)的方法進(jìn)行制備而獲得。進(jìn)一步地，所述單鏈DNA結(jié)合蛋白，雙鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶的摩爾比為1-2 1-2 10-15。為了詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)效果，本發(fā)明在此提供了一種單鏈DNA結(jié)合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，并提供一種雙鏈DNA結(jié)合蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO 2所示。 進(jìn)一步地，為了達(dá)到更好的技術(shù)效果，所述DNA聚合酶優(yōu)選為Taq DNA聚合酶，可以通過購買或現(xiàn)有技術(shù)制備獲得，例如Easy Taq DNA Polymerase (北京全式金生物技術(shù)有限公司)、TaKaRa Taq (寶生物工程大連有限公司)或Taq DNA Polymerase (天根生化科技有限公司)或所有從克隆有Thermu aquaticus DNA polymerase基因的大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)后,經(jīng)過蛋白純化分離出的94KD的重組蛋白等。本發(fā)明還提供了上述熱啟動(dòng)DNA聚合酶在熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是傳統(tǒng)的熱啟動(dòng)方法，需要利用化學(xué)封閉法或抗體封閉法。由于這兩種方法是對(duì)DNA聚合酶加以封閉，無法完全封閉酶活，使得熱啟動(dòng)效果受到影響。本發(fā)明所述的方法反其道而行之，利用兩種DNA結(jié)合蛋白封閉DNA聚合酶的底物即引物與模板，使得封閉效率可以達(dá)到100%，實(shí)現(xiàn)更為徹底的熱啟動(dòng)。與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明提供的利用熱啟動(dòng)DNA聚合酶進(jìn)行熱啟動(dòng)PCR方法具有更高的擴(kuò)增效率與特異性，尤其對(duì)于高靈敏度、高特異性要求的實(shí)驗(yàn)，如熒光定量PCR，有明顯的優(yōu)勢(shì)。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖I :使用本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)熱啟動(dòng)的示意圖；圖2 :熱啟動(dòng)DNA聚合酶與Platinum Taq酶擴(kuò)增比較電泳圖；其中泳道M:Trans2K Plus DNA Marker,泳道I :Platinum Taq酶擴(kuò)增產(chǎn)物泳道2 :熱啟動(dòng)DNA聚合酶擴(kuò)增產(chǎn)物
具體實(shí)施例方式實(shí)施例中所用的材料及來源分別為Platinum Taq(美國(guó)Invitrogen公司)、TaqDNA Polymerase (天根生化科技有限公司)，EasyPure Genomic DNA Kit (北京全式金生物技術(shù)有限公司)，Trans2K Plus DNA Marker (北京全式金生物技術(shù)有限公司)，pEASY-El表達(dá)載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，大腸桿菌BL21 (DE3)(全式金生物技術(shù)有限公司)，引物合成(北京英俊生物技術(shù)有限公司)。實(shí)施例I兩種DNA結(jié)合蛋白的獲得本發(fā)明所述的兩種DNA結(jié)合蛋白(單鏈DNA結(jié)合蛋白和雙鏈DNA結(jié)合蛋白)可以是現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)公開的任何具有結(jié)合DNA單鏈結(jié)構(gòu)或雙鏈結(jié)構(gòu)的結(jié)合蛋白。為了更好的說明本發(fā)明的效果，本實(shí)施例提供了兩種存在于噬菌體RB6中DNA結(jié)合蛋白。根據(jù)RB6 基因組 DNA 序列(Enterobacteria phage RB69 (Bacteriophage RB69)DNA polymerase (Gp43) GenBank U34036. I.)分別合成單鏈DNA結(jié)合蛋白的核苷酸序列SEQID NO 3和雙鏈DNA結(jié)合蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO :4 (上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，測(cè)序正確后(北京英俊生物技術(shù)有限公司)，將片段分別克隆于PEASY-El表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序分析，其序列與GenBank公布的相應(yīng)序列(GenBank :U34036. I)相同。經(jīng)大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)、純化得到兩種結(jié)合蛋白，所述單鏈結(jié)合蛋白由103個(gè)氨基酸構(gòu)成，見序列表SEQ ID NO :1，雙鏈結(jié)合蛋白由101個(gè)氨基酸組成，見序列表SEQ ID NO :2。 實(shí)施例2 熱啟動(dòng) DNA 聚合酶(TransStart Taq DNA Polymerase)的制備將Taq DNA Polymerase (天根生化科技有限公司)與實(shí)施例I制備的單鏈DNA結(jié)合蛋白、雙鏈DNA結(jié)合蛋白，按照摩爾比10-15 1-2 1_2的比例混勻后既得熱啟動(dòng)DNA聚合酶，-20°C保存。實(shí)施例3I :酶活力測(cè)定I單位(U)熱啟動(dòng)DNA聚合酶活性相當(dāng)于在74°C，30min內(nèi)以活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板引物，將IOnmol脫氧核苷酸參入到酸不溶物質(zhì)所需的酶量。2:質(zhì)量控制SDS-PAGE檢測(cè)純度大于99%，經(jīng)檢測(cè)無外源核酸酶活性；PCR方法檢測(cè)無宿主殘余DNA，能有效地?cái)U(kuò)增人基因組中的單拷貝基因。實(shí)施例4實(shí)施例2制得的熱啟動(dòng)DNA聚合酶(TransStart熱啟動(dòng)原理)與Platinum Taq酶(抗體封閉法熱啟動(dòng)原理)擴(kuò)增四個(gè)不同長(zhǎng)度的基因，比較兩者擴(kuò)增效果。I :人基因組DNA模板與引物的制備用EasyPure Genomic DNA KU，提取Hela細(xì)胞的基因組DNA，并用紫外分光光度計(jì)定量，將其稀釋至50ng/ μ I。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物四個(gè)基因的大小、引物見表I。2 PCR熱啟動(dòng)DNA聚合酶(實(shí)施例2制備):PCR反應(yīng)體系為50 μ I。人基因組DNA模板(50ng/y〗)I μ I
IOX熱啟動(dòng)DNA聚合酶Buffer (含Mg2+ )5 μ I
熱啟動(dòng)DNA聚合酶(5 u/ μ I)0.5 μ I
2.5mM dNTPs4 μ I基因 Π向引物(10 μ Μ)I μ 基因反向引物(]0 μ Μ)I μ CldH2O37.5 μ I
總體積50 μ I注10XTransStartTopTaq Buffer(500mM Tris-HClPH 9. 0,200Mm(NH) 4S04,20mM MgSO4,10% Glycerol) Platinum Taq DNA 酶PCR 反應(yīng)體系為 50 μ I。
人基因組DNA模板(50ng/ul)I μ I
IOX Platinum Taq Buffer (含 Mg2+)5 μ I
Platinum Taq DNA 聚合酶(5 u/ μ I)0.5 μ I
2.5mM dNTPs4 μ I
基因正向引物(10 μΜ)I μ I
基因反向引物(10 μ Μ)I μ I
ddH2037.5 μ I
總體積50 μ I兩種PCR酶采用相同的反應(yīng)條件，PCR條件為50°C孵育30分鐘，94°C預(yù)變性10分鐘；94°C 30秒，55°C 30秒，lkb/min于72°C延伸，共30個(gè)循環(huán)；72°C 20分鐘；PCR結(jié)束后，各取5μ I于I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。表I PCR擴(kuò)增所用引物、DNA片段來源與大小
權(quán)利要求
1.一種熱啟動(dòng)DNA聚合酶，其特征在于，該酶包括 能夠與引物結(jié)合的單鏈DNA結(jié)合蛋白； 能夠與DNA模板結(jié)合的雙鏈DNA結(jié)合蛋白；及 DNA聚合酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的熱啟動(dòng)DNA聚合酶，其特征在于，在所述熱啟動(dòng)DNA聚合酶中，所述單鏈DNA結(jié)合蛋白，雙鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶的摩爾比為1-2 1-2 10-15。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的熱啟動(dòng)DNA聚合酶，其特征在于所述單鏈DNA結(jié)合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO : I所示，所述雙鏈DNA結(jié)合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的熱啟動(dòng)DNA聚合酶，其特征在于，所述DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶。
5.權(quán)利要求I 4任一權(quán)利要求所述的熱啟動(dòng)DNA聚合酶在熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種熱啟動(dòng)DNA聚合酶及其應(yīng)用。該酶包括能夠與引物結(jié)合的單鏈DNA結(jié)合蛋白；能夠與DNA模板結(jié)合的雙鏈DNA結(jié)合蛋白；及DNA聚合酶。本發(fā)明所述的熱啟動(dòng)DNA聚合酶極大地提高了PCR反應(yīng)特異性、靈敏度。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102703400SQ20121018581
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月7日
發(fā)明者耿亮, 辛文 申請(qǐng)人:北京全式金生物技術(shù)有限公司