專(zhuān)利名稱(chēng)：重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測(cè)序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測(cè)序方法,具體是關(guān)于一種設(shè)計(jì)特定引物、采用二次PCR以實(shí)現(xiàn)對(duì)重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測(cè)序的方法。
背景技術(shù)：
RNA 干涉(RNA interfering, RNAi)是一種由雙鏈 RNA (double-stranded RNA,dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing, PGTS)機(jī)制，具有普遍的生物學(xué)意義。目前RNA干涉的作用機(jī)理還不是十分的明確，一般認(rèn)為有兩個(gè)階段。在RNAi的起始期，雙鏈RNA被細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶(RNA酶III家族成員)切割降解成21-23個(gè)核苷酸的小片段干擾RNA (siRNA)，每個(gè)siRNA片段均含有2_3個(gè)3’突出端和5’磷酸基團(tuán)，其5’磷酸末端對(duì)mRNA的降解有著重要的作用。在效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物形成RNA導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC),在ATP存在的 情況下，雙鏈的siRNA解旋，解旋后的siRNA反義鏈引導(dǎo)RISC到達(dá)靶mRNA，通過(guò)堿基配對(duì)的原則特異性地降解靶序列，從而達(dá)到高效特異性沉默目的基因表達(dá)。RNA干涉技術(shù)能有效、特異性地抑制細(xì)胞內(nèi)特定基因的表達(dá)，它在基因功能研究、惡性腫瘤的治療和神經(jīng)退行性疾病基因治療方面可能存在著較高的應(yīng)用價(jià)值。目前，siRNA的獲得主要通過(guò)化學(xué)合成法和siRNA表達(dá)載體法，siRNA表達(dá)載體法常用的是質(zhì)粒表達(dá)和病毒表達(dá)，目前常用的病毒有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒。腺病毒(adenovirus)是一種沒(méi)有包膜的直徑為70 90nm的顆粒,基因組大小約為36kb,有大約超過(guò)50種的腺病毒血清型中，人腺病毒2型及5型研究最為深入，常用作基因轉(zhuǎn)移的載體。因?yàn)橄俨《净蚪M較大，在構(gòu)建腺病毒載體時(shí)，通常將El區(qū)基因切除，把目的基因插入到多克隆位點(diǎn)后與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組，得到腺病毒。目前腺病毒載體法是基因治療中最常用的基因轉(zhuǎn)移方法之一，其具有以下優(yōu)點(diǎn)①克隆容量可達(dá)10kb，適合容納較大片段基因腺病毒基因的結(jié)構(gòu)和功能比較清楚，易操作和構(gòu)建；③宿主范圍廣，能感染分裂狀態(tài)的細(xì)胞與感染非分裂狀態(tài)的細(xì)胞；④病毒滴度高；⑤安全性好。He等介紹的AdEasy-I系統(tǒng)是通過(guò)細(xì)菌內(nèi)同源重組來(lái)構(gòu)建腺病毒載體的一種方法，其具有成功率高、不需要電穿孔等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛的應(yīng)用。但是該腺病毒系統(tǒng)中穿梭質(zhì)粒PAdTrack,由于多克隆位點(diǎn)前后序列高度重復(fù)，目前尚沒(méi)有一種通用的測(cè)序引物，從而限制了該病毒系統(tǒng)在RNA干擾領(lǐng)域中的直接應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)pAdTrack-shRNA的測(cè)序難題，提供一種對(duì)重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA進(jìn)行測(cè)序的方法，進(jìn)而為pAdEasy-Ι系統(tǒng)直接應(yīng)用于基因沉默方面奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的另一目的在于提供用于實(shí)現(xiàn)上述重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA測(cè)序方法的引物對(duì)。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測(cè)序方法，其中是通過(guò)設(shè)計(jì)特定引物、采用二次PCR以實(shí)現(xiàn)對(duì)重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測(cè)序。具體地,該方法包括在多克隆位點(diǎn)前后設(shè)計(jì)上游引物M和下游引物N，使上游引物M和下游引物N分別在DNA鏈上有2個(gè)匹配位點(diǎn)，且引物M的2個(gè)匹配位點(diǎn)位于多克隆序列的同側(cè)，引物N的2個(gè)匹配位點(diǎn)分別位于多克隆序列的兩側(cè)；進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，電泳后膠回收含有多克隆位點(diǎn)的目的條帶；以膠回收產(chǎn)物為模板，利用上游引物M和下游引物N進(jìn)行二次PCR反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。siRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)可參見(jiàn)圖I所示。本發(fā)明的間接測(cè)序的方法具體原理可參見(jiàn)圖2所示在本發(fā)明的方法中，是于多克隆位點(diǎn)前后設(shè)計(jì)上游引物M和下游引物N，它們分別在DNA鏈上有2個(gè)匹配位點(diǎn)，即引物M可以識(shí)別A或者A’位點(diǎn)，下游引物N可以識(shí)別B或者B’位點(diǎn)。其中引物N的匹配位點(diǎn)在多克隆序列的兩側(cè)，引物M的匹配位點(diǎn)在多克隆序列的同側(cè)。進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)時(shí)其產(chǎn)物會(huì)出現(xiàn)以下情況的三條帶I. A點(diǎn)為上游引物識(shí)別位點(diǎn)，B’為下游引物識(shí)別位點(diǎn)。2. A點(diǎn)為上游引物識(shí)別位點(diǎn)，B為下游引物識(shí)別位點(diǎn)。3. A’點(diǎn)為上游引物識(shí)別位點(diǎn)，B為下游引物識(shí)別位點(diǎn)。電泳后膠回收含有多克隆位點(diǎn)的目的條帶，以膠回收產(chǎn)物為模板，M和N為引物進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)，其產(chǎn)物即可測(cè)序，測(cè)序引物為M或者N。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的方法特別適用于重組質(zhì)粒的插入片段小于IOObp的情況。在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，利用本發(fā)明的上述方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)重組質(zhì)粒pAdTrack-IL-Ι β -shRNA的測(cè)序。S卩，本發(fā)明還提供了一種重組質(zhì)粒pAdTrack-IL-Ι β -shRNA的測(cè)序方法,該方法包括在多克隆位點(diǎn)前后設(shè)計(jì)上游引物M和下游引物N:上游引物M :ACCTCTACAAATGTGGTATG (SEQ ID No. I)下游引物N :TTATGGGACTTTCCTACTTG (SEQ ID No. 2)；進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，電泳后膠回收含有多克隆位點(diǎn)的目的條帶(即，含有插入片段的目的條帶)；以膠回收產(chǎn)物為模板，利用上游引物M和下游引物N進(jìn)行二次PCR反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在上述對(duì)重組質(zhì)粒pAdTrack-IL-Ι β -shRNA的測(cè)序方法中，所述第一次PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性45s ;94°C變性45s，59. 6°C退火45s，72°C延伸lmin，共30 35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5 lOmin。所述第二次PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性45s ;94°C變性45s，59. 6°C退火45s，72°C延伸lmin，共30 35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5 lOmin。反應(yīng)體系包括DNA聚合酶、引物、脫氧核苷酸、DNA模板和緩沖液等的備置可以參照所屬領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。需要說(shuō)明的是，盡管本發(fā)明的具體實(shí)施例是對(duì)pAdTrack-IL-Ι β -shRNA進(jìn)行測(cè)序，本發(fā)明的測(cè)序方法的思路可以延及對(duì)其他類(lèi)似shRNA小片段的重組質(zhì)粒的測(cè)序。另一方面，本發(fā)明還提供了用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述測(cè)序方法例如上述對(duì)重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測(cè)序方法的引物對(duì)，即所述的引物對(duì)M和N，更具體地，在對(duì)pAdTrack-shRNA測(cè)序時(shí)，所述的引物對(duì)M、N分別為所述的引物對(duì)SEQ ID No. I和SEQ ID
No. 2o綜上所述，本發(fā)明提供了一種間接的測(cè)序方法，針對(duì)pAdTrack設(shè) 計(jì)了引物、通過(guò)二次PCR方法，巧妙的完成了對(duì)pAdTrack-IL-Ι β -shRNA測(cè)序。其設(shè)計(jì)的思路可同樣應(yīng)用于所有以PAdTrack質(zhì)粒為基礎(chǔ)的研究，同樣為腺病毒AdEasy-I系統(tǒng)在基因治療的領(lǐng)域應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。


圖IsiRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)示意圖；圖2 二次PCR原理示意圖；圖3重組穿梭質(zhì)粒酶切鑒定圖；圖4第一次PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖；圖5第二次PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖；圖6重組穿梭質(zhì)粒的測(cè)序圖譜。
具體實(shí)施例方式為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實(shí)施例及附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照制造商所建議的條件；實(shí)施例中所用AdTrack載體為電子科技大學(xué)神經(jīng)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，感受態(tài)細(xì)菌及其它各試劑材料均為寶生物公司商購(gòu)獲得。實(shí)施例I重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-IL-Ι β -shRNA的構(gòu)建首先通過(guò)Genbank中報(bào)道的大鼠IL-I β基因的mRNA序列(基因編號(hào)ΝΜ_031512)。應(yīng)用 Amhino 公司網(wǎng)站中 siRNA 輔助設(shè)計(jì)工具(http: //www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder.html)在線尋找IL-I β-siRNA的祀序列。根據(jù)干涉祀點(diǎn)的選擇原則，設(shè)計(jì)革巴向 mRNA 序列，隨后用 BLAST (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/blast, cgi)對(duì)選擇的靶序列進(jìn)行同源性分析，排除siRNA非特異性地抑制其他基因片段的可能。設(shè)計(jì)IL-I β -shRNA表達(dá)載體的插入序列結(jié)構(gòu)酶切位點(diǎn)+siRNA序列+環(huán)狀結(jié)構(gòu)+終止序列+酶切位點(diǎn)，為了后續(xù)重組穿梭質(zhì)粒的檢測(cè)方便，在設(shè)計(jì)并合成插入序列模板兩端的酶切位點(diǎn)時(shí)僅保留四個(gè)堿基，將插入序列連接到穿梭質(zhì)粒上時(shí)，此酶切位點(diǎn)因?yàn)槿笔б粋€(gè)堿基故被破壞掉。加入轉(zhuǎn)錄終止序列(TTTTTT，polyT)是確保轉(zhuǎn)錄準(zhǔn)確終止，并在合成DNA的末端設(shè)計(jì)一個(gè)新的Stu I酶切位點(diǎn)，具體堿基序列為T(mén)CGAGCACAGACCTGTCTTCCTATTCAAGACGTAGGAAGACAGGTCTGTGCTTTTTTAGGCCT (SEQ ID No. 3)。將合成的寡核苷酸片段用無(wú)菌水溶解，按照如下體系進(jìn)行退火反應(yīng)正義鏈2ul，反義鏈2ul，退火緩沖液16ul充分混勻后95°C 2min，之后自然冷卻至室溫37°C Ih0產(chǎn)物最后保存于4 C。
將AdTrack載體經(jīng)HindIII和Sal I酶切后，瓊脂糖回收DNA大片段。與退火片段過(guò)夜連接，之后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5 α，挑選單克隆菌落，質(zhì)粒提取進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示為 pAdTrack-IL-Ι β -shRNA (見(jiàn)圖 3,M λ -HindIII/DNA Marker ；Γ2 :未酶切質(zhì)粒；3 :質(zhì)粒+Stu I酶切)。實(shí)施例2第一次PCR反應(yīng)因pAdTrack載體多克隆位點(diǎn)前后均為重復(fù)序列，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序時(shí)，沒(méi)有一個(gè)通用的測(cè)序引物。本發(fā)明設(shè)計(jì)引物時(shí)遵循以下原則①引物長(zhǎng)度在18-25堿基。②引物序列中G+C含量一般為40-55%。③避免擴(kuò)增模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。④引物末端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C。按照以后原則在多克隆位點(diǎn)前后設(shè)計(jì)上游引物M和下游引物N，其具體的序列為上游引物M:ACCTCTACAAATGTGGTATG (SEQ ID No. I)下游引物N :TTATGGGACTTTCCTACTTG (SEQ ID No. 2)第一次PCR反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.重組質(zhì)粒PAdTrack-ShRNA的測(cè)序方法，該方法包括 在多克隆位點(diǎn)前后設(shè)計(jì)上游引物M和下游引物N，使上游引物M和下游引物N分別在DNA鏈上有2個(gè)匹配位點(diǎn)，且引物M的2個(gè)匹配位點(diǎn)位于多克隆序列的同側(cè)，引物N的2個(gè)匹配位點(diǎn)分別位于多克隆序列的兩側(cè)； 進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，電泳后膠回收含有多克隆位點(diǎn)的目的條帶； 以膠回收產(chǎn)物為模板，利用上游引物M和下游引物N進(jìn)行二次PCR反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測(cè)序方法，其中，重組質(zhì)粒的插入片段小于lOObp。
3.重組質(zhì)粒pAdTrack-IL-Ιβ -shRNA的測(cè)序方法，該方法包括 在多克隆位點(diǎn)前后設(shè)計(jì)上游引物和下游引物上游引物 SEQ ID No. I ACCTCTACAAATGTGGTATG下游引物 SEQ ID No. 2 TTATGGGACTTTCCTACTTG 進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，電泳后膠回收含有多克隆位點(diǎn)的目的條帶； 以膠回收產(chǎn)物為模板，利用上游引物SEQ ID No. I和下游引物SEQ ID No. 2進(jìn)行二次PCR反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測(cè)序方法，其中，所述第一次PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性45s ;941變性458，59.61退火458，721延伸lmin，共30 35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5 IOmin0
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的測(cè)序方法，其中，所述第二次PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性45s ;94°C變性45s，59. 6°C退火45s，72°C延伸lmin，共30 35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5 IOmin0
6.一種用于實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求3、任一項(xiàng)所述重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測(cè)序方法的引物對(duì) SEQ ID No. I 和 SEQ ID No. 2。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒pAdTrack-shRNA的測(cè)序方法，該方法包括在多克隆位點(diǎn)前后設(shè)計(jì)上游引物M和下游引物N，使上游引物M和下游引物N分別在DNA鏈上有2個(gè)匹配位點(diǎn)，且引物M的2個(gè)匹配位點(diǎn)位于多克隆序列的同側(cè)，引物N的2個(gè)匹配位點(diǎn)分別位于多克隆序列的兩側(cè)；進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，電泳后膠回收含有多克隆位點(diǎn)的目的條帶；以膠回收產(chǎn)物為模板，利用上游引物M和下游引物N進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。利用本發(fā)明的方法，通過(guò)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行二次PCR反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)以pAdTrack為基礎(chǔ)的重組質(zhì)粒的測(cè)序，為腺病毒AdEasy-1系統(tǒng)在基因治療的領(lǐng)域應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102864217SQ20121018556
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月7日
發(fā)明者霍家佳, 游自立, 曹云飛, 徐從倫, 申兵, 佘輝 申請(qǐng)人:中國(guó)電子科技集團(tuán)公司第三十研究所