專利名稱：使用磁性膠態(tài)顆粒檢測(cè)分析物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)液體、生物或合成樣品中至少一種分析物的方法，包括將所述物質(zhì)與類似凝集劑的試劑偶聯(lián)。
背景技術(shù)：
迄今，已提出了許多“凝集”方法。它們主要用于檢測(cè)抗原和/或抗體以進(jìn)行診斷。這些方法尤其適用于生物分析鑒定(驗(yàn)孕、凝固試驗(yàn))或者診斷傳染病。然而，這些方法通常具有有限的靈敏度。事實(shí)上，這些試驗(yàn)的一般原理在于檢測(cè)有分析物的情況下膠態(tài)顆粒凝膠的形成。在這類試驗(yàn)中，分析物必須能夠附著兩種膠態(tài)顆粒，這些顆粒的表面覆蓋有識(shí)別待檢測(cè)分析物(廣義上說(shuō))的分子。
更具體地，本發(fā)明基于使用磁性顆粒作為膠體凝集劑。
磁性顆粒已用于生物分離技術(shù)或診斷檢測(cè)技術(shù)(WO 94/09368；EP180 384；WO 98/51435)。磁性分離速度快并且易于實(shí)施，需要的設(shè)備簡(jiǎn)單。使用覆蓋有識(shí)別待捕獲分析物的分子的磁性顆粒，可以在磁力作用下將分析物從復(fù)雜混合物中分離。例如，使用該方法有益于“ELISA”測(cè)定(酶聯(lián)免疫測(cè)定)。所用的磁性顆粒將磁性材料(例如磁鐵礦、鐵氧體、氧化鉻或氧化鎳)加入基質(zhì)(通常為有機(jī)基質(zhì))中。使用抗原、半抗原或抗體類型的反應(yīng)基團(tuán)對(duì)它們的表面進(jìn)行官能化，以使其與待分離的反應(yīng)物反應(yīng)。
為了避免與剩磁有關(guān)的問(wèn)題，通常超順磁材料比傳統(tǒng)鐵磁性材料優(yōu)選。鐵磁流體，具有高的磁化度和飽和度(大于100mT)并且在沒(méi)有外來(lái)磁場(chǎng)的情況下不顯示任何剩磁，它們是用于超順磁膠體方法的良好候選物。
本發(fā)明旨在在磁場(chǎng)的作用下利用這些磁性膠體所示的能力形成特定的結(jié)構(gòu)組織。
在這種情況下，磁場(chǎng)誘導(dǎo)的凝集作用(根據(jù)膠體的體積份)產(chǎn)生單獨(dú)“鏈”或稱作“簇”的鏈組。本文后面將鏈或簇?zé)o差別地稱作鏈。關(guān)于這些結(jié)構(gòu)及其形成的詳細(xì)文獻(xiàn)在許多出版物中都可以找到。
換句話說(shuō)，在沒(méi)有磁場(chǎng)的情況下，這些顆粒呈分散態(tài)。在有磁場(chǎng)的情況下，它們?cè)谒芤褐薪M裝成顆粒鏈。當(dāng)然，這些鏈?zhǔn)强赡娴?，并且?dāng)除去磁場(chǎng)之后，在熱攪拌的作用下它們快速解開(kāi)。有利地，如果這些顆粒足夠小，并因此作布朗運(yùn)動(dòng)和可極化的話，這些鏈將沿施加其上的磁場(chǎng)的軸快速形成，并且它們對(duì)重力不敏感。這種現(xiàn)象圖示于

圖1A。圖1B顯示了這些顆粒在磁場(chǎng)中形成的鏈的顯微照片。
本發(fā)明人已出人意料地證實(shí)，可以利用磁性膠態(tài)顆粒在磁場(chǎng)的作用下快速組裝成顆粒鏈的能力來(lái)檢測(cè)和/或定量液體介質(zhì)中的特定物質(zhì)，。
在這種情況下，當(dāng)這些磁性膠態(tài)顆粒的表面上覆蓋有特異性配體，并且它們分散于其中的連續(xù)相含有能夠與至少兩個(gè)特異性配體反應(yīng)的物質(zhì)時(shí)，所述物質(zhì)將在磁場(chǎng)的催化作用下附著到所述磁場(chǎng)誘導(dǎo)鏈內(nèi)的兩個(gè)相鄰的不同顆粒上。磁場(chǎng)除去之后，附著有所述物質(zhì)的顆粒被牢固地組裝在永久鏈內(nèi)，并由此指示在所分析的介質(zhì)中存在目標(biāo)物質(zhì)。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明首先涉及一種檢測(cè)和/或定量液體介質(zhì)中的至少一種分析物的方法，其特征在于使用磁性膠態(tài)顆粒，所述磁性膠態(tài)顆粒的表面用所述待檢測(cè)和/或測(cè)定的分析物的至少一種特異性配體進(jìn)行官能化，并且其特征還在于它包括1、將所述顆粒與所述介質(zhì)接觸，2、對(duì)所述介質(zhì)施加一磁場(chǎng)，其強(qiáng)度足夠使所述磁性顆粒組裝成鏈狀，3、將所述磁場(chǎng)保持足夠時(shí)間，以使所述分析物與至少兩個(gè)分別存在于鏈的兩個(gè)相鄰顆粒上的特異性配體偶聯(lián)或結(jié)合，4、去除磁場(chǎng)，和5、檢測(cè)所述分析物是否存在，并根據(jù)情況，通過(guò)所述液體介質(zhì)中是否存在所述恒定的磁性膠態(tài)顆粒鏈來(lái)檢測(cè)其濃度。
應(yīng)注意的是，所列的這些步驟的順序相當(dāng)于本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是在本發(fā)明的上下文中，也可以不同順序?qū)嵤┧鼈?，例如在加入待分析的介質(zhì)之前激活磁場(chǎng)。
在本發(fā)明的上下文中，也可以收集由待檢測(cè)、測(cè)定和替換的分析物連接的磁性膠態(tài)顆粒。
在本發(fā)明的上下文中，可以使用各種不同的磁場(chǎng)和磁場(chǎng)梯度幾何形狀，也可以使用各種不同幾何形狀的“凝集池”。根據(jù)情況，這些不同的幾何形狀易于使配體-受體締合的速度以及恒定鏈的檢測(cè)最佳化，所述恒定鏈可以隨條件的不同在長(zhǎng)度和粗細(xì)方面有很大的不同。具體地說(shuō)，本發(fā)明包括微流體設(shè)備，它使得通道的寬度或高度小于100μm。可以使用與通道軸垂直和平行取向的磁場(chǎng)。
有利地，該方法可用于診斷工具中，例如分析設(shè)備中。特別優(yōu)選自動(dòng)化分析設(shè)備。
至于這些恒定鏈的具體表征，可以有利地通過(guò)對(duì)待分析介質(zhì)的簡(jiǎn)單顯微測(cè)定來(lái)進(jìn)行。然而，尤其是當(dāng)使用自動(dòng)化分析設(shè)備時(shí)，優(yōu)選對(duì)這些鏈的存在進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)。因此通過(guò)測(cè)定光散射(例如通過(guò)光度測(cè)定法和濁度測(cè)定法)可以檢測(cè)鏈的存在。另一種方法是處理捕獲的圖像，例如通過(guò)CCD照相機(jī)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于能夠?qū)@些鏈的大小作細(xì)微分析。任何適宜的光源(優(yōu)選激光)都可用于這些檢測(cè)方法。
當(dāng)然，與傳統(tǒng)凝集物相似，鏈的形成首先取決于待分析的介質(zhì)中分析物的濃度，其次取決于顆粒的濃度。可以直觀地認(rèn)為，所述介質(zhì)中存在的分析物越多，鏈越長(zhǎng)，并且顆粒濃度越高，鏈越粗，并且與聚集物更相似。因此本發(fā)明證實(shí)可以通過(guò)對(duì)組裝成恒定鏈狀的磁性顆粒的密度的定量來(lái)確定分析物的濃度。這種密度測(cè)定可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。因此對(duì)給定的分析物可以預(yù)先建立參照校準(zhǔn)。
所述方法在靈敏度方面特別有益。因此證實(shí)其對(duì)檢測(cè)液體介質(zhì)中低濃度的分析物是有益的。
正如下面實(shí)施例中所示，使用相同的配體-受體偶聯(lián)對(duì)(生物素-抗生蛋白鏈菌素)進(jìn)行，以抗原分析物為例，當(dāng)分析物的濃度數(shù)量級(jí)是10-9mol/l時(shí)，本發(fā)明鏈狀物持久存在，而傳統(tǒng)凝集測(cè)定的檢測(cè)限則為10-5mol/l。有利地，當(dāng)使用相同的抗原-抗體偶聯(lián)對(duì)，并在沒(méi)有磁場(chǎng)的情況下，這一濃度閾值低于傳統(tǒng)凝集測(cè)定中聚集物持久存在和形成凝膠所需的濃度閾值。
因此所述方法有利地替代了傳統(tǒng)凝集測(cè)定，并且大大增加了測(cè)定的靈敏度。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“膠體”是指顆粒大小在5-10000nm之間，更優(yōu)選在100-500nm之間。然而，特別有利地是優(yōu)選使用盡可能小的顆粒，與此同時(shí)還要保證它們具有足夠的磁化率，使它們能夠在磁性偶極力和布朗運(yùn)動(dòng)的結(jié)合作用下立即凝集。通常，當(dāng)磁性材料(通常是包封的氧化鐵)的量最大時(shí)，粒徑不大于幾微米，優(yōu)選約0.1-0.5微米就達(dá)到這種平衡。
為了上述原因，優(yōu)選使用超順磁的膠態(tài)顆粒。
有幾種不同方法可以生產(chǎn)具有本發(fā)明所需質(zhì)量的超順磁膠態(tài)顆粒。例如用含水鐵氧流體與天然或合成的聚合物共沉淀，或者在有機(jī)相中用鐵氧流體乳化。
以控制方式獲得這類膠體材料的優(yōu)選工藝是基于乳化然后聚合并枝接的原理。這些乳液尤其可以通過(guò)將由有機(jī)鐵氧流體和冨含表面活性劑的水相組成的混合物剪切制得。選擇鐵氧流體，以便其有機(jī)相微溶于水相中。在這種情況下，每一液滴轉(zhuǎn)變成包含磁性材料(優(yōu)選磁性氧化鐵(磁赤鐵礦))的納米顆粒的球狀聚集體，其中在每一液滴中約有60體積％的氧化鐵。通過(guò)加入疏水單體(例如苯乙烯)將由此獲得的顆粒聚合，這樣在這些液滴內(nèi)發(fā)生反應(yīng)。在聚合作用結(jié)束時(shí)加入水溶性功能單體使得表面官能化。通過(guò)乳化和聚合這兩個(gè)操作獲得冨含氧化鐵并且涂布有經(jīng)過(guò)聚合和官能化的層的球形顆粒。就該乳液的制備而言，尤其可以參考J.Bibette在J.Magn.and Magn.Mat.V.122，p.37(1993)和T.Mason和J.Bibette在Phys.Rev.Lett.77，3481(1996)以及WO 97/38787和FR 2800836中公開(kāi)的方法。
有利地，加入的磁性材料選自氧化鐵、氧化鈷或者最終分開(kāi)并穩(wěn)定的金屬，并且優(yōu)選磁赤鐵礦。以40體積％，并優(yōu)選60％的比例將磁性材料加入到這些顆粒內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，基本磁性材料是鐵氧流體。
根據(jù)傳統(tǒng)工業(yè)方法，由于由此獲得的磁性膠態(tài)顆?？梢约嫒莨潭ㄔ谄浔砻娴拇罅颗潴w，因此它們是特別有益的。
有益地，它們可以與各種特異性配體混合以將它們轉(zhuǎn)化成特別適用于本發(fā)明所述的免疫測(cè)定和凝集測(cè)定的試劑。
所述配體分子可以通過(guò)吸附相互作用、共價(jià)相互作用和/或高親合力相互作用固定到磁性膠態(tài)顆粒的表面上。
例如，可以使用顆粒表面上存在的化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)。更具體地說(shuō)，這些基團(tuán)可以是羧基、氨基、醛和環(huán)氧基團(tuán)。當(dāng)將要表征的分析物是一反應(yīng)活性化學(xué)物質(zhì)時(shí)，這些基團(tuán)本身能夠起到目標(biāo)分析物的特異性配體的作用。
至于通過(guò)高親合力相互作用獲得的固定，通常是借助如下高親合力鍵合偶聯(lián)的兩個(gè)成對(duì)物(聚)碳水化合物/electin；生物素或生物素化的化合物/抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素、蛋白受體及其特異性配體；和半抗原/抗體等。
最后，配體與顆粒表面的附著可以直接進(jìn)行，或者可以使用間隔單元來(lái)進(jìn)行，也稱之為使用術(shù)語(yǔ)“連接物”和“間隔物”。
借助這些共價(jià)或高親合力相互作用可以固定天然或合成的配體，例如肽；包括糖蛋白、脂蛋白和其它類似或衍生結(jié)構(gòu)的自由或絡(luò)合形式的蛋白質(zhì)；免疫球蛋白；核酸，如DNA或RNA及其同源物；糖類如單糖或二糖、低聚糖和多糖；脂類；激素；受體；代謝物和其它生物物質(zhì)。
可以通過(guò)所述方法檢測(cè)和/或測(cè)定的分析物優(yōu)選為可以高親合力特異性地與本發(fā)明的官能化顆粒相互作用的物質(zhì)。因此它們可以是可通過(guò)免疫反應(yīng)檢測(cè)到的抗原和抗體，或者可以通過(guò)雜交反應(yīng)檢測(cè)的核酸，并且更一般地是所有類型的蛋白質(zhì)。
優(yōu)選，這些分析物在待分析的介質(zhì)中的擴(kuò)散系數(shù)至少等于所述顆粒的擴(kuò)散系數(shù)。
待鑒定的分析物可以天然形式以相同方式與兩個(gè)不同配體(例如抗原和抗體，它們通常具有幾個(gè)締合位點(diǎn))反應(yīng)。
在相反情況下，在采用所述方法之前對(duì)待分析的介質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，以便使分析物對(duì)其特異性配體之一的至少兩個(gè)分子具有反應(yīng)活性。這種預(yù)處理尤其可以是用上面討論的“高親合力”偶聯(lián)成對(duì)物之一的至少一個(gè)分子官能化該分析物。這種預(yù)處理的實(shí)施在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方式涉及檢測(cè)和/或定量液體樣品內(nèi)抗體型的分析物諸如針對(duì)病毒、細(xì)菌或原生動(dòng)物和其它感染劑的病原體的抗體；腫瘤抗體；針對(duì)變應(yīng)原的抗體或者自身抗體。
本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方式涉及檢測(cè)和/或定量抗原，如自由抗原，例如血蛋白和諸如凝血因子的因子、代謝物、激素或介體；或者與載體相連的抗原，例如微生物的表面抗原、膜結(jié)合的受體；血型抗原和主要組織相容性系統(tǒng)的抗原等。
所述方法還可用于檢測(cè)和/或定量非生物分子，例如任意天然或人造藥物，應(yīng)理解為所討論的藥物對(duì)一配體可以直接具有雙重親合力。如果不是這種情況，必須通過(guò)締合預(yù)處理使這類分析物相對(duì)設(shè)計(jì)的配體為二價(jià)。本發(fā)明在分析和微量分析化學(xué)中尤其有用。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
，幾種不同的磁性膠態(tài)顆?？梢栽谕粶y(cè)試中用作凝集劑。當(dāng)分析物易于與兩種配體發(fā)生反應(yīng)時(shí)這可能是有益的。而且，本發(fā)明所用的膠態(tài)顆粒可以帶有第二標(biāo)記。
由于這種標(biāo)記能夠?qū)⒌诙Ｊ降臋z測(cè)與顯微觀察檢測(cè)結(jié)合起來(lái)，或者能夠簡(jiǎn)單地改善顯微觀察檢測(cè)，因此它是有益的。這種附加的標(biāo)記尤其可以通過(guò)肉眼、光學(xué)、機(jī)械和/或電方法表征。根據(jù)本發(fā)明的這一實(shí)施方式，鏈的表征可以通過(guò)顯微觀察直接進(jìn)行，或者根據(jù)所選標(biāo)記的性質(zhì)通過(guò)光學(xué)、機(jī)械和/或電方法間接進(jìn)行。適用于本發(fā)明的標(biāo)記，尤其可以提到的有彩色顏料、熒光劑或磷光劑。
待分析的液體介質(zhì)可以是合成或天然的，例如生物流體。它們尤其可以是體液，例如血液(全血或部分血)、血清、血漿、尿或腦脊髓液，它們可以稀釋或未稀釋的形式使用。
至于磁場(chǎng)，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方式產(chǎn)生，例如赫姆霍茲線圈、電磁鐵或永久磁鐵。
所施加的連續(xù)磁場(chǎng)通常為1-500mT，優(yōu)選1-100mT。
施加基本上均勻的磁場(chǎng)通常是有益的。產(chǎn)生這種磁場(chǎng)的簡(jiǎn)單方法是在“凝集”區(qū)的任一側(cè)分別放置永久磁鐵或電磁鐵的兩極(北極和南極)。另一種方式是用電流發(fā)生器磁化的赫姆霍茲線圈構(gòu)建一具有基本上為環(huán)狀和同心軸通道。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，施加振蕩(交變)磁場(chǎng)。
振蕩磁場(chǎng)能夠增加待檢測(cè)的分析物處于分別存在于兩個(gè)顆粒的兩個(gè)特異性配體附近的可能性。在每一磁場(chǎng)循環(huán)中，顆?？梢员舜司喓弦员阈纬苫蜓由戽?，并且不會(huì)影響已經(jīng)形成的鏈。因此這意味著能夠?qū)崿F(xiàn)官能化磁性膠態(tài)顆粒的配體與待檢測(cè)分析物之間的反應(yīng)。
因此可以檢測(cè)低濃度的分析物，由此獲得具有較好靈敏度的測(cè)定。
然而，應(yīng)注意的是，本發(fā)明的一些用途可能需要非均勻的磁場(chǎng)。具體地說(shuō)，可以使用能夠?qū)︻w粒進(jìn)行凝集的磁場(chǎng)和能夠在精確位置將鏈濃縮的磁場(chǎng)梯度。該磁場(chǎng)及其梯度都可以同時(shí)或單獨(dú)操作。因此，可以首先濃縮分析物，然后通過(guò)形成足夠大小的聚集體來(lái)觀察它們。在為本發(fā)明內(nèi)容的一部分的其它應(yīng)用中，優(yōu)選在微流體通道內(nèi)進(jìn)行凝集。例如(E.M.Lawrence等人，Int.J.of Modern Phys.B，8，2765-2777，1994)已知冨含磁性顆粒的柱或鏈的直徑和間隔取決于磁場(chǎng)和池的厚度。因此可以選擇最適合所需應(yīng)用的凝集條件。
加入待分析介質(zhì)的手段包括-采用一個(gè)或多個(gè)沉積樣品的凹口或“孔”，如凝膠電泳中的，“Electrophoresistheory，techniques and biochemical and clinicalapplications，A.T.Andrews，Oxford University Press，NY 1986”，-或者采用過(guò)壓或減壓系統(tǒng)，如毛細(xì)管電泳中的，例如參見(jiàn)“Capillary Electrophoresis”，P.D.Grossman，J.C.Colbum published byAcademic Press，San Diego，CA，USA，1992)，-或者采用一通道，經(jīng)過(guò)它滴流樣品連續(xù)溢出，如液體靜脈中的電泳，-或者采用一種用于色譜分析的進(jìn)樣方法(“Chromatographie enphase liquide et supercritique”[液相色譜和超臨界色譜法]，R.Rosset，M.Caude，A.Jardy，巴黎，Masson出版，1991；“Practical High PerformanceLiquid Chromatography”，V.R.Meyer，John Wiley出版，Chichester，NY，USA；“Chromatography of polymers”，T.Prodver，由華盛頓特區(qū)的ACS出版公司出版，1993)，
-或者使用樣品池或其它容器，例如自動(dòng)化分析設(shè)備中常用的。
在其最簡(jiǎn)單的實(shí)施中，按照以下方案進(jìn)行試驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上，容易想到許多其它方案。
將具有上述性能的膠態(tài)顆粒上枝接待測(cè)抗原的特異性抗體。為了清楚起見(jiàn)，在本說(shuō)明書中考慮抗生蛋白鏈菌素-生物素配體-受體的偶聯(lián)。由于抗生蛋白鏈菌素被枝接在這些顆粒上，因此待檢測(cè)的抗原例如是其兩端枝接有生物素分子的小聚乙二醇聚合物。如果足量的該抗原以1％或更大的體積份與所述顆?；旌希敲凑鐐鹘y(tǒng)凝集測(cè)定所預(yù)期的，可以在幾秒鐘，或者甚至幾分鐘內(nèi)便可看到凝膠形式的凝集。C*是傳統(tǒng)檢測(cè)方法的抗原濃度檢測(cè)限，低于該值時(shí)，在傳統(tǒng)方法中檢測(cè)不到凝集。
在本發(fā)明的試驗(yàn)中，將0.1體積％的顆粒與濃度C(計(jì)作C*/x)遠(yuǎn)低于C*的抗原混合，將該混合物吸入矩形橫截面(厚度為20-50μm)的毛細(xì)管內(nèi)并與毛細(xì)管軸平行地施加一磁場(chǎng)?？梢酝ㄟ^(guò)放置在毛細(xì)管兩側(cè)的兩個(gè)磁鐵施加該磁場(chǎng)。該磁場(chǎng)保持2分鐘，強(qiáng)度例如為至少500高斯。然后用顯微鏡觀察該毛細(xì)管，以便檢測(cè)鏈或聚集體的存在。
因此通過(guò)生物素-抗生蛋白鏈菌素的實(shí)例可以發(fā)現(xiàn)，在低達(dá)C*/1000的抗原濃度下也可以通過(guò)磁場(chǎng)凝集檢測(cè)聚集體。
所述方法對(duì)檢測(cè)特別有益，并且在適當(dāng)情況下，可以定量微流體中的至少一種分析物。在該具體實(shí)施方式
中，可以在微流體系統(tǒng)的一個(gè)進(jìn)行磁性凝集，并在另一區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)。這種實(shí)施方式尤其有益地適用于將顆粒的恒定鏈與沒(méi)有經(jīng)過(guò)凝集的顆粒分離。
本發(fā)明方法的特別有益的應(yīng)用包括多標(biāo)準(zhǔn)分析，用于在同一測(cè)量中同時(shí)檢測(cè)幾種分析物。
根據(jù)該實(shí)施方式，同時(shí)使用多種官能化磁性膠態(tài)顆粒。每一種顆粒用至少一種待測(cè)定分析物的特異性配體官能化。
然后施加振蕩磁場(chǎng)，使得逐漸形成由每一分析物的同種特異性顆粒構(gòu)成的鏈。
為了能夠區(qū)分它們，并因此使測(cè)定結(jié)果能夠讀出，各種磁性膠態(tài)顆粒帶有針對(duì)每一待測(cè)定的分析物的特異性第二標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)液體介質(zhì)(優(yōu)選生物流體)中至少一種分析物的試劑盒，其特征在于它包含至少一種表面用所述至少一種分析物的至少一種特異性配體官能化的磁性膠態(tài)顆粒。
下面通過(guò)實(shí)施例并參照附圖更清楚地描述本發(fā)明，這些附圖顯示了圖1在磁場(chǎng)下形成磁性膠態(tài)顆粒鏈的原理示意圖和顯微照片。
圖2除去磁場(chǎng)之后含有枝接磁性膠態(tài)顆粒和生物素化BSA的溶液的顯微照片。
圖3顯示了在磁場(chǎng)下以及除去磁場(chǎng)之后磁性膠態(tài)顆粒鏈的平均長(zhǎng)度作為溶液內(nèi)生物素化BSA的濃度的函數(shù)的圖。
圖4A顯示了0％稀釋(對(duì)照)的實(shí)施例2的溶液的顯微照片；圖4B顯示了0.1％稀釋的實(shí)施例2的溶液的顯微照片；圖4C顯示了1％稀釋的實(shí)施例2的溶液的顯微照片；圖4D顯示了100％稀釋的實(shí)施例2的溶液的顯微照片；實(shí)施例1使用磁性膠態(tài)顆粒檢測(cè)分析物本實(shí)施例描述了得自生物素/抗生蛋白鏈菌素高親合力偶聯(lián)的模型分析物的檢測(cè)并且旨在表征本發(fā)明方法對(duì)給定分析物的靈敏度域值。分析物為生物素，并將抗生蛋白鏈菌素枝接在膠態(tài)顆粒上。
更具體地說(shuō)，生物素化分析物是由分子量為5000的聚乙二醇聚合物構(gòu)成，在其兩端枝接有生物素分子。這些產(chǎn)品可商購(gòu)獲得(Shearwater USA)。
預(yù)先獲得枝接抗生蛋白鏈菌素的超順磁膠態(tài)顆粒。這些膠態(tài)顆粒是按照J(rèn).Bibette的J.Magn.and Magn.Mat.V.122，p.37(1993)和F.Leal Calderon、T.Stora、O.Mondain-Monval、P.Poulin和J.Bibette、Phys.Rev.Lett.，72，2959(1994)公開(kāi)的步驟或者按照T.Mason和JBibette的Phys.Rev.Lett.77，3481(1996)以及WO 97/38787中公開(kāi)的步驟獲得。這些顆粒的聚合是按照申請(qǐng)F(tuán)R 2800836中所述的方法獲得的?？股鞍祖溇卦隰然恢玫闹訉?duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)為公知?？梢詤⒖糓olday RS、Dreyer WJ、Rembaum A、Yen SP、J CellBiol 1975年1月；64(1)75-88和Staros JV、Wright RW、Swingle DM、Anal Biochem.1986年7月；156(1)220-2。
在磁場(chǎng)下的凝集試驗(yàn)包括將枝接有抗生蛋白鏈菌素的磁性膠態(tài)顆粒與“PEG-生物素”分析物混合。選擇的檢測(cè)方法是在顯微鏡下直接觀察。
對(duì)10-4-10-2的給定顆粒濃度(以體積φ計(jì))，改變分析物的濃度C以檢測(cè)該測(cè)量的靈敏度極限。
對(duì)每一測(cè)量而言，將所述混合物吸入厚度為50微米的扁平毛細(xì)管，將其放置在兩個(gè)平面磁鐵之間，這樣產(chǎn)生的磁場(chǎng)大于約50mT并且與毛細(xì)管的軸平行。該磁場(chǎng)由市售平面磁鐵產(chǎn)生。將磁場(chǎng)施加2分鐘并在沒(méi)有磁場(chǎng)的情況下在顯微鏡下觀察毛細(xì)管。當(dāng)在顯微鏡下可以看到有鏈和聚集體(參見(jiàn)圖2)時(shí)，該檢測(cè)為陽(yáng)性，當(dāng)在熱攪拌作用下顆粒立即再次分散時(shí)，該檢測(cè)為陰性。
根據(jù)該實(shí)施方式的發(fā)現(xiàn)，分析物濃度降低至10-9mol/l時(shí)，本發(fā)明方法檢測(cè)結(jié)果仍然為陽(yáng)性。而作為對(duì)照，當(dāng)分析物濃度低于10-5mol/l，傳統(tǒng)凝集檢測(cè)是不可能進(jìn)行的。
在一補(bǔ)充研究中，測(cè)得鏈的平均長(zhǎng)度為待測(cè)定的分析物(生物素化的BSA，8-12生物素/BSA)的濃度的函數(shù)。圖3顯示了在10mT的磁場(chǎng)中30分鐘之后鏈的平均長(zhǎng)度(實(shí)線)以及在沒(méi)有磁場(chǎng)下24小時(shí)之后鏈的平均長(zhǎng)度(虛線)，橫坐標(biāo)為生物素化的BSA的濃度。
注意到，使用磁場(chǎng)可以快速檢測(cè)濃度低至10-9mol/l甚至更低的分析物，這說(shuō)明靈敏度比目前銷售的測(cè)量方法的高。
此外，注意到形成的鏈的平均長(zhǎng)度隨分析物濃度的增加而增加。因此，本發(fā)明的方法也能夠通過(guò)測(cè)定鏈的平均長(zhǎng)度來(lái)定量測(cè)定待測(cè)定的分析物。
實(shí)施例2枝接有抗-vWF免疫球蛋白G(IgG)的磁性膠態(tài)顆粒的制備和von Willebrand因子的檢測(cè)制備200μl在磷酸鹽緩沖液中的膠態(tài)顆粒溶液(20mM，pH7.2)，它含有1體積％的磁性膠態(tài)顆粒(直徑為206nm，可從法國(guó)Ademtech獲得)。
為了激活這些顆粒，向該溶液中加入200μl的0.01g/l 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDAC)水溶液，并在44℃下將混合物持續(xù)攪拌20分鐘。然后用0.001％的吐溫20水溶液洗滌除去過(guò)量的EDAC。
接下來(lái)，通過(guò)將400μl激活的膠態(tài)顆粒溶液加入到400μl的IgG溶液(1.7μl IgG以20mg/ml于398μl水中)中將IgG枝接到膠態(tài)顆粒上。在44℃下將該溶液持續(xù)攪拌20分鐘，然后在室溫下保持10分鐘。
然后用飽和緩沖液沖洗將過(guò)量的IgG溶液除去(含有0.001％吐溫20的甘氨酸-BSA緩沖液)。通過(guò)1.2μm過(guò)濾器過(guò)濾分離由此獲得的枝接顆粒。
由此制得的枝接顆粒具有控制密度和取向的枝接抗體。此外，枝接穩(wěn)定，即使在溶液中有表面活性劑和其它蛋白的情況下。就vonWillebrand因子的測(cè)定而言，使用含有200％(2國(guó)際單位)vonWillebrand因子的LiatestvVF校準(zhǔn)血漿(STAvWF Calibrator，可從Diagnostica Stago獲得)，并且基本上按照本測(cè)試說(shuō)明書中所述的步驟，只是使用枝接磁性顆粒的膠體溶液。
用Owren-Koller緩沖液制備含100％、1％、0.1％von Willebrand因子的血漿稀釋液。使用該Owren-Koller緩沖液作為對(duì)照(0％)。
接下來(lái)，向1體積的各稀釋液中加入2體積的甘氨酸緩沖液和3體積的枝接磁性顆粒的膠體溶液。
然后將所得溶液放置在橫截面為50μm的正方形毛細(xì)管中。將該裝配放置在強(qiáng)度為70mT的磁場(chǎng)中持續(xù)5分鐘。除去磁場(chǎng)之后，將該樣品放置在光學(xué)顯微鏡的平臺(tái)上。圖4A、B、C和D顯示了所研究的不同稀釋樣品在顯微鏡下的外觀。尤其注意到，所述方法還可以可見(jiàn)地分辨出相對(duì)于對(duì)照物(0％)為0.1％的樣品。這一結(jié)果比Liatest的2％的檢測(cè)域值要好。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)和/或定量液體介質(zhì)中的至少一種分析物的方法，其特征在于使用表面經(jīng)所述待檢測(cè)和/或待測(cè)定的分析物的至少一種特異性配體官能化的磁性膠態(tài)顆粒，并且所述方法包括(1)將所述顆粒與所述待分析的介質(zhì)接觸，(2)對(duì)所述介質(zhì)施加一磁場(chǎng)，其強(qiáng)度足夠使所述磁性顆粒組裝成鏈狀，(3)將所述磁場(chǎng)保持足夠時(shí)間，以使所述分析物與至少兩個(gè)分別存在于鏈的兩個(gè)相鄰顆粒上的特異性配體偶聯(lián)或結(jié)合，(4)去除磁場(chǎng)，和(5)檢測(cè)所述分析物是否存在，并根據(jù)情況，通過(guò)是否存在恒定的磁性膠態(tài)顆粒鏈來(lái)檢測(cè)其濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述顆粒是超順磁的膠態(tài)顆粒。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述超順磁膠態(tài)顆粒是用含水鐵氧流體與聚合物共沉淀或者在有機(jī)相中用鐵氧流體乳化而獲得的。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述磁性膠態(tài)顆粒大小在5-10000nm之間，更優(yōu)選在100-500nm之間。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述特異性配體通過(guò)吸附相互作用、共價(jià)相互作用和/或高親合力相互作用固定到所述顆粒的表面上。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所固定的配體是高親合力鍵合偶聯(lián)的兩個(gè)成對(duì)物之一。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述配體為選自如下偶聯(lián)對(duì)的一個(gè)配對(duì)物(聚)碳水化合物/electin；生物素或生物素化的化合物/抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素、蛋白受體及其特異性配體；和半抗原/抗體。
8.如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所固定的配體是選自如下的化合物肽；包括糖蛋白、脂蛋白和其它類似或衍生結(jié)構(gòu)的自由或絡(luò)合形式的蛋白質(zhì)；免疫球蛋白；核酸，如DNA或RNA及其同源物；糖類如單糖或二糖、低聚糖和多糖；脂類；激素；受體；代謝物和其它生物物質(zhì)。
9.如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于目標(biāo)分析物是抗原、抗體和核酸和/或蛋白質(zhì)。
10.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于待分析的介質(zhì)預(yù)先經(jīng)過(guò)預(yù)處理，以便使分析物對(duì)其特異性配體之一的至少兩個(gè)分子具有反應(yīng)活性。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述預(yù)處理包括用高親合力偶聯(lián)成對(duì)物之一官能化所述分析物。
12.如權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的方法，其中所檢測(cè)和/或定量的分析物為諸如病毒、細(xì)菌或原生動(dòng)物和其它感染劑的病原體的抗體；腫瘤抗體；針對(duì)變應(yīng)原的抗體或者自身抗體。
13.如權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的方法，其中所檢測(cè)和/或定量的抗原為自由抗原，例如血蛋白和諸如凝血因子的因子、代謝物、激素或介體；或者與載體相連的抗原，例如微生物的表面抗原、膜結(jié)合的受體；血型抗原和主要組織相容性系統(tǒng)的抗原。
14.如權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述磁性膠態(tài)顆粒還帶有第二標(biāo)記。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述標(biāo)記能夠通過(guò)肉眼、光學(xué)、機(jī)械和/或電的方式表征。
16.如權(quán)利要求14或15所述的方法，其特征在于所述標(biāo)記選自彩色顏料和熒光劑或磷光劑。
17.如權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于使用多種磁性膠態(tài)顆粒，分別用各待測(cè)定分析物的至少一種特異性配體對(duì)這些磁性膠態(tài)顆粒進(jìn)行官能化。
18.如權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述磁場(chǎng)是連續(xù)的。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于所述連續(xù)磁場(chǎng)的磁通量密度為5-500mT，優(yōu)選10-100mT。
20.如權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述磁場(chǎng)是交變的。
21.如權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述鏈的表征通過(guò)顯微鏡觀察直接進(jìn)行，和/或根據(jù)情況通過(guò)任意的光學(xué)、機(jī)械和/或電方法間接進(jìn)行。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于所述鏈的表征是通過(guò)光度測(cè)定法或濁度測(cè)定法進(jìn)行的。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于所述鏈的表征是通過(guò)圖像處理進(jìn)行的。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于使用CCD照相機(jī)作為圖像捕獲設(shè)備。
25.如權(quán)利要求21-24任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于使用激光作為光源。
26.一種檢測(cè)液體介質(zhì)中分析物的試劑盒，其特征在于它至少包括表面經(jīng)所述目標(biāo)分析物的至少一種特異性配體官能化的磁性膠態(tài)顆粒。
27.如權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)所述的方法用于檢測(cè)和/或定量微流體系統(tǒng)中的至少一種分析物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)和/或定量液體介質(zhì)中的至少一種分析物的方法，其特征在于使用表面經(jīng)所述待檢測(cè)和/或待測(cè)定的分析物的至少一種特異性配體官能化的磁性膠態(tài)顆粒，并且所述方法包括將所述顆粒與所述待分析的介質(zhì)接觸；對(duì)所述介質(zhì)施加一磁場(chǎng)，其強(qiáng)度足夠使所述磁性顆粒組裝成鏈狀；將所述磁場(chǎng)保持足夠時(shí)間，以使所述分析物與至少兩個(gè)分別存在于鏈的兩個(gè)相鄰顆粒上的特異性配體偶聯(lián)或結(jié)合；去除磁場(chǎng)，并檢測(cè)所述分析物是否存在，并根據(jù)情況，通過(guò)是否存在所述恒定的磁性顆粒鏈來(lái)檢測(cè)其濃度。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1589405SQ02823033
公開(kāi)日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2002年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月20日
發(fā)明者熱羅姆·比貝特, 讓·博德里, 阿蘭·魯索 申請(qǐng)人:斯達(dá)高診斷公司, 熱羅姆·比貝特