專利名稱：檢查和制造降低了粒子形成能力的(－)鏈rna載體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢查和制造(-)鏈RNA病毒載體的方法，所述載體的粒子形成能力已被降低或消除。
背景技術(shù)：
近年來，(-)鏈RNA病毒如仙臺(tái)病毒(Sendai virus)(SeV)的遺傳重組技術(shù)的發(fā)展已使其可作為基因轉(zhuǎn)移載體用于更廣泛應(yīng)用(WO00/70055和WO00/70070)。但是，這些載體都有一個(gè)問題，就是載體導(dǎo)入后，病毒從靶細(xì)胞中二次釋放。病毒粒子在被復(fù)制型病毒感染的細(xì)胞內(nèi)形成，然后釋放出子代病毒。還發(fā)現(xiàn)病毒樣粒子(VLP)可以從導(dǎo)入了F缺陷型非復(fù)制型SeV的細(xì)胞釋放。這樣，非?？释l(fā)展出一種不生產(chǎn)VLP的表達(dá)載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供檢查和制造(-)鏈RNA病毒載體的方法，所述載體的粒子形成能力已被減弱或消除。
已經(jīng)報(bào)道基質(zhì)(M)蛋白對于仙臺(tái)病毒(SeV)和其它(-)鏈RNA病毒中病毒粒子的形成起關(guān)鍵作用。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)水泡性口炎病毒(VSV)中M蛋白的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致VLP出芽(budding)(Justice，P.A.等，J.Virol.69；3156-3160(1995))。還有報(bào)道稱副流感病毒VLP的形成也在僅僅有M蛋白過表達(dá)的情況下發(fā)生(Coronel，E.C.等，J.Virol.73；7035-7038(1999))。雖然這種由M蛋白單獨(dú)引起的VLP形成并不能在所有的(-)鏈RNA病毒內(nèi)觀察到，但M蛋白可作為病毒粒子形成的核心來識(shí)別，就這一點(diǎn)而言所有(-)鏈RNA病毒均一致(Garoff，H等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.621171-1190(1998))。
M蛋白對病毒粒子形成的特定作用歸納如下病毒粒子是在細(xì)胞膜中所謂的脂筏(lipid raft)上形成的(Simons，K和Ikonen，E.Nature 387；569-572(1997))。這些起初是被鑒定為不溶于非離子型去污劑(如TritonX-100)的脂類組份(Brown，D.A.和Rose，J.K.Cell 68；533-544(1992))。病毒粒子在脂筏上的形成已在流感病毒(Ali，A等，J.Virol.74；8709-8719(2000))，麻疹病毒(MeV；Manie，S.N.等，J.Virol.74；305-311(2000))，SeV(Ali A和Nayak，D.P.Virology 276；289-303(2000))以及其它病毒中證實(shí)。在這些脂筏位點(diǎn)上，M蛋白能夠促進(jìn)病毒粒子的形成，濃縮包膜蛋白(也稱為刺突蛋白(spike protein))和核糖核蛋白(RNP)。換言之，M蛋白能夠驅(qū)動(dòng)病毒組裝及出芽(Cathomen，T等，EMBO J.17；3899-3908(1998)，Mebatsion，T.等，J.Virol.73242-250(1999))。事實(shí)上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)M蛋白能夠結(jié)合流感病毒(Zhang，J等，J.Virol.67；651-663(1993))和SeV(Sanderson，C.M等，J.Virol.74；651-663(1993))刺突蛋白的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尾巴(cytoplasmic tail)等。它還可結(jié)合流感病毒(Ruigrok，R.W等，Virology 173；311-316(1989))，副流感病毒，SeV(Coronel，E.C.等，J.Virol.75；1117-1123(2001))等的RNP。另外，已經(jīng)報(bào)道M蛋白在SeV(Heggeness，M.H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79；6232-6236(1982)和水泡性口炎病毒等(VSV；Gaudin，Y.等，Virology 206；28-37(1995)，Gaudin，Y.等，J.Mol.Biol.274；816-825(1997))中可以與自身形成寡聚物。這樣，根據(jù)這些病毒組份結(jié)合脂類的能力，M蛋白可以作為病毒組裝和出芽的驅(qū)動(dòng)力量。
基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人認(rèn)為應(yīng)該重點(diǎn)研究M蛋白的修飾，以抑制粒子(VLP)的二次釋放。另外，一些報(bào)告顯示對包膜蛋白(刺突蛋白)進(jìn)行修飾也可以抑制VLP釋放。下述試驗(yàn)性實(shí)施例是病毒粒子的形成被確實(shí)抑制的具體報(bào)告狂犬病病毒(RV)中G蛋白缺陷導(dǎo)致VLP形成降低1/30(Mebatsion，T.等，Cell 84；941-951(1996))。當(dāng)M蛋白缺陷時(shí)，該水平下降至1/500,000或更低(Mebatsion，T等，J.Virol.73；242-250(1999))。另外，在麻疹病毒(MeV)的例子中，當(dāng)M蛋白缺陷時(shí)，細(xì)胞與細(xì)胞的融合會(huì)提高(Cathomen，T.等，EMBO J.17；3899-3908(1998))?？梢约僭O(shè)這是由于病毒粒子的形成被抑制而導(dǎo)致。另外，當(dāng)F或H蛋白的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尾巴(在細(xì)胞質(zhì)一側(cè)的尾巴)中存在突變時(shí)也會(huì)出現(xiàn)類似的融合提高現(xiàn)象(Cathomen，T等，J.Virol.72；1224-1234(1998))。具體而言，已經(jīng)闡明了SeV的下述問題當(dāng)SeV蛋白F和HN處于分泌途徑中時(shí)(具體為當(dāng)它們位于高爾基體等時(shí))，(F或HN蛋白的)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尾巴會(huì)結(jié)合M蛋白(Sanderson，C.M.等，J.Virol.67；651-663(1993)，Sanderson，C.M.等，J.Virol.68；69-76(1994))。本發(fā)明的發(fā)明人假定該結(jié)合對于M蛋白有效轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜脂筏上的過程至關(guān)重要，而病毒粒子正是在脂筏上形成。M蛋白被認(rèn)為可以結(jié)合細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的F和HN蛋白，然后就可以通過F和HN蛋白分泌途徑轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上。
本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為缺失這種“核心”M蛋白應(yīng)該是進(jìn)行修飾以抑制二次粒子釋放即VLP釋放的最有效途徑。但是，如果該修飾病毒在工業(yè)規(guī)模應(yīng)用，例如用于基因治療，那么必須考慮該病毒的生產(chǎn)過程。如上所述，使用此前報(bào)道的RV和MeV體系——即由痘苗病毒(VV)-驅(qū)動(dòng)的T7聚合酶誘導(dǎo)表達(dá)的體系(Mebatsion，T等，J.Virol.73242-250(1999)；Cathomen，T等，EMBO J.17；3899-3908(1998))——很難獲得高滴度的病毒。用于誘導(dǎo)表達(dá)的VV會(huì)不可避免地污染制備的M缺陷病毒溶液。這樣，很難生產(chǎn)事實(shí)上可應(yīng)用的病毒。
除了M蛋白缺失方法之外的有效方法包括缺失F和HN蛋白，F(xiàn)和HN蛋白被認(rèn)為在M蛋白向細(xì)胞膜脂筏上轉(zhuǎn)移的過程中起作用；或者導(dǎo)入突變以便僅僅使這些蛋白的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尾巴缺失的方法。但是，一些報(bào)告描述了許多VLP的存在，特別是在F缺陷型(WO 00/70070)和HN-缺陷型SeV(Stricker，R.和Roux，L.，J.Gen.Virol.72；1703-1707(1991))的情況中。于是認(rèn)為該方法并非行之有效的方法。目前為止，除了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尾巴之外，沒有鑒定出預(yù)期能夠影響VLP形成的刺突蛋白區(qū)域。同樣，也沒有鑒定出預(yù)期能夠影響VLP形成的M蛋白區(qū)域。另外，仍需考慮適于工業(yè)應(yīng)用的病毒制備，這類過程的設(shè)計(jì)難度頗大。
為解決VLP釋放被抑制的載體的構(gòu)建問題，本發(fā)明人考慮在病毒基因中使用溫度敏感突變。已經(jīng)報(bào)告了能夠在低溫而不能在高溫下生長的突變病毒株。本發(fā)明人設(shè)想，在高溫下抑制病毒粒子形成的突變蛋白，特別是突變M或蛋白，可以通過下述方式用于抑制VLP形成可以在低溫下(例如32℃)進(jìn)行病毒的生成，但是該病毒的實(shí)際應(yīng)用，例如基因治療的應(yīng)用，可以在更高溫度(如37℃)下進(jìn)行。為此，本發(fā)明人構(gòu)建了重組F基因缺陷型仙臺(tái)病毒載體，其編碼突變M和突變HN蛋白，并含有總共6種已報(bào)告的M和HN蛋白溫度敏感型突變(M蛋白和HN蛋白各3種)。測試該病毒的VLP釋放，測得的水平大約是野生型病毒的1/10或更低。另外，通過抗M抗體進(jìn)行免疫染色來分析M蛋白在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，所述細(xì)胞中已經(jīng)導(dǎo)入了VLP釋放被抑制的仙臺(tái)病毒載體。結(jié)果表明，與導(dǎo)入了野生型病毒的細(xì)胞相比，VLP被抑制的病毒的導(dǎo)入可以顯著地減少M(fèi)蛋白在細(xì)胞表面的聚集。特別是在高溫(38℃)，M蛋白縮合模式大幅降低。使用共焦激光顯微鏡密切檢查M和HN蛋白在細(xì)胞上的亞細(xì)胞定位，所述細(xì)胞已被含有溫度敏感型突變M基因的SeV所感染。M蛋白在細(xì)胞表面的定位明顯減少，甚至在低溫(32℃)也如此，并觀察到具有與微管類似的形態(tài)學(xué)。高溫下(37℃)，M蛋白位于微管中心體附近，也就是在高爾基體附近。加入微管解聚劑會(huì)破壞M蛋白的定位結(jié)構(gòu)。在含有溫度敏感型M基因的SeV和含有野生型M基因的SeV中都出現(xiàn)了該現(xiàn)象。這就產(chǎn)生了這樣的可能性M蛋白實(shí)際上沿微管進(jìn)行有效定位。這些發(fā)現(xiàn)表明導(dǎo)入了溫度敏感突變的病毒中二次粒子釋放水平的降低是由于M蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位的不足而引起的，而這種定位被認(rèn)為在粒子形成的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這樣，通過防止M蛋白正常的細(xì)胞內(nèi)定位就可有效抑制VLP的形成。另外，與微管的相互作用對于M蛋白行使功能非常重要。例如，可使用基因突變或那些抑制M蛋白沿著微管從高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的藥物來破壞M蛋白的亞細(xì)胞定位，從而減少二次粒子釋放。也就是說，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過制備含有導(dǎo)致缺陷M蛋白定位的突變的(-)RNA病毒載體，可以得到粒子形成能力被減弱或消除了的重組(-)鏈RNA病毒載體。
例如，首先誘變M基因，或編碼刺突蛋白的基因如F基因和HN基因。然后從攜帶這些突變基因的病毒載體中篩選出具有異常M蛋白定位的載體，特別是M蛋白在細(xì)胞表面的聚集被削弱或消除了的那些載體。這樣就可以有效獲得粒子形成能力已被削弱或清除的重組仙臺(tái)病毒載體。例如，這種載體可用于測試對VLP形成的抑制作用，所述抑制是通過修飾刺突蛋白的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尾巴或其它區(qū)域而導(dǎo)致的。另外，還可根據(jù)M蛋白在細(xì)胞膜上是否存在定位來篩選各種突變病毒，包括那些帶有M蛋白修飾的突變病毒。這些方法可應(yīng)用于(-)鏈RNA病毒以及SeV。
通過向P基因和L基因中導(dǎo)入突變，本發(fā)明人構(gòu)建了F缺陷型載體，其能夠抑制病毒粒子的二次釋放，降低細(xì)胞毒性，并使插入的基因在更長時(shí)間內(nèi)持續(xù)表達(dá)。本發(fā)明人使用了含有E86K或L511F取代突變的SeV P蛋白基因，以及含有N1197S和K1795E取代突變的SeV L蛋白基因。與不含基因突變的載體相比，同時(shí)帶有P和L基因突變的載體被導(dǎo)入能表達(dá)這些導(dǎo)入基因的細(xì)胞時(shí)，所述細(xì)胞的數(shù)目的降低程度被顯著抑制。細(xì)胞毒性程度和VLP二次釋放也明顯減少。本發(fā)明人還構(gòu)建了在四種蛋白M，HN，P和L中帶有突變的病毒。通過將P蛋白和L蛋白的突變與上述M蛋白和HN蛋白的溫度敏感突變相組合而獲得這種病毒。使用這些重組突變病毒可以顯著降低細(xì)胞毒性。特別是含有L511位氨基酸取代的P蛋白基因的SeV中，粒子的二次釋放被顯著降低。
本發(fā)明人的目標(biāo)還在于構(gòu)建一種病毒，其中M蛋白在含有該病毒的細(xì)胞表面上的聚集被徹底消除。為此，本發(fā)明首次構(gòu)建了持續(xù)表達(dá)M蛋白的細(xì)胞，該細(xì)胞可以用于生產(chǎn)M缺陷型病毒。通過利用這些細(xì)胞，使得首次有可能生產(chǎn)已證實(shí)沒有其它病毒污染的基因治療載體，這些載體甚至可以是高滴度的。本發(fā)明的M缺陷型SeV生產(chǎn)體系是第一次提供了切實(shí)可利用的M缺陷型(-)鏈RNA病毒。缺乏M基因的感染性病毒粒子可以在病毒形成細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中收集，所述病毒滴度為107CIU/ml或更高。導(dǎo)入了上述病毒的細(xì)胞的VLP二次釋放幾乎被完全抑制。細(xì)胞毒性也下降。另外，本發(fā)明人還新制備了既表達(dá)M蛋白又表達(dá)F蛋白的輔助細(xì)胞。通過使用這些輔助細(xì)胞，他們首次成功地收集到了同時(shí)缺乏M和F基因的感染性病毒粒子。該病毒可以在病毒形成細(xì)胞的培養(yǎng)上清中收集，滴度最高為108CIU/ml或更高。在如此制備的病毒中幾乎不存在二次粒子的生成。同時(shí)缺乏M和F基因的病毒載體的細(xì)胞毒性明顯低于只缺乏M或F基因的載體。該病毒載體在體內(nèi)和體外的神經(jīng)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移中均非常有效。預(yù)期該病毒可以用作基因轉(zhuǎn)移載體，其具有感染多種細(xì)胞的能力，包括感染非分裂細(xì)胞。
本發(fā)明涉及檢查并制造(-)鏈RNA病毒載體的方法，所述載體中粒子形成能力已被削弱或消除。更具體地，本發(fā)明涉及1.一種檢查(-)鏈RNA病毒載體的粒子形成能力的方法，其中該方法包括檢測M蛋白在導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞中的定位。
2.一種篩選粒子形成能力已被降低或消除的(-)鏈RNA病毒載體的方法，包括(a)檢測已導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞中M蛋白的定位，以及(b)篩選出已降低或消除定位的載體。
3.項(xiàng)1或2的方法，其中M蛋白的定位是指M蛋白在細(xì)胞表面的聚集。
4.一種篩選基因的方法，所述基因能降低或消除(-)鏈RNA病毒載體的粒子形成能力，所述方法包括(a)檢測已導(dǎo)入了含有測試基因的(-)鏈RNA病毒載體的細(xì)胞中M蛋白的定位，以及(b)篩選出能夠降低或消除定位的基因。
5.項(xiàng)4的方法，其中M蛋白的定位是指M蛋白在細(xì)胞表面的聚集。
6.項(xiàng)4或5的方法，其中所述測試基因是選自(-)鏈RNA病毒M，F(xiàn)或HN基因的一種基因的突變。
7.粒子形成能力已被降低或消除的重組(-)鏈RNA病毒載體的制備方法，其中該方法包括重建該(-)鏈RNA病毒載體，所述載體含有可根據(jù)項(xiàng)4-6任一方法鑒定或分離的基因，所述重建是在該基因可以持續(xù)彌補(bǔ)M蛋白定位的降低或消除的條件下進(jìn)行。
8.粒子形成能力已被降低或消除的重組(-)鏈RNA病毒載體的制備方法，其中該方法包括，在能夠持續(xù)表達(dá)功能性M蛋白的條件下，重建該(-)鏈RNA病毒載體，所述載體由于M基因的缺失或突變而導(dǎo)致M基因表達(dá)產(chǎn)物的定位被降低或消除。
9.項(xiàng)8的方法，其中的步驟包括，在允許溫度重建含有溫度敏感型突變M基因的(-)鏈RNA病毒載體，所述突變M基因降低或消除了基因產(chǎn)物在細(xì)胞表面的聚集。
10.項(xiàng)9的方法，其中溫度敏感型突變M基因是編碼(-)鏈RNA病毒M蛋白的基因，該基因中相應(yīng)于下述至少一個(gè)氨基酸位點(diǎn)的氨基酸已被其它氨基酸取代仙臺(tái)病毒M蛋白的G69，T116和A183。
11.項(xiàng)8的方法，其中的步驟包括在已被導(dǎo)入用于重建的細(xì)胞的染色體中的M基因可以表達(dá)的條件下，重建M基因缺失型(-)鏈RNA病毒載體。
12.項(xiàng)7-11的任一方法，其中所述(-)鏈RNA病毒載體進(jìn)一步含有HN和/或F基因缺失，或者含有HN和/或F基因的溫度敏感型突變。
13.項(xiàng)12的方法，其中所述溫度敏感型突變HN基因是編碼(-)鏈RNA病毒HN蛋白的基因，該基因中相應(yīng)于下述至少一個(gè)氨基酸位點(diǎn)的氨基酸已被其它氨基酸取代仙臺(tái)病毒HN蛋白的A262，G264和K461。
14.項(xiàng)7-13之一的方法，其中所述(-)鏈RNA病毒載體進(jìn)一步含有P和/或L基因的突變。
15.項(xiàng)14的方法，其中所述P基因中的突變是該(-)鏈RNA病毒P蛋白的氨基酸位點(diǎn)被其它氨基酸取代，所述位點(diǎn)相應(yīng)于仙臺(tái)病毒P蛋白的E86和/或L511。
16.項(xiàng)14或15的方法，其中所述L基因中的突變是該(-)鏈RNA病毒L蛋白的氨基酸位點(diǎn)被其它氨基酸取代，所述位點(diǎn)相應(yīng)于仙臺(tái)病毒L蛋白的N1197和/或K1795。
17.項(xiàng)7-16之一的方法，其中該方法包括在35℃或更低溫度重建載體。
18.項(xiàng)1-17的任一方法，其中所述(-)鏈RNA病毒為副粘病毒。
19.項(xiàng)18的方法，其中所述副粘病毒為仙臺(tái)病毒。
20.根據(jù)項(xiàng)7-14任一方法制備的重組(-)鏈RNA病毒載體，其中該載體的粒子形成能力已被降低或消除。
21.重組(-)鏈RNA病毒，它含有功能性M蛋白，但該病毒基因組中M蛋白編碼序列已被缺失。
22.含有下述(a)-(d)中至少一種特性的重組(-)鏈RNA病毒(a)該病毒基因組所編碼的M蛋白在相應(yīng)于仙臺(tái)病毒M蛋白G69，T116和A183位點(diǎn)的至少一個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸被其它氨基酸取代；(b)該病毒基因組所編碼的HN蛋白在相應(yīng)于仙臺(tái)病毒HN蛋白A262，G264和K461位點(diǎn)的至少一個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸被其它氨基酸取代；(c)該病毒基因組所編碼的P蛋白在相應(yīng)于仙臺(tái)病毒P蛋白E86或L511位點(diǎn)上的氨基酸被其它氨基酸取代；(d)該病毒基因組所編碼的L蛋白在相應(yīng)于仙臺(tái)病毒L蛋白N1197和/或K1795位點(diǎn)上的氨基酸，或另一(-)鏈RNA病毒M蛋白同源位點(diǎn)的氨基酸，被其它氨基酸取代；23.項(xiàng)22的病毒，至少含有特性(a)和(b)。
24.項(xiàng)22的病毒，至少含有特性(c)和(d)。
25.項(xiàng)22的病毒，含有(a)-(b)全部特性。
26.項(xiàng)21-25之一的病毒，其中該病毒基因組中至少有一種編碼刺突蛋白的序列被進(jìn)一步缺失。
27.項(xiàng)26的病毒，其中該刺突蛋白為F蛋白。
28.項(xiàng)21-27的任一病毒，其中該(-)鏈RNA病毒為副粘病毒。
29.項(xiàng)28的病毒，其中該副粘病毒為仙臺(tái)病毒。
30.項(xiàng)21-29的任一重組病毒，其用于通過基因?qū)雭斫档图?xì)胞毒性。
31.項(xiàng)21-30的任一重組病毒，其用于通過基因?qū)雭硪种茖?dǎo)入基因的表達(dá)水平的降低。
32.項(xiàng)21-31的任一重組病毒，其用于通過基因?qū)雭硪种茝膶?dǎo)入了病毒的細(xì)胞釋放病毒樣粒子(VLP)。
33.一種水溶液，它含有106CIU/ml或更多的根據(jù)項(xiàng)21-32任一所述的重組病毒。
本發(fā)明提供測試(-)鏈RNA病毒載體的粒子形成能力的方法，其含有在導(dǎo)入該載體的細(xì)胞中檢測M蛋白定位的步驟。本發(fā)明人表明了M蛋白在載體形成細(xì)胞內(nèi)的定位與(-)鏈RNA病毒載體的粒子形成能力之間的緊密聯(lián)系。在形成這些粒子的細(xì)胞中，在細(xì)胞表面檢測到高水平的M蛋白；更嚴(yán)格地說，它們在細(xì)胞表面聚集。但是，在感染了粒子形成能力已減弱的載體的細(xì)胞中，M蛋白在細(xì)胞表面的定位減少，并在細(xì)胞質(zhì)中檢測到高水平的M蛋白。當(dāng)粒子形成能力被消除時(shí)，M蛋白會(huì)濃縮到核周圍。這種情況下，M蛋白會(huì)濃縮在預(yù)期接近高爾基體的區(qū)域，表明M蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)異常，而該蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)有微管參與。這樣，由于M蛋白的亞細(xì)胞定位與載體的粒子形成能力相關(guān)，就可以通過檢測M蛋白的定位來測試該能力。本發(fā)明的這種測試是通過檢測M蛋白在導(dǎo)入了載體的細(xì)胞中的定位，將M蛋白的定位與粒子形成能力相聯(lián)系而實(shí)現(xiàn)的。換言之，M蛋白在細(xì)胞中的定位已被減少或消除的那些載體具有較低的粒子形成能力；定位被阻礙得越強(qiáng)烈，則粒子形成能力減少的幅度越大。具體而言，如上所述，M蛋白在細(xì)胞表面聚集的程度越低，則該載體粒子形成能力降低的幅度越大。特別地，當(dāng)載體消除了M蛋白在細(xì)胞表面的聚集時(shí)，該載體就被認(rèn)為不具備粒子形成能力。肉眼程度上M蛋白在細(xì)胞表面的定位減少時(shí)，就可斷定該載體形成粒子的能力更低。導(dǎo)致M蛋白在細(xì)胞質(zhì)或核周圍而不是在細(xì)胞表面定位的載體，其粒子形成能力會(huì)降低。特別地，當(dāng)M蛋白在核附近濃縮并定位時(shí)，或者聚集在高爾基體區(qū)域時(shí)，該載體的粒子形成能力被認(rèn)為實(shí)際上或徹底地消除了。通過開發(fā)一種導(dǎo)致抑制M蛋白亞細(xì)胞定位，特別是導(dǎo)致抑制M蛋白在細(xì)胞表面聚集的載體，有可能抑制VLP從感染細(xì)胞釋放。
本發(fā)明中，M蛋白在細(xì)胞中定位的減少或消除指，例如M蛋白細(xì)胞定位的缺陷。也就是說，在感染了副粘病毒的細(xì)胞中“M蛋白定位”(還可指“M蛋白的正常定位”)的顯著破壞，所述病毒維持粒子或VLP的形成能力(例如，野生型副粘病毒和維持VLP形成能力但含有缺陷的刺突蛋白基因的病毒等)。具體而言，M蛋白亞細(xì)胞定位的缺陷是指M蛋白在細(xì)胞中定位減少或消除的現(xiàn)象，所述細(xì)胞已被具有粒子或VLP形成能力的載體所感染。M蛋白在細(xì)胞表面附近定位，更具體而言，它是在感染了粒子或VLP形成能力正常的副粘病毒的細(xì)胞表面聚集。本發(fā)明中，M蛋白正常定位的改變或消除分別是指M蛋白定位的減少或消除。本發(fā)明中，M蛋白定位的缺陷可以包括，例如M蛋白定位的異常(與正常的M蛋白定位不同)。本發(fā)明中，M蛋白定位的缺陷包括例如，細(xì)胞表面聚集的減少和消除，細(xì)胞表面表達(dá)的減少，細(xì)胞質(zhì)中M蛋白水平的提高，M蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的濃縮(如在核周圍濃縮)等，M蛋白水平在整個(gè)細(xì)胞中的降低或消失。
M蛋白的亞細(xì)胞定位可通過細(xì)胞分級(jí)分離進(jìn)行測定，或通過使用免疫染色直接測定M蛋白的定位等方法進(jìn)行檢測。在免疫染色中，例如，熒光標(biāo)記抗體染色的M蛋白可在共焦激光顯微鏡下觀察到。當(dāng)細(xì)胞被裂解后，可使用已知的細(xì)胞分級(jí)分離方法分級(jí)分離細(xì)胞，然后可使用抗M蛋白的抗體，通過諸如免疫沉淀或Western印跡技術(shù)，鑒定含M蛋白的組份以測定定位情況。用具有粒子形成能力的載體感染的細(xì)胞中，M蛋白定位在細(xì)胞膜上。當(dāng)M蛋白在細(xì)胞膜上定位的水平降低時(shí)，就可斷定病毒粒子的形成減少。本發(fā)明方法中，優(yōu)選通過檢測細(xì)胞表面M蛋白的聚集來測定M蛋白的定位情況。
檢測M蛋白亞細(xì)胞定位的直接方法都可用于檢測M蛋白的細(xì)胞表面聚集，所述方法如細(xì)胞分級(jí)分離，免疫染色等。病毒粒子在所謂的細(xì)胞膜脂筏中形成，該脂筏不溶于非離子型去污劑如Triton X-100。由于M蛋白與刺突蛋白，RNP以及與M蛋白本身和與脂類的結(jié)合能力，認(rèn)為M蛋白參與病毒組份在脂筏中的聚集。相應(yīng)地，認(rèn)為用脂筏級(jí)分進(jìn)行電泳等處理所檢測到的M蛋白可以反映聚集的M蛋白。也就是說，當(dāng)可檢測到的M蛋白的數(shù)量減少時(shí)，就會(huì)檢測到M蛋白在細(xì)胞膜上的聚集降低?？梢允褂帽景l(fā)明人用于測定亞細(xì)胞定位的免疫細(xì)胞學(xué)染色方法直接觀察M蛋白在細(xì)胞膜上的聚集，也許是在脂筏中的整合。這需要能夠用于免疫細(xì)胞學(xué)染色的抗M抗體。用該方法進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)M蛋白聚集時(shí)，在細(xì)胞膜附近可以觀察到強(qiáng)烈濃縮的圖像。當(dāng)M蛋白未聚集時(shí)，既不會(huì)觀察到可檢測的濃縮形式，也不會(huì)檢測到清晰的細(xì)胞膜輪廓。另外，在細(xì)胞質(zhì)中只觀察到極少量的染色。這樣，當(dāng)檢測到少量濃縮形式或者根本未檢測到濃縮形式時(shí)，或者優(yōu)選地當(dāng)細(xì)胞膜輪廓不清晰并在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中觀察到少量染色時(shí)，就可以判斷M蛋白在細(xì)胞表面的聚集已降低。細(xì)胞表面M蛋白聚集已減少的這些病毒中粒子形成能力被抑制。
可使用上述檢測方法篩選粒子形成能力已被降低或消除的(-)鏈RNA病毒載體。該篩選方法包括以下步驟(a)檢測已導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞中M蛋白的定位情況，以及(b)篩選出降低或消除定位的載體(即該載體改變了M蛋白的正常定位)。如上所述，定位的減少或消除是指M蛋白的正常定位被顯著地破壞。另外，定位的減少或消除還包括M蛋白和/或其定位的徹底消除。定位的這種減少和消除不僅包括在所有細(xì)胞中定位均減少或消除，還包括在部分細(xì)胞群中定位的減少或消除，或者在單一細(xì)胞中部分定位被減少或消除。另外，還包括在特定情況下定位的減少或消除。例如，還包括這樣的情況在特定溫度或更低溫度，定位的水平與野生型相同，但是在較高溫度，相比于野生型的定位則降低或消除。與野生型病毒相比，較高定位水平被減少或消除的優(yōu)選溫度約為37℃到約38℃，其相應(yīng)于哺乳動(dòng)物體溫。例如，用各種突變病毒株感染細(xì)胞，然后檢測M蛋白的亞細(xì)胞定位。通過篩選M蛋白的定位被降低或消除的病毒，篩選出并分離出粒子形成能力已被降低或消除的病毒。
在本發(fā)明的篩選方法中，優(yōu)選使用以細(xì)胞表面M蛋白聚集作為指標(biāo)的方法來篩選粒子形成能力被降低或消除的(-)鏈RNA病毒載體。該篩選方法包括以下步驟(a)檢測已導(dǎo)入了載體的細(xì)胞中M蛋白在細(xì)胞表面的聚集，以及(b)篩選出已降低或消除聚集的載體。聚集的降低是指聚集的顯著降低。另外，聚集的降低還包括聚集以及M蛋白本身的徹底消除。聚集的降低或消除不僅包括在所有細(xì)胞中聚集均降低或消除，還包括在部分細(xì)胞群中細(xì)胞表面聚集的降低或消除，以及在部分細(xì)胞表面聚集的降低或消除。還包括在特定情況下聚集的降低或消除。例如，還包括這樣的情況在特定溫度或更低溫度，聚集的水平與野生型相同，但是在較高溫度，相比于野生型，聚集則降低或消除。與野生型病毒相比，聚集降低或消除的優(yōu)選溫度約為37℃到約38℃，其相應(yīng)于哺乳動(dòng)物體溫。例如，用各種突變病毒株感染細(xì)胞，然后檢測M蛋白在細(xì)胞表面的定位。篩選出細(xì)胞表面M蛋白聚集降低或消除的病毒株，從而分離出粒子形成能力已降低或消除的病毒。
本發(fā)明中，粒子形成能力指載體從感染了病毒載體的細(xì)胞中釋放感染性以及非感染性病毒粒子的能力。這種釋放被稱為二次釋放，而該粒子則被稱為病毒樣粒子(VLP)。本發(fā)明中，粒子形成的減少和抑制指粒子形成能力的顯著降低。粒子形成能力的這種降低包括形成粒子的能力被徹底消除。粒子形成能力的這種降低或消除包括病毒載體的平均粒子形成能力被降低。例如，包括一些被感染細(xì)胞中粒子形成能力的降低或消除，以及在部分被感染病毒中粒子形成能力的降低或消除。另外，還包括在特定條件下粒子形成能力的降低或消除。例如，包括這樣的情況在特定溫度或更低溫度，轉(zhuǎn)基因病毒的粒子形成能力與野生型類似，但是在高于該特定溫度的溫度，相比于野生型，粒子形成能力則降低或消除。轉(zhuǎn)基因病毒與野生型病毒相比，使粒子形成能力減少或消除的優(yōu)選溫度為37℃到38℃，其相應(yīng)于哺乳動(dòng)物體溫(如37℃)。
所述病毒中粒子形成能力的降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(例如，5％或更低的顯著性水平)?？梢允褂美鏢tudent t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。病毒中粒子形成能力被降至1/2水平或更低，優(yōu)選1/5或更低，更優(yōu)選1/10或更低，更優(yōu)選1/30或更低，更優(yōu)選1/50或更低，更優(yōu)選1/100或更低，更優(yōu)選1/300或更低，更優(yōu)選1/500或更低。
粒子形成能力的消除包括粒子形成在數(shù)量或功能上的消除。粒子形成能力在數(shù)量上的消除是指，例如VLP低于檢測下限。在這種情況下，VLP的數(shù)目為103/ml或更低，優(yōu)選102/ml或更低，更優(yōu)選101/ml或更低。粒子形成能力在功能上的消除是指用可能含有VLP的樣品轉(zhuǎn)染細(xì)胞但是檢測不到感染性。病毒粒子可以在電子顯微鏡下觀察從而得到直接的確認(rèn)?；蛘撸梢允褂貌《竞怂峄虻鞍鬃鳛橹甘緞┻M(jìn)行檢測和定量。例如，可使用常規(guī)核酸檢測方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測病毒粒子中的基因組核酸?；蛘?，可用含有外源基因的病毒粒子感染細(xì)胞并檢測該基因的表達(dá)來定量所述病毒粒子?？稍趯⒎歉腥拘圆《玖Ｗ?病毒樣粒子等)與轉(zhuǎn)染試劑共同導(dǎo)入細(xì)胞后檢測基因表達(dá)來定量該粒子。具體而言，可使用脂轉(zhuǎn)染試劑，如DOSPER Liposomal Transfection Reagent(Roche，Basel，Switzerland；Cat.No.1811169)。將100微升含有或不含有病毒粒子的溶液與12.5μl DOSPER混合，并于室溫靜置10分鐘。每15分鐘震蕩混合物，并轉(zhuǎn)染已在6孔板上培養(yǎng)到融匯的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后第二天開始觀察是否出現(xiàn)被感染的細(xì)胞，以此檢測病毒樣粒子?？墒褂美鏑IU實(shí)驗(yàn)或紅細(xì)胞凝集活性(HA)(Kato，A等，1996，Genes Cells 1569-579；Yonemitsu，Y.& Kaneda，Y.，“Hemaggulutinating virus ofJapan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells.”，Ed.by BakerAH.，Molecular Biology of Vascular Disease.Method in MolecularMedicineHuman Presspp.295-306，1999)來測定病毒粒子或感染性?？墒褂弥D(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。還可使用DOSPER Liposomal TransfectionReagent(Roche，Basel，Switzerland；Cat.No.1811169)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將12.5μlDOSPER與100μl含有或不含有VLP的溶液混合，混合物于室溫靜置10分鐘。每15分鐘震蕩混合物并轉(zhuǎn)染已在6孔板上培養(yǎng)至融匯的細(xì)胞。兩天后檢測是否存在被感染的細(xì)胞，以此檢測是否存在VLP。
用于篩選的待測試病毒可以是自發(fā)突變株等，也可以是人工突變株。篩選出來的病毒可用作粒子形成能力已被降低或消除的(-)鏈RNA病毒載體。
可使用上述檢測方法篩選導(dǎo)致粒子形成能力在(-)鏈RNA病毒載體中降低或消除的基因。該篩選方法包括以下步驟(a)檢測已導(dǎo)入了含有受試基因的(-)鏈RNA病毒載體的細(xì)胞中M蛋白定位情況，以及(b)篩選出能夠降低或消除定位的基因。定位的降低或消除可按上述檢測。例如，以M蛋白在細(xì)胞表面的聚集作為指標(biāo)的定位篩選方法包括(a)檢測已導(dǎo)入了含有受試基因的(-)鏈RNA病毒載體的細(xì)胞中M蛋白在細(xì)胞表面的聚集，以及(b)篩選出能夠降低或消除聚集的基因。例如，制備已插入各種突變病毒基因和其它基因的病毒載體，用這些載體感染細(xì)胞，再檢測這些細(xì)胞中由感染性病毒所表達(dá)的細(xì)胞表面M蛋白定位。通過篩選細(xì)胞表面M蛋白聚集已降低或消除的病毒載體中所包含的基因，可以分離出導(dǎo)致粒子形成能力被降低或消除的基因。用于篩選的受試基因沒有特別的限制，可包括來自病毒或細(xì)胞的基因，以及含有自發(fā)或人工突變的基因。受試基因優(yōu)選為選自下述的基因的突變基因(-)鏈RNA病毒M，F(xiàn)和HN基因。有時(shí)與(-)鏈RNA病毒M基因功能相同的基因被稱為M1，類似地，與F和HN基因功能相同的基因分別被稱為G和H。本發(fā)明中，M基因包括M1基因，F(xiàn)和HN基因分別包括G和H基因。術(shù)語“突變基因”指與野生型基因產(chǎn)物相比，基因編碼的蛋白帶有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，缺失，添加和/或插入的基因。當(dāng)該受試基因?yàn)橥蛔僊基因時(shí)，在步驟(a)中，檢測在已導(dǎo)入了含有該受試突變M基因的(-)鏈RNA病毒載體的細(xì)胞中，該突變M基因的表達(dá)產(chǎn)物的定位情況。當(dāng)該受試基因?yàn)橥蛔僃和/或HN基因時(shí)，在步驟(a)中，檢測在已導(dǎo)入了含有該受試突變F和/或HN基因的(-)鏈RNA病毒載體的細(xì)胞中，該載體所表達(dá)的M蛋白的定位情況。通過檢測M蛋白在細(xì)胞中的定位情況，篩選出能夠減少或消除M蛋白定位的基因。例如，當(dāng)使用細(xì)胞表面聚集作為指標(biāo)測試M蛋白的定位時(shí)，通過檢測M蛋白的細(xì)胞表面聚集，篩選出能夠降低或消除M蛋白聚集的基因。類似地，可以使用受試基因進(jìn)行篩選，所述受試基因編碼能夠與病毒基因產(chǎn)物如M，F(xiàn)或HN蛋白相互作用的蛋白。所獲基因可用于生產(chǎn)粒子形成能力已被降低或消除的(-)鏈RNA病毒載體。
本文中，術(shù)語“能夠降低或消除M蛋白在細(xì)胞上定位的基因”是指能夠?qū)е翸蛋白亞細(xì)胞定位減少或消除的基因(也就是說它能改變M蛋白正常的定位)。例如，除了表示降低或消除M蛋白定位的基因之外，該術(shù)語還包括基因表達(dá)后導(dǎo)致M蛋白定位缺陷，或其它環(huán)境因素改變(例如，pH，鹽濃度，溫度，化合物的添加，其它基因的共表達(dá)等)的情況。
使用該篩選方法，可以從上述病毒中鑒定出與粒子形成能力的降低或消除相關(guān)的基因，該基因通過篩選粒子形成能力已被降低或消除的(-)鏈RNA病毒載體而分離。即，可以用分離的病毒中所含的基因作為受試基因，篩選出那些能夠降低或消除粒子形成能力的基因。所獲的基因可用于制備粒子形成能力已被降低或消除的重組病毒。
當(dāng)使用如上述分離的基因制備粒子形成能力已被降低或消除的(-)鏈RNA病毒載體時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，含有這種基因的(-)鏈RNA病毒載體可通過以下方法有效制備，該方法包括，在能夠持久彌補(bǔ)(persistentlycomplementing)由該基因?qū)е碌腗蛋白定位的降低或消除——例如，細(xì)胞表面M蛋白聚集的降低或消除——的條件下進(jìn)行重建。本發(fā)明方法制備的粒子形成能力已被降低或消除的重組(-)鏈RNA病毒載體，具有導(dǎo)入靶細(xì)胞后不釋放VLP的優(yōu)點(diǎn)。
術(shù)語“持續(xù)彌補(bǔ)條件(conditions persistently complementing)”指一種條件，在該條件下彌補(bǔ)作用持續(xù)足夠長的時(shí)間以便能重建(-)鏈RNA病毒載體。持續(xù)彌補(bǔ)條件通常指M蛋白在細(xì)胞上定位的降低或消除，例如，M蛋白在細(xì)胞表面聚集的降低或消除在至少2天，優(yōu)選4天或更長，更優(yōu)選7天或更長，更優(yōu)選10天或更長，最優(yōu)選14天或更長時(shí)間內(nèi)被持續(xù)彌補(bǔ)。
例如，為生產(chǎn)含有突變的M基因的載體(所述突變可導(dǎo)致細(xì)胞表面聚集在一定條件下被降低)，在持久維持所述條件(此時(shí)細(xì)胞表面的聚集被抑制)的同時(shí)重建病毒。例如，可在使突變表型不表達(dá)的條件下進(jìn)行重建?；蛘?，可通過在細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)野生型M基因來彌補(bǔ)(coplemented)突變M蛋白。進(jìn)一步地，當(dāng)制備M基因缺陷型載體時(shí)，可以通過在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)野生型M基因進(jìn)行重建。
本發(fā)明顯示，當(dāng)在低溫下重建病毒載體時(shí)，可以抑制M蛋白正常定位的減少或消除，這樣就大大提高了病毒重建的效率。特別是在重建含有導(dǎo)致粒子形成能力被降低的突變(或缺陷)基因的載體時(shí)，37℃和38℃不能有效進(jìn)行重建，還觀察到了細(xì)胞毒性。而在35℃或更低，優(yōu)選32℃，可以獲得有效的重建。相應(yīng)地，本發(fā)明優(yōu)選在35℃或更低，更優(yōu)選34℃或更低，更優(yōu)選33℃或更低，最優(yōu)選32℃或更低溫度重建病毒載體。
本發(fā)明特別提供一種重建M基因缺陷或M基因突變的(-)鏈RNA病毒載體的方法。即，本發(fā)明涉及制備重組(-)鏈RNA病毒載體的方法，所述載體中粒子形成能力已被降低或消除，該方法包括在持續(xù)表達(dá)功能性M蛋白的條件下重建(-)鏈RNA病毒載體，該載體由于M基因的缺陷或突變而使得M蛋白的定位被降低或消除。具體而言，例如，本發(fā)明涉及能夠降低或消除M蛋白細(xì)胞表面聚集的(-)鏈RNA病毒載體。術(shù)語“功能性M蛋白”指野生型M蛋白或含有該蛋白功能性等同物的蛋白。具體是指含有導(dǎo)致細(xì)胞表面聚集活性的蛋白，從而使(-)鏈RNA病毒可以支持粒子的形成。
這些方法的特別優(yōu)選實(shí)施方式包括以下方法，該方法包括在容許的溫度，重建含有溫度敏感型突變M基因的(-)鏈RNA病毒載體，所述基因可以減少或消除其基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的定位。溫度敏感型突變指那些能夠使高溫下(如37℃)活性比低溫下(如32℃)活性顯著減少的突變。該方法的具體實(shí)施例包括在容許的低溫下，重建含有溫度敏感型突變M基因的(-)鏈RNA病毒載體，所述突變能夠降低或消除基因產(chǎn)物在細(xì)胞表面的聚集。該溫度敏感型M基因突變沒有特殊限制，可包括，例如選自仙臺(tái)病毒M蛋白的至少一個(gè)下述氨基酸位點(diǎn)G69，T116或A118，優(yōu)選至少其中任意兩個(gè)位點(diǎn)，更優(yōu)選全部3個(gè)位點(diǎn)。還可適當(dāng)使用其他含有同源突變的(-)鏈RNA病毒M蛋白，并且其應(yīng)用也沒有特殊的限制。本文中，G69是指M蛋白中第69位氨基酸甘氨酸，T116是M蛋白中第116位的氨基酸蘇氨酸，A183指M蛋白中第183位的氨基酸丙氨酸。
M蛋白編碼基因(M基因)在各種(-)鏈RNA病毒中廣泛保守，并且已知其可與核衣殼和包膜相互作用(Garoff，H等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62117-190(1998))。SeV M蛋白第104-119位的氨基酸序列(104-KACTCLRITVRRTVRA-119/SEQ ID NO38)預(yù)計(jì)可以形成兩親性α螺旋，并被鑒定為病毒粒子形成能力的重要區(qū)域(Motter，G等，J.Gen.Virol.802977-2986(1999))。該區(qū)域在(-)鏈RNA病毒中普遍保守。(-)鏈RNA病毒中的M蛋白氨基酸序列都很相似。特別是屬于副粘病毒亞科的病毒中已知的M蛋白都是330-380個(gè)氨基酸長度。它們的整個(gè)序列結(jié)構(gòu)都很相似，尤其是C末端那半邊具有特別高的同源性(Gould，A.R.，Virus Res.4317-31(1996)，Harcourt，B.H等，Virology 271334-349(2000))。因此，可以很容易地鑒定與SeV M蛋白G69，T116和A183的同源的氨基酸殘基。
通過使用氨基酸同源性檢索程序(包括比對形成功能)如BLAST，或諸如CLUSTAL W這樣的比對形成程序來創(chuàng)建SeV M蛋白比對，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以鑒定其它(-)鏈RNA病毒M蛋白上相應(yīng)于SeV M蛋白G69，T116和A183的氨基酸殘基。M蛋白中相應(yīng)于SeV M蛋白G69的同源位點(diǎn)包括人副流感病毒-1(HPIV-1)的G69；人副流感病毒-3(HPIV-3)的G73；海豹瘟病毒(phocine distemper virus，PDV)和犬瘟病毒(caninedistemper virus，CDV)的G70；海豚麻疹病毒(dolphinumolbillivirus)(DMV)的G71；peste-des-petits-ruminants病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)和牛瘟病毒(RPV)的G70；Hendra病毒(hendra)和Nipah病毒(Nipah)的G81；人副流感病毒-2(HPIV-2)的G70；人副流感病毒-4a(HPIV-4a)和人副流感病毒-4b(HPIV-4b)的E47；流行性腮腺炎病毒(Mumps)的E72。(括號(hào)內(nèi)的說明代表縮寫，字母和數(shù)字代表氨基酸和位置。)M蛋白中與SeV M蛋白T116相應(yīng)的同源位點(diǎn)包括人副流感病毒-1(HPIV-1)的T116；人副流感病毒-3(HPIV-3)的T120；海豹瘟病毒(PDV)和犬瘟病毒(CDV)的T104；海豚麻疹病毒(DMV)的T105；peste-des-petits-ruminants病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)和牛瘟病毒(RPV)的T104；Hendra病毒(hendra)和Nipah病毒(Nipah)的T120；人副流感病毒-2(HPIV-2)和猴副流感病毒5(SV5)的T117；人副流感病毒-4a(HPIV-4a)和人副流感病毒-4b(HPIV-4b)的T121；流行性腮腺炎病毒(Mumps)的T119；以及新城疫病毒(NDV)的S120。M蛋白中與SeV M蛋白A183相應(yīng)的同源位點(diǎn)包括人副流感病毒-1(HPIV-1)的A183；人副流感病毒-3(HPIV-3)的F187；海豹瘟病毒(PDV)和犬瘟病毒(CDV)的Y171；海豚麻疹病毒(DMV)的Y172；peste-des-petits-ruminants病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)和牛瘟病毒(RPV)的Y172；Hendra病毒(hendra)和Nipah病毒(Nipah)的Y187；人副流感病毒-2(HPIV-2)的Y184；猴副流感病毒5(SV5)的F184；人副流感病毒-4a(HPIV-4a)和人副流感病毒-4b(HPIV-4b)的F188；流行性腮腺炎病毒(Mumps)的F186；以及新城疫病毒(NDV)的Y187。上述病毒中適用于本發(fā)明的病毒包括那些含有M蛋白突變編碼基因的病毒，其中上述三個(gè)位點(diǎn)中任一位點(diǎn)的氨基酸殘基已被取代，優(yōu)選這三個(gè)位點(diǎn)中的任意兩個(gè)被取代，更優(yōu)選三個(gè)均被取代。
氨基酸突變包括用任意其它所需氨基酸進(jìn)行取代。但是，優(yōu)選用其側(cè)鏈具有不同化學(xué)屬性的氨基酸進(jìn)行取代。氨基酸可分為，堿性氨基酸(諸如賴氨酸，精氨酸，組氨酸)；酸性氨基酸(如，天冬氨酸，谷氨酸)；不帶電荷的極性氨基酸(如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)；非極性氨基酸(如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)；β分支氨基酸(如蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)；以及芳族氨基酸(如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)。屬于一組的氨基酸可以被屬于另外一組的氨基酸取代。具體的例子包括但不限于用酸性或中性氨基酸取代堿性氨基酸，用非極性氨基酸取代極性氨基酸，用分子量低于天然氨基酸平均值20的氨基酸取代分子量高于該平均值的氨基酸；以及，相反地，用分子量高于該平均值的氨基酸取代分子量低于該平均值的氨基酸。例如，可以適當(dāng)?shù)厥褂眠x自仙臺(tái)病毒M蛋白G69E，T116A和A183S的突變，或與其同源的突變。本文中，G69E指M蛋白第69位的氨基酸甘氨酸被谷氨酸取代，T116A指M蛋白第116位的氨基酸蘇氨酸被丙氨酸取代，A183S指M蛋白第183位的氨基酸丙氨酸被絲氨酸取代。換言之，仙臺(tái)病毒M蛋白中的G69，T116和A183或其它病毒中同源性M蛋白位點(diǎn)可以分別被谷氨酸(E)，丙氨酸(A)和絲氨酸(S)取代。這些突變優(yōu)選被組合使用，特別優(yōu)選將上述三種突變同時(shí)使用?？筛鶕?jù)已知的誘變方法進(jìn)行M基因突變。例如，實(shí)施例中所描述的，可使用含有目的突變的寡核苷酸導(dǎo)入突變。
如果是麻疹病毒，可以導(dǎo)入溫度敏感株P(guān)253-505的M基因序列，其中抗M蛋白單克隆抗體的表位序列已被改變(Morikawa，Y等，KitastoArch.Exp.Med.，6415-30(1991))。另外，麻疹病毒M蛋白中104位的蘇氨酸或者流行性腮腺炎病毒M蛋白119位的蘇氨酸(它們相應(yīng)于仙臺(tái)病毒M蛋白116位的蘇氨酸)可以用其它任意氨基酸(如丙氨酸)取代。
本發(fā)明上述方法中其它特別優(yōu)選的實(shí)施例包括重建含有缺陷型M基因的(-)鏈RNA病毒載體的步驟，所述重建是在能夠使已整合到重建所用細(xì)胞的染色體中的M基因被表達(dá)的條件下進(jìn)行。術(shù)語“M基因缺陷”指功能性M蛋白編碼序列的缺陷，包括含有功能性缺陷突變的M基因的情況，還包括M基因缺失的情況?？赏ㄟ^缺失編碼蛋白的M基因序列，或插入其它序列來制備功能性缺陷M基因突變。例如，可在M蛋白編碼序列中間插入一個(gè)終止密碼子(WO00/09700)。最優(yōu)選的是將M蛋白編碼序列徹底從M基因缺陷載體中缺失。與編碼溫度敏感型突變M蛋白的載體不同，不帶有M蛋白開放閱讀框(ORF)的載體在任何條件下均不能產(chǎn)生病毒粒子。
本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)將M基因整合到載體重建所用的宿主細(xì)胞染色體中可以有效地生產(chǎn)重組病毒，然后可以持續(xù)地表達(dá)并提供M蛋白?？衫萌鐚?shí)施例中所述方法制備染色體中整合有M基因的細(xì)胞。該M基因可以在病毒重建體中持續(xù)地表達(dá)，或誘導(dǎo)表達(dá)。出乎意料地發(fā)現(xiàn)，低溫重建時(shí)，載體生產(chǎn)效率有顯著提高，甚至在野生型M蛋白存在的條件下也是如此。因此，優(yōu)選在低溫下進(jìn)行載體的重建，具體是35℃或更低，優(yōu)選34℃或更低，更優(yōu)選33℃或更低，最優(yōu)選32℃或更低。
在制備粒子形成能力已被降低或消除的重組(-)鏈RNA病毒載體的方法中，(-)鏈RNA病毒載體優(yōu)選進(jìn)一步含有缺陷型HN和/或F基因，或溫度敏感型突變HN和/或F基因，其中該方法包括，在功能性M蛋白被持續(xù)表達(dá)的條件下重建(-)鏈RNA病毒載體的步驟，所述載體通過M基因缺陷或突變能降低或消除M蛋白的定位。在非允許溫度，顯示粒子形成能力被顯著降低，特別是載體含有溫度敏感型HN基因突變以及M基因缺陷或突變的情況下。溫度敏感型HN基因突變沒有特別限制，可包括在選自下述的至少一個(gè)氨基酸位點(diǎn)仙臺(tái)病毒HN蛋白A262，G264和K461，優(yōu)選其中任意兩個(gè)，更優(yōu)選所有三個(gè)位點(diǎn)均突變。含有同源性突變的其它(-)鏈RNA病毒HN蛋白也可適當(dāng)使用，同樣沒有限制。本文中，A262指HN蛋白第262位氨基酸丙氨酸，G264指HN蛋白第264位氨基酸甘氨酸，K461指HN蛋白第461位氨基酸賴氨酸。氨基酸突變可以是用任何目的氨基酸進(jìn)行的取代。但是，優(yōu)選用具有不同化學(xué)側(cè)鏈屬性的氨基酸進(jìn)行取代，如前文中關(guān)于M蛋白突變的描述一樣。例如，可包括用另一組的氨基酸進(jìn)行取代，如前文所述。具體而言，可適當(dāng)?shù)厥褂眠x自仙臺(tái)病毒HN蛋白的下述突變A262T，G264R或K461G，或者含有與上述突變同源的突變。本文中，A262T指HN蛋白第262位氨基酸丙氨酸被蘇氨酸取代；G264R指HN蛋白第264位氨基酸甘氨酸被精氨酸取代；K461G指HN蛋白第461位氨基酸賴氨酸被甘氨酸取代。換言之，仙臺(tái)病毒HN蛋白中A262，G264，和K461或其它病毒HN蛋白的同源位點(diǎn)，均可分別被蘇氨酸(T)，精氨酸(R)和甘氨酸(G)取代。優(yōu)選聯(lián)合使用這些突變，更優(yōu)選這三種突變?nèi)渴褂谩?br> 另外一例是指流行性腮腺炎病毒的Urabe AM9株，其說明了溫度敏感型并被用作疫苗(Wright，K.E等，Virus Res.，67；49-57(2000))。本發(fā)明中，當(dāng)適用于該病毒時(shí)，優(yōu)選在464位和468位氨基酸引入突變。與其位點(diǎn)同源的氨基酸突變也可適用于其它(-)鏈RNA病毒。
含有溫度敏感型M基因的(-)鏈RNA病毒中特別優(yōu)選缺陷型F基因。另外，含有該溫度敏感型M基因的F基因缺陷型載體更優(yōu)選進(jìn)一步含有溫度敏感型突變HN基因。本發(fā)明證實(shí)，含有溫度敏感型M和HN基因的高滴度F基因缺陷型(-)鏈RNA病毒可通過在允許溫度使用表達(dá)F蛋白的輔助細(xì)胞重建該病毒載體而制備獲得。該載體還顯示其產(chǎn)生的VLP量顯著降低。本發(fā)明中，基因的“缺陷”是指功能性基因產(chǎn)物(如果是蛋白編碼基因則其功能性基因產(chǎn)物為蛋白)基本上不表達(dá)?；蛉毕莅康幕虻臒o效表型(null phenotype)。基因缺陷還包括基因已被缺失的情況，如由于在轉(zhuǎn)錄起始序列或其它序列中的突變而使得該基因不能轉(zhuǎn)錄，如由于移碼突變或密碼子突變等原因并未形成功能性蛋白，如由于氨基酸突變等原因使表達(dá)蛋白的活性已被基本上消除(或極大地降低(例如降低到1/10或更低))，如蛋白的翻譯已被消除或極大的降低(例如降低到1/10或更低)等。
本發(fā)明還涉及一種重組病毒，它在(-)鏈RNA病毒P基因或L基因中含有能刺激持續(xù)感染的突變。這些突變具體包括SeV P第86位氨基酸谷氨酰胺(E86)的突變，SeV P第511位氨基酸亮氨酸(L511)被其它氨基酸取代，以及其它(-)鏈RNA病毒P蛋白的同源位點(diǎn)的取代。氨基酸突變可以是被任何其它目的氨基酸取代，不過優(yōu)選被上述化學(xué)側(cè)鏈屬性不同的氨基酸取代。例如，取代包括被屬于不同組的氨基酸取代，如前所述。更具體的例子包括E86被賴氨酸取代(E86K)，L511被苯丙氨酸取代(L511F)。如果是L蛋白，則是第1197位氨基酸天冬酰胺(N1197)和/或第1795位氨基酸賴氨酸(K1795)被其它氨基酸取代，或者其它(-)鏈RNA病毒L蛋白的同源位點(diǎn)被取代。特別優(yōu)選含有L蛋白這兩個(gè)突變的L蛋白基因。氨基酸突變還可被任意所選氨基酸取代，但是優(yōu)選被不同化學(xué)側(cè)鏈特性的氨基酸取代，如前所述。例如，可包括由屬于不同組的氨基酸進(jìn)行的取代。更具體的例子包括N1197被絲氨酸取代(N1197S)，K1795被谷氨酸取代(K1795E)。P和L基因同時(shí)存在突變顯著地提高了持續(xù)感染性，極大地抑制了二次粒子釋放和細(xì)胞毒性。將HN蛋白和/或M蛋白中上述溫度敏感突變基因結(jié)合使用會(huì)極大地提高這種效果。優(yōu)選M和/或HN基因含有至少一種溫度敏感突變且P和/或L基因含有至少一種持續(xù)感染性突變的重組(-)鏈RNA病毒。特別優(yōu)選在所有四種基因中(M，HN，P和L)均帶有突變的病毒。最優(yōu)選這樣的病毒，它在M和HN基因中含有上述三種氨基酸突變(在SeV中M的G69，T116和A183；和HN的A262，G264和K461)，并在P基因中含有上述兩個(gè)突變(SeV中的E86或L511)的至少一個(gè)，在L基因中含有上述兩個(gè)突變(SeV中N1197和K1795)的至少一個(gè)。當(dāng)(-)鏈RNA病毒刺突蛋白基因(如F基因)缺失時(shí)，優(yōu)選這些在P和/或L基因中含有突變的重組病毒。使用缺陷型F基因和表達(dá)F蛋白的F輔助細(xì)胞，通過制備病毒株，就可以獲得感染靶細(xì)胞后不會(huì)擴(kuò)增的病毒載體，并且，其細(xì)胞毒性已被降低，二次粒子釋放也被極大抑制。這種載體可以比帶有野生型P或L基因的載體更加長效地表達(dá)導(dǎo)入的基因。本發(fā)明的這些病毒可用于為減少細(xì)胞毒性，抑制導(dǎo)入基因表達(dá)量的減少，和抑制病毒及病毒樣粒子(VLP)從病毒感染細(xì)胞中釋放，而進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移。
如說明書所述，本發(fā)明提供一種降低基因轉(zhuǎn)移的細(xì)胞毒性程度的方法。該方法包括將含有突變或缺陷型病毒基因(如M，HN，P或L基因或其組合)的病毒導(dǎo)入細(xì)胞的步驟。本發(fā)明還提供一種在基因轉(zhuǎn)移中抑制導(dǎo)入了病毒的細(xì)胞釋放VLP的方法，該方法包括將這種病毒導(dǎo)入細(xì)胞的步驟?？梢酝ㄟ^例如實(shí)施例所述測定LDH的釋放來鑒定細(xì)胞毒性的程度。該導(dǎo)入基因的表達(dá)水平可以，使用導(dǎo)入基因的片段作為探針或引物，通過Northern雜交或RT-PCR測定；使用抗導(dǎo)入基因的產(chǎn)物的抗體，通過免疫沉淀或Western印跡分析來檢測；或者通過測量該導(dǎo)入基因的產(chǎn)物的活性進(jìn)行測定。例如，可以如實(shí)施例所示，通過測定HA的活性來測量VLP的釋放。或者，可以通過回收上清溶液，測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后包括VLP在內(nèi)的基因表達(dá)情況，從而定量上清溶液中的VLP。優(yōu)選細(xì)胞毒性的降低，導(dǎo)入基因的表達(dá)以及VLP的釋放，與不帶有相應(yīng)突變或缺陷的病毒相比，都顯著降低(或抑制)并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(例如統(tǒng)計(jì)學(xué)水平為5％或更低)?？墒褂肧tudeng t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。降低或抑制應(yīng)當(dāng)優(yōu)選為對照病毒的90％或更低，更優(yōu)選80％或更低，更優(yōu)選70％或更低，或60％或更低。更優(yōu)選降低或抑制為對照水平的1/2或更低，優(yōu)選1/3或更低，1/5或更低，1/8或更低。
如說明書所述，本發(fā)明還可用于基因轉(zhuǎn)移，從而減少細(xì)胞毒性，抑制導(dǎo)入基因表達(dá)量減少的現(xiàn)象，并抑制導(dǎo)入了病毒(含有突變或缺失的病毒基因)的細(xì)胞釋放VLP。這些病毒可用于基因轉(zhuǎn)移，以便降低細(xì)胞毒性，抑制導(dǎo)入基因表達(dá)量的減少，或抑制導(dǎo)入病毒的細(xì)胞釋放VLP。
本發(fā)明中，“(-)鏈RNA病毒”指含有負(fù)鏈作為基因組的RNA病毒。本發(fā)明中，(-)鏈RNA病毒優(yōu)選指非分節(jié)段的(-)鏈RNA病毒，即含有負(fù)鏈作為其基因組的單鏈RNA病毒。該(-)鏈RNA病毒可以是屬于副粘病毒科的病毒，如仙臺(tái)病毒，新城疫病毒，流行性腮腺炎病毒，麻疹病毒，RS病毒(呼吸道合胞病毒)，牛瘟病毒和瘟熱病毒；屬于正粘病毒科的病毒，如流感病毒；屬于彈狀病毒科的病毒，如水泡性口炎病毒和狂犬病病毒等。本文中，(-)鏈RNA病毒載體優(yōu)選為非分節(jié)段型的(-)鏈RNA病毒，更優(yōu)選為副粘病毒本發(fā)明中，優(yōu)選的(-)鏈RNA病毒包括仙臺(tái)病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟病毒(PDV)，犬瘟病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(molbillivirus)(DMV)，peste-des-petits-ruminants病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)，Hendra病毒(hendra)，Nipah病毒(Nipah)，人副流感病毒-2(HPIV-2)，猴副流感病毒5(SV5)，人副流感病毒-4a(HPIV-4a)，人副流感病毒-4b(HPIV-4b)，流行性腮腺炎病毒(Mumps)和新城疫病毒(NDV)。更優(yōu)選的例子包括選自下述的病毒仙臺(tái)病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟病毒(PDV)，犬瘟病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(molbillivirus)(DMV)，peste-des-petits-ruminants病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)，Hendra病毒(hendra)，和Nipah病毒(Nipah)。
由這些病毒編碼的病毒基因是已知的。下面列舉一些登陸號(hào)N基因AF014953(CDV)，X75961(DMV)，D01070(HPIV-1)，M55320(HPIV-2)，D10025(HPIV-3)，X85128(Mapuera)，D86172(Mumps)，K01711(MV)，AF064091(NDV)，X74443(PDPR)，X75717(PDV)，X68311(RPV)，X00087(SeV)，M81442(SV5)，和AF079780(Tupaia)；P基因X51869(CDV)，Z47758(DMV)，M74081(HPIV-1)，X04721(HPIV-3)，M55975(HPIV-4a)，M55976(HPIV-4b)，D86173(Mumps)，M89920(MV)，M20302(NDV)，X75960(PDV)，X68311(RPV)，M30202(SeV)，AF052755(SV5)，和AF079780(Tupaia)；C基因AF014953(CDV)，Z47758(DMV)，M74081(HPIV-1)，D00047(HPIV-3)，ABO16162(MV)，X68311(RPV)，AB005796(SeV)，和AF079780(Tupaia)；M基因M12669(CDV)，Z30087(DMV)，S3 8067(HPIV-1)，M62734(HPIV-2)，D00130(HPIV-3)，D10241(HPIV-4a)，D10242(HPIV-4b)，D86171(Mumps)，AB012948(MV)，AF089819(NDV)，Z47977(PDPR)，X75717(PDV)，M34018(RPV)，U31956(SeV)，和M32248(SV5)；F基因M21849(CDV)，AJ224704(DMV)，M22347(HPN-1)，M60182(HPIV-2)，X05303(HPIV-3)，D49821(HPIV-4a)，D49822(HPIV-4b)，D86169(Mumps)，AB003178(MV)，AF048763(NDV)，Z37017(PDPR)，AJ224706(PDV)，M21514(RPV)，D17334(SeV)，和AB021962(SV5)；HN(H或G)基因AF112189(CDV)，AJ224705(DMV)，U709498(HPIV-1)，D000865(HPIV-2)，AB012132(HPIV-3)，M34033(HPIV-4A)，AB006954(HPIV-4B)，X99040(Mumps)，K01711(MV)，AF204872(NDV)，Z81358(PDPR)，Z36979(PDV)，AF132934(RPV)，U06433(SeV)，和S76876(SV-5)。各種病毒中已知的病毒株不止一種，也可能存在含有除了上述已知序列之外的序列的基因，這要視不同病毒株而定。
本發(fā)明中，“副粘病毒”指屬于副粘病毒科的病毒以及其衍生病毒。副粘病毒是帶有非分節(jié)段負(fù)鏈RNA基因組的病毒。本發(fā)明的副粘病毒包括副粘病毒亞科(包括呼吸道病毒屬(也稱為副粘病毒屬)，風(fēng)疹病毒屬和Morbillivirus)，肺病毒亞科(含有肺病毒屬和Metapneumovirus屬)?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的副粘病毒包括，例如，副粘病毒科的病毒，如仙臺(tái)病毒，新城疫病毒，流行性腮腺炎病毒，麻疹病毒，RS病毒(呼吸道合胞病毒)，牛瘟病毒，瘟熱病毒，猴副流感病毒(SV5)，和人副流感病毒1，2和3型等。本發(fā)明優(yōu)選屬于副粘病毒亞科(包括呼吸道病毒屬，風(fēng)疹病毒屬和麻疹病毒屬)的病毒，更優(yōu)選呼吸道病毒屬(也稱為副粘病毒屬)的病毒或其衍生物?？捎糜诒景l(fā)明的呼吸道病毒屬病毒實(shí)例包括人副流感病毒1型(HPIV-1)，人副流感病毒3型(HPIV-3)，牛副流感病毒3型(BPIV-3)，仙臺(tái)病毒(也稱為鼠副流感病毒1型)，猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。本發(fā)明最優(yōu)選的副粘病毒為仙臺(tái)病毒。這些病毒可衍生自天然株，野生型株，突變株，實(shí)驗(yàn)室傳代株，人工構(gòu)建株等。還可使用不完全病毒，如DI顆粒(J.Virol.68，8413-8417(1994))，合成的寡核苷酸等作為原料生產(chǎn)本發(fā)明的病毒載體。(-)鏈RNA病毒適于用作基因轉(zhuǎn)移的載體。其轉(zhuǎn)錄和復(fù)制只在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行。它們不具備DNA期，這樣就不會(huì)發(fā)生染色體整合。因此，不存在染色體畸變帶來的安全問題，如癌癥和永生化問題。這些特性極大地提高了(-)鏈RNA病毒作為載體的安全性。外源基因表達(dá)的結(jié)果顯示未發(fā)生核苷酸突變，甚至在SeV的持續(xù)多代培養(yǎng)過程中也是如此，這說明基因組穩(wěn)定性很高，在很長時(shí)間內(nèi)外源基因的表達(dá)較穩(wěn)定(Yu，D等，Genes Cells 2457-466(1997))。由于(-)鏈RNA病毒不具備衣殼蛋白結(jié)構(gòu)，因此在導(dǎo)入基因的裝配和大小靈活性上具有優(yōu)勢。SeV載體可用于導(dǎo)入4kb或更大的外源基因。加入轉(zhuǎn)錄單位就可以同時(shí)表達(dá)兩種或多種類型的基因。
已知仙臺(tái)病毒在嚙齒動(dòng)物中具有致病性且會(huì)導(dǎo)致肺炎，但在人類中不具有致病性。以前的報(bào)告就支持了這一點(diǎn)通過鼻內(nèi)應(yīng)用野生型仙臺(tái)病毒不會(huì)在非人靈長類中引起嚴(yán)重的癥狀(Hurwitz，J.L等，Vaccine 15533-540(1997))。其它引人注目的優(yōu)點(diǎn)是其“高感染性”和“高表達(dá)水平”。SeV是通過與細(xì)胞膜蛋白糖鏈上的唾液酸結(jié)合而進(jìn)行感染的。由于唾液酸在幾乎所有細(xì)胞中均有表達(dá)，因此預(yù)期其具有廣譜感染性，即高感染性?；赟eV復(fù)制子的復(fù)制型載體可以通過釋放病毒粒子誘導(dǎo)周圍細(xì)胞再次感染。預(yù)期隨著細(xì)胞分裂，子代細(xì)胞將擴(kuò)散，這將導(dǎo)致在被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中持續(xù)表達(dá)多拷貝RNP。SeV載體可用于各種不同組織。這種廣泛的感染性表明這些載體可以用于各種類型的抗體治療(和分析)。由于其特征性表達(dá)機(jī)制(其中轉(zhuǎn)錄和復(fù)制只在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)生)，使得導(dǎo)入基因的表達(dá)量顯示出較高的水平(Moriya，C等，F(xiàn)EBS Lett.425(1)105-111(1998)；WO00/70070)。
本發(fā)明中，“載體”指一種媒介物，其將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。本發(fā)明中，“(-)鏈RNA病毒載體”指衍生自(-)鏈RNA病毒并能夠?qū)⒑怂徂D(zhuǎn)移到細(xì)胞中的載體(媒介物)。本發(fā)明中，(-)鏈RNA病毒載體可以是感染性病毒粒子。病毒粒子指含有核酸的微小粒子，其能通過病毒蛋白的活動(dòng)從細(xì)胞中被釋放。病毒粒子可以具有不同的形式，如球狀或桿狀，這要視病毒種類而定。它們遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于細(xì)胞，通常約為10nm-800nm。副粘病毒的病毒粒子的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致上述RNP含有基因組RNA和病毒蛋白，并被細(xì)胞膜衍生的脂膜(或包膜)包圍。當(dāng)病毒基因組包含編碼帶有氨基酸取代(如實(shí)施例所述的突變M，HM，P或L蛋白)的突變病毒蛋白的基因時(shí)，該病毒載體可以是由(-)鏈RNA病毒的基因組RNA和病毒蛋白即核糖核蛋白(RNP)構(gòu)成的復(fù)合體。RNP可被導(dǎo)入靶細(xì)胞，例如與目的轉(zhuǎn)染試劑一起導(dǎo)入。這種RNP更具體而言，可以是含有(-)鏈RNA病毒基因組RNA，N蛋白，P蛋白，和L蛋白的復(fù)合體。當(dāng)RNP被導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，病毒蛋白使基因組RNA中編碼病毒蛋白的順反子轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致基因組本身被復(fù)制，并獲得子代RNP?？墒褂肦T-PCR，Northern雜交等檢測RNA拷貝數(shù)的增加來證實(shí)基因組RNA的復(fù)制。本文中，“感染力”指通過維持重組(-)鏈RNA病毒載體粘附細(xì)胞的能力，從而使載體將基因?qū)氡徽掣郊?xì)胞的能力。在期望的實(shí)施例中，維持(-)鏈RNA病毒載體使其表達(dá)外源基因。本發(fā)明的(-)鏈RNA病毒載體不具備野生型病毒的復(fù)制能力，因?yàn)榧?xì)胞表面M蛋白聚集已被降低或消除，粒子形成被抑制。在用病毒載體感染宿主細(xì)胞的情況中，“復(fù)制能力”指病毒在宿主細(xì)胞中復(fù)制并生產(chǎn)感染性粒子的能力。宿主細(xì)胞的實(shí)例包括LLC-MK2和CV-1。
(-)鏈RNA病毒載體含有(-)鏈RNA病毒的基因組RNA?！盎蚪MRNA”指具備與RNP一起形成(-)鏈RNA病毒蛋白，利用這些蛋白表達(dá)基因組中的基因，然后復(fù)制這些核酸并形成子代RNP的能力的RNA。(-)鏈RNA病毒含有負(fù)鏈RNA作為基因組，這種RNA以反義形式編碼其所攜帶的基因。通常(-)鏈RNA病毒基因組在3′前導(dǎo)區(qū)域和5′尾巴區(qū)域之間含有反義形式的病毒基因。在各基因開放閱讀框之間存在一組序列轉(zhuǎn)錄終止序列(E序列)，間插序列(I序列)和轉(zhuǎn)錄起始序列(S序列)。這樣一來，編碼每一基因的開放閱讀框的RNA可以被轉(zhuǎn)錄為單獨(dú)的順反子。本發(fā)明病毒中包含的基因組RNA編碼(以反義形式)核衣殼(N)，磷(P)和大(L)蛋白以及其突變蛋白。這些蛋白對于所述RNA編碼基因的表達(dá)以及RNA本身的自主復(fù)制十分必要。在優(yōu)選實(shí)施例中，RNA既不編碼形成病毒粒子所必需的基質(zhì)蛋白(M)，也不編碼突變M蛋白。RNA可以編碼或不編碼刺突蛋白，該蛋白是病毒粒子感染所必需的。在優(yōu)選實(shí)施例中，RNA在至少一種刺突蛋白中含有突變。或者，RNA不編碼至少一種刺突蛋白。副粘病毒刺突蛋白包括，誘導(dǎo)細(xì)胞膜融合的融合蛋白(F蛋白)，以及使蛋白與細(xì)胞粘附所必需的血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN蛋白)。
“重組體”指利用重組多核苷酸制備的化合物或組合物?！爸亟M多核苷酸”指天然狀態(tài)下不存在的多核苷酸。具體而言，重組多核苷酸包括人工重排多核苷酸鏈或人工合成多核苷酸。本文中，“重組”(-)鏈RNA病毒載體指基因工程構(gòu)建的(-)鏈RNA病毒載體或該載體擴(kuò)增所獲的(-)鏈RNA病毒載體。重組(-)鏈RNA病毒載體可通過例如重建重組(-)鏈RNA病毒cDNA而獲得。
編碼副粘病毒蛋白的基因包括例如NP、P、M、F、HN和L基因。副粘病毒科病毒的“NP、P、M、F、HN和L基因”指分別編碼核殼、磷酸、基質(zhì)、融合、血凝素-神經(jīng)氨酸酶和大蛋白質(zhì)的基因。副粘病毒亞科病毒的基因一般表示如下NP基因通常也稱“N基因”。
呼吸道病毒(Respirovirus)屬NP P/C/V M F HN - L風(fēng)疹病毒(Rubullavirus)屬 NP P/V M F HN (SH) L麻疹(Morbillivirus)屬 NP P/C/V M F H - L歸類于副粘病毒科呼吸道病毒的仙臺(tái)病毒基因的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)是NP基因?yàn)镸29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046和X17218，對于P基因，是M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、X00583、X17007和X17008，對于M基因，是D11446、K02742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、X00584和X53056，對于F基因，是D00152、D11446、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152和X02131，對于HN基因，是D26475、M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808和X56131以及對于L基因，是D00053、M30202、M30203、M30204、M69040、X00587和X58886。
本文所用術(shù)語“基因”指遺傳物質(zhì)，包括核酸如RNA，DNA等。通?；蚩梢跃幋a或不編碼蛋白。本發(fā)明中，編碼蛋白的核酸被稱為蛋白基因。例如，一種基因可能編碼一種功能性RNA如核酶，反義RNA等?；蚩梢跃哂刑烊谎苌蛉斯ぴO(shè)計(jì)的序列。本文中，“DNA”包括單鏈DNA和雙鏈DNA。術(shù)語“編碼蛋白”的含義包括反義或正義ORF，其編碼蛋白氨基酸序列，使多核苷酸可以在適當(dāng)?shù)臈l件下表達(dá)。
本發(fā)明中，需要檢查或制備的(-)鏈RNA病毒載體沒有特別限制。優(yōu)選的(-)鏈RNA病毒載體包括，例如具有復(fù)制能力的載體，其可在確保持續(xù)彌補(bǔ)細(xì)胞表面M蛋白聚集的降低或消除的條件下自主復(fù)制。例如，天然副粘病毒的基因組在3′末端通常含有一段較短的前導(dǎo)區(qū)域，其后為編碼N，P，M，F(xiàn)，HN和L蛋白的6個(gè)基因，然后在另一端帶有一個(gè)很短的5′尾巴區(qū)域。通過設(shè)計(jì)含有與其類似結(jié)構(gòu)的基因組就可以制備能夠自主復(fù)制的副粘病毒載體。例如，可以構(gòu)建下述病毒基因組由于這些基因中任一個(gè)的突變或缺陷而使得M蛋白定位被降低或消除的病毒基因組，或者含有其它基因而該基因使得M蛋白的定位被降低或消除的病毒基因組。然后在確保彌補(bǔ)所述缺陷的條件下轉(zhuǎn)錄該基因組，完成病毒的重建?？赏ㄟ^將外源基因插入基因組來制備表達(dá)外源基因的載體。在本發(fā)明的(-)鏈RNA病毒載體中，病毒基因的重排可以被修飾以使其與野生型病毒的不同。
本發(fā)明粒子形成能力已被降低或消除的病毒載體中，病毒基因可被進(jìn)一步缺失或誘變。例如，含有帶有溫度敏感型突變的M基因的病毒載體，或由于M基因缺失而使得粒子形成能力降低的病毒載體，可以含有HN，F(xiàn)和/或其它病毒基因的突變或缺失。例如，以及如實(shí)施例所述，本發(fā)明有利于產(chǎn)生一種載體，它含有溫度敏感性M基因，還含有HN、F和/或其它攜帶溫度敏感突變的基因，或含有F、HN和/或其它基因的缺失。另外，還可制備這樣的載體含有M基因缺失，同時(shí)F和/或HN基因已被缺失或攜帶諸如溫度敏感型突變等突變。當(dāng)這些載體含有溫度敏感型突變時(shí)，可以在允許的溫度重建這些載體。當(dāng)基因缺失或缺陷時(shí)，可通過以反式作用方式應(yīng)用具備正常功能的基因產(chǎn)物來重建。例如，可將編碼這些基因產(chǎn)物的基因整合到宿主細(xì)胞染色體中，導(dǎo)入編碼所述載體基因組的表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)，這樣就將基因產(chǎn)物應(yīng)用到了宿主細(xì)胞，并且可以進(jìn)行載體的重建。這些基因產(chǎn)物的氨基酸序列并不一定與病毒衍生序列本身嚴(yán)格一致。如果將要制備的病毒載體的核酸導(dǎo)入能力等于或高于其天然形式，可以向序列中引入突變，或使用從其它病毒衍生的同源基因來代替該序列。
另外，可以制備這樣的載體其含有包膜蛋白，該蛋白與衍生出載體基因組的病毒的包膜蛋白不同。例如，當(dāng)重建病毒載體時(shí)，可通過在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)包膜蛋白來制備含有目的包膜蛋白的病毒，其中所表達(dá)的包膜蛋白與作為載體基礎(chǔ)的病毒基因組所編碼的包膜蛋白不同。這種蛋白沒有特別限制，例如包括來自其它病毒的包膜蛋白，如水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白(VSV-G)。本發(fā)明的(-)鏈RNA病毒載體包括含有包膜蛋白的假型病毒載體，如VSV-G蛋白，其與病毒基因組來自不同病毒。
例如，本發(fā)明的(-)鏈RNA病毒載體包括，在包膜表面含有能夠粘附特定細(xì)胞的蛋白的載體，所述蛋白如粘附因子，配體和受體。這些蛋白還包括，例如在細(xì)胞外區(qū)域含有這種蛋白的嵌合蛋白，或在細(xì)胞內(nèi)區(qū)域含有病毒包膜蛋白衍生的多肽的嵌合蛋白。通過這種方式，可以制備靶向特定組織的載體。這些蛋白可以由病毒基因組編碼，或者通過在病毒的重建中表達(dá)該基因組之外的基因(如其它表達(dá)載體或宿主染色體基因)來供給。
本發(fā)明(-)鏈RNA病毒載體所含的病毒基因可以通過修飾野生型基因而獲得，從而例如降低載體衍生的病毒蛋白的免疫原性，或者提高RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制效率。具體而言，例如，在副粘病毒中，可通過修飾至少一種復(fù)制因子NP基因，P/C基因和L基因來增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄或復(fù)制功能。結(jié)構(gòu)蛋白HN具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶兩種活性。當(dāng)前一種活性降低時(shí)，病毒在血液中的穩(wěn)定性下降。當(dāng)后一種活性改變時(shí)，可以調(diào)控其感染力。修飾與膜融合相關(guān)的F蛋白可以調(diào)控膜融合能力。例如，使用抗原遞呈表位分析以及可能的細(xì)胞表面抗原分子(例如F和HN蛋白)分析，就可以制備一種病毒載體，其針對這些蛋白的抗原遞呈能力減弱。
帶有缺陷性輔助基因的病毒載體可以作為本發(fā)明的(-)鏈RNA病毒載體。例如，敲除V基因(一種SeV輔助基因)，可以在不破壞培養(yǎng)細(xì)胞中基因的表達(dá)和復(fù)制的情況下，使SeV對宿主如小鼠的致病性顯著降低(Kato，A等，1997，J.Virol.717266-7272；Kato，A等，1997，EMBO J.16578-587；Curran J等，WO01/04272，EP1067179)。這種減毒載體特別優(yōu)選作為體內(nèi)或回體(ex vivo)基因轉(zhuǎn)移的病毒載體。
本發(fā)明病毒載體的基因組RNA可包含編碼外源基因的RNA?？蓪⑦@些外源基因插入病毒載體基因組，來制備含有外源基因的重組病毒載體。任何期望在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的基因都可以作為外源基因。這種外源基因可以是編碼天然蛋白的基因，或通過缺失，取代或插入進(jìn)行修飾的基因，只要其編碼的蛋白與天然蛋白的功能相同?；蛘?，該基因可編碼缺失型天然蛋白，或人工蛋白等。例如，如果期望進(jìn)行基因治療，就將用于治療目的疾病的基因插入病毒載體DNA。如果將外源基因插入病毒載體DNA，例如仙臺(tái)病毒載體DNA，優(yōu)選在轉(zhuǎn)錄終止序列(E)和轉(zhuǎn)錄起始序列(S)之間插入6的倍數(shù)個(gè)核苷酸的序列等(Journal of Virology，Vol.67，No.8，1993，p.4822-4830)。可在每種病毒基因(如NP，P，M，F(xiàn)，HN和L基因)之前和/或之后插入外源基因。E-I-S序列(轉(zhuǎn)錄終止序列-間插序列-轉(zhuǎn)錄起始序列)或其部分被適當(dāng)?shù)夭迦氲酵庠椿蛑盎蛑?，并且E-I-S序列單元位于各基因之間以避免干擾外源基因之前和/或之后的基因的表達(dá)?；蛘?，可使用IRES插入外源基因。
可利用加入到該基因上游的轉(zhuǎn)錄起始序列的類型(WO01/18223)，以及基因插入的位點(diǎn)和該基因之前或之后的核苷酸序列，來調(diào)控插入基因的表達(dá)水平。以仙臺(tái)病毒為例，插入位點(diǎn)與該病毒基因組負(fù)鏈RNA的3’末端距離越近(在野生型病毒基因組的基因排列中為越接近NP基因)，該插入基因的表達(dá)量越高。為使插入基因獲得高表達(dá)量，優(yōu)選將該基因插入到上游區(qū)域(負(fù)鏈的3′端)，例如NP基因的上游(負(fù)鏈的3′端)或NP與P基因之間。相反地，插入位點(diǎn)與該負(fù)鏈RNA的5’末端距離越近(在野生型病毒基因組的基因排列中為越接近L基因)，該插入基因表達(dá)量的減少越明顯。為了將外源基因的表達(dá)量抑制到較低水平，可以將外源基因插入到例如負(fù)鏈的5’最末端，也就是野生型病毒基因組中L基因的下游(臨近負(fù)鏈L基因的5’端)或L基因的上游(臨近負(fù)鏈中L基因的3’端)。這樣，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)外源基因的插入位點(diǎn)以使該基因以期望的水平表達(dá)，或者使外源基因與該基因之前和之后的病毒蛋白編碼基因之間的組合最優(yōu)化。例如，通過接種高滴度病毒載體而導(dǎo)入的基因過量表達(dá)時(shí)，可引起毒性。這種情況下，不僅可以通過限制病毒的接種滴度來獲得適當(dāng)?shù)闹委熜Ч?，還可以例如將該基因插入到載體中盡可能靠近負(fù)鏈基因組5′末端的位置上，或者用較低轉(zhuǎn)錄效率的序列替換轉(zhuǎn)錄起始序列，從而通過降低單個(gè)病毒載體的表達(dá)量來獲得治療效果。
外源基因的高表達(dá)通常都是有利的，只要不發(fā)生細(xì)胞毒性。因此優(yōu)選將外源基因與高效率的轉(zhuǎn)錄起始序列相連，還優(yōu)選將該基因插入到靠近負(fù)鏈基因組3’末端的位置。優(yōu)選載體的實(shí)例包括這樣的載體外源基因位于(-)鏈RNA病毒載體負(fù)鏈基因組中任一病毒蛋白基因的3’端。例如，優(yōu)選外源基因插入到N基因上游(在負(fù)鏈N基因編碼序列的3’端)的載體?；蛘撸庠椿蛞部杀徊迦氲骄o接N基因的下游。外源基因還可插入到缺失了病毒基因如M和/或F基因的基因組區(qū)域。
為簡化外源基因的插入，可以在編碼基因組的載體DNA的插入點(diǎn)設(shè)計(jì)一個(gè)克隆位點(diǎn)。例如，該克隆位點(diǎn)可以是限制性酶識(shí)別序列?？寺∥稽c(diǎn)還可以是所謂的多克隆位點(diǎn)，帶有多個(gè)限制性酶識(shí)別序列。本發(fā)明的(-)鏈RNA病毒載體還可以在其它的插入位點(diǎn)帶有其它外源基因。
為制備(-)鏈RNA病毒載體，在重建RNP所必需的病毒蛋白(即N，P和L蛋白)的存在下，在哺乳細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄編碼該(-)鏈RNA病毒基因組RNA的DNA，其中所述RNP含有(-)鏈RNA病毒基因組RNA。病毒RNP可以通過形成負(fù)鏈基因組(即與病毒基因組相同的反義鏈)或正鏈(編碼病毒蛋白的正義鏈)而制備。為提高重建效率，優(yōu)選形成正鏈。RNA末端的3’前導(dǎo)和5’尾巴序列優(yōu)選盡可能精確地反映天然病毒基因組。為準(zhǔn)確地控制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5’末端，可以使用T7 RNA聚合酶識(shí)別序列作為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)用于在細(xì)胞中表達(dá)RNA聚合酶。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’末端可以通過例如在該3’末端編碼自我切割性核酶來調(diào)控，以確保其精確切割(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820(1997)；Kato，A.et al.，EMBO J.16578-587(1997)；以及Yu，D.et al.，Genes Cells 2457-466(1997))。
例如，可以根據(jù)“Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820，1997”，“Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16578-587”和“Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2457-466”中的描述，構(gòu)建含有外源基因的重組仙臺(tái)病毒載體。該方法如下所述為導(dǎo)入外源基因，首先制備含有所需外源基因的cDNA核苷酸序列的DNA試樣。該DNA試樣優(yōu)選在25ng/μl或更高濃度下被電泳鑒定為單一質(zhì)粒。以下實(shí)例描述利用NotI位點(diǎn)將外源基因插入到編碼病毒基因組的DNA中當(dāng)目標(biāo)cDNA核苷酸序列包括NotI識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，應(yīng)該預(yù)先采用諸如定點(diǎn)誘變等技術(shù)去除該NotI位點(diǎn)以改變核苷酸序列，但不改變其編碼的氨基酸序列。通過PCR從該DNA試樣中擴(kuò)增目的基因并回收。向兩個(gè)引物的5’末端加入NotI位點(diǎn)，使擴(kuò)增片段的兩端都具備NotI位點(diǎn)。通過安排E-I-S序列(或其部分，視插入位點(diǎn)而定)使其容納在引物中，這樣E-I-S序列單元就可以位于病毒基因ORF的任一側(cè)與外源基因(當(dāng)其并入病毒基因組后)ORF之間。
例如，為了確保NotI切割，將正向側(cè)合成DNA序列如下排列在該合成DNA的5’-側(cè)選擇任意兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸(優(yōu)選四個(gè)核苷酸，但不包括GCG和GCC等來源于NotI識(shí)別位點(diǎn)的序列；更優(yōu)選ACTT)；將NotI識(shí)別位點(diǎn)添加到它的3’-側(cè)“gcggccgc”。進(jìn)一步地，在3’-側(cè)添加間隔序列(任意9個(gè)核苷酸或9加6的倍數(shù)個(gè)核苷酸)和ORF(相當(dāng)于約25個(gè)核苷酸的序列，含有所需cDNA的起始密碼子ATG)。優(yōu)選從所需cDNA選擇約25個(gè)核苷酸，使該正向側(cè)合成性寡DNA的3’端最后一個(gè)核苷酸為G或C。
反向側(cè)合成性DNA序列如下安排5’-側(cè)選擇任意兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸(優(yōu)選四個(gè)核苷酸，但不包括GCG和GCC等來源于NotI識(shí)別位點(diǎn)的序列；更優(yōu)選ACTT)；將NotI識(shí)別位點(diǎn)“gcggccgc”添加到它的3’-側(cè)，在3’側(cè)進(jìn)一步添加寡DNA插入片段以調(diào)節(jié)其長度。該寡DNA的長度經(jīng)過設(shè)計(jì)，使得最后經(jīng)PCR擴(kuò)增的NotI片段產(chǎn)物(含E-I-S序列)的核苷酸總數(shù)成為6的倍數(shù)(所謂的“6的規(guī)則(rule of six)”；Kolakofski，D.etal.，J.Virol.72891-899，1998；Calain，P.and Roux，L.，J.Virol.674822-4830，1993；Calain，P.and Roux，L.，J.Virol.674822-4830，1993)。進(jìn)一步往插入片段的3’-側(cè)加入仙臺(tái)病毒S序列的互補(bǔ)序列，優(yōu)選為5’-CTTTCACCCT-3’(SEQ ID NO1)，I序列的互補(bǔ)序列，優(yōu)選5’-AAG-3’和E序列的互補(bǔ)序列，優(yōu)選5’-TTTTTCTTACTACGG-3’(SEQ ID NO2)。通過加入互補(bǔ)序列可形成反向側(cè)合成性寡DNA的3’末端，它相當(dāng)于是從所需cDNA終止密碼子開始反向計(jì)數(shù)的約25個(gè)核苷酸，通過選擇長度而使最后的核苷酸為G或C。
可以利用ExTaq聚合酶(TaKaRa)通過常規(guī)方法進(jìn)行PCR。優(yōu)選使用Vent聚合酶(NEB)，更優(yōu)選用Ffu聚合酶(Toyobo)。擴(kuò)增的片段用NotI消化，然后插入質(zhì)粒載體pBluescript的NotI位點(diǎn)。用測序儀檢測所得PCR產(chǎn)物的核苷酸序列，選出具有正確序列的質(zhì)粒。用NotI從該質(zhì)粒上切出插入片段，亞克隆到含所述基因組cDNA的質(zhì)粒的NotI位點(diǎn)。或者也可以不借助質(zhì)粒載體pBluescript，而是將該片段直接插入NotI位點(diǎn)而獲得重組仙臺(tái)病毒cDNA。
例如，重組仙臺(tái)病毒基因組cDNA可根據(jù)參考文獻(xiàn)所述方法構(gòu)建(Yu，D.et al.，Genes Cells 2457-466，1997；Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.782813-2820，1997)。例如將含有NotI限制性位點(diǎn)(5′-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3′)(SEQ ID NO3)的18bp間隔序列插入到克隆化仙臺(tái)病毒基因組cDNA(pSeV(+))中前導(dǎo)序列與編碼N蛋白的ORF之間，從而獲得質(zhì)粒pSeV18+b(+)，它含有來自含有σ肝炎病毒反基因組鏈(antigenomic strand)的自我切割性核酶位點(diǎn)(Hasan，M.K.et al.，1997，J.General Virology 782813-2820)。
例如，在M基因缺失或向M基因中導(dǎo)入溫度敏感型突變的情況中，用限制性酶消化(-)鏈病毒全長基因組cDNA，收集含有M基因的片段并克隆到適當(dāng)質(zhì)粒中。使用該質(zhì)粒進(jìn)行M基因誘變或構(gòu)建M基因缺陷位點(diǎn)。例如，可使用QuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA)，根據(jù)試劑盒說明書所述方法來導(dǎo)入突變。例如，可使用PCR-連接組合法完成M基因缺陷或缺失，在該方法中可以實(shí)現(xiàn)M基因ORF的全部或部分缺失，以及與適當(dāng)間隔序列的連接。獲得期望的M基因突變或缺失序列后，收集含有該序列的片段，用該序列取代原始全長cDNA中的M基因。如此獲得含有溫度敏感型突變M基因的病毒基因組cDNA等。使用類似的方法，可以向例如F和/或HN基因中導(dǎo)入突變。
粒子形成能力已被降低或消除的(-)鏈RNA病毒載體可以如下產(chǎn)生對編碼(-)鏈RNA病毒載體基因組的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，在確保持續(xù)彌補(bǔ)M蛋白定位的降低或消除的條件下，重構(gòu)該載體。本發(fā)明提供了編碼(-)鏈RNA病毒載體基因組的DNA，他可用于本發(fā)明制備粒子形成能力已被降低或消除的(-)鏈RNA病毒載體的方法中。另外，本發(fā)明涉及編碼載體基因組的DNA在制備本發(fā)明粒子形成能力已被降低或消除的(-)鏈RNA病毒載體的方法中的應(yīng)用?？梢杂靡阎椒◤牟《据d體DNA重建病毒(WO97/16539和97/16538Durbin，A.P.et al.，1997，Virology 235323-332；Whelan，S.P.et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928388-8392；Schnell，M.J.et al.，1994，EMBO J.134195-4203；Radecke，F(xiàn).et al.，1995，EMBO J.145773-5784；Lawson，N.D.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924477-4481；Garcin，D.et al.，1995，EMBO J.146087-6094；Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1569-579；Baron，M.D.和Barrett，T.，1997，J.Virol.711265-1271；Bridgen，A.和Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9315400-15404)。(-)鏈RNA病毒或作為病毒組分的RNP可以用這些方法從它們的DNA重建，所述病毒包括副流感病毒，水泡性口炎病毒，狂犬病病毒，麻疹病毒，牛瘟病毒，仙臺(tái)病毒等。
具體地，可通過下述步驟制備重組(-)鏈RNA病毒載體(a)在表達(dá)NP，P和L蛋白的細(xì)胞(輔助細(xì)胞)中，對編碼(-)鏈RNA病毒來源的負(fù)鏈RNA或其互補(bǔ)鏈(正鏈)的載體DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，以及(b)在確保持續(xù)彌補(bǔ)M蛋白亞細(xì)胞定位的降低或消除(例如細(xì)胞表面M蛋白聚集的減少或消除)的條件下，培養(yǎng)這些細(xì)胞，或者可以從這些細(xì)胞產(chǎn)生病毒載體的細(xì)胞，或者已導(dǎo)入RNP組分的細(xì)胞，然后從培養(yǎng)上清中回收病毒粒子。從載體DNA轉(zhuǎn)錄的RNA與NP，L和P蛋白一起形成了RNP復(fù)合物，然后在步驟(b)中進(jìn)一步形成了被含有包膜蛋白的衣殼所包被的病毒粒子。本發(fā)明中，步驟(b)中的培養(yǎng)優(yōu)選在低溫進(jìn)行，具體為35℃或更低，更優(yōu)選34℃或更低，更優(yōu)選33℃或更低，最優(yōu)選32℃或更低。
當(dāng)使用溫度敏感型突變時(shí)，“在確保持續(xù)彌補(bǔ)M蛋白亞細(xì)胞定位的降低或消除的條件下”培養(yǎng)細(xì)胞具體是指在允許的溫度培養(yǎng)這些細(xì)胞。當(dāng)制備帶有基因缺陷(或缺失)突變的病毒時(shí)，則指在下述條件下培養(yǎng)野生型基因或含有其功能等同物的基因能夠被持續(xù)表達(dá)，更具體而言，例如，在這樣的條件下培養(yǎng)所述基因已被整合到輔助細(xì)胞的染色體中并可以表達(dá)。
將要在輔助細(xì)胞中表達(dá)的、編碼病毒基因組的DNA(載體DNA)編碼基因組負(fù)鏈(負(fù)鏈RNA)或其互補(bǔ)鏈(正鏈RNA)。例如，編碼負(fù)鏈RNA或其互補(bǔ)鏈的DNA被置于T7啟動(dòng)子下游，然后使用T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄為RNA。還可使用不含有T7-聚合酶識(shí)別序列的目的啟動(dòng)子?；蛘?，體外轉(zhuǎn)錄的RNA可以轉(zhuǎn)染到輔助細(xì)胞中。細(xì)胞中的待轉(zhuǎn)錄鏈可以是病毒基因組的正鏈或負(fù)鏈，但是為了提高重建的效率，優(yōu)選轉(zhuǎn)錄正鏈。
將載體DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的方法包括1)制備可被目的細(xì)胞攝取的DNA沉淀物的方法；2)制備含有DNA的帶正電的復(fù)合物的方法，該復(fù)合物細(xì)胞毒性小并可被靶細(xì)胞攝??；以及3)使用電脈沖在靶細(xì)胞膜上形成瞬時(shí)開放小孔以使DNA分子通過的方法。
在上述方法2)中，可以利用各種轉(zhuǎn)染試劑，例如DOTMA(Boehringer)、SuperFect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boheringer#1811169)等。方法1)的一個(gè)實(shí)例為采用磷酸鈣的轉(zhuǎn)染方法，其中進(jìn)入細(xì)胞的DNA被并入到吞噬體內(nèi)，但是也有足夠的數(shù)量進(jìn)入核內(nèi)(Graham，F(xiàn).L.和Van Der Eb，J.，1973，，Virology 52；456；Wigler，M.和Silverstein，S.1977，Cell 11223)。Chen和Okayama研究優(yōu)化了這種轉(zhuǎn)移技術(shù)，報(bào)道可以在以下條件下獲得優(yōu)化的DNA沉淀物1)細(xì)胞與共沉淀物在2-4％CO2，35℃的條件下培養(yǎng)15-24小時(shí)，2)使用活性比線性DNA高的環(huán)狀DNA，和3)沉淀混合物中的DNA濃度為20-30μg/ml時(shí)，可以得到最佳的沉淀(Chen，C.和Okayama，H.，1987，Mol.Cell.Biol.72745)。方法2)適于瞬間轉(zhuǎn)染。在已知的較早期方法中，以期望的DNA濃度比例制備DNA與DEAE-葡聚糖的混合物(Sigma #D-9885，M.W.5×105)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。由于大部分的復(fù)合體在內(nèi)體中被分解，因此可以加入氯喹以增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效果(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA803015)。方法3)被稱作為電穿孔，因?yàn)樗簧婕凹?xì)胞的選擇性，因此比方法1)和2)更為通用。當(dāng)脈沖電流的持續(xù)時(shí)間，脈沖形狀(pulse shape)，電場勢能(電極間的間隔，電壓)，緩沖液傳導(dǎo)率，DNA濃度和細(xì)胞密度等條件被優(yōu)化時(shí)，方法3)被認(rèn)為有效。
在上述的三類方法中，方法2)易于操作，并有助于利用大量的細(xì)胞檢查大量的試樣。因此當(dāng)DNA被導(dǎo)入細(xì)胞用于載體重建時(shí)，適于使用轉(zhuǎn)染試劑。優(yōu)選使用SuperFect轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN，Cat.No.301305)或DOSPER脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Boechringer Mannheim，Cat.No.1811169)。
具體而言，可按如下方法從cDNA中進(jìn)行病毒載體的重建。
采用含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100單位/ml青霉素G和100μg/ml鏈霉素)的極限必需培養(yǎng)基(MEM)在24-孔至6-孔塑料培養(yǎng)皿或100mm直徑的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)來自猴腎的LLC-MK2細(xì)胞，直到達(dá)到70-80％融合。然后以例如2PFU/細(xì)胞的量，用表達(dá)T7聚合酶的重組痘苗病毒vTF7-3感染該細(xì)胞。此病毒已在1μg/ml的補(bǔ)骨脂素的存在下用UV照射處理20分鐘而滅活(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA838122-8126，1986；Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579，1996)?？梢赃m當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)補(bǔ)骨脂素的加入量和UV照射時(shí)間。感染一小時(shí)后，使用脂轉(zhuǎn)染等方法，用2-60μg更優(yōu)選3-30μg的上述DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所述DNA編碼粒子形成能力已被降低或消除的重組仙臺(tái)病毒基因組RNA。這種方法使用SuperFect(QIAGEN)和表達(dá)制備病毒RNP所需的反式作用病毒蛋白的質(zhì)粒(0.5-24μg的pGEM-N、0.25-12μg的pGEM-P和0.5-24μg的pGEM-L，更優(yōu)選，例如，1μg的pGEM-N、0.5μg的pGEM-P和1μg的pGEM-L)(Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579，1996)。編碼N，P和L的表達(dá)載體比例優(yōu)選為2∶1∶2。可適當(dāng)調(diào)整質(zhì)粒的數(shù)量，例如，1μg-4μg的pGEM-N、0.5-2μg的pGEM-P和1-4μg的pGEM-L。如果同時(shí)共轉(zhuǎn)染了粒子形成所必需的基因，形成的病毒粒子再次感染輔助細(xì)胞，就可進(jìn)一步擴(kuò)增該病毒。在根據(jù)需要而含有利福平(Sigma)和阿糖胞苷(AraC)各100μg/ml，優(yōu)選只含有40μg/ml阿糖胞苷(AraC)(Sigma)的無血清MEM中培養(yǎng)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。使反應(yīng)劑的濃度最優(yōu)化，以使痘苗病毒的細(xì)胞毒性最小化和使所要的病毒的回收率最大化(Kato，A.et al.，1996，GenesCells 1，569-579)。轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)約48-72小時(shí)，回收這些細(xì)胞，重復(fù)三次冷凍和融化循環(huán)使其破裂。用這些破裂細(xì)胞再次轉(zhuǎn)染LLC-MK2細(xì)胞，并在確保持續(xù)彌補(bǔ)M蛋白亞細(xì)胞定位的降低或消除的條件下加以培養(yǎng)。該過程中，形成了病毒粒子，且病毒被擴(kuò)增?；蛘?，可以收集培養(yǎng)上清，并加入到被培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中，以生成病毒。在確保持續(xù)彌補(bǔ)M蛋白亞細(xì)胞定位的降低或消除的條件下培養(yǎng)3-7天以后，收集該培養(yǎng)液。
可以將RNP與，例如，脂轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine)和多陽離子脂質(zhì)體的復(fù)合物一起導(dǎo)入細(xì)胞。具體地，可使用各種轉(zhuǎn)染試劑，例如DOTMA(Boehringer)、SuperFect(QIAGEN #301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boheringer #1811169)等?？梢约尤肼揉苑乐筊NP在內(nèi)體中被分解(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA803015)。
當(dāng)重建編碼包膜蛋白基因缺陷的病毒載體時(shí)，可使用表達(dá)包膜蛋白的LLC-MK2細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染，或用表達(dá)包膜蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染?；蛘?，可將被轉(zhuǎn)染細(xì)胞覆蓋表達(dá)包膜蛋白的LLC-MK2細(xì)胞，以擴(kuò)增病毒載體，并在確保持續(xù)彌補(bǔ)M蛋白亞細(xì)胞定位的降低或消除的條件下(參見WO00/70055和WO00/70070)培養(yǎng)這些細(xì)胞?；蛘?，將上述通過凍融所獲得細(xì)胞裂解物通過尿囊膜接種到10天齡的受孕雞胚中，然后在確保持續(xù)彌補(bǔ)M蛋白亞細(xì)胞定位的降低或消除的條件下維持，大約3天后收集尿囊液。通過測定紅細(xì)胞凝集活性(HA)來鑒定培養(yǎng)上清或尿囊液中病毒的滴度?？赏ㄟ^“內(nèi)點(diǎn)稀釋方法”測定HA(Kato，A.et al.，1996，GenesCells 1569-579；Yonemitsu，Y.& Kaneda，Y.，Hemaggulutinating virus ofJapan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular MedicineHumana Presspp.295-306，1999)。所獲的尿囊液可適當(dāng)稀釋以去除潛在的污染物，即表達(dá)T7聚合酶的痘苗病毒(例如稀釋106倍)?？稍诖_保持續(xù)彌補(bǔ)M蛋白亞細(xì)胞定位的降低或消除的條件下再次在雞胚中擴(kuò)增病毒?？梢灾貜?fù)再擴(kuò)增過程，例如3次或更多。所獲的病毒儲(chǔ)備液保存在-80℃。
可以測定回收病毒的潛能，例如，通過測定細(xì)胞感染單位(CIU)或紅細(xì)胞凝集活性(HA)(WO00/70070；Kato，A.et al.，Genes Cells 1569-579(1996)；Yonemitsu，Y.and Kaneda，Y.，″Hemaggulutinating virus ofJapan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells.″，Ed.by Baker，A.H.，Molecular Biology of Vascular Diseases.Methods in MolecularMedicine.，Humana Press.，pp.295-306(1999))。如果用標(biāo)記基因例如綠色熒光蛋白(GFP)，標(biāo)記了載體，那么就可以使用該標(biāo)記作為指示物(例如作為GFP-CIU)直接計(jì)數(shù)被感染細(xì)胞從而定量病毒的滴度。可以認(rèn)可這樣測定的滴度與CIU相等(WO00/70070)。
用于病毒重建的宿主細(xì)胞類型沒有特別限制，只要病毒載體可以在其中重建。例如，在仙臺(tái)病毒載體的重建中，可以使用如來源于猴腎的LLC-MK2細(xì)胞和CV-I細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞如來源于倉鼠腎的BHK細(xì)胞，來源于人的細(xì)胞等等。還可以通過在這些細(xì)胞中適宜地表達(dá)包膜蛋白而獲得包膜中包含該蛋白的感染性病毒粒子。為了在持續(xù)彌補(bǔ)M蛋白亞細(xì)胞定位的降低或消除的條件下擴(kuò)增所述載體，可以用獲自上述宿主細(xì)胞的大量病毒載體感染受精的雞胚。采用雞胚制造病毒載體的方法已被開發(fā)(Nakanishi，et al.(eds.)，1993，“sinkei-kagaku Kenkyu-no Sentan-gijutuProtocol III(High Technology Protocol III of Neuroscience Research”，Molecular Neurocyte Physiology，Koseisha，Osaka，pp.153-172)。具體地，例如，將受精卵放在孵化器中并在37-38℃下孵化9-12天使胚胎生長。然后將病毒載體接種到尿囊腔中，再培養(yǎng)數(shù)日以擴(kuò)增病毒，然后收集含有病毒的尿囊液。培養(yǎng)時(shí)間等條件可以根據(jù)所擴(kuò)增重組病毒的類型而定。可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行尿囊液病毒載體的分離和純化(Tashiro，M.，“Virus Experiment Protocols”，Nagai和Ishihama(eds.)，Medicalview，pp.68-73(1995))。
具體而言，例如，當(dāng)試圖重建含有溫度敏感型突變M基因的M蛋白亞細(xì)胞定位已被減少或消除的重組(-)鏈RNA病毒載體時(shí)，可按下述步驟制備病毒(a)在表達(dá)NP，P和L蛋白的細(xì)胞(輔助細(xì)胞)中轉(zhuǎn)錄編碼負(fù)鏈RNA的載體DNA，所述RNA衍生自(-)鏈RNA病毒或其互補(bǔ)鏈(正鏈)，以及(b)在允許的或更低溫度，培養(yǎng)這些細(xì)胞，或者病毒載體所獲自的細(xì)胞，或者已導(dǎo)入RNP組分的細(xì)胞，然后從培養(yǎng)上清中回收病毒粒子。本發(fā)明中，特別優(yōu)選步驟(b)中的培養(yǎng)過程在允許的或更低溫度進(jìn)行。具體為35℃或更低，更優(yōu)選34℃或更低，更優(yōu)選33℃或更低，最優(yōu)選32℃或更低。
M蛋白已被缺失的(-)鏈RNA病毒載體可按下述構(gòu)建和制備<1>構(gòu)建M缺失(-)鏈RNA病毒基因組cDNA和M表達(dá)質(zhì)粒用限制性酶消化(-)鏈RNA病毒全長基因組cDNA，收集含有M基因的片段，并克隆到pU18中。在該質(zhì)粒上構(gòu)建M基因缺失位點(diǎn)。使用PCR和連接相結(jié)合的方法缺失M基因。去除M基因的ORF，將剩余部分與適當(dāng)?shù)拈g插序列相連。這樣就構(gòu)建了M缺失的基因組cDNA。使用PCR擴(kuò)增編碼該基因組M基因上游和下游區(qū)域的DNA，然后連接這些片段，制備出含有全長M缺失(-)鏈RNA病毒基因組cDNA的質(zhì)粒。例如可在M缺失位點(diǎn)中的限制性位點(diǎn)上插入外源基因。
<2>制備可誘導(dǎo)表達(dá)(-)鏈RNA病毒M蛋白的輔助細(xì)胞使用結(jié)合方法(如Cre/loxP)，制備能夠誘導(dǎo)表達(dá)(-)鏈RNA病毒M蛋白的載體，例如誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或表達(dá)調(diào)控體系。PCR擴(kuò)增(-)鏈RNA病毒M基因，并將其插入例如質(zhì)粒pCALNdlw(該質(zhì)粒的設(shè)計(jì)使其可以通過CreDNA重組酶誘導(dǎo)表達(dá)基因產(chǎn)物)中唯一的SwaI位點(diǎn)，構(gòu)建可指導(dǎo)表達(dá)(-)鏈RNA病毒M基因的Cre/loxP誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒(Arai，T.et al.，J.Virology 72，1998，p1115-1121)。
為收集M缺陷基因組的感染性病毒粒子，建立一種能夠持續(xù)表達(dá)M蛋白的輔助細(xì)胞。例如，可使用來自猴腎的LLC-MK2細(xì)胞系等。在5％CO2下，采用含有10％熱處理固定的胎牛血清(FBS)，50單位/ml青霉素G鈉和50μg/ml鏈霉素的MEM培養(yǎng)LLC-MK2細(xì)胞。上述質(zhì)粒的設(shè)計(jì)可以通過Cre DNA重組酶誘導(dǎo)表達(dá)M基因，根據(jù)已知方法，使用磷酸鈣方法(哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染試劑盒(Stratagene))將該質(zhì)粒導(dǎo)入LLC-MK2細(xì)胞。
例如，將10μg表達(dá)M的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LLC-MK2細(xì)胞，所述細(xì)胞已在10-cm板上培養(yǎng)至40％融匯。然后在37℃培養(yǎng)箱中，5％CO2下用10ml含有10％FBS的MEM孵育這些細(xì)胞。孵育24小時(shí)后，收集細(xì)胞并懸浮于10ml培養(yǎng)基中。將上清涂布于5個(gè)10cm直徑的培養(yǎng)皿中向一個(gè)培養(yǎng)皿中加入5ml上清，兩個(gè)加2ml，兩個(gè)加0.2ml。用10ml含有10％FBS和1200μg/ml G418(GIBCO-BRL)的MEM培養(yǎng)各培養(yǎng)皿中的細(xì)胞14天；每兩天換一次培養(yǎng)基。從而選出穩(wěn)定導(dǎo)入基因的細(xì)胞系。利用克隆環(huán)收集培養(yǎng)基中生長的G418抗性細(xì)胞。然后將收集的各克隆的細(xì)胞在10cm板上進(jìn)一步培養(yǎng)直到融匯。
輔助細(xì)胞中M蛋白的高水平表達(dá)對于收集高滴度病毒十分重要。為此，優(yōu)選將上述M表達(dá)細(xì)胞的篩選過程進(jìn)行兩次或更多。例如，轉(zhuǎn)染含有藥物抗性標(biāo)記基因的M蛋白表達(dá)質(zhì)粒，使用該藥物篩選含有該M基因的細(xì)胞。然后用含有不同藥物的抗性標(biāo)記基因的M蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相同的細(xì)胞，使用第二種藥物抗性標(biāo)記篩選細(xì)胞。使用第二種抗性標(biāo)記篩選的細(xì)胞傾向于比第一次轉(zhuǎn)染后篩選的細(xì)胞具有更高水平的M蛋白表達(dá)。這樣，可以適當(dāng)?shù)貞?yīng)用通過兩次重復(fù)轉(zhuǎn)染所構(gòu)建的M輔助細(xì)胞。由于M輔助細(xì)胞能夠同時(shí)表達(dá)F基因，因此可以產(chǎn)生同時(shí)缺陷了F和M基因的感染性病毒粒子(參見實(shí)施例)。這種情況下，為提高F蛋白表達(dá)誘導(dǎo)水平，優(yōu)選F基因表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染為2次以上。
培育細(xì)胞使其在6cm皿中融匯，然后根據(jù)Saito等的方法，用MOI＝～3的腺病毒AxCANCre感染這些細(xì)胞，可獲得M蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)(Saito et al.，Nucl.Acids Res.233816-3821(1995)；Arai，T.et al.，J.Virol.72，1115-1121(1998))。
<3>M缺失型病毒的重建和擴(kuò)增為使用表達(dá)野生型M蛋白或該蛋白等同物的細(xì)胞(M輔助細(xì)胞)制備重組M缺陷(-)鏈RNA病毒粒子，可將M缺陷(-)鏈RNA病毒RNP導(dǎo)入這些細(xì)胞中或在這些細(xì)胞中生成。例如通過將含有RNP的細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)染到M輔助細(xì)胞中，或通過將RNP生成細(xì)胞與M輔助細(xì)胞共培養(yǎng)來誘導(dǎo)細(xì)胞融合，可以將RNP導(dǎo)入M輔助細(xì)胞。這也可以如下實(shí)現(xiàn)將基因組RNA轉(zhuǎn)錄到M輔助細(xì)胞中并在N，P和L蛋白存在下再次(de novo)進(jìn)行RNP合成。可從M基因已被缺失的(-)鏈RNA病毒基因組cDNA中重建并制備重組病毒載體。具體可如下獲得(a)在表達(dá)NP，P和L蛋白的細(xì)胞(輔助細(xì)胞)中轉(zhuǎn)錄編碼M基因缺失型負(fù)鏈RNA的載體DNA(所述RNA衍生自(-)鏈RNA病毒或其互補(bǔ)鏈(正鏈))，以及(b)培養(yǎng)這些細(xì)胞，或者培養(yǎng)可以從中獲得病毒載體的那些細(xì)胞，或者已導(dǎo)入RNP組分的細(xì)胞，然后從培養(yǎng)上清中回收病毒粒子，其中所用的培養(yǎng)條件確保整合到染色體中的M基因可以在這些細(xì)胞或感染的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。本發(fā)明中，特別優(yōu)選步驟(b)的培養(yǎng)在允許溫度或更低溫度進(jìn)行。所述溫度可以為35℃或更低，更優(yōu)選34℃或更低，更優(yōu)選33℃或更低，最優(yōu)選32℃或更低。在使用溫度敏感型突變M蛋白制備載體時(shí)，病毒粒子的制備過程必須在低于允許溫度的條件下進(jìn)行。但是，出乎意料的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該方法中，當(dāng)病毒粒子形成過程在低溫下進(jìn)行時(shí)，可以高效制備粒子，甚至在使用野生型M蛋白時(shí)也如此。在步驟(a)中，可將編碼NP，P和L蛋白的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，以便表達(dá)這些蛋白。另外，在步驟(a)中，可在輔助細(xì)胞中表達(dá)M蛋白(在F和/或HN基因缺陷病毒的情況下，這些基因也可以被表達(dá))(參見實(shí)施例)?；蛘?，還可以在步驟(a)中使用在步驟(b)中將要使用的細(xì)胞，該細(xì)胞中M基因已整合到染色體中?？赏ㄟ^例如凍融來破壞步驟(a)中的細(xì)胞，再使用已知轉(zhuǎn)染試劑將該溶胞物導(dǎo)入步驟(b)中的細(xì)胞，從而將在步驟(a)中制備的RNP導(dǎo)入步驟(b)的細(xì)胞中。
具體地，例如可按下述將編碼上述M缺失(-)鏈RNA病毒基因組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到LLC-MK2細(xì)胞中當(dāng)使用T7 RNA聚合酶誘導(dǎo)基因組RNA轉(zhuǎn)錄時(shí)，將LLC-MK2細(xì)胞以5×106細(xì)胞/皿的濃度涂布在100mm Petri培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24小時(shí)。然后室溫用表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒(PLWUV-VacT7)(MOI＝2)感染這些細(xì)胞1小時(shí)，所述病毒已被補(bǔ)骨脂素和長波長紫外光(365nm)處理了20分鐘(MOI＝2～3，優(yōu)選使用MOI＝2)(Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))。使用例如帶有15瓦燈泡的UV Stratalinker 2400(目錄號(hào)400676(100V)；Stratagene，La Jolla，CA，USA)照射痘苗病毒。洗滌細(xì)胞三次。將表達(dá)基因組RNA的質(zhì)粒以及指導(dǎo)NP，P和L蛋白(可選M蛋白和其它蛋白)表達(dá)的質(zhì)粒懸浮于OptiMEM(GIBCO)中，加入SuperFect轉(zhuǎn)染試劑(1μg DNA/5μl SuperFect，QIAGEN)并混合。將混合物于室溫靜置10分鐘，然后加入到含有3％FBS的3ml OptiMEM中?；蛘撸衫眠m當(dāng)?shù)闹D(zhuǎn)染試劑，分別使用表達(dá)基因組RNA的質(zhì)粒和表達(dá)N，P，L，F(xiàn)和HN蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。質(zhì)粒的比例可以是，例如6∶2∶1∶2∶2∶2，但沒有特別限制。培養(yǎng)3-5小時(shí)后，用不含血清的MEM清洗細(xì)胞兩次，然后在含有40μg/ml胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶(GIBCO)的MEM中培養(yǎng)24-70小時(shí)。此時(shí)，可以以大約8.5×106細(xì)胞/皿的濃度，用持續(xù)表達(dá)M蛋白的細(xì)胞(M輔助細(xì)胞)覆蓋這些細(xì)胞，然后在含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中37℃再培養(yǎng)2天。收集培養(yǎng)細(xì)胞并以107細(xì)胞/ml濃度將沉淀懸浮于OptiMEM中。通過凍融3次與脂轉(zhuǎn)染試劑DOSPER(Roche)混合(106細(xì)胞/25μl)，混合物于室溫靜置15分鐘，然后轉(zhuǎn)染按上述克隆的M蛋白表達(dá)性輔助細(xì)胞(12孔板，106細(xì)胞/孔的濃度)。在不含血清的MEM中(含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，優(yōu)選在低溫下培養(yǎng)，收集上清液。該方法中轉(zhuǎn)染還可以在不加入諸如脂轉(zhuǎn)染試劑DOSPER等轉(zhuǎn)染試劑的情況下進(jìn)行。同樣地，可以通過缺失基因組中F和/或HN基因，然后誘導(dǎo)F和/或HN蛋白在輔助細(xì)胞中共表達(dá)，從而制備出F和/或HN缺陷的病毒載體。
根據(jù)本發(fā)明，病毒載體可以釋放到病毒形成細(xì)胞的外部液體中，其滴度為例如1×105CIU/ml或更多，優(yōu)選1×106CIU/ml或更多，更優(yōu)選1×107CIU/ml或更多，更優(yōu)選1×108CIU/ml或更多，更優(yōu)選5×108CIU/ml或更多。可根據(jù)說明書和其它文獻(xiàn)所述方法測定病毒滴度(Kiyotani，K.etal.，Virology 177(1)65-74(1990)；WO00/70070)。
從M缺失型(-)鏈RNA病毒基因組cDNA重建重組病毒的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式如下即，該方法包括以下步驟(a)在表達(dá)感染性病毒粒子形成所必需的病毒蛋白(即NP，P，L，M，F(xiàn)和HN蛋白)的細(xì)胞(輔助細(xì)胞)中轉(zhuǎn)錄編碼M基因缺失的負(fù)鏈RNA的載體DNA(所述RNA衍生自(-)鏈RNA病毒或其互補(bǔ)鏈(正鏈))，以及(b)將這些細(xì)胞與表達(dá)染色體整合狀態(tài)的M基因的細(xì)胞(M輔助細(xì)胞)共培養(yǎng)；(c)從該培養(yǎng)物中制備細(xì)胞提取物；(d)將提取物導(dǎo)入表達(dá)染色體整合狀態(tài)的M基因的細(xì)胞(M輔助細(xì)胞)并培養(yǎng)這些細(xì)胞，以及(e)收集培養(yǎng)物上清中的病毒粒子。步驟(d)優(yōu)選在上述低溫下進(jìn)行。所獲病毒粒子可通過再次感染輔助細(xì)胞(優(yōu)選低溫下)而被擴(kuò)增。具體地，可根據(jù)實(shí)施例的描述重建病毒。
當(dāng)制備帶有缺陷病毒基因的載體時(shí)，可以將兩種或多種載體導(dǎo)入同一細(xì)胞，其中所述兩種或多種載體在其病毒基因組中帶有不同的缺陷型病毒基因。利用其它載體表達(dá)并供應(yīng)每種缺陷型病毒蛋白，這種相互彌補(bǔ)導(dǎo)致形成感染性病毒粒子，并可在復(fù)制循環(huán)中擴(kuò)增該病毒載體。即，當(dāng)將本發(fā)明兩種或多種載體與互補(bǔ)的病毒蛋白組合接種時(shí)，可大量且低成本地生產(chǎn)混合病毒基因缺陷的病毒載體。由于這些病毒缺乏病毒基因，其基因組小于完整病毒的基因組，這樣它們就可以含有更大的外源基因。另外，很難維持這些病毒的共感染性，這些病毒由于病毒基因缺陷而不能繁殖，并在細(xì)胞外被稀釋。因此這種載體是不能繁殖的，從控制環(huán)境釋放的角度來看，這點(diǎn)非常有利。
可以將收集的(-)鏈RNA病毒純化以達(dá)到基本純的純度?？筛鶕?jù)已知純化和分離方法進(jìn)行純化，如過濾，離心，柱層析純化等，或其組合?！盎炯儭敝缸鳛榻M分而言，病毒是病毒所存在的樣品中的主要部分。通常，基本純的病毒載體，可通過確定樣品中病毒衍生的蛋白與總蛋白的比例(加入作為載體或穩(wěn)定劑的蛋白除外)達(dá)到10％或更多來檢測，優(yōu)選20％或更多，更優(yōu)選50％或更多，更優(yōu)選70％或更多，更優(yōu)選80％或更多，更優(yōu)選90％或更多。具體地，可通過使用纖維素硫酸酯或交聯(lián)多糖硫酸酯的方法(Examined Published Japanese Patent Application(JP-B)No.Sho 62-30752；JP-B Sho 62-33879；JP-B Sho 62-30753)，與含有硫酸巖藻糖的多糖和/或其降解產(chǎn)物吸附的方法(WO97/32010)等純化(-)鏈RNA病毒。
當(dāng)使用治療性基因作為外源基因制備病毒載體時(shí)，可通過施用病毒載體進(jìn)行基因治療。本發(fā)明制備的病毒載體用于基因治療時(shí)，可以表達(dá)預(yù)期具備治療效果的外源基因，或患者體內(nèi)供給不足的內(nèi)源性基因。這可通過直接(體內(nèi))或間接(回體)施用該復(fù)合物來完成。外源基因的類型沒有特別限制，可包括編碼蛋白的核酸，以及不編碼蛋白的核酸，如反義核酸或核酶核酸。
本發(fā)明方法制備的(-)鏈RNA病毒載體可以根據(jù)需要，而與所需的藥學(xué)可接受賦形劑(carrier)或溶劑組合而配制成組合物。“藥學(xué)可接受的賦形劑或溶劑”指可與載體一起施用，且不顯著抑制載體的基因轉(zhuǎn)移的材料。例如，可用生理鹽水，磷酸鹽緩沖液(PBS)等適當(dāng)稀釋載體再制成組合物。當(dāng)(-)鏈RNA病毒載體在雞胚等中傳代時(shí)，組合物可含有尿囊液。另外，含有載體的組合物可含有賦形劑或溶劑，如去離子水和5％葡萄糖溶液。此外，組合物還可含有植物油，懸浮劑，去污劑，穩(wěn)定劑，殺菌劑等。另外，防腐劑和其它添加劑也可加入該組合物。含有(-)鏈RNA病毒載體的組合物可用作試劑和藥物。
載體的劑量根據(jù)疾病類型，患者體重，年齡，性別和癥狀，施用目的，待施用組合物的劑型，施用方法，待導(dǎo)入的基因的類型等而定。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)貨Q定劑量。(-)鏈RNA病毒載體的施用劑量優(yōu)選為大約105-1011CIU/ml，更優(yōu)選約107-109CIU/ml，最優(yōu)選約1×108-5×108CIU/ml。優(yōu)選與藥學(xué)可接受賦形劑一起施用載體。對于單個(gè)人體的每次施用劑量優(yōu)選2×109-2×1010CIU?？稍谂R床可接受的副作用的極限以內(nèi)進(jìn)行一次或多次施用。每日施用的頻率可類似測定。當(dāng)對非人動(dòng)物施用病毒載體時(shí)，可根據(jù)靶動(dòng)物與人之間的體重比或施用靶部位的體積比(例如平均值)來換算上述劑量從而確定所需施用劑量。含有(-)鏈RNA病毒載體的組合物可施用于所有哺乳動(dòng)物物種，如人，猴，小鼠，大鼠，兔子，綿羊，牛，狗等。


圖1顯示F缺陷的、M基因中導(dǎo)入了溫度敏感型突變的SeV基因組cDNA的構(gòu)建過程圖。
圖2顯示為基于已導(dǎo)入M基因中的溫度敏感型突變來抑制二次粒子釋放的目的，以及為測試并對比這些導(dǎo)入突變的效果的目的而構(gòu)建的病毒基因的結(jié)構(gòu)。
圖3的顯微照片顯示持續(xù)表達(dá)F基因的細(xì)胞(LLC-MK2/F7/A)中GFP的表達(dá)，該細(xì)胞被SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染后，在32℃和37℃培養(yǎng)6天。
圖4顯示了使用Western印跡，隨時(shí)間半定量測定細(xì)胞(LLC-MK2/F7/A)中F蛋白表達(dá)水平的結(jié)果圖，所述細(xì)胞持續(xù)表達(dá)SeV-F蛋白，該細(xì)胞在不含血清和胰蛋白酶的MEM中，32℃或37℃下培養(yǎng)。
圖5的顯微照片顯示了LLC-MK2細(xì)胞中的GFP表達(dá)，該細(xì)胞用MOI＝3的SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染后，在32℃，37℃或38℃培養(yǎng)3天。
圖6顯示了LLC-MK2細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中紅細(xì)胞凝集活性(HA活性)，所述上清隨時(shí)間取樣(同時(shí)加入新鮮培養(yǎng)基)，該細(xì)胞在MOI＝3的SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染后，在32℃，37℃或38℃培養(yǎng)。
圖7顯示細(xì)胞中M蛋白水平與病毒樣粒子(VLP)的比例。使用抗M抗體通過Western印跡測定該比例。從LLC-MK2細(xì)胞培養(yǎng)物中收集培養(yǎng)物上清和細(xì)胞，所述細(xì)胞培養(yǎng)物是在MOI＝3的SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染后，在37℃培養(yǎng)2天獲得。每道均含有6孔板每孔培養(yǎng)物含量的1/10。
圖8顯示LLC-MK2細(xì)胞被MOI＝3的SeV18+GFP，SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP感染后，培養(yǎng)12，18，24，50或120小時(shí)所獲培養(yǎng)物上清中SEAP活性。
圖9顯示LLC-MK2細(xì)胞被MOI＝3的SeV18+GFP，SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP感染后，培養(yǎng)24，50或120小時(shí)所獲培養(yǎng)物上清中HA活性。
圖10顯示VLP定量圖，使用抗M抗體通過Western印跡進(jìn)行定量。LLC-MK2細(xì)胞被MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP感染后，培養(yǎng)5天。離心培養(yǎng)物上清以收集病毒。每道均含有6孔板每孔培養(yǎng)物含量的1/10。
圖11顯示根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)基中釋放的LDH量所估測的細(xì)胞毒性。用MOI＝0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，或10的SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染LLC-MK2，BEAS-2B或CV-1細(xì)胞。在不含血清或含有10％FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，感染后3或6天分別進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。
圖12顯示M蛋白在LLC-MK2細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，所述細(xì)胞經(jīng)MOI＝1的SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染后，在32℃，37℃或38℃培養(yǎng)2天，使用抗M抗體進(jìn)行免疫染色觀察定位。
圖13顯示共焦激光顯微鏡下觀察到的M和HN蛋白亞細(xì)胞定位的立體三維圖。用MOI＝1的SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP感染A-10細(xì)胞后，在32℃或37℃培養(yǎng)1天。使用抗M抗體和抗HN抗體進(jìn)行免疫染色獲得這些圖像。
圖14顯示共焦激光顯微鏡下觀察到的M和HN蛋白亞細(xì)胞定位的立體三維圖。用MOI＝1的SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP感染A-10細(xì)胞后，在32℃或37℃培養(yǎng)2天。使用抗M抗體和抗HN抗體進(jìn)行免疫染色獲得這些圖像。
圖15顯示微管解聚劑對M和HN蛋白亞細(xì)胞定位的影響。用MOI＝1的SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP感染A-10細(xì)胞，立即向這些細(xì)胞中加入微管解聚劑秋水仙素或秋水仙酰胺，使終濃度為1μM。在32℃培養(yǎng)細(xì)胞。2天后，細(xì)胞用抗M抗體和抗HN抗體進(jìn)行免疫染色，然后在共焦激光顯微鏡下觀察。這些圖像顯示M和HN蛋白亞細(xì)胞定位的立體三維圖。
圖16顯示微管解聚劑對M和HN蛋白亞細(xì)胞定位的影響。用MOI＝1的SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染A-10細(xì)胞，立即向這些細(xì)胞中加入微管解聚劑秋水仙素或秋水仙酰胺，使終濃度為1μM。在32℃或37℃培養(yǎng)細(xì)胞。2天后，這些細(xì)胞用抗M抗體和抗HN抗體進(jìn)行免疫染色，然后在共焦激光顯微鏡下觀察。這些圖像顯示M和HN蛋白亞細(xì)胞定位的立體三維圖。
圖17顯示帶有P和L基因突變的F缺陷SeV基因組cDNA的構(gòu)建。
圖18顯示感染了帶有P和L基因突變的F缺陷SeV的細(xì)胞中病毒粒子二次釋放結(jié)果?！癲F”代表SeV18+/ΔF-GFP。“P86”代表SeV18+/P86 Lmut·ΔF-GFP，“P511”代表SeV18+/P511Lmut·ΔF-GFP。
圖19顯示帶有P和L基因突變的F缺陷SeV的細(xì)胞毒性結(jié)果?！癙86”代表SeV18+/P86Lmut·ΔF-GFP，“P511”代表SeV18+/P511Lmut·ΔF-GFP，“DF”代表SeV18+/ΔF-GFP。
圖20顯示在CV-1細(xì)胞中表達(dá)導(dǎo)入基因(GFP)的細(xì)胞的數(shù)量變化，所述細(xì)胞用含有P和L基因突變的F缺陷SeV感染?！癙86”代表SeV18+/P86Lmut·ΔF-GFP，“P511”代表SeV18+/P511Lmut·ΔF-GFP，“df”代表SeV18+/ΔF-GFP。
圖21顯示在CV-1細(xì)胞中導(dǎo)入基因(GFP)的表達(dá)，所述細(xì)胞用含有P和L基因突變的F缺陷SeV感染。“P86”代表SeV18+/P86Lmut·ΔF-GFP，“P511”代表SeV18+/P511Lmut·ΔF-GFP，“ΔF”代表SeV18+/ΔF-GFP。
圖22顯示細(xì)胞中導(dǎo)入基因(SEAP)的組成型表達(dá)，所述細(xì)胞用含有P和L基因突變的F缺陷SeV感染?！癗C”代表未導(dǎo)入載體的陰性對照?！癲F”代表SeV18+SEAP/SEAPΔF-GFP?！癙86”代表SeV18+SEAP/P86Lmut·ΔF-GFP，“P511”代表SeV18+SEAP/P511Lmut·ΔF-GFP。
圖23顯示用帶有P和L基因突變的F缺陷SeV(含SEAP基因的類型)所感染的細(xì)胞中病毒粒子二次釋放的結(jié)果?！癲F”代表SeV18+SEAP/ΔF-GFP。“P86”代表SeV18+SEAP/P86Lmut·ΔF-GFP，“P511”代表SeV18+SEAP/P511Lmut·ΔF-GFP。
圖24顯示帶有P和L基因突變的F缺陷SeV(含SEAP基因的類型)的細(xì)胞毒性結(jié)果?！癲F+SEAP”代表SeV18+SEAP/ΔF-GFP。“P86+SEAP”代表SeV18+SEAP/P86Lmut·ΔF-GFP，“P511+SEAP”代表SeV18+SEAP/P511Lmut·ΔF-GFP。
圖25顯示在M和HN基因中帶有溫度敏感型突變并在P和L基因中帶有突變的F缺陷SeV的基因組結(jié)構(gòu)。
圖26顯示在M和HN基因中帶有溫度敏感型突變并在P和L基因中帶有突變的F缺陷SeV的基因組cDNA構(gòu)建圖。
圖27顯示在M和HN基因中帶有溫度敏感型突變并在P和L基因中帶有突變的F缺陷SeV所感染的細(xì)胞中病毒粒子二次釋放的結(jié)果?！癲F”代表SeV18+/ΔF-GFP。“ts”代表SeV18+/MtsHNts·ΔF-GFP?！皌s+86”代表SeV18+/MtsHNts P86Lmut·ΔF-GFP，“ts+511”代表SeV18+/MtsHNts P511Lmut·ΔF-GFP。
圖28顯示在M和HN基因中帶有溫度敏感型突變并在P和L基因中帶有突變的F缺陷SeV的細(xì)胞毒性結(jié)果。“dF”代表SeV18+/ΔF-GFP?！皌s”代表SeV18+/MtsHNts·ΔF-GFP。“ts+86”代表SeV18+/MtsHNtsP86Lmut·ΔF-GFP，“ts+511”代表SeV18+/MtsHNts P511Lmut·ΔF-GFP。
圖29顯示外源基因在帶有溫度敏感型M和HN突變以及P和L基因突變的F缺陷SeV(含外源基因的類型)中的時(shí)程表達(dá)結(jié)果。“dF”代表SeV18+SEAP/ΔF-GFP。“ts+86”代表SeV18+SEAP/MtsHNts P86Lmut·ΔF-GFP，“ts+511”代表SeV18+SEAP/MtsHNts P511Lmut·ΔF-GFP。
圖30顯示帶有溫度敏感型M和HN突變以及P和L基因突變的F缺陷SeV(含外源基因的類型)的細(xì)胞毒性時(shí)程圖。“dF”代表SeV18+SEAP/ΔF-GFP。“dF/ts+P86L”代表SeV 18+SEAP/MtsHNtsP86Lmut·ΔF-GFP，“dF/ts+P511L”代表SeV 18+SEAP/MtsHNtsP511Lmut·ΔF-GFP。
圖31顯示含有EGFP基因的M缺失SeV基因組cDNA的構(gòu)建圖。
圖32顯示F-和M缺失型SeV基因組cDNA的構(gòu)建圖。
圖33顯示所構(gòu)建的F-和/或M-缺失型SeV基因的結(jié)構(gòu)。
圖34顯示帶有潮霉素抗性基因的M基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建圖。
圖35顯示，在用表達(dá)Cre DNA重組酶的重組腺病毒(AcCANCre)感染那些可誘導(dǎo)表達(dá)克隆化M蛋白(和F蛋白)的克隆化細(xì)胞之后，通過Western印跡對M和F蛋白在所述細(xì)胞中的表達(dá)水平進(jìn)行的半定量對比。
圖36顯示利用輔助細(xì)胞(LLC-MK2/F7/M)克隆#18和#62進(jìn)行的M缺失SeV(SeV18+/ΔM-GFP)的病毒重建圖。
圖37顯示SeV18+/ΔM-GFP的病毒生產(chǎn)力(CIU和HAU時(shí)程)。
圖38的照片和圖顯示RT-PCR結(jié)果，它證實(shí)SeV18+/ΔM-GFP病毒粒子的基因結(jié)構(gòu)。
圖39顯示SeV18+/ΔM-GFP，SeV18+GFP和SeV18+/ΔF-GFP的對比結(jié)果，其中LLC-MK2細(xì)胞感染后，對來自這些細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒蛋白進(jìn)行Western印跡，以便從蛋白角度證實(shí)SeV18+/ΔM-GFP的病毒結(jié)構(gòu)。
圖40顯示被SeV18+/ΔM-GFP和SeV18+/ΔF-GFP感染的LLC-MK2細(xì)胞的培養(yǎng)上清中病毒來源的蛋白的定量對比(制備一系列稀釋度并使用Western印跡分析)。使用了抗SeV抗體。
圖41顯示培養(yǎng)上清中的HA活性，所述上清是在用MOI＝3的SeV18+/ΔM-GFP和SeV18+/ΔF-GFP感染LLC-MK2細(xì)胞之后，在一段時(shí)間內(nèi)收集到的。
圖42顯示LLC-MK2細(xì)胞被MOI＝3的SeV18+/ΔM-GFP和SeV18+/ΔF-GFP感染5天后，所獲得的熒光顯微圖像。
圖43顯示按下述制備的LLC-MK2細(xì)胞的熒光顯微圖像用MOI＝3的SeV18+/ΔM-GFP或SeV18+/ΔF-GFP感染LLC-MK2細(xì)胞，5天后收集上清，并使用陽離子脂質(zhì)體(Dosper)轉(zhuǎn)染到LLC-MK2細(xì)胞中。兩天后進(jìn)行顯微觀察。
圖44顯示F-和M缺失型SeV(SeV18+/ΔMΔF-GFP)的病毒重建。
圖45顯示用SeV18+/ΔM-GFP或SeV18+/ΔF-GFP感染既能夠表達(dá)M又能表達(dá)F的細(xì)胞(LLC-MK2/F7/M62/A)3天和5天后所獲得的熒光顯微圖像。
圖46顯示帶有zeocin選擇標(biāo)記的M或G基因表達(dá)誘導(dǎo)型載體的構(gòu)建圖。
圖47顯示表達(dá)M和F的輔助細(xì)胞中M和F蛋白的表達(dá)圖。
圖48顯示被帶有GFP基因的M/F雙缺陷型SeV所感染的細(xì)胞中GFP的表達(dá)圖。
圖49顯示被帶有GFP基因的M/F雙缺陷型SeV感染的細(xì)胞中病毒生成的結(jié)果50的照片用RT-PCR證實(shí)了M/F雙缺陷型SeV的基因組結(jié)構(gòu)?！癲F”代表SeV18+/ΔF-GFP?！癲M”代表SeV18+/ΔM-GFP?！癲MdF”代表SeV18+/ΔMΔF-GFP。
圖51的照片證實(shí)被M/F雙缺陷型SeV感染的細(xì)胞中不存在M和F蛋白的表達(dá)。
圖52顯示了在被M/F雙缺陷型SeV感染的細(xì)胞中是否存在病毒粒子二次釋放的分析結(jié)果，其是通過測定HA活性來進(jìn)行分析的。
圖53的照片顯示了在被M/F雙缺陷型SeV感染的細(xì)胞中是否存在病毒粒子二次釋放的分析結(jié)果，其是利用培養(yǎng)上清液的轉(zhuǎn)染進(jìn)行的分析。
圖54顯示M/F雙缺陷型SeV和M缺陷型SeV對大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的感染性。
圖55顯示對蒙古沙土鼠大腦體內(nèi)應(yīng)用M/F雙缺陷型SeV和M缺陷型SeV后，導(dǎo)入的基因的表達(dá)。
圖56顯示M/F雙缺陷型SeV和M缺陷型SeV的感染性依賴性細(xì)胞毒性結(jié)果。“陽性對照”代表帶有全部復(fù)制活性的SeV(SeV18+GFP)?！癲F”代表SeV18+/ΔF-GFP。“dM”代表SeV18+/ΔM-GFP?！癲MdF”代表SeV18+/ΔMΔF-GFP。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式以下參照實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地例舉，但不要理解為是對本發(fā)明的限制。本文引用的所有文獻(xiàn)均并入作為參考。
構(gòu)建帶有溫度敏感型突變的F缺陷SeV基因組cDNA圖1顯示帶有溫度敏感型突變的F缺陷SeV基因組cDNA構(gòu)建過程，其如下所述用NaeI消化在F缺失位點(diǎn)含有EGFP基因的F缺陷全長仙臺(tái)病毒基因組cDNA(pSeV18+/ΔF-GFPLi，H.-O.et al.，J.Virology 74，6564-6569(2000)；WO00/70070)。使用瓊脂糖電泳分離含有M基因的片段(4922bp)。切取目的帶后，用QIAEXII Gel Extraction System(QIAGEN，Bothell，WA)回收DNA，并亞克隆到pBluescript II(Stratagene，La Jolla，CA)的EcoRV位點(diǎn)(pBlueNaeIfrg-ΔFGFP構(gòu)建體)。使用QuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA)，根據(jù)試劑盒所述方法，向pBlueNaeIfrg-ΔFGFP的M基因中導(dǎo)入溫度敏感型突變。在Kondo等報(bào)告的Cl.151株序列的基礎(chǔ)上(Kondo，T.et al.，J.Biol.Chem.26821924-21930(1993))，導(dǎo)入M基因的三種突變類型為G69E，T116A和A183S。用于導(dǎo)入突變的合成寡核苷酸序列為G69(5′-gaaacaaacaaccaatctagagagcgtatctgacttgac-3′/SEQ ID NO4，5′-gtcaagtcagatacgctctctagattggttgtttgtttc-3′/SEQ ID NO5)，T116A(5′-attacggtgaggagggctgttcgagcaggag-3′/SEQ ID NO6，5′-ctcctgctcgaacagccctcctcaccgtaat-3′/SEQ ID NO7)和A183S(5′-ggggcaatcaccatatccaagatcccaaagacc-3′/SEQ ID NO8，5′-ggtctttgggatcttggatatggtgattgcccc-3′/SEQ ID NO9)。
質(zhì)粒pBlueNaeIfrg-ΔFGFP(該質(zhì)粒中M基因含有上述三種突變)用SalI消化，然后用ApaL部分消化。然后收集含有整個(gè)M基因的片段(2644bp)。用ApaLI/NheI消化pSeV18+/ΔF-GFP，收集含有HN基因的片段(6287bp)。將這兩個(gè)片段亞克隆到Litmus38(New England Biolabs，Beverly，MA)的SalI/NheI位點(diǎn)(LitmusSalI/NheIfrg-MtsΔFGFP構(gòu)建體)。與向M基因中導(dǎo)入突變的過程一樣，使用QuikChangeTMSite-DirectedMutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA)，根據(jù)試劑盒所述方法，向LitmusSalI/NheIfrg-MtsΔFGFP HN基因中導(dǎo)入溫度敏感型突變。在Thompson等報(bào)告的ts271株序列基礎(chǔ)上(Thompson，S.D.et al.，Virology1601-8(1987))，導(dǎo)入HN基因的三種突變類型為A262T，G264R和K461G。用于導(dǎo)入突變的合成寡核苷酸序列為A262T/G264R(5′-catgctctgtggtgacaacccggactaggggttatca-3′/SEQ ID NO10，5′-tgataacccctagtccgggttgtcaccacagagcatg-3′/SEQ ID NO11)，K461G(5′-cttgtctagaccaggaaatgaagagtgcaattggtacaata-3′/SEQ ID NO12，5′-tattgtaccaattgcactcttcatttcctggtctagacaag-3′/SEQ ID NO13)。將M和HN基因的突變分別導(dǎo)入不同載體中，但也可以使用按下述方法制備的質(zhì)粒(LitmusSalI/NheIfrg-ΔFGFP)向M和H基因中引入所有這些突變用SalI/NheI消化pSeV18+/ΔF-GFP得到含有M和H基因的片段(8931bp)，將該片段亞克隆到Litmus38的SalI/NheI位點(diǎn)。突變的成功導(dǎo)入使得總共導(dǎo)入了6種溫度敏感型突變；其中3種在M基因上，另外3種在HN基因上(LitmusSalI/NheIfrg-MtsHNtsΔFGFP構(gòu)建體)。
用SalI/NheI消化LitmusSalI/NheIfrg-MtsHNtsΔFGFP，收集8931bp片段。用SalI/NheI消化pSeV18+/ΔF-GFP，收集不含M和HN基因等的另一片段(8294bp)。將這兩個(gè)片段連接起來構(gòu)建F缺陷型全長仙臺(tái)病毒基因組cDNA(pSeV18+/MtsHNtsΔF-GFP)，該基因組cDNA在M和HN基因中含有上述6種溫度敏感型突變，并在F缺陷位點(diǎn)含有EFGP基因(圖2)。
另外，為定量質(zhì)粒中的基因表達(dá)水平，構(gòu)建含有分泌型堿性磷酸酶(SEAP)的cDNA。具體地，使用NotI切割出SEAP片段(1638bp)，該片段含有SEAP基因下游的終止信號(hào)-間插序列-起始信號(hào)(WO00/70070)。收集該片段并電泳純化。然后將該片段插入pSeV18+/ΔF-GFP和pSeV18+/MtsHNtsΔF-GFP的各自NotI位點(diǎn)。所獲的質(zhì)粒分別命名為pSeV18+SEAP/ΔF-GFP和pSeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP(圖2)。
重建和擴(kuò)增含有溫度敏感型突變的病毒根據(jù)Li等的報(bào)告(Li，H.-O.et al.，J.Virology 74.6564-6569(2000)；WO00/70070)，進(jìn)行病毒重建。由于該病毒中F被缺失，利用F蛋白輔助細(xì)胞，所述細(xì)胞使用誘導(dǎo)型Cre/loxP表達(dá)體系制備。該體系使用pCALNdLw質(zhì)粒，它被設(shè)計(jì)用于Cre DNA重組酶介導(dǎo)的誘導(dǎo)型基因產(chǎn)物表達(dá)(Arai，T.et al.，J.Virol.721115-1121(1988))。該體系中，使用Saito等的方法，用表達(dá)Cre DNA重組酶的重組腺病毒(AxCANCre)感染轉(zhuǎn)化子(Saito，I.et al.，Nucl.Acid.Res.23，3816-3821(1995)，Arai，T.etal.，J.Virol.72，1115-1121(1998))，可以使插入的基因在帶有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子中表達(dá)。在SeV-F蛋白的情況下，將此處含有F基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞稱為LLC-MK2/F7，而AxCANCre誘導(dǎo)后能夠持續(xù)表達(dá)F蛋白的細(xì)胞稱為LLC-MK2/F7/A。
按下述重建含有溫度敏感型突變的病毒將LLC-MK2細(xì)胞以5×106細(xì)胞/皿的濃度涂布在100-mm培養(yǎng)皿上，然后培養(yǎng)24小時(shí)。然后室溫用表達(dá)T7聚合酶的重組痘苗病毒(PLWUV-VacT7Fuerst，T.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))感染這些細(xì)胞1小時(shí)，所述病毒已被補(bǔ)骨脂素和長波長紫外光(365nm)處理了20分鐘。用不含血清的MEM清洗細(xì)胞。以12μg，4μg，2μg，4μg和4μg/皿的濃度分別將質(zhì)粒pSeV18+/MtsHNtsΔF-GFP，pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L和pGEM/F-HN(Kato，A.et al.，Genes Cells 1，569-579(1996))懸浮在Opti-MEM(Gibco-BRL，Rockville，MD)中。加入相應(yīng)于1μg DNA/5μl的SuperFect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen，Bothell，WA)并混合。所獲的混合物于室溫靜置15分鐘，然后加入到含有3％FBS的30ml Opti-MEM中。將該混合物加入細(xì)胞。培養(yǎng)5小時(shí)后，細(xì)胞用不含血清的MEM清洗兩次，并在含有40μg/ml胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma，St.Louis，MO)和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，以8.5×106細(xì)胞/皿的濃度，覆蓋持續(xù)表達(dá)F蛋白的細(xì)胞(LLC-MK2/F7/ALi，H.-O.et al.，J.Virology 74.65 64-65 69(2000)，WO00/70070)。37℃下，在含有40μg/ml Arac和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中進(jìn)一步培養(yǎng)這些細(xì)胞2天(P0)。收集細(xì)胞并將沉淀懸浮于2ml Opti-MEM/皿中。進(jìn)行三次凍融處理，用溶胞物直接轉(zhuǎn)染LLC-MK2/F7/A。32℃下用不含血清但含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM培養(yǎng)細(xì)胞(P1)。5-7天后，用部分培養(yǎng)上清感染新鮮制備的LLC-MK2/F7/A，并于32℃下在同樣的不含血清但含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中培養(yǎng)細(xì)胞(P2)。3-5天后，再次感染新鮮制備的LLC-MK2/F7/A，并于32℃下在不含血清但只含有7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中培養(yǎng)細(xì)胞3-5天(P3)。向收集的培養(yǎng)上清中加入BSA使其終濃度為1％，將混合物保存在-80℃。將保藏的病毒溶液解凍，用于隨后的試驗(yàn)。
該方法制備的病毒溶液的滴度如下SeV18+/ΔF-GFP，3×108；SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP，7×107；SeV18+SEAP/ΔF-GFP，1.8×108；SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP，8.9×107GFP-CIU/mL(GFP-CIU已在WO00/70070中定義)。SeV18+/ΔF-GFP和SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP滴度測定中，在32℃和37℃下可以觀察到感染后持續(xù)表達(dá)F蛋白的細(xì)胞(LLC-MK2/F7/A)空斑的擴(kuò)展。圖3顯示感染6天后觀察到的模式。SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP空斑在32℃下的擴(kuò)展達(dá)到一定程度，但在37℃下明顯減少。這說明37℃下病毒粒子的形成減少。
培養(yǎng)溫度(32℃)對病毒重建的影響在病毒的實(shí)驗(yàn)室重建過程中導(dǎo)入了溫度敏感型突變(實(shí)施例2)，在32℃下培養(yǎng)P1及所有后續(xù)培養(yǎng)物。使用該溫度的原因是，用于評價(jià)溫度敏感型突變的導(dǎo)入的對照病毒在32℃生長良好(Kondo，T.et al.，J.Biol.Chem.26821924-21930(1993)，Thompson，S.D.et al.，Virology 1601-8(1987))。實(shí)驗(yàn)室條件的詳細(xì)觀察顯示對于SeV(以及除了引入溫度敏感型突變的病毒之外的其它病毒)重建而言，在32℃進(jìn)行P1及隨后的培養(yǎng)可以提高重建效率，使得收集原本難以獲得的病毒的可能性很高。
還有2個(gè)原因使得在32℃下可以提高重建效率。第一點(diǎn)，當(dāng)在32℃而不是37℃培養(yǎng)時(shí)，認(rèn)為可以抑制由AraC(其可抑制痘苗病毒擴(kuò)增)引起的細(xì)胞毒性。在病毒重建條件下，在不含血清但含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中37℃培養(yǎng)LLC-MK2/F7/A，3-4天后會(huì)引起細(xì)胞損傷，包括脫壁細(xì)胞數(shù)目增加。但是，在32℃下培養(yǎng)可以充裕地持續(xù)7-10天，而細(xì)胞仍然完整無損。當(dāng)SeV重建中未充分轉(zhuǎn)錄和/或復(fù)制，或感染性病毒粒子不能有效形成時(shí)，成功就被認(rèn)為是培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間的直接反映。第二點(diǎn)是當(dāng)LLC-MK2/F7/A在32℃培養(yǎng)時(shí)，可以在該細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)F蛋白。37℃下在含有10％FBS的MEM中，在6孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)能夠持續(xù)表達(dá)F蛋白的LLC-MK2/F7/A細(xì)胞，使其融匯，用含有7.5μg/ml胰蛋白酶的無血清MEM代替上述培養(yǎng)基，然后在32℃或37℃進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞。使用細(xì)胞刮除器隨時(shí)間收集細(xì)胞，利用抗F蛋白的抗體(小鼠單克隆)進(jìn)行Western印跡，以半定量分析細(xì)胞內(nèi)F蛋白。在37℃下F蛋白的表達(dá)持續(xù)2天，然后降低。但是，在32℃下F蛋白的表達(dá)至少可以持續(xù)8天(圖4)。這些結(jié)果證實(shí)了32℃下重建病毒的有效性(P1代之后)。
使用下述方法進(jìn)行上述Western印跡從6孔板的一孔中收集細(xì)胞，保存在-80℃，然后在100μl 1x稀釋的SDS-PAGE樣品緩沖液中解凍(Red Loading Buffer Pack；New England Biolabs，Beverly，MA)。然后將樣品加熱到98℃ 10分鐘，離心，SDS-PAGE凝膠的加樣量為10μl上清等份試樣(multigel 10/20；Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)。15mA電泳2.5小時(shí)后，使用半干法100mA處理1小時(shí)，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Immobilon PVDF轉(zhuǎn)移膜；Millipore，Bedford，MA)上。4℃下將轉(zhuǎn)移的膜浸入封閉液(Block Ace；Snow Brand Milk Products Co.，Ltd.，Sapporo，Japan)1小時(shí)或更長時(shí)間，在補(bǔ)充有1/1000體積抗F蛋白抗體且含有10％Block Ace的一抗溶液中浸泡，然后4℃靜置過夜。用含有0.05％Tween 20的TBS(TBST)清洗3次后，再用TBS清洗3次，將膜浸入補(bǔ)充有1/5000體積抗小鼠IgG+IgM抗體(該抗體與HRP(Goat F(ab’)2Anti-Mouse IgG+IgM，HRP；BioSource Int.，Camarillo，CA)相連)且含有10％Block Ace的二抗溶液中。然后室溫?cái)嚢铇悠?小時(shí)。用TBST清洗膜3次，再用TBS清洗3次，然后使用化學(xué)發(fā)光法(ECL western印跡檢測試劑；Amersham Pharmacia biotech，Uppsala，Sweden)檢測膜上的蛋白。
定量導(dǎo)入了溫度敏感型突變的病毒的病毒粒子二次釋放(HA試驗(yàn)，Western-印跡)使用自主復(fù)制型SeV，比較SeV18+/ΔF-GFP和SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP的病毒粒子二次釋放水平，所述SeV含有所有病毒蛋白以及GFP片段(780bp)，所述GFP片段在NotI位點(diǎn)含有GFP基因下游的終止信號(hào)-間插序列-起始信號(hào)(SeV18+GFP圖2)。
在6孔板上培養(yǎng)LLC-MK2細(xì)胞直至融匯。以100μl/孔的量向這些細(xì)胞中加入3×107CIU/ml每種病毒溶液(MOI＝3)，感染細(xì)胞1小時(shí)。用MEM清洗細(xì)胞后，向各孔中加入不含血清的MEM(1ml)，然后分別在32℃，37℃和38℃培養(yǎng)細(xì)胞。每天取樣，并在取樣后立即向剩余細(xì)胞中加入1ml不含血清的新鮮MEM。培養(yǎng)和取樣隨時(shí)間進(jìn)行。感染3天后，在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)，結(jié)果表明在所有溫度(32℃，37℃和38℃)下，這三種病毒類型的感染水平幾乎相同，且GFP表達(dá)水平類似(圖5)。
根據(jù)Kato等的方法(Kato，A.，et al.，Genes Cell 1，569-579(1996))，使用紅細(xì)胞凝集活性(HA活性)試驗(yàn)定量病毒粒子的二次釋放。具體地，用PBS在圓底96孔板上進(jìn)行連續(xù)稀釋。每孔中加入50μl連續(xù)2倍稀釋液。用PBS將50μl保藏的雞血(Cosmo Bio，Tokyo，Japan)稀釋到1％，再將其加入到50μl病毒溶液中，然后4℃下靜置混合物1小時(shí)。然后檢測紅細(xì)胞凝集作用。凝集樣品中最高的病毒稀釋度判定為HA活性。另外，一個(gè)紅細(xì)胞凝集單位(HAU)換算為1×106病毒，表示為病毒數(shù)量(圖6)。SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP的病毒粒子二次釋放水平顯著降低，37℃下被判定為SeV18+/ΔF-GFP水平的大約1/10。SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP的病毒粒子形成在32℃也減少，盡管只形成了少量粒子，但其產(chǎn)率仍達(dá)到了某種程度。
使用Western印跡定量二次釋放的粒子。與上述方法類似，用MOI＝3的病毒感染LLC-MK2細(xì)胞，感染2天后收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞。48000g離心上清45分鐘以收集病毒蛋白。SDS-PAGE后，使用抗M蛋白抗體進(jìn)行Western印跡以檢測這些蛋白。該抗M蛋白抗體是剛剛制備的多克隆抗體，是從用下述三種合成多肽所免疫的兔子的血清制備的相應(yīng)于SeV M蛋白1-13位氨基酸(MADIYRFPKFSYE+Cys/SEQ ID NO14)，23-35位氨基酸(LRTGPDKKAIPH+Cys/SEQ ID NO15)，和336-348位氨基酸(Cys+NVVAKNIGRIRKL/SEQ ID NO16)。根據(jù)實(shí)施例3所述方法進(jìn)行Western印跡，其中作為一抗的抗M蛋白抗體以1/4000稀釋度應(yīng)用，作為二抗的與HRP相連的抗兔IgG抗體(抗-兔IgG(山羊)H+L偶聯(lián)物；ICN P.，Aurola，OH)以1/5000稀釋度應(yīng)用。在SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染細(xì)胞的情況中，則M蛋白以類似的程度廣泛表達(dá)，但是病毒蛋白減少(圖7)。Western印跡還證實(shí)了病毒粒子二次釋放降低。
含有溫度敏感型突變的病毒中各基因的表達(dá)水平(SEAP試驗(yàn))SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP二次粒子釋放減少。但是，如果伴隨導(dǎo)入基因的表達(dá)量的同時(shí)減少，那么這種修飾則毫無意義。這樣，就需要評價(jià)基因的表達(dá)水平。用SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝3感染LLC-MK2細(xì)胞，并隨時(shí)間收集培養(yǎng)上清(感染后12，18，24，50和120小時(shí))。使用Reporter AssayKit-SEAP(TOYOBO，Osaka，Japan)，根據(jù)試劑盒的方法，測試上清中SEAP活性。兩種類型的SEAP活性相似(圖8)。還測試了相同樣品中紅細(xì)胞凝集活性(HA活性)。SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP的HA活性降低了大約1/10(圖9)。48000g離心45分鐘收集樣品中病毒蛋白，然后使用抗M抗體通過Western印跡半定量分析。上清中病毒蛋白的水平也有所減少(圖10)。這些發(fā)現(xiàn)表明導(dǎo)入溫度敏感型突變可以將二次粒子釋放降低到約1/10，而對導(dǎo)入基因的表達(dá)量沒有實(shí)際影響。
導(dǎo)入了溫度敏感型突變的病毒的細(xì)胞毒性(LDH試驗(yàn))SeV感染通常具有細(xì)胞毒性。因此從該角度檢查所導(dǎo)入的突變的影響。將LLC-MK2，BEAS-2B和CV-1細(xì)胞以2.5×104細(xì)胞/孔(100μL/孔)的濃度分別涂布于96孔板上，進(jìn)行培養(yǎng)。用含有10％FBS的MEM培養(yǎng)LLC-MK2和CV-1細(xì)胞，用含有10％FBS的D-MEM和RPMI(Gibco-BRL，Rockville，MD)1∶1混合培養(yǎng)基培養(yǎng)BEAS-2B。培養(yǎng)24小時(shí)后，加入5μl/孔用含有1％BSA的MEM稀釋的SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP，進(jìn)行病毒感染。6小時(shí)后，去除含有病毒溶液的培養(yǎng)基，用相應(yīng)的含有或不含有10％FBS的新鮮培養(yǎng)基代替。使用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基時(shí)，在感染3天后取樣培養(yǎng)上清，如果使用含有FBS的培養(yǎng)基時(shí)，則在感染6天后取樣。使用Cytotoxicity Detection Kit(Roche，Basel，Switzerland)，根據(jù)試劑盒的說明分析細(xì)胞毒性。在LLC-MK2中，上述病毒載體均無細(xì)胞毒性。另外，測定出SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP在CV-1和BEAS-2B(圖11)中的細(xì)胞毒性與SeV18+/ΔF-GFP相當(dāng)或比其更低。這樣，認(rèn)為通過導(dǎo)入溫度敏感型突變抑制二次粒子釋放不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。
研究二次粒子釋放的抑制作用機(jī)制為說明通過導(dǎo)入溫度敏感型突變來抑制二次粒子釋放的部分機(jī)制，測定M蛋白的亞細(xì)胞定位。用各種類型SeV(SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP，SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP)感染LLC-MK2細(xì)胞，并在32℃，37℃或38℃培養(yǎng)2天。細(xì)胞用抗M抗體免疫染色。如下進(jìn)行免疫染色經(jīng)過培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS清洗1次，加入冷卻到-20℃的甲醇，然后4℃下固定細(xì)胞15分鐘。用PBS清洗細(xì)胞3次后，使用含有2％山羊血清和0.1％Triton的PBS溶液在室溫封閉1小時(shí)。再用PBS清洗3次后，使細(xì)胞與含有2％山羊血清的一抗溶液(10μg/ml抗M抗體)在37℃反應(yīng)30分鐘。PBS清洗3次后，使細(xì)胞與含有2％山羊血清的二抗溶液(10μg/mlAlexa Fluor 488山羊抗兔IgG(H+L)偶聯(lián)物Molecular Probes，Eugene，OR)在37℃反應(yīng)15分鐘。最后，細(xì)胞PBS再次清洗3次后，在熒光顯微鏡下觀察。如果是含有F和HN蛋白的自主復(fù)制型SeV18+GFP，可在所有測試溫度均觀察到細(xì)胞表面的M蛋白濃縮(圖12)。這種M蛋白濃縮情況已被報(bào)告過(Yoshida，T.et al.，Virology 71143-161(1976))，并被認(rèn)為是反映了病毒粒子形成的位置。具體地，使用SeV18+GFP時(shí)，細(xì)胞表面的M蛋白定位似乎在所有溫度均正常，表明形成了足夠數(shù)量的病毒粒子。相反，使用SeV18+/ΔF-GFP時(shí)，M蛋白的濃縮在38℃下大為減少。認(rèn)為M蛋白定位于細(xì)胞表面，與F和HN蛋白的細(xì)胞內(nèi)尾部結(jié)合(Sanderson，C.M.et al.，J.Virology 6869-76(1994)，Ali，A.et al.，Virology276289-303(2000))。由于這兩種蛋白中的一種，即F蛋白，在SeV18+/ΔF-GFP中缺失，因此認(rèn)為F蛋白的缺陷可以影響M蛋白定位。這種影響預(yù)期對于SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP而言更為強(qiáng)烈，還預(yù)期甚至在37℃下，M蛋白的定位也會(huì)被破壞，并且二次釋放中的粒子數(shù)會(huì)減少。
研究二次粒子釋放的抑制作用機(jī)制(2)為更詳細(xì)地研究SeV蛋白亞細(xì)胞定位，使用共焦激光顯微鏡(MRC1024；Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA)進(jìn)行分析。用SeV18+SEAP/ΔF-GFP和SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP(MOI＝1)分別感染A-10細(xì)胞(大鼠成肌細(xì)胞)，并在32℃或37℃，在含有10％血清的MEM中培養(yǎng)。1或2天后，細(xì)胞用抗M抗體和抗HN抗體免疫染色。如下進(jìn)行免疫染色已被感染的培養(yǎng)細(xì)胞用PBS清洗1次，加入已冷卻到-20℃的甲醇，然后4℃下固定細(xì)胞15分鐘。用PBS清洗細(xì)胞3次后，使用含有2％山羊血清，1％BSA和0.1％Triton的PBS溶液在室溫封閉1小時(shí)。使細(xì)胞與含有2％山羊血清的一抗溶液(1μg/ml抗M抗體)在37℃反應(yīng)30分鐘。然后再使細(xì)胞與HN一抗溶液(10μg/ml抗HN抗體(IL4-1))在37℃反應(yīng)30分鐘。PBS清洗3次后，使細(xì)胞與含有2％山羊血清的二抗溶液(10μg/mL Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG(H+L)偶聯(lián)物和10μg/mL Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)偶聯(lián)物Molecular Probes，Eugene，OR)在37℃反應(yīng)15分鐘。細(xì)胞用PBS再清洗3次，核用稀釋4000倍的TO_PRO3(Molecular Probes，Eugene，OR)染色。使細(xì)胞室溫靜置15分鐘。最后，為防止淬火，使用Slow Fade Antifade Kit溶液(Molecular Probes，Eugene，OR)代替該液體，在共焦激光顯微鏡下觀察細(xì)胞。圖13顯示感染1天后的結(jié)果。紅色代表M蛋白定位；綠色為HN蛋白定位；黃色代表這兩種蛋白的共同定位。遠(yuǎn)處的紅色發(fā)生了顏色轉(zhuǎn)換，因此藍(lán)色代表核。如果使用SeV18+SEAP/ΔF-GFP，在32和37℃這兩種蛋白的定位模式?jīng)]有太大區(qū)別，并且在細(xì)胞表面上觀察到了M蛋白和HN蛋白的定位。相反，使用SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP時(shí)，這兩種溫度每種蛋白的定位均與使用SeV18+SEAP/ΔF-GFP的情況不同，幾乎沒有什么M蛋白定位在細(xì)胞表面。特別是37℃下，M蛋白和HN蛋白幾乎被徹底分離，這樣M蛋白就定位于假定靠近微管中心體的位點(diǎn)上(即，靠近高爾基體)。感染后培養(yǎng)2天的細(xì)胞也獲得了類似的結(jié)果。特別是在SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP感染細(xì)胞中，M蛋白亞細(xì)胞定位在感染后1天和2天之間并沒有區(qū)別(圖14)，蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)似乎停止了。這些結(jié)果還表明由于M蛋白定位(預(yù)計(jì)這是粒子形成的一個(gè)關(guān)鍵因素)的缺陷，導(dǎo)致帶有溫度敏感型突變的病毒粒子的二次釋放減少。
細(xì)胞用SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP感染后在32℃培養(yǎng)時(shí)，染色的M蛋白的形態(tài)與微管類似(圖13)。為證實(shí)微管的參與，加入了可以促進(jìn)微管解聚的試劑，然后研究M蛋白(以及HN蛋白)定位上的改變。用MOI＝1的SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP感染A-10細(xì)胞，立即加入微管解聚劑秋水仙素(Nakarai Tesque，Kyoto，Japan)或秋水仙酰胺(NakaraiTesque，Kyoto，Japan)，使終濃度為1mM。然后在32℃培養(yǎng)細(xì)胞。感染2天后，以上述方法觀察M和HN的亞細(xì)胞定位。當(dāng)解聚劑不存在時(shí)，M蛋白分布的形狀與微管類似(圖13)。但是，加入解聚劑使得該結(jié)構(gòu)被破壞，并測出M蛋白為大型纖維結(jié)構(gòu)(圖15)。該結(jié)構(gòu)可能是M蛋白本身的聚集體，或者是M蛋白與殘余的已解聚的微管結(jié)合。不論何種情況，如圖13所示，有理由判斷用SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP感染后在32℃培養(yǎng)的細(xì)胞中M蛋白定位于微管中。
為證實(shí)上述M蛋白在微管中的定位究竟是否屬于溫度敏感型病毒的特性，使用兩種病毒SeV18+/ΔF-GFP和SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP測評了微管解聚劑(秋水仙素)對于M蛋白(和HN蛋白)定位的感染后影響。用MOI＝1的SeV18+/ΔF-GFP和SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染A-10細(xì)胞，然后立即加入微管解聚劑秋水仙素，使終濃度為1μM。然后在32℃或37℃培養(yǎng)細(xì)胞。感染2天后，以上述方法觀察M蛋白(和HN蛋白)的亞細(xì)胞定位。結(jié)果如圖16所示。兩種病毒所感染的細(xì)胞顯示出類似的特征。具體而言，感染后在32℃培養(yǎng)時(shí)，觀察到M蛋白為大型纖維結(jié)構(gòu)，與圖15中的類似。SeV18+/ΔF-GFP也提示出M蛋白與微管的共存。特別地，SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染細(xì)胞在37℃培養(yǎng)時(shí)，觀察到M蛋白定位在預(yù)想的高爾基體臨近區(qū)域。
根據(jù)以上結(jié)果，可以得到如下結(jié)論M蛋白在高爾基體附近被合成；它沿微管在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)(例如與動(dòng)力蛋白如驅(qū)動(dòng)蛋白結(jié)合)，主要與F和HN蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的尾巴結(jié)合(Sanderson，C.M.et al.，J.Virology 6869-76(1994)；Ali，A.et al.，Virology 276289-303(2000))；并且M蛋白定位于細(xì)胞表面，隨后粒子形成。在含有溫度敏感型突變的病毒中，32℃時(shí)，包括沿著微管進(jìn)行的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等運(yùn)作都很正常。但是，從微管向細(xì)胞表面進(jìn)行的轉(zhuǎn)運(yùn)則被阻斷，導(dǎo)致沿微管定位。在37℃時(shí)可以假定，即便是沿著微管進(jìn)行的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)也被抑制，這樣，就觀察到高爾基體附近的定位。有觀點(diǎn)認(rèn)為M蛋白的合成發(fā)生在高爾基體附近。但是，有可能在這些位點(diǎn)上所觀察到的是M蛋白的凝集，而其本身的合成地點(diǎn)則另有其地。不過，已有報(bào)告表明微管的一種組分，微管蛋白，能夠激活并參與SeV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制(Moyer，S.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.835405-5409(1986)；以及Ogino，T.et al.，J.Biol.Chem.27435999-36008(1999))。另外，由于高爾基體位于中心體附近，預(yù)期微管蛋白在該處數(shù)量較大，因此高爾基體可能在靠近微管中心體(即靠近高爾基體)的區(qū)域合成。此外，盡管SeV突變株F1-R含有M基因突變，它在感染細(xì)胞后改變了微管，這種改變使得粒子的形成不依賴于F1-R株的細(xì)胞極性(Tashiro，M.et al.，J.Virol.67，5902-5910(1993))。換言之，本實(shí)施例所獲結(jié)果還可被解釋為可以認(rèn)定M蛋白沿著微管在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。在該設(shè)想機(jī)制中，M和HN基因中導(dǎo)入溫度敏感型突變會(huì)引發(fā)M蛋白亞細(xì)胞定位的缺陷，導(dǎo)致二次粒子釋放減少。
構(gòu)建帶有P和L基因突變的F缺陷型SeV基因組cDNA為通過進(jìn)一步向F缺陷型SeV載體中導(dǎo)入突變從而抑制二次粒子釋放(并減少細(xì)胞毒性)，在具有持續(xù)感染性的SeV中鑒定的基因結(jié)構(gòu)(Bossow，S.et al.，Negative Strand Viruses.p.157(2000))基礎(chǔ)上，進(jìn)行一些修飾。具體設(shè)計(jì)按下述進(jìn)行通過分析上述帶有持續(xù)感染性的SeV而鑒定每種模式。向P基因(在這兩種模式中不同)的一個(gè)位點(diǎn)和L基因(在這兩種模式中相同)的兩個(gè)位點(diǎn)上導(dǎo)入突變，這兩種模式為P(E86K)和L(N1197S/K1795E)；以及P(L511F)和L(N1197S/K1795E)。經(jīng)鑒定含有這些突變的突變株已經(jīng)被報(bào)告具有降低的轉(zhuǎn)錄活性(為對照的1/4-1/8)和降低的復(fù)制活性(為對照的1/2-1/3)，并且還報(bào)告病毒釋放也減少(至約1％)(Bossow，S.et al.，Negative Strand Viruses.p.157(2000))。
圖17顯示了突變導(dǎo)入過程。使用SalI和NheI消化在F缺陷位點(diǎn)帶有GFP基因的F缺陷型全長仙臺(tái)病毒基因組cDNA(pSeV18+/ΔF-GFP；Li，H.-O.et al.，J.Virology 746564-6569(2000)；WO00/70070)。收集含有NP基因的片段(8294bp)，使用合成寡DNA引入多克隆位點(diǎn)(pSeV/ΔSalINheIfrg-MCS構(gòu)建體)。用于引入多克隆位點(diǎn)的合成寡核苷酸序列為5′-tcgacaccaggtatttaaattaattaatcgcgag-3′(SEQ ID NO17)和5′-ctagctcgcgattaattaatttaaatacctggtg-3′(SEQ ID NO18)。使用構(gòu)建的pSeV/ΔSalINheIfrg-MCS向L基因引入突變。根據(jù)誘變試劑盒(QuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA))的說明書進(jìn)行導(dǎo)入。用于向L基因?qū)隢1197S突變的合成寡核苷酸為5′-gttctatcttcctgacTCtatagacctggacacgcttac-3′(SEQ ID NO19)和5′-gtaagcgtgtccaggtctataGAgtcaggaagatagaac-3′(SEQ ID NO20)。用于導(dǎo)入K1795E突變的合成寡核苷酸為5′-ctacctattgagccccttagttgacGaAgataaagataggcta-3′(SEQ ID NO21)和5′-tagcctatctttatcTtCgtcaactaaggggctcaataggtag-3′(SEQID NO22)。將含有P基因的片段(8931bp)(該片段是通過用SalI/NheI消化pSeV18+/ΔF-GFP而獲得)與相同的Litmus98位點(diǎn)相連，獲得LitmusSalI/NheIfrg ΔF-GFP，然后將其用于向P基因中引入突變。用于向P基因中引入E86K突變的合成寡核苷酸為5′-caaga taatcgatcaggtAaAgagagtagagtctctgggag-3′(SEQ ID NO23)和5′-ctcccagagactctactctcTtTacctgatcgattatcttg-3′(SEQ ID NO24)。用于引入L511F突變的合成寡核苷酸為5′-ctcaaacgcatcacgtctcTtTccctccaaagagaagc-3′(SEQ ID NO25)和5′-gcttctctttggagggAaAgagacgtgatgcgtttgag-3′(SEQ ID NO26)。導(dǎo)入這些突變后，連接下述片段用SalI/NheI消化帶有單一P基因突變的質(zhì)粒(LitmusSalI/NheIfrgΔF-GFP)所獲的8294bp片段；用SalI/NheI消化帶有兩個(gè)L基因突變的質(zhì)粒(pSeV/ΔSalINheIfrg-MCS)所獲的含L基因的片段(8931bp)。然后構(gòu)建pSeV18+/P86Lmut·ΔF-GFP(其在P基因中帶有E86K突變并在L基因中帶有N1197S/K1795E突變)和pSeV18+/P511Lmut·ΔF-GFP(其在P基因中帶有L511F突變并在L基因中帶有N1197S/K1795E突變)。這些質(zhì)粒被統(tǒng)稱為pSeV18+/PLmut·ΔF-GFP。
另外，為定量導(dǎo)入基因的表達(dá)水平，本發(fā)明人構(gòu)建了含有分泌型堿性磷酸酶(SEAP)基因的cDNA。具體來說，使用NotI切取SEAP片段(1638bp)，該片段含有SEAP基因下游的終止信號(hào)-間插序列-起始信號(hào)(WO00/70070)。將該片段插入pSeV18+/P86Lmut·ΔF-GFP和pSeV18+/P511Lmut·ΔF-GFP中第18位核苷酸上的NotI位點(diǎn)，分別制備得到pSeV18+SEAP/P86Lmut·ΔF-GFP和pSeV18+SEAP/P511Lmut·ΔF-GFP。
F缺陷型SeV的重建和擴(kuò)增，該SeV中P/L處插入了提供持續(xù)感染性的SeV序列根據(jù)Li等所述方法(Li，H.-O.et al.，J.Virology 746564-6569(2000)，WO00/70070)，進(jìn)行病毒重建。具體而言，其方法與本說明書實(shí)施例2中所述相同。該方法制備的病毒溶液的滴度為SeV18+/P86Lmut·ΔF-GFP為4.0×108GFP-CIU/ml；SeV18+/P511Lmut·ΔF-GFP為2.8×108GFP-CIU/ml；SeV18+SEAP/P86Lmut·ΔF-GFP為3.7×108GFP-CIU/ml；SeV18+SEAP/P511Lmut·ΔF-GFP為2.0×108GFP-CIU/ml(GFP-CIU已在WO00/70070中定義)。
定量F缺陷型SeV的二次釋放粒子，所述SeV中P/L處插入了提供持續(xù)感染性的SeV序列使用感染細(xì)胞的培養(yǎng)物上清，通過測定HA活性，定量二次釋放的粒子。為了進(jìn)行對比，同時(shí)還測定了SeV18+/ΔF-GFP二次釋放粒子。該實(shí)驗(yàn)已在上面的實(shí)施例4中詳細(xì)描述。簡言之，在6孔板上培養(yǎng)LLC-MK2細(xì)胞直至融匯，將100μl 1×107CIU/ml(MOI＝1)或5×107CIU/ml(MOI＝5)的每種病毒溶液加入到每孔中。感染細(xì)胞1小時(shí)。用MEM清洗細(xì)胞后，向各孔中加入1ml不含血清的MEM，然后在37℃培養(yǎng)細(xì)胞。每天取樣。在取樣后立即向每份樣品中加入1ml不含血清的新鮮MEM。培養(yǎng)和取樣隨時(shí)間進(jìn)行。
根據(jù)Kato等的方法(Kato，A.，et al.，Genes Cell 1，569-579(1996))，測定HA活性。具體地，用PBS在圓底96孔板上進(jìn)行病毒液的連續(xù)稀釋，每孔內(nèi)進(jìn)行連續(xù)2倍50μl稀釋。將50μl該溶液與用PBS稀釋到1％的50μl保藏雞血(Cosmo Bio，Tokyo，Japan)混合，然后4℃下靜置1小時(shí)。檢測紅細(xì)胞凝集，凝集樣品中形成凝集的最高病毒稀釋度判定為HA活性。
MOI＝1和MOI＝5的這兩種感染中，用P和L中插入了持續(xù)感染性SeV序列的載體所感染的細(xì)胞中二次釋放粒子水平稍微減少(圖18)。這樣就認(rèn)為將突變引入P和L基因會(huì)導(dǎo)致二次釋放的粒子的形成稍微減少。但是抑制的程度并不明顯。特有地，在感染后期，在SeV18+/ΔF-GFP感染細(xì)胞中，二次釋放的粒子水平逐步減少，而這種減少在SeV18+/P86Lmut·ΔF-GFP-和SeV18+/P511Lmut·ΔF-GFP-感染細(xì)胞中并不存在。這些結(jié)果顯示向P和L基因中引入突變會(huì)減少細(xì)胞毒性，使得SeV載體即使在感染后期仍可被轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，從而維持二次釋放粒子的形成。
在P/L處插入了持續(xù)感染性SeV序列的F缺陷型SeV的細(xì)胞毒性明顯的SeV感染依賴性細(xì)胞毒性在CV-1細(xì)胞中可以觀察到，并可使用這些細(xì)胞進(jìn)行測評。使用P/L處未引入突變的F缺陷型SeV(SeV18+/ΔF-GFP)作為對照。實(shí)驗(yàn)方法在實(shí)施例6中詳細(xì)描述。簡言之，將CV-1細(xì)胞以2.5×104細(xì)胞/孔的濃度接種于96孔板上(100μL/孔)，進(jìn)行培養(yǎng)。用含有10％FBS的MEM培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，加入5μl/孔用含有1％BSA的MEM稀釋的SeV18+/ΔF-GFP，SeV18+/P86Lmut·ΔF-GFP或SeV18+/P511Lmut·ΔF-GFP，進(jìn)行細(xì)胞感染。6小時(shí)后，去除含有病毒溶液的培養(yǎng)基，并用不含F(xiàn)BS的新鮮MEM代替。感染3天后，取樣培養(yǎng)物上清，使用Cytotoxicity Detection Kit(Roche，Basel，Switzerland)，根據(jù)試劑盒的說明，定量細(xì)胞毒性。與SeV18+/ΔF-GFP相比，SeV18+/P86Lmut·ΔF-GFP和SeV18+/P511Lmut·ΔF-GFP都顯示細(xì)胞毒性顯著減少(圖19)。
在同樣的試驗(yàn)中，以一定的時(shí)間間隔計(jì)數(shù)GFP陽性細(xì)胞。該陽性細(xì)胞數(shù)目在被P和L處插入了持續(xù)感染性SeV序列的兩種載體中任一種感染的CV-1細(xì)胞中均維持不變(圖20)。CV-1細(xì)胞對SeV感染依賴性細(xì)胞毒性很敏感，而被感染的細(xì)胞很容易脫落。用P和L處插入了持續(xù)感染性SeV序列的載體所感染的細(xì)胞可以被良好地維持，這有力地支持了這種暗示這些載體降低了細(xì)胞毒性。
圖21顯示同樣感染(MOI＝10)的CV-1細(xì)胞在感染3和6天后的熒光顯微照片。被P和L處插入了持續(xù)感染性SeV序列的載體所感染的細(xì)胞的數(shù)目很大，目視還證實(shí)了良好狀態(tài)。SeV18+/P511Lmut·ΔF-GFP-感染的CV-1細(xì)胞的增殖特別明顯。這些結(jié)果說明向P和L中引入持續(xù)感染性SeV序列可以有效地減弱SeV感染依賴性細(xì)胞毒性。
定量P/L中插入了持續(xù)感染性SeV序列的F缺陷型SeV所攜帶基因的表達(dá)水平SeV18+/P86Lmut·ΔF-GFP和SeV18+/P511Lmut·ΔF-GFP減少二次釋放粒子以及減少細(xì)胞毒性的能力可能是歸因于初始鑒定的突變中轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的減少(據(jù)報(bào)道分別減少了1/4到1/8，以及1/2到1/3Bossow，S.et al.，Negative Strand Viruses 2000，p.157)。這樣，減少的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制同時(shí)可能導(dǎo)致導(dǎo)入基因的表達(dá)量減少。這種減少量如果很大，SeV載體的優(yōu)勢特性則可能消失。相應(yīng)地，P/L中插入了持續(xù)感染性SeV序列的SeV載體還在+18位點(diǎn)處導(dǎo)入了SEAP基因，并隨時(shí)間測定SEAP在感染細(xì)胞中的表達(dá)水平。
實(shí)驗(yàn)方法在實(shí)施例5中詳細(xì)描述。簡言之，LLC-MK2細(xì)胞用MOI＝10的SeV18+SEAP/ΔF-GFP，SeV18+SEAP/P86Lmut·ΔF-GFP或SeV18+SEAP/P511Lmut·ΔF-GFP感染，并隨后取樣培養(yǎng)物上清(每24小時(shí))。使用Reporter Assay Kit-SEAP(Toyobo Co.，Ltd.，Osaka，Japan)，根據(jù)試劑盒的說明書，測定SEAP活性。所有載體中SEAP的活性水平基本相同(圖22)。因此，實(shí)際上表達(dá)水平?jīng)]有減少，甚至使用P/L中插入了持續(xù)感染性SeV序列的載體也是如此。
再用含有SEAP基因的各種載體定量來自感染細(xì)胞的二次釋放粒子，以及定量細(xì)胞培養(yǎng)物上清中的LDH作為細(xì)胞毒性指標(biāo)。導(dǎo)入的SEAP基因的效果在二次釋放粒子的水平上得以明顯體現(xiàn)。具體而言，該水平在P/L中插入了持續(xù)感染性SeV序列的兩種載體中被降低至約1/10(圖23)。根據(jù)判斷，P/L的導(dǎo)入突變效果反映了更滿意的結(jié)果。在P/L中插入了持續(xù)感染性SeV序列的兩種載體中以及不含SEAP基因的載體中觀察到了類似的細(xì)胞毒性減少(圖24)。
構(gòu)建同時(shí)含有溫度敏感型突變和P/L突變的F缺陷型SeV基因組cDNA將M蛋白和HN蛋白中引入溫度敏感型突變與在P蛋白和L蛋白中引入SeV來源的持續(xù)感染性序列進(jìn)行組合，組合后對二次釋放粒子(以及細(xì)胞毒性)的效果可能比單個(gè)突變的更大。相應(yīng)地，構(gòu)建兩種F缺陷型SeV載體(圖25SeV18+/MtsHNtsP86Lmut·ΔF-GFP，SeV18+/MtsHNtsP511Lmut·ΔF-GFP)。這些載體總共含有9種突變，其中6種為溫度敏感型突變(MG69E，T116A和A183S；以及HNA262T，G264R和K461G)，三種為SeV來源的持續(xù)感染性突變(PE86K或L511F；以及LN1197S和K1795E)。
圖26顯示了突變導(dǎo)入過程。用SalI和NheI消化含有溫度敏感型突變的F-缺陷型仙臺(tái)病毒基因組cDNA(pSeV18+/MtsHNts ΔF-GFP參見實(shí)施例1)，并在與Litmus38相同的位點(diǎn)與含有P基因的片段(8931bp)相連。這樣獲得了隨后將使用的LitmusSalI/NheIfrg MtsHNts·ΔF-GFP。根據(jù)實(shí)施例1描述的方法，使用合成寡核苷酸向P基因中引入E86K突變，所述寡核苷酸包含下述序列5′-caagataatcgatcaggtAaAgagagtagagtctctgggag-3′/SEQ ID No23；和5′-ctcccagagactctactctcTtTacctgatcgattatcttg-3′/SEQ ID No24。使用合成寡核苷酸引入L511F突變，所述寡核苷酸包含下述序列5′-ctcaaacgcatcacgtctcTtTccctccaaagagaagc-3′/SEQID No25；和5′-gcttctctttggagggAaAgagacgtgatgcgtttgag-3′/SEQ ID No26。引入這些突變后，用SalI/NheI消化這些各自含有一個(gè)P基因突變的質(zhì)粒(LitmusSalI/NheIfrg MtsHNts ΔF-GFP)。將所獲的8294bp片段與帶有L基因的片段(8931bp)相連，后一種片段是用SalI/NheI消化在L基因中含有2個(gè)突變的質(zhì)粒(pSeV/ΔSalINheIfrg-MCS)(該質(zhì)粒在實(shí)施例1中構(gòu)建)后收集所獲。最后，構(gòu)建pSeV18+/MtsHNtsP86Lmut·ΔF-GFP(含有溫度敏感型突變以及P(E86K)和L(N1197S/K1795E)突變)和pSeV18+/MtsHNts P511Lmut·ΔF-GFP(含有溫度敏感型突變和P(L511F)和L(N1197S/K1795E)突變)(通常稱為pSeV18+/MtsHNtsPLmutΔF-GFP)。
構(gòu)建含有SEPA的cDNA以測定導(dǎo)入基因的表達(dá)水平。具體而言，使用NotI切取一段1638bp的SEAP片段，該片段含有SEAP基因下游的終止信號(hào)-間插序列-起始信號(hào)(WO00/70070)。將該片段整合到pSeV18+/MtsHNts P86Lmut·ΔF-GFP和pSeV18+/MtsHNts P511Lmut·ΔF-GFP中+18位的NotI位點(diǎn)，然后將其分別命名為pSeV18+SEAP/MtsHNts P86Lmut·ΔF-GFP和pSeV18+SEAP/MtsHNts P511Lmut·ΔF-GFP。
重建和擴(kuò)增同時(shí)含有溫度敏感型突變和P/L突變的F缺陷型SeV根據(jù)Li等的方法重建病毒(Li，H.-O.et al.，J.Virology 74，6564-6569(2000)，WO00/70070)，該方法已在本說明書實(shí)施例2中詳細(xì)描述。該方法制備的各病毒溶液的滴度如下SeV18+/MtsHNts P86Lmut·ΔF-GFP為8.6×108GFP-CIU/ml；SeV18+/MtsHNts P511Lmut·ΔF-GFP為4.2×108GFP-CIU/mL；SeV18+SEAP/MtsHNts P86Lmut·ΔF-GFP為1.7×108GFP-CIU/mL；以及SeV18+SEAP/MtsHNts P511Lmut·ΔF-GFP為1.7×108GFP-CIU/mL(GFP-CIU已在WO00/70070中描述)。
定量同時(shí)含有溫度敏感型突變和P/L突變的F缺陷型SeV的二次釋放粒子使用被感染的細(xì)胞的培養(yǎng)上清，通過測定HA活性來定量二次釋放粒子。同時(shí)還測定了SeV18+/ΔF-GFP的二次釋放粒子。實(shí)驗(yàn)方法已在上面的實(shí)施例4和實(shí)施例11中詳細(xì)描述。簡言之，在6孔板上培養(yǎng)LLC-MK2細(xì)胞直至融匯，將1×107CIU/ml或3×107CIU/ml的每種病毒(MOI＝3)溶液加入到每孔中(100μl/孔)。感染細(xì)胞1小時(shí)。用MEM清洗細(xì)胞后，向各孔中加入1ml不含血清的MEM，然后在37℃培養(yǎng)細(xì)胞。每天取樣，并在取樣后立即向樣品中加入1ml不含血清的新鮮MEM。培養(yǎng)和取樣隨時(shí)間進(jìn)行。
根據(jù)Kato等的方法(Kato，A.，et al.，Genes Cell 1，569-579(1996))，測定HA活性。也就是，用PBS在圓底96孔板上進(jìn)行連續(xù)稀釋，每孔內(nèi)進(jìn)行連續(xù)2倍50μl稀釋。將50μl該溶液與用PBS稀釋到1％的50μl保藏雞血(Cosmo Bio，Tokyo，Japan)混合，然后4℃下靜置1小時(shí)。檢測紅細(xì)胞凝集，凝集樣品中形成凝集的最高病毒稀釋度判定為HA活性。
當(dāng)與感染了非突變F缺陷SeV(SeV18+/ΔF-GFP)(MOI＝1和MOI＝3)的細(xì)胞相比時(shí)，用同時(shí)含有溫度敏感型突變和P/L突變的F缺陷SeV感染的細(xì)胞中，二次釋放粒子的水平有所降低(圖27)。與不帶有P/L突變的SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP相比，SeV18+/MtsHNts P511Lmut·ΔF-GFP的二次釋放粒子尤其減少，這說明引入P/L突變可以產(chǎn)生相加效應(yīng)。但是，與SeV18+/MtsHNts ΔF-GFP相比，SeV18+/MtsHNts P86Lmut·ΔF-GFP則顯示出二次釋放粒子水平有增加。這表示沒有相加效應(yīng)。從二次釋放粒子減少的角度而言，認(rèn)為SeV18+/MtsHNts P511Lmut·ΔF-GFP尤為突出。
同時(shí)含有溫度敏感型突變和P/L突變的F缺陷SeV的細(xì)胞毒性使用CV-1細(xì)胞測評細(xì)胞毒性。所用對照為不帶有P/L突變的F缺陷SeV(SeV18+/ΔF-GFP)；以及兩種類型SeV，一種僅帶有溫度敏感型突變(SeV18+/MtsHNts ΔF-GFP)，而另一種則僅帶有P/L突變(SeV18+/P511Lmut·ΔF-GFP，SeV18+/P86Lmut·ΔF-GFP)。實(shí)驗(yàn)方法已在實(shí)施例6和實(shí)施例12中詳細(xì)描述。簡言之，將CV-1細(xì)胞以2.5×104細(xì)胞/孔的濃度接種于96孔板(100μL/孔)上，進(jìn)行培養(yǎng)。用含有10％FBS的MEM培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，加入5μl/孔用含有1％BSA的MEM稀釋的SeV18+/ΔF-GFP，SeV18+/MtsHNts P86Lmut·ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNts P511Lmut·ΔF-GFP，進(jìn)行細(xì)胞感染。6小時(shí)后，去除含有病毒溶液的培養(yǎng)基，并用不含F(xiàn)BS的新鮮MEM代替。感染3天后，取樣培養(yǎng)物上清，使用Cytotoxicity Detection Kit(Roche，Basel，Switzerland)，根據(jù)試劑盒的說明，定量細(xì)胞毒性。導(dǎo)入溫度敏感型突變(在SeV18+/MtsHNts·ΔF-GFP中)在一定程度上減少了細(xì)胞毒性，而導(dǎo)入P/L突變(在SeV18+/P86Lmut·ΔF-GFP和SeV18+/P511Lmut·ΔF-GFP中)也導(dǎo)致了類似的細(xì)胞毒性減少。二者的結(jié)合(在SeV18+/MtsHNtsP86Lmut·ΔF-GFP和SeV18+/MtsHNts P511Lmut·ΔF-GFP中)產(chǎn)生了相加效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞毒性明顯降低(圖28)。
定量同時(shí)含有溫度敏感型突變和P/L突變的F缺陷SeV中所含基因的表達(dá)水平將SEPA導(dǎo)入SeV18+/MtsHNts P86Lmut·ΔF-GFP和SeV18+/MtsHNts P511Lmut·ΔF-GFP中+18位點(diǎn)，隨時(shí)間測定感染細(xì)胞中SEAP的表達(dá)水平。
實(shí)驗(yàn)方法已在實(shí)施例5和1 3中詳細(xì)描述。簡言之，用MOI＝1或MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP，SeV18+SEAP/MtsHNts P86Lmut·ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNts P511Lmut·ΔF-GFP感染LLC-MK2細(xì)胞，并隨時(shí)間取樣培養(yǎng)物上清(每24小時(shí))。使用Reporter AssayKit-SEAP(Toyobo Co.，Ltd.，Osaka，Japan)，根據(jù)試劑盒的說明書，測定SEAP活性。觀察到在感染初期表達(dá)水平有輕微降低，但在所有載體中SEAP的活性水平基本相同(圖29)。因此判斷，表達(dá)水平?jīng)]有減少，甚至使用同時(shí)帶有溫度敏感型突變和P/L突變的載體也是如此。
使用含有SEAP基因的每種載體，定量感染細(xì)胞培養(yǎng)物上清中的LDH，作為細(xì)胞毒性指標(biāo)。與不帶有SEAP基因的載體類似，導(dǎo)入溫度敏感型突變和P/L突變導(dǎo)致細(xì)胞毒性顯著下降(圖30)。
構(gòu)建帶有EGFP基因的M缺陷型SeV的基因組cDNA該構(gòu)建過程使用M基因缺陷的M缺陷型SeV(pSeV18+/ΔMWO00/09700)的全長基因組cDNA。構(gòu)建圖如圖31所示。將含有pSeV18+/ΔM中M缺陷位點(diǎn)的BstEII片段(2098bp)亞克隆到pSE280的BstEII位點(diǎn)(pSE-BstEIIfrg構(gòu)建體)。預(yù)先用SalI/XhoI消化再連接(Invitrogen，Groningen，Netherlands)，去除了pSE280中的EcoRV識(shí)別位點(diǎn)。用Acc65I和EcoRI消化含有GFP基因的pEGFP(TOYOBO，Osaka，Japan)，然后使用DNA blunting Kit(Takara，Kyoto，Japan)將消化物的5’-末端填補(bǔ)為平頭。然后將該平頭片段亞克隆到pSE-BstEIIfrg中，所述pSE-BstEIIfrg已被EcoRV消化并用BAP(TOYOBO，Osaka，Japan)處理。將含有EGFP基因的該BstEII片段返回到起初的pSeV18+/ΔM中，以構(gòu)建M缺陷位點(diǎn)處含有EGFP基因的M基因缺陷型SeV基因組cDNA(pSeV18+/ΔM-GFP)。
構(gòu)建M和F基因缺陷的SeV基因組cDNA下述構(gòu)建如圖32所示。使用pBlueNaeIfrg-ΔFGFP使M基因缺失，所述pBlueNaeIfrg-ΔFGFP的構(gòu)建如下將在F基因缺陷位點(diǎn)處含有EGFP基因的F缺陷型仙臺(tái)病毒全長基因組cDNA(pSeV18+/ΔF-GFPLi，H.-O.et al.，J.Virology 74，6564-6569(2000)，WO00/70070)的NaeI片段(4922bp)亞克隆到pBluescript II(Stratagene，La Jolla，CA)的EcoRV位點(diǎn)。設(shè)計(jì)缺失以便能用緊隨M基因之后的ApaLI位點(diǎn)切除M基因。也就是說，將ApaLI識(shí)別位點(diǎn)插入到P基因之后，這樣就可使被切除的片段為6n。使用QuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA)，根據(jù)試劑盒的方法進(jìn)行誘變。用于誘變的合成寡核苷酸序列為5’-agagtcactgaccaactagatcgtgcacgaggcatcctaccatcctca-3’/SEQ ID NO27和5’-tgaggatggtaggatgcctcgtgcacgatctagttggtcagtgactct-3’/SEQ ID NO28。誘變后，使用ApaLI對所獲的突變cDNA進(jìn)行部分消化(37℃下5分鐘)，使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN，Bothell，WA)回收，然后按其原本狀態(tài)連接。使用QIAquick PCR Purification Kit再次收集DNA，并用BsmI和StuI消化，然后用于轉(zhuǎn)化DH5α，以制備M基因缺陷型(及F基因缺陷型)DNA(pBlueNaeIfrg-ΔMΔFGFP)。
用SalI和ApaLI消化M基因(和F基因)有缺陷的pBlueNaeIfrg-ΔMΔFGFP，收集含有M基因缺陷位點(diǎn)的1480bp片段。用ApaLI/NheI消化pSeV18+/ΔF-GFP，收集含有HN基因的片段(6287bp)，將這兩個(gè)片段亞克隆到Litmus 38(New England Biolabs，Beverly，MA)的SalI/NheI位點(diǎn)(LitmusSalI/NheIfrg-ΔMΔFGFP構(gòu)建體)。用SalI/NheI消化LitmusSalI/NheIfrg-ΔMΔFGFP，收集7767bp片段，并與用SalI/NheI消化pSeV18+/ΔF-GFP后所獲的另一片段(8294bp)相連，所述另一片段并不含M和HN基因。通過這種方法構(gòu)建了在缺陷位點(diǎn)含有EGFP基因的M-和F-缺陷型仙臺(tái)病毒全長基因組cDNA(pSeV18+/ΔMΔF-GFP)。如此構(gòu)建的M缺陷型(及M-和F-缺陷型)病毒的結(jié)構(gòu)如圖33所示。
制備表達(dá)SeV-F和SeV-M蛋白的輔助細(xì)胞為制備表達(dá)M蛋白(以及F蛋白)的輔助細(xì)胞，使用Cre/loxP表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)。該系統(tǒng)使用pCALNdLw質(zhì)粒，該質(zhì)粒被設(shè)計(jì)可以使用Cre DNA重組酶(Arai，T.et al.，J.Virol.721115-1121(1988))誘導(dǎo)表達(dá)基因產(chǎn)物。還使用該系統(tǒng)制備輔助細(xì)胞(LLC-MK2/F7細(xì)胞)以便表達(dá)F蛋白(Li，H.-O.et al.，J.Virology 74，6564-6569(2000)，WO00/70070)。
<1>構(gòu)建M基因表達(dá)質(zhì)粒為制備可誘導(dǎo)F和M蛋白同時(shí)表達(dá)的輔助細(xì)胞，使用上述系統(tǒng)，用前面所述的LLC-MK2/F7細(xì)胞將M基因轉(zhuǎn)移到這些細(xì)胞中。由于F基因轉(zhuǎn)移中所用的pCALNdLw/F含有新霉素抗性基因，必須插入一個(gè)不同的藥物抗性基因以便能使用相同細(xì)胞。因此，按照圖34所述過程，用潮霉素抗性基因取代含有M基因的質(zhì)粒(pCALNdLw/MM基因插入在pCALNdLw的SwaI位點(diǎn))中的新霉素抗性基因。也就是說，用HincII和EcoT22I消化pCALNdLw/M，瓊脂糖電泳分離出含有M基因的片段(4737bp)，切取相應(yīng)的泳帶，并使用QIAEXII Gel Extraction System收集。同時(shí)，用XhoI消化pCALNdLw/M，收集不含有新霉素抗性基因的片段(5941bp)，進(jìn)一步用HincII消化，收集1779bp片段。使用pcDNA3.1hygro(+)(Invitrogen，Groningen，Netherlands)作為模板，利用下述引物組通過PCR制備潮霉素抗性基因hygro-5’(5’-tctcgagtcgctcggtacgatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgag-3’/SEQ IDNO29)和hygro-3’(5’-aatgcatgatcagtaaattacaatgaacatcgaaccccagagtcccgcctattcctttgccctcggacgagtgctggggcgtc-3’)/SEQ ID NO30)。使用QIAquickPCR Purification Kit收集PCR產(chǎn)物，然后用XhoI和EcoT22I消化。將這三種片段相連，構(gòu)建pCALNdLw-hygroM。
<2>克隆可誘導(dǎo)SeV-M(和SeV-F)蛋白表達(dá)的輔助細(xì)胞使用SuperFect Transfection Reagent，根據(jù)Reagent的說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以5×105細(xì)胞/皿的濃度，將LLC-MK2/F7細(xì)胞涂布于60mm直徑的Petri培養(yǎng)皿中。然后在含有10％FBS的D-MEM中培養(yǎng)24小時(shí)。pCALNdLw-hygroM(5μg)用既不含F(xiàn)BS也不含抗生素的D-MEM稀釋(共150μl)。攪拌該混合物。加入30μl SuperFect Transfection Reagent，然后再次攪拌混合物。室溫靜置10分鐘后，加入含有10％FBS的D-MEM(1ml)。攪拌所獲的轉(zhuǎn)染混合物，并加入到已用PBS清洗過一次的LLC-MK2/F7細(xì)胞中。在37℃以及5％CO2的氣氛中培養(yǎng)3小時(shí)，去除轉(zhuǎn)染混合物，用PBS清洗細(xì)胞3次。向細(xì)胞中加入含有10％FBS的D-MEM(5ml)，再培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，使用胰蛋白酶使細(xì)胞脫落，以大約5細(xì)胞/孔的量將細(xì)胞接入96孔板，并在補(bǔ)充有150μg/ml潮霉素(Gibco-BRL，Rockville，MD)且含10％FBS的D-MEM中培養(yǎng)約2周。培養(yǎng)由單個(gè)細(xì)胞繁殖出的克隆，并將其擴(kuò)增到6孔板上。如此制備共130個(gè)克隆，然后按下述進(jìn)行分析。
<3>分析可誘導(dǎo)SeV-M(和SeV-F)蛋白表達(dá)的輔助細(xì)胞克隆使用Western-印跡半定量分析如上所獲的130個(gè)克隆中M蛋白的表達(dá)。將每一克隆接種到6孔板中，當(dāng)接近融匯時(shí)，根據(jù)Saito等的方法(Saito，I.et al.，Nucl.Acid.Res.23，3816-3821(1995)；Arai，T.et al.，J.Virol.72，1115-1121(1998))，用含有5％FBS的MEM稀釋的可表達(dá)CreDNA重組酶的重組腺病毒(AxCANCre)，以MOI＝5感染細(xì)胞。32℃培養(yǎng)2天后，去除培養(yǎng)上清。用PBS洗滌細(xì)胞1次，并使用刮除器收集脫落細(xì)胞。對收集的細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE，每道的加樣量為收集量的1/10。然后根據(jù)實(shí)施例3和4所述方法，使用抗M抗體進(jìn)行Western-印跡。用抗F蛋白抗體經(jīng)Western印跡分析130個(gè)克隆中顯示出相對較高M(jìn)蛋白表達(dá)水平的克隆(f236Segawa，H.et al.，J.Biochem.123，1064-1072(1998))。二者的結(jié)果均如圖35所示。
重建M基因缺陷型SeV病毒結(jié)合實(shí)施例21所述的克隆測評結(jié)果，進(jìn)行M基因缺陷型SeV(SeV18+/ΔM-GFP)的重建。即，向每種克隆中加入SeV18+/ΔM-GFP的P0溶胞液，檢測是否出現(xiàn)GFP蛋白的擴(kuò)散(是否獲得M蛋白的轉(zhuǎn)移供給(trans-supply))。根據(jù)實(shí)施例2所述方法制備P0溶胞液，具體如下將LLC-MK2細(xì)胞以5×106細(xì)胞/皿的量接入100-mm直徑的Petri培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24小時(shí)，然后室溫用MOI＝2的PLWUV-VacT7感染這些細(xì)胞1小時(shí)。以12μg，4μg，2μg，4μg，4μg和4μg/皿的重量比將質(zhì)粒pSeV18+/ΔM-GFP，pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L，pGEM/F-HN和pGEM/M分別懸浮在Opti-MEM中。向懸浮液中加入相應(yīng)于1μgDNA/5μl的SuperFect轉(zhuǎn)染試劑并混合。所獲的混合物于室溫靜置15分鐘，最后加入到3ml含有3％FBS的Opti-MEM中。將該混合物加入細(xì)胞，然后培養(yǎng)。培養(yǎng)5小時(shí)后，細(xì)胞用不含血清的MEM清洗兩次，并在含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，以8.5×106細(xì)胞/皿的濃度，覆蓋LLC-MK2/F7/A，并于37℃下，在含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中進(jìn)一步培養(yǎng)2天。收集細(xì)胞并將沉淀懸浮于2ml/皿Opti-MEM中，通過重復(fù)三次凍融處理，制備P0溶胞液。同時(shí)，將10個(gè)不同克隆接入24孔板。當(dāng)接近匯合時(shí)，用MOI＝5的AxCANCre感染細(xì)胞，并32℃培養(yǎng)2天。這些細(xì)胞用SeV18+/ΔM-GFP的P0溶胞液以200μl/孔的量轉(zhuǎn)染，并在不含血清但含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中32℃培養(yǎng)。在克隆#18和#62中觀察到了由SeV18+/ΔM-GFP引起的GFP擴(kuò)散(圖36)。該擴(kuò)散在克隆#62中尤為迅速，使用該克隆進(jìn)行隨后的試驗(yàn)。后文中，在AxCANCre誘導(dǎo)細(xì)胞之前，這些細(xì)胞被稱為LLC-MK2/F7/M62。誘導(dǎo)后，能夠持續(xù)表達(dá)F和M蛋白的細(xì)胞被稱為LLC-MK2/F7/M62/A。使用LLC-MK2/F7/M62/A細(xì)胞繼續(xù)制備SeV18+/ΔM-GFP細(xì)胞。P2感染6天后，制備出9.5×107GFP-CIU病毒。P4感染5天后，制備出3.7×107GFP-CIU病毒。
據(jù)認(rèn)為在該實(shí)驗(yàn)中，SeV18+/ΔM-GFP病毒的收集在實(shí)施例3所述修飾(如P1階段后32℃培養(yǎng))之后變得有可能。在SeV18+/ΔM-GFP中，認(rèn)為M蛋白從表達(dá)細(xì)胞(LLC-MK2/F7/M62/A)的反式供給(in trans supply)是一個(gè)根源，但是擴(kuò)展極其緩慢，并在P1感染后7天才最終觀察到(圖36)。因此，即使是在病毒重建試驗(yàn)中，也支持“P1階段后32℃培養(yǎng)”對于不能有效轉(zhuǎn)錄-復(fù)制，或者難以形成感染性病毒粒子的SeV重建非常有效。
M基因缺陷型病毒的生產(chǎn)力還測定了該病毒的生產(chǎn)力。將LLC-MK2/F7/M62/A細(xì)胞接入6孔板并37℃培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞接近融匯時(shí)，轉(zhuǎn)到32℃。1天后，用SeV18+/ΔM-GFP(MOI＝0.5)感染這些細(xì)胞。隨時(shí)間收集培養(yǎng)物上清并用新鮮培養(yǎng)基代替。用所獲的上清液進(jìn)行CIU和HAU試驗(yàn)。多數(shù)病毒在感染4-6天后收集(圖37)。感染后HAU可以維持6天或更長，但是細(xì)胞毒性在該時(shí)間點(diǎn)很強(qiáng)，說明起因并不是來自病毒粒子的HA蛋白，而是游離的或與細(xì)胞碎屑結(jié)合的HA蛋白。因此對于病毒的收集而言，應(yīng)該在感染后第5天收集培養(yǎng)物上清。
證實(shí)M基因缺陷型SeV的結(jié)構(gòu)用RT-PCR驗(yàn)證SeV18+/ΔM-GFP的病毒基因，并用Western印跡驗(yàn)證病毒蛋白。RT-PCR中，使用感染后6天的P2階段病毒。使用QIAampViral RNA Mini Kit(QIAGEN，Bothell，WA)從病毒液中收集RNA。使用Thermoscript RT-PCR System(Gibco-BRL，Rockville，MD)制備cDNA。這兩種系統(tǒng)均使用試劑盒說明書方法。利用試劑盒提供的隨機(jī)六聚物作為制備cDNA的引物。為證實(shí)產(chǎn)物來自RNA，在存在或不存在逆轉(zhuǎn)錄酶的條件下進(jìn)行RT-PCR。用上述制備的cDNA作為模板，使用下述引物組進(jìn)行PCR一組是P基因中的F3593(5’-ccaatctaccatcagcatcagc-3’/SEQ IDNO3 1)和F基因中的R4993(5’-ttcccttcatcgactatgacc-3’/SEQ ID NO32)的組合，另一是P基因中的F3208(5’-agagaacaagactaaggctacc-3’/SEQ IDNO33)和R4993組合。如同通過SeV18+/ΔM-GFP基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行的預(yù)測，通過前后兩種組合分別觀察到了1073bp和1458bp DNA的擴(kuò)增(圖38)。當(dāng)省略了逆轉(zhuǎn)錄酶時(shí)(RT-)，不發(fā)生基因擴(kuò)增。當(dāng)插入M基因而不是GFP基因時(shí)(pSeV18+GFP)，分別擴(kuò)增了1400bp和1785bp DNA。這些DNA的大小明顯與上述不同，說明該病毒為M基因缺陷型結(jié)構(gòu)。
使用Western印跡驗(yàn)證蛋白。分別用MOI＝3的SeV18+/ΔM-GFP，SeV18+/ΔF-GFP和SeV18+GFP感染LLC-MK2細(xì)胞，感染3天后收集培養(yǎng)物上清和細(xì)胞。48000g離心上清45分鐘以收集病毒蛋白。SDS-PAGE后，使用抗M蛋白抗體，抗F蛋白抗體和DN-1抗體(兔多克隆)(該抗體主要檢測NP蛋白)，根據(jù)實(shí)施例3和4所述方法，進(jìn)行Western印跡以檢測蛋白。在用SeV18+/ΔM-GFP感染的細(xì)胞中，未檢測到M蛋白但觀察到了F或NP蛋白。因此該病毒也從蛋白角度被證實(shí)具有SeV18+/ΔM-GFP結(jié)構(gòu)(圖39)。在用SeV18+/ΔF-GFP感染的細(xì)胞中未觀察到F蛋白，而用SeV18+GFP感染的細(xì)胞中檢測到了所有病毒蛋白。另外，在用SeV18+/ΔM-GFP感染時(shí)，在培養(yǎng)上清中幾乎未觀察到NP蛋白，說明沒有或幾乎沒有二次釋放的粒子。
M基因缺陷型SeV的二次釋放粒子存在與否的定量分析如實(shí)施例24所述，用MOI＝3的SeV18+/ΔM-GFP感染LLK-MK2細(xì)胞，感染后3天收集培養(yǎng)物上清，通過0.45μm孔徑濾器過濾，然后48000g離心45分鐘，收集病毒蛋白。然后進(jìn)行Western印跡，以便半定量檢測培養(yǎng)物上清中存在的病毒蛋白。將SeV18+/ΔF-GFP感染細(xì)胞的類似制備樣品作為對照。制備每一種樣品的連續(xù)稀釋，使用DN-1抗體(主要識(shí)別NP蛋白)，進(jìn)行Western印跡以檢測蛋白。估測SeV18+/ΔM-GFP感染細(xì)胞培養(yǎng)物上清中的病毒蛋白水平約為SeV18+/ΔF-GFP感染細(xì)胞的約1/100(圖40)。樣品HA活性為SeV18+/ΔF-GFP為64HAU，而SeV18+/ΔM-GFP則低于2HAU。
對同樣的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)程檢測。即，用MOI＝3的SeV18+/ΔM-GFP感染LLC-MK2細(xì)胞，然后隨時(shí)間(每天)收集培養(yǎng)物上清，以測定HA活性(圖41)。感染后4天或更長，檢測到了輕微的HA活性。但是，作為細(xì)胞毒性指標(biāo)的LDH活性的測定則顯示感染后4天或更長時(shí)間的SeV18+/ΔM-GFP感染細(xì)胞中具有明顯細(xì)胞毒性(圖42)。這說明HA活性的提高很可能并非由VLP引起，而是歸因于游離的或與細(xì)胞碎屑結(jié)合的HA蛋白的活性。另外，使用一種陽離子脂質(zhì)體——Dosper LiposomalTransfection Reagent(Roche，Basel，Switzerland)測定感染后5天所獲的培養(yǎng)物上清。將該培養(yǎng)物上清(100μl)與Dosper(12.5μl)混合，室溫靜置10分鐘，然后用其轉(zhuǎn)染6孔板上已培養(yǎng)至融匯的LLC-MK2細(xì)胞。感染2天后在熒光顯微鏡下檢測，結(jié)果顯示在含有二次釋放粒子的SeV18+/ΔF-GFP感染細(xì)胞的培養(yǎng)物上清中發(fā)現(xiàn)許多GFP陽性細(xì)胞，而在SeV18+/ΔM-GFP感染細(xì)胞的上清中卻發(fā)現(xiàn)只有極少量或幾乎沒有GFP陽性細(xì)胞(圖43)。上述結(jié)果表明M蛋白缺陷幾乎徹底抑制了粒子的二次釋放。
重建F和M基因都缺陷的SeV根據(jù)實(shí)施例22中重建SeV18+/ΔM-GFP的方法，重建F和M基因都缺陷的SeV(SeV18+/ΔMΔF-GFP)。也就是說，將LLC-MK2細(xì)胞以5×106細(xì)胞/皿的量接入100-mm直徑的Petri培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24小時(shí)，然后室溫用MOI＝2的PLWUV-VacT7感染這些細(xì)胞1小時(shí)。以12μg，4μg，2μg，4μg，4μg和4μg/皿的重量比將質(zhì)粒pSeV18+/ΔMΔF-GFP，pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L，pGEM/F-HN和pGEM/M分別懸浮在Opti-MEM中。向懸浮液中加入相應(yīng)于1μg DNA/5μl的SuperFect轉(zhuǎn)染試劑并混合。所獲的混合物于室溫靜置15分鐘，然后加入3ml含有3％FBS的Opti-MEM。用不含血清的MEM清洗后，將該混合物加入細(xì)胞，然后培養(yǎng)。培養(yǎng)5小時(shí)后，細(xì)胞用不含血清的MEM清洗兩次，并在含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，以8.5×106細(xì)胞/皿的濃度，覆蓋LLC-MK2/F7/M62/A細(xì)胞，并于37℃下，在含有40μg/mlAraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中進(jìn)一步培養(yǎng)2天。收集細(xì)胞并將沉淀懸浮于2ml/皿Opti-MEM中，通過重復(fù)三次凍融處理，制備P0溶胞液。同時(shí)，將LLC-MK2/F7/M62/A細(xì)胞接入24孔板直至接近匯合，轉(zhuǎn)到32℃培養(yǎng)1天。所獲細(xì)胞用SeV18+/ΔMΔF-GFP的P0溶胞液以200μl/孔轉(zhuǎn)染。并在不含血清但含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中32℃培養(yǎng)。P0時(shí)，可以觀察到良好擴(kuò)散的GFP陽性細(xì)胞。P1時(shí)，也觀察到了擴(kuò)散的GFP陽性細(xì)胞，盡管很不明顯(圖44)。但是，未收集到可檢測滴度的病毒溶液。當(dāng)用SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/ΔM-GFP感染LLC-MK2/F7/M62/A細(xì)胞時(shí)，兩種病毒均檢測到GFP陽性細(xì)胞的順利擴(kuò)展(圖45)。用SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/ΔM-GFP(MOI＝0.5)感染既能表達(dá)F又能表達(dá)M的細(xì)胞(LLC-MK2/F7/M62/A細(xì)胞)。3天和6天后取樣。將樣品與1/6.5體積的7.5％BSA(終濃度＝1％)混合并保藏。通過測定滴度來檢測載體的生產(chǎn)力。結(jié)果顯示，收集的SeV18+/ΔF-GFP病毒溶液為108或更高GFP-CIU/ml，而收集的SeV18+/ΔM-GFP病毒溶液為107或更高GFP-CIU/ml(表1)。因此，這些結(jié)果表明M和F蛋白都可以成功地反式供給。
表1感染后3天 感染后6天SeV18+/ΔF-GFP1.0×1081.7×108SeV18+/ΔM-GFP1.0×1073.6×107GFP-CIU/ml[實(shí)施例27]改進(jìn)表達(dá)SeV-F和M蛋白的輔助細(xì)胞當(dāng)使用M/F-表達(dá)型LLC-MK2/F7/M62/A輔助細(xì)胞時(shí)，不能收集M/F雙缺陷型SeV(SeV18+/ΔMΔF-GFP)病毒粒子。但是F-缺陷型SeV(SeV18+/ΔF-GFP)和M-缺陷型SeV(SeV18+/ΔM-GFP)卻可以重建和制備。因此，作為Cre/loxP表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)的一種基本功能，認(rèn)為完全有可能使用相同的輔助細(xì)胞實(shí)現(xiàn)M和F蛋白的反式供給。所以，判斷Cre/loxP表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)的應(yīng)用是有效的，并認(rèn)為有必要使用該系統(tǒng)進(jìn)一步提高M(jìn)和F蛋白表達(dá)水平，以便能重建M/F雙缺陷型SeV。
<1>構(gòu)建M和F表達(dá)質(zhì)粒為改進(jìn)能夠同時(shí)誘導(dǎo)M和F蛋白表達(dá)的輔助細(xì)胞，使用前述系統(tǒng)，將M和F基因再導(dǎo)入前述LLC-MK2/F7/M62細(xì)胞中(先前制備的)。因?yàn)橛糜趯?dǎo)入F基因的pCALNdLw/F含有新霉素抗性基因，而用于導(dǎo)入M基因的pCALNdLw/hygroM含有潮霉素抗性基因，因此需要導(dǎo)入不同的抗性基因以便能使用這些細(xì)胞。相應(yīng)地，如圖46所示，用zeocin抗性基因取代含F(xiàn)基因的質(zhì)粒中的新霉素抗性基因(pCALNdLw/FM基因?qū)雙CALNdLw的SwaI位點(diǎn))。然后，用SpeI和EcoT22I消化pCALNdLw/F，使用瓊脂糖電泳分離出含有F基因的片段(5477bp)，使用QIAEXII Gel Extraction System切取相關(guān)泳帶并回收。同時(shí)，用XhoI消化pCALNdLw/F，收集不含新霉素抗性基因的片段(6663bp)，然后用SpeI進(jìn)一步酶切，收集1761bp片段。按下述制備zeocin抗性基因使用pcDNA3.1 Zeo(+)(Invitrogen，Groningen，Netherlands)作為模板，用兩種引物zeo-5′(5′-TCTCGAGTCGCTCGGTACGatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcac-3′/SEQ ID No34)；和zeo-3′(5′-AATGCATGATCAGTAAATTACAATGAACATCGAACCCCAGAGTCCCGCtcagtcctgctcctcggccacgaagtgcacgcagttg-3′/SEQ ID NO35)，進(jìn)行PCR。使用QIAquick PCRPurification Kit收集PCR產(chǎn)物，用XhoI和EcoT22I消化。然后連接這三種片段，制備pCALNdLw-zeoF。再使用XhoI片段來重組含有藥物抗性基因的片段，并構(gòu)建出pCALNdLw-zeoM基因。
<2>輔助細(xì)胞的克隆化使用LipofectAMINE PLUS試劑(Invitrogen Corp.，Groningen，Netherlands)，根據(jù)說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。也就是進(jìn)行以下步驟以5×105細(xì)胞/皿的密度，將LLC-MK2/F7/M62細(xì)胞接種于60mm petri皿中，并在含有10％FBS的D-MEM中培養(yǎng)24小時(shí)。用不含F(xiàn)BS和抗生素的D-MEM(總計(jì)242μL)稀釋1μg pCALNdLw-zeoF和1μgpCALNdLw-zeoM(總計(jì)2μg)，攪拌，與8μl LipofectAMINE PLUS試劑混合，再次攪拌，室溫靜置15分鐘。然后，加入12μL預(yù)先用不含F(xiàn)BS和抗生素的D-MEM稀釋的LipofectAMINE試劑(總計(jì)250μL)，將混合物室溫靜置15分鐘。再加入2ml不含F(xiàn)BS和抗生素的D-MEM并攪拌。將該轉(zhuǎn)染混合物加入到已用PBS清洗過一次的LLC-MK2/F7/M62細(xì)胞中。在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)3小時(shí)后，無需去除轉(zhuǎn)染混合物，即可加入2.5ml含有20％FBS的D-MEM。培養(yǎng)24小時(shí)后，用胰蛋白酶使細(xì)胞脫落，以大約5個(gè)細(xì)胞/孔或25個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種96孔板，在含有500μg/mL zeocin(Gibco-BRL，Rockville，MD)并補(bǔ)充有10％FBS的D-MEM中培養(yǎng)約2周。將由單個(gè)細(xì)胞增殖得到的克隆傳代，直到6孔板水平。分析如此制備的共98個(gè)克隆。
通過Western印跡半定量分析所獲98個(gè)克隆中M和F蛋白的表達(dá)水平。將每一克隆分別接種到12孔板，當(dāng)近乎匯合時(shí)，使用Saito等的方法(Saito，I.et al.，Nucl.Acid.Res.23，3816-3821(1995)；and Arai，T.etal.，J.Virol.72，1115-1121(1998))，用已被含有5％FBS的MEM稀釋的Cre DNA重組酶表達(dá)性重組腺病毒(AxCANCre)以MOI＝5感染細(xì)胞。32℃培養(yǎng)2天后，去除培養(yǎng)物上清。PBS清洗細(xì)胞1次，使用細(xì)胞刮除器進(jìn)行刮除以收集細(xì)胞。以1/5體積等分試樣的加樣量給每道加樣，進(jìn)行SDS-PAGE，然后使用抗M抗體和抗F抗體(f236Segawa，H.et al.，J.Biochem.123，1064-1072(1998))進(jìn)行Western印跡。測評的約98個(gè)克隆中，9個(gè)克隆的結(jié)果如圖47所示。
重建M/F雙缺陷型SeV(2)結(jié)合實(shí)施例27的克隆測評結(jié)果，進(jìn)行M/F雙缺陷型SeV(SeV18+/ΔMΔF-GFP)的重建。即，使用P0溶胞液(被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的溶胞液)測評重建M/F雙缺陷型SeV的可能性。P0溶胞液的制備如下，與實(shí)施例2所述方法類似將LLC-MK2細(xì)胞以5×106細(xì)胞/皿的量接入100-mm直徑的Petri培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24小時(shí)，然后室溫用MOI＝2的aPLWUV-VacT7感染這些細(xì)胞1小時(shí)。用不含血清的MEM清洗后，以12μg，4μg，2μg，4μg，4μg和4μg/皿的重量比將質(zhì)粒pSeV18+/ΔMAF-GFP，pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L，pGEM/F-HN和pGEM/M分別懸浮在Opti-MEM中。以5μl/1μgDNA的濃度加入SuperFect轉(zhuǎn)染試劑?；旌蠘悠罚⒂谑覝仂o置15分鐘，最后加入3ml含有3％FBS的Opti-MEM。將該混合物加入細(xì)胞，然后培養(yǎng)5小時(shí)。然后細(xì)胞用不含血清的MEM清洗兩次，并在含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，以8.5×106細(xì)胞/皿的濃度，覆蓋LLC-MK2/F7/A，并于37℃下，在含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中進(jìn)一步培養(yǎng)2天。收集細(xì)胞并將沉淀懸浮于2ml/皿Opti-MEM中，重復(fù)三次凍融，制得P0溶胞液。同時(shí)，將新克隆的細(xì)胞接種到24孔板。當(dāng)接近匯合時(shí)，用MOI＝5的AxCANCre感染細(xì)胞，并32℃培養(yǎng)2天。用SeV18+/ΔMΔF-GFP的P0溶胞液以200μl/孔的量轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞，并在不含血清但含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中32℃培養(yǎng)。被評價(jià)的克隆中有20個(gè)克隆顯示出GFP蛋白擴(kuò)散，并成功地收集到了M/F雙缺陷型SeV。列出了這些克隆中幾種克隆的重建狀況(圖48)。但是，在克隆#33(LLC-MK2/F7/M62/#33)中，在p3階段(第3個(gè)亞培養(yǎng))收集到了108GFP-CIU/mL或更多的感染性病毒粒子。因此，將克隆#33認(rèn)為是最有希望用于生產(chǎn)的細(xì)胞。將M和F基因?qū)隠LC-MK2/F7/M62細(xì)胞后制備的細(xì)胞能夠大量地收集M/F雙缺陷型SeV。這些結(jié)果表明在LLC-MK2/F7/M62細(xì)胞階段的表達(dá)令人十分滿意，M/F蛋白(通過導(dǎo)入M和F基因)被輕微上調(diào)，使得可以收集M/F雙缺陷型SeV。
生產(chǎn)M/F雙缺陷型SeV的能力從是否容易產(chǎn)生的角度檢測該病毒。將LLC-MK2/F7/M62/#33接種到6孔板，37℃培養(yǎng)。當(dāng)接近融合時(shí)，用AxCANCre感染細(xì)胞，MOI＝5(LLC-MK2/F7/M62/#33/A)，并在32℃培養(yǎng)2天。然后用SeV18+/ΔMΔF-GFP感染細(xì)胞，MOI＝0.5，隨時(shí)間收集培養(yǎng)物上清并加入新鮮培養(yǎng)基。檢測收集的上清中的CIU和HAU。感染后2天，持續(xù)收集到108CIU/mL或更多的病毒(圖49)。認(rèn)為病毒的生產(chǎn)是有效的，因?yàn)槌霈F(xiàn)了CIU和HAU的平行變化，并且所產(chǎn)生的大多數(shù)粒子都具有感染性。
M/F雙缺陷型SeV的結(jié)構(gòu)驗(yàn)證用RT-PCR驗(yàn)證SeV18+/ΔMΔF-GFP的病毒基因，并用Western印跡驗(yàn)證病毒蛋白。RT-PCR中，使用感染后5天的P2階段病毒(P2d5)。使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN，Bothell，WA)從病毒溶液中收集RNA。使用SuperScript One-Step RT-PCR System(Gibco-BRL，Rockville，MD)制備cDNA。這兩種系統(tǒng)均使用所附說明書方法進(jìn)行應(yīng)用。cDNA制備性PCR和RT-PCR中使用兩種組合的引物P基因中F3208(5′-agagaacaagactaaggctacc-3′/SEQ ID No33)和GFP基因中的GFP-RV(5′-cagatgaacttcagggtcagcttg-3′/SEQ ID No36)組合；以及該同一F3208和HN基因中R6823(5′-tgggtgaatgagagaatcagc-3′/SEQ ID No37)組合。如同通過SeV18+/ΔMΔF-GFP基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行的預(yù)測，使用前一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增了644bp片段，使用后一對擴(kuò)增了1495bp片段(圖50)。使用SeV18+/ΔM-GFP和SeV18+/ΔF-GFP擴(kuò)增分別獲得了預(yù)期大小的基因，表明與使用SeV18+/ΔMΔF-GFP所獲的相比，大小明顯不同。根據(jù)上述結(jié)果，證明該病毒為M/F雙基因缺陷型結(jié)構(gòu)。
另外，使用Western印跡從蛋白角度驗(yàn)證結(jié)構(gòu)。LLC-MK2細(xì)胞分別用SeV18+/ΔMΔF-GFP，SeV18+/ΔM-GFP，SeV18+/ΔF-GFP和SeV18+GFP以MOI＝3感染，并在感染2天后收集。SDS-PAGE后，使用抗M蛋白抗體，抗F蛋白抗體和DN-1抗體(兔多克隆)(該抗體主要識(shí)別NP蛋白)，進(jìn)行Western印跡。該方法已在實(shí)施例3和4中描述。在SeV18+/ΔMΔF-GFP感染的細(xì)胞中，未檢測到M蛋白或F蛋白，但觀察到NP蛋白。因此從蛋白角度證實(shí)了SeV18+/ΔMΔF-GFP的結(jié)構(gòu)(圖51)。此時(shí)，在用SeV18+/ΔF-GFP感染的細(xì)胞中未觀察到F蛋白，在用SeV18+/ΔM-GFP感染的細(xì)胞中未觀察到M蛋白，而用SeV18+GFP感染的細(xì)胞中檢測到了所有病毒蛋白。
M/F雙缺陷型SeV的二次釋放粒子存在與否的定量分析隨時(shí)間進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。即，用SeV18+/ΔMΔF-GFP(MOI＝3)感染LLK-MK2細(xì)胞，以一定時(shí)間間隔(每24小時(shí))收集培養(yǎng)物上清并檢測HA活性(圖52)。感染4天后檢測HA活性，此時(shí)活性還較低。假定SeV18+/ΔMΔF-GFP的HA活性的提高是歸因于與細(xì)胞碎屑結(jié)合或游離的HA蛋白，而不是VLP。另外，使用一種陽離子脂質(zhì)體——DosperLiposomal Transfection Reagent(Roche，Basel，Switzerland)測定感染后5天所獲的培養(yǎng)物上清。即，將100μl該培養(yǎng)物上清與12.5μl Dosper混合，室溫靜置10分鐘，然后用其轉(zhuǎn)染6孔板上已培養(yǎng)至融匯的LLC-MK2細(xì)胞。2天后在熒光顯微鏡下檢測，結(jié)果顯示在含有二次釋放粒子的SeV18+/ΔF-GFP感染細(xì)胞的培養(yǎng)物上清中發(fā)現(xiàn)許多GFP陽性細(xì)胞，而在SeV18+/ΔMΔF-GFP感染細(xì)胞的上清中卻幾乎沒有發(fā)現(xiàn)GFP陽性細(xì)胞(圖53)?；谏鲜鼋Y(jié)果，可以表明在SeV18+/ΔMΔF-GFP的情況中，幾乎徹底消除了感染細(xì)胞的粒子二次釋放。
評價(jià)M/F雙缺陷型SeV和M缺陷型SeV的病毒感染性(體外)
未分裂細(xì)胞中導(dǎo)入和表達(dá)的效率是評價(jià)基因轉(zhuǎn)移載體性能的一種重要因素。因此，評價(jià)是很必要的。相應(yīng)地，從妊娠17天的大鼠胚胎腦部制備大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞。將這些細(xì)胞作為第一代用于測定未分裂細(xì)胞中的感染性。
按下述制備獲自大鼠大腦皮層的第一代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物在妊娠17天，將乙醚麻醉的妊娠SD大鼠斷頭處死。使用Isodine和80％乙醇消毒腹部，切取子宮并置于10cm petri培養(yǎng)皿內(nèi)，從子宮內(nèi)取出胚胎。然后使用INOX5鑷子剝?nèi)ヅ咛ヮ^皮，打開顱骨，切取大腦置于35mm petri培養(yǎng)皿。使用眼科剪去除小腦和部分腦干，將大腦分成兩個(gè)半球，去除殘留的腦干。使用鉗子夾出嗅球和腦膜。最后，使用眼科剪去除間腦和海馬狀突起，將皮層收集到petri培養(yǎng)皿中，使用外科解剖刀切成小塊，并轉(zhuǎn)移到15mm離心管中。用0.3mg木瓜蛋白酶/ml在37℃處理細(xì)胞10分鐘，然后用5ml含有血清的培養(yǎng)基清洗，切碎。通過70μm濾網(wǎng)后，離心收集細(xì)胞，用吸管輕柔吹吸使其分散。然后計(jì)數(shù)細(xì)胞。將細(xì)胞以2×105或4×105細(xì)胞/孔的密度接種到聚-L-賴氨酸(PLL)-覆蓋的24孔板中，2天后用M/F雙缺陷型SeV(SeV18+/ΔMΔF-GFP)和M-缺陷型SeV(SeV18+/ΔM-GFP)以MOI＝3感染。感染后36小時(shí)，細(xì)胞用神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記MAP2進(jìn)行免疫染色，并在覆蓋的GFP表達(dá)細(xì)胞上鑒定感染細(xì)胞(SeV-感染細(xì)胞)。
按下述進(jìn)行MAP2免疫染色感染細(xì)胞用PBS清洗，用4％多聚甲醛在室溫固定10分鐘，再用PBS清洗，然后用含有2％正常山羊血清的PBS在室溫封閉60分鐘。使細(xì)胞與200倍稀釋的抗MAP2抗體(Sigma，St.Louis，MO)在37℃下反應(yīng)30分鐘，PBS清洗，再與200倍稀釋的二抗(山羊抗小鼠IgG Alexa568Molecular Probes Inc.，Eugene，OR)在37℃反應(yīng)30分鐘。用PBS清洗后，使用熒光顯微鏡(DM IRB-SLRLeica，Wetzlar，Germany)觀察細(xì)胞熒光。
在M/F雙缺陷型SeV(SeV18+/ΔMΔF-GFP)和M缺陷型SeV(SeV18+/ΔM-GFP)中，多數(shù)MAP2-陽性細(xì)胞為GFP陽性(圖54)。也就是說，制備的多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞顯示出有效的SeV感染，因此M/F雙缺陷型SeV和M-缺陷型SeV都被證實(shí)在未分裂細(xì)胞中具有有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)。
評價(jià)M/F雙缺陷型SeV和M缺陷型SeV的病毒感染性(體內(nèi))評價(jià)了體內(nèi)感染性。使用實(shí)體方法(stereo method)對沙鼠左側(cè)腦室施用M/F雙缺陷型SeV(SeV18+/ΔMΔF-GFP)和M-缺陷型SeV(SeV18+/ΔM-GFP)各5μl(1×109p.f.u/ml)，施用后2天處死這些鼠，取出腦部，制備冷凍切片。使用熒光顯微鏡觀察樣品，基于GFP熒光密度來檢測感染。M/F雙缺陷型SeV(SeV18+/ΔMΔF-GFP)和M-缺陷型SeV(SeV18+/ΔM-GFP)在雙側(cè)腦室室管膜細(xì)胞中均導(dǎo)致大量陽性細(xì)胞(圖55)。因此，表明M/F雙缺陷型SeV和M缺陷型SeV都能夠在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)有效的基因?qū)牒捅磉_(dá)。
評價(jià)M/F雙缺陷型SeV和M缺陷型SeV的細(xì)胞毒性使用允許觀察SeV依賴性細(xì)胞毒性的細(xì)胞評價(jià)細(xì)胞毒性，即，使用CV-1細(xì)胞和HeLa細(xì)胞。同時(shí)還測定對照細(xì)胞一種附加型SeV(天然類型SeV18+GFP)(具有復(fù)制能力)和一種F-缺陷型SeV(SeV18+/ΔF-GFP)。實(shí)驗(yàn)方法在實(shí)施例6，12，17中描述。簡言之，將CV-1細(xì)胞或HeLa細(xì)胞以2.5×104細(xì)胞/孔(100μL/孔)的濃度接種于96孔板上，進(jìn)行培養(yǎng)。用含有10％FBS的MEM培養(yǎng)這兩種細(xì)胞。培養(yǎng)24小時(shí)后，加入5μl/孔用含有1％BSA的MEM稀釋的SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP，SeV18+/ΔM-GFP或SeV18+/ΔMΔF-GFP，進(jìn)行細(xì)胞感染。6小時(shí)后，去除含有病毒溶液的培養(yǎng)基，并用不含F(xiàn)BS的新鮮MEM代替。感染3天后，取樣培養(yǎng)物上清，使用Cytotoxicity Detection Kit(Roche，Basel，Switzerland)，根據(jù)試劑盒的說明，定量細(xì)胞毒性。與附加型SeV相比，M基因或F基因的缺失(在SeV18+/ΔF-GFP和SeV18+/ΔM-GFP中)導(dǎo)致細(xì)胞毒性減少，而這兩種缺失的結(jié)合(在SeV18+/ΔMΔF-GFP中)導(dǎo)致相加效應(yīng)，其進(jìn)一步降低了細(xì)胞毒性(圖56)。
如上所述，本發(fā)明首次成功地重建了“M/F雙缺陷型SeV載體”，該載體是一種應(yīng)用廣泛的基因轉(zhuǎn)移載體，能夠感染包括未分裂細(xì)胞在內(nèi)的不同細(xì)胞，幾乎消除了所有的二次釋放粒子，并且細(xì)胞毒性有所減少。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了檢查，篩選及制備粒子形成能力已被降低或消除的(-)鏈RNA病毒的方法。本發(fā)明制備的病毒可作為基因轉(zhuǎn)移載體使用，其對宿主的副作用低，因?yàn)闇p少了細(xì)胞毒性及由基因轉(zhuǎn)移細(xì)胞中二次釋放(VLP釋放)所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。本發(fā)明提供的載體尤其可作為載體在體內(nèi)或回體(ex vivo)基因治療中有廣泛應(yīng)用。
序列表<110>株式會(huì)社載體研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)<120>檢查和制造降低了粒子形成能力的(-)鏈RNA載體的方法<130>D3-A0105Y1P<140>
<141>
<150>JP 2001-283451<151>2001-09-18<150>JP 2001-356336<151>2001-11-21<160>38<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>10<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>1ctttcaccct10<210>2<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>2tttttcttac tacgg 15<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述
<400>3cggccgcaga tcttcacg 18<210>4<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>4gaaacaaaca accaatctag agagcgtatc tgacttgac 39<210>5<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列
<400>5gtcaagtcag atacgctctc tagattggtt gtttgtttc 39<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>6attacggtga ggagggctgt tcgagcagga g 31<210>7<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>7ctcctgctcg aacagccctc ctcaccgtaa t 31
<210>8<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>8ggggcaatca ccatatccaa gatcccaaag acc 33<210>9<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>9ggtctttggg atcttggata tggtgattgc ccc 33
<210>10<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>10catgctctgt ggtgacaacc cggactaggg gttatca 37<210>11<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>11tgataacccc tagtccgggt tgtcaccaca gagcatg 37<210>12<211>41
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>12cttgtctaga ccaggaaatg aagagtgcaa ttggtacaat a41<210>13<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>13tattgtacca attgcactct tcatttcctg gtctagacaa g41<210>14<211>13<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>14Met Ala Asp Ile Tyr Arg Phe Pro Lys Phe Ser Tyr Glu1 5 10<210>15<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>15Leu Arg Thr Gly Pro Asp Lys Lys Ala Ile Pro His1 5 10<210>16<211>13
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>16Asn Val Val Ala Lys Asn Ile Gly Arg Ile Arg Lys Leu1 5 10<210>17<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>17tcgacaccag gtatttaaat taattaatcg cgag34<210>18<211>34
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>18ctagctcgcg attaattaat ttaaatacct ggtg 34<210>19<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>19gttctatctt cctgactcta tagacctgga cacgcttac 39<210>20<211>39<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>20gtaagcgtgt ccaggtctat agagtcagga agatagaac 39<210>21<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>21ctacctattg agccccttag ttgacgaaga taaagatagg cta 43<210>22<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>22tagcctatct ttatcttcgt caactaaggg gctcaatagg tag 43<210>23<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>23caagataatc gatcaggtaa agagagtaga gtctctggga g41<210>24<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列
<400>24ctcccagaga ctctactctc tttacctgat cgattatctt g41<210>25<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>25ctcaaacgca tcacgtctct ttccctccaa agagaagc38<210>26<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>26
gcttctcttt ggagggaaag agacgtgatg cgtttgag 38<210>27<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>27agagtcactg accaactaga tcgtgcacga ggcatcctac catcctca 48<210>28<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>28tgaggatggt aggatgcctc gtgcacgatc tagttggtca gtgactct 48
<210>29<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>29tctcgagtcg ctcggtacga tgaaaaagcc tgaactcacc gcgacgtctg tcgag 55<210>30<211>83<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>30aatgcatgat cagtaaatta caatgaacat cgaaccccag agtcccgcct attcctttgc 60cctcggacga gtgctggggc gtc 83<210>31
<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>31ccaatctacc atcagcatca gc 22<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>32ttcccttcat cgactatgac c 21<210>33<211>22<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>33agagaacaag actaaggcta cc 22<210>34<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>34tctcgagtcg ctcggtacga tggccaagtt gaccagtgcc gttccggtgc tcac 54<210>35<211>85<212>DNA<213>人工序列
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<223>人工序列的描述人工合成序列<400>35aatgcatgat cagtaaatta caatgaacat cgaaccccag agtcccgctc agtcctgctc 60ctcggccacg aagtgcacgc agttg 85<210>36<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>36cagatgaact tcagggtcag cttg24<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成序列<400>37tgggtgaatg agagaatcag c 21<210>38<211>16<212>PRT<213>仙臺(tái)病毒(Sendai virus)<400>38Lys Ala Cys Thr Asp Leu Arg Ile Thr Val Arg Arg Thr Val Arg Ala1 5 10 1權(quán)利要求
1.一種檢查(-)鏈RNA病毒載體的粒子形成能力的方法，其中該方法包括檢測M蛋白在導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞中的定位。
2.一種篩選粒子形成能力已被降低或消除的(-)鏈RNA病毒載體的方法，包括(a)檢測已導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞中M蛋白的定位，以及(b)篩選出已降低或消除定位的載體。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中M蛋白的定位是指M蛋白在細(xì)胞表面的聚集。
4.一種篩選基因的方法，所述基因能降低或消除(-)鏈RNA病毒載體的粒子形成能力，所述方法包括(a)檢測已導(dǎo)入了含有測試基因的(-)鏈RNA病毒載體的細(xì)胞中M蛋白的定位，以及(b)篩選出能夠降低或消除定位的基因。
5.權(quán)利要求4的方法，其中M蛋白的定位是指M蛋白在細(xì)胞表面的聚集。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中所述測試基因是選自(-)鏈RNA病毒M，F(xiàn)或HN基因的一種基因的突變。
7.粒子形成能力已被降低或消除的重組(-)鏈RNA病毒載體的制備方法，其中該方法包括重建該(-)鏈RNA病毒載體，所述載體含有可根據(jù)權(quán)利要求4-6任一方法鑒定或分離的基因，所述重建是在該基因可以持續(xù)彌補(bǔ)M蛋白定位的降低或消除的條件下進(jìn)行。
8.粒子形成能力已被降低或消除的重組(-)鏈RNA病毒載體的制備方法，其中該方法包括，在能夠持續(xù)表達(dá)功能性M蛋白的條件下，重建該(-)鏈RNA病毒載體，所述載體由于M基因的缺失或突變而導(dǎo)致M基因表達(dá)產(chǎn)物的定位被降低或消除。
9.權(quán)利要求8的方法，其中的步驟包括，在允許溫度重建含有溫度敏感型突變M基因的(-)鏈RNA病毒載體，所述突變M基因降低或消除了基因產(chǎn)物在細(xì)胞表面的聚集。
10.權(quán)利要求9的方法，其中溫度敏感型突變M基因是編碼(-)鏈RNA病毒M蛋白的基因，該基因中相應(yīng)于下述至少一個(gè)氨基酸位點(diǎn)的氨基酸已被其它氨基酸取代仙臺(tái)病毒M蛋白的G69，T116和A183。
11.權(quán)利要求8的方法，其中的步驟包括在已被導(dǎo)入用于重建的細(xì)胞的染色體中的M基因可以表達(dá)的條件下，重建M基因缺失型(-)鏈RNA病毒載體。
12.權(quán)利要求7-11的任一方法，其中所述(-)鏈RNA病毒載體進(jìn)一步含有HN和/或F基因缺失，或者含有HN和/或F基因的溫度敏感型突變。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述溫度敏感型突變HN基因是編碼(-)鏈RNA病毒HN蛋白的基因，該基因中相應(yīng)于下述至少一個(gè)氨基酸位點(diǎn)的氨基酸已被其它氨基酸取代仙臺(tái)病毒HN蛋白的A262，G264和K461。
14.權(quán)利要求7-13之一的方法，其中所述(-)鏈RNA病毒載體進(jìn)一步含有P和/或L基因的突變。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述P基因中的突變是該(-)鏈RNA病毒P蛋白的氨基酸位點(diǎn)被其它氨基酸取代，所述位點(diǎn)相應(yīng)于仙臺(tái)病毒P蛋白的E86和/或L511。
16.權(quán)利要求14或15的方法，其中所述L基因中的突變是該(-)鏈RNA病毒L蛋白的氨基酸位點(diǎn)被其它氨基酸取代，所述位點(diǎn)相應(yīng)于仙臺(tái)病毒L蛋白的N1197和/或K1795。
17.權(quán)利要求7-16之一的方法，其中該方法包括在35℃或更低溫度重建載體。
18.權(quán)利要求1-17的任一方法，其中所述(-)鏈RNA病毒為副粘病毒。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述副粘病毒為仙臺(tái)病毒。
20.根據(jù)權(quán)利要求7-14任一方法制備的重組(-)鏈RNA病毒載體，其中該載體的粒子形成能力已被降低或消除。
21.重組(-)鏈RNA病毒，它含有功能性M蛋白，但該病毒基因組中M蛋白編碼序列已被缺失。
22.含有下述(a)-(d)中至少一種特性的重組(-)鏈RNA病毒(a)該病毒基因組所編碼的M蛋白在相應(yīng)于仙臺(tái)病毒M蛋白G69，T116和A183位點(diǎn)的至少一個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸被其它氨基酸取代；(b)該病毒基因組所編碼的HN蛋白在相應(yīng)于仙臺(tái)病毒HN蛋白A262，G264和K461位點(diǎn)的至少一個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸被其它氨基酸取代；(c)該病毒基因組所編碼的P蛋白在相應(yīng)于仙臺(tái)病毒P蛋白E86或L511位點(diǎn)上的氨基酸被其它氨基酸取代；(d)該病毒基因組所編碼的L蛋白在相應(yīng)于仙臺(tái)病毒L蛋白N1197和/或K1795位點(diǎn)上的氨基酸，或另一(-)鏈RNA病毒M蛋白同源位點(diǎn)的氨基酸，被其它氨基酸取代；
23.權(quán)利要求22的病毒，至少含有特性(a)和(b)。
24.權(quán)利要求22的病毒，至少含有特性(c)和(d)。
25.權(quán)利要求22的病毒，含有(a)-(b)全部特性。
26.權(quán)利要求21-25之一的病毒，其中該病毒基因組中至少有一種編碼刺突蛋白的序列被進(jìn)一步缺失。
27.權(quán)利要求26的病毒，其中該刺突蛋白為F蛋白。
28.權(quán)利要求21-27的任一病毒，其中該(-)鏈RNA病毒為副粘病毒。
29.權(quán)利要求28的病毒，其中該副粘病毒為仙臺(tái)病毒。
30.權(quán)利要求21-29的任一重組病毒，其用于通過基因?qū)雭斫档图?xì)胞毒性。
31.權(quán)利要求21-30的任一重組病毒，其用于通過基因?qū)雭硪种茖?dǎo)入基因的表達(dá)水平的降低。
32.權(quán)利要求21-31的任一重組病毒，其用于通過基因?qū)雭硪种茝膶?dǎo)入了病毒的細(xì)胞釋放病毒樣粒子(VLP)。
33.一種水溶液，它含有106CIU/ml或更多的根據(jù)權(quán)利要求21-32任一所述的重組病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供測試及制備粒子形成能力已被降低或消除的(－)鏈RNA病毒的方法。表明導(dǎo)入了這種(－)鏈RNA病毒載體的細(xì)胞中M蛋白定位的缺陷會(huì)抑制該細(xì)胞中病毒樣粒子(VLP)形成。本發(fā)明提供測試及篩選病毒粒子形成能力已被降低或消除的(－)鏈RNA病毒載體的方法，以及制備粒子形成能力已被降低或消除的(－)鏈RNA病毒載體的方法。由于該載體在導(dǎo)入細(xì)胞中既不產(chǎn)生細(xì)胞毒性又不會(huì)引發(fā)病毒二次釋放所帶來的免疫反應(yīng)，這種VLP形成能力已被降低或消除的載體可以用于基因治療。
文檔編號(hào)C12N15/86GK1633599SQ0282287
公開日2005年6月29日 申請日期2002年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月18日
發(fā)明者井上誠, 德炭由美子, 飯?zhí)镎虏? 長谷川護(hù) 申請人:株式會(huì)社載體研究所