專利名稱：骨抗重吸收化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合RANK的多肽，且該多肽含有一個或多個RANKL外表面環(huán)AA”、CD、EF和DE的氨基酸序列。另外本發(fā)明還包括所述多肽的片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明還涉及含有上述多肽和/或其片段、類似物和衍生物的藥物組合物。本發(fā)明還提供抑制破骨細胞分化的方法和通過給予有效量所述組合物競爭性抑制RANKL的方法。本發(fā)明還提供抑制骨重吸收的方法和治療至少部分以骨質(zhì)損失為特征的疾病的方法。
背景技術(shù)：
表現(xiàn)為骨損失或骨變薄的多種疾病不斷增加，已經(jīng)成為嚴重的健康問題。據(jù)估計單骨質(zhì)疏松這種疾病，就有3千萬美國人受到其威脅，而全世界就有10億人。Mundy等，科學(Science)，2861946-1949(1999)。其它與骨損失相關(guān)的疾病包括幼年骨質(zhì)疏松、成骨不全、高血鈣、甲狀旁腺功能亢進、骨質(zhì)軟化癥、骨質(zhì)缺乏、溶骨疾病、骨壞死、骨佩吉特(Paget’s)病、由風濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、皮質(zhì)類固醇治療、轉(zhuǎn)移性骨疾病造成的骨損失、牙周骨損失、癌癥造成的骨損失、衰老相關(guān)的骨質(zhì)損失和其它形式的骨質(zhì)減少。另外，很多情況需要新骨形成，例如促進骨折的骨修復(fù)或置換、骨缺陷、整形手術(shù)、牙科和其它移植及其它諸如此類的情況。
骨是致密的結(jié)締組織的特化形式。骨基質(zhì)由位于現(xiàn)存骨基質(zhì)表面或者附近的成骨細胞形成。骨被已知為破骨細胞(一種巨噬細胞)的其它類型的細胞所吸收(侵蝕)。這些細胞分泌溶解骨無機物的酸和消化其有機成分的水解酶。因此，骨形成和重建是一個涉及成骨細胞和破骨細胞的生成和侵蝕活性進行中的相互作用的動力學過程，。Alberts等，細胞分子生物學(Molecular Biology of the Cell)，Garland出版社，N.Y.(第三版，1994)，pp.1182-1186。
目前批準的臨床骨損失治療藥物主要是抗重吸收性質(zhì)的，因其抑制骨重吸收過程。因能夠抑制骨重吸收而用于或推薦用于治療骨質(zhì)疏松的藥物有雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)、鈣、骨化三醇、降鈣素(Sambrook，P等人，N.Engl.J.MED.3281747-1753)、阿侖特羅(Saag，K等，N.Engl.J.Med.339292-299)和其它二磷酸鹽。Luckman等人，J.Bone Min.Res.13，581(1998)。不過，目前的抗重吸收藥物在抑制骨吸收/重建方面產(chǎn)生了不好的影響或其它不利的副作用。
因此，人們渴望得到其它能夠治療骨損失疾病的化合物。最近，在骨細胞生物學領(lǐng)域中的一個關(guān)鍵性進展是發(fā)現(xiàn)了RANK配體(RANKL，又名為骨保護素配體(OPGL)、TNF相關(guān)激活誘導的細胞因子(TRANCE)以及破骨細胞分化因子(ODF))，該配體表達在基質(zhì)細胞、成骨細胞、激活的T淋巴細胞和乳腺上皮中，是巨噬細胞分化成破骨細胞所必需的獨特分子。Lacey等，細胞(Cell)93165-176(1998)(骨保護素配體是一種調(diào)節(jié)破骨細胞分化和激活的細胞因子)，RANKL的細胞表面受體是RANK(ReceptorActivatorofNecrosisFactor(NF)-Kappa B)。RANKL是2型跨膜蛋白質(zhì)，含有少于50個氨基酸的細胞內(nèi)區(qū)域、大約21個氨基酸的跨膜區(qū)域和大約240到250個氨基酸的細胞外區(qū)域。天然RANKL以跨膜和可溶性形式蛋白質(zhì)存在。已知至少在小鼠、大鼠和人中存在RANKL的推定的氨基酸序列以及起其它多種變體。參見Anderson等，美國專利6,017,729，Boyle，美國專利5,843,678，和Xu J.等人，J.BoneMin.Res.(2000/152178)，此處引用作為參考。另外，我們還解析了RANKL外部結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)果公布于2001年8月9日提交的美國專利申請60/311,163，和2002年8月9日提交的美國專利申請10/215,446中。
已經(jīng)確認RANKL(OPGL)是一種骨重吸收的強誘導物，同時它又是破骨細胞發(fā)育的正調(diào)節(jié)子。Lacey等，見上文。它發(fā)揮破骨細胞分化和激活因子作用以外，據(jù)報道，RANKL能夠誘導人樹狀細胞(DC)簇形成。Anderson等人，見上文及mammary epitheliumdevelopment J.Fata等人，“The osteoclast differentiation factorosteoprotegerin ligand is essential for mammary glanddevelopment”Cell，10341-50(2000)。最近我們確證RANKL在骨形成合成代謝中具有重要作用，而且可以用于刺激成骨細胞增殖或者骨結(jié)節(jié)礦化。該結(jié)果公布于2001年3月22日提交的美國專利申請60/277,855，和2002年3月22日提交的美國專利申請10,105,057中。最近我們還確認了RANKL外部結(jié)構(gòu)域的精確三維結(jié)構(gòu)，并定位了和RANK相互作用的RANKL獨特外表面環(huán)的氨基酸序列。該結(jié)果公布于2001年8月9日提交的美國專利申請60/311,163，和2002年8月9日提交的美國專利申請10/215,446中。
因此，鑒于現(xiàn)行藥物治療骨損失效果有限的現(xiàn)狀，亟待開發(fā)治療該類疾病的新型藥物。
發(fā)明簡述因此，本發(fā)明的目標是提供含有一個或者多個RANKL外表面環(huán)AA”、CD、DE或者EF的多肽，同時該多肽具有RANK結(jié)合能力。RANKL環(huán)對應(yīng)RANKL分子(SEQ ID No6)的部分如下所述AA”含有氨基酸殘基170-193(SEQ ID No2)；CD含有的氨基酸殘基224-233(SEQ ID No3)；DE含有的氨基酸殘基245-251(SEQ ID No4)和EF含有的氨基酸殘基261-269(SEQ ID No5)；含有AA”環(huán)序列部分的多肽也包括在本發(fā)明之中，并且它還包括氨基酸殘基175-185(SEQ ID No1)。SEQ ID No7和SEQ ID No11的多肽是天然存在的人RANKL的AA”環(huán)的變體。二者都是人RANKL的天然變體。SEQ ID No8、SEQ ID No9和SEQ ID No10分別是人RANKL的CD、DE和EF環(huán)的表面環(huán)多肽序列。
一方面，本發(fā)明包括RANK結(jié)合多肽且其由選自SEQ ID No1-SEQ ID No5以及SEQ ID No7-SEQ ID No11的序列構(gòu)成。
本發(fā)明的另外目的是提供含有RANKL外表面環(huán)的且具有競爭性抑制RANKL活性的多肽。
本發(fā)明的另外目的是提供這種多肽的片段、類似物和衍生物并描述了獲得上述片段、類似物和衍生物的方法。
另一方面，本發(fā)明提供了含有該多肽的藥物組合物。該組合物可以進一步含有可藥用的載體、輔料、增溶劑、穩(wěn)定劑和/或抗氧化劑。
本發(fā)明還包括抑制破骨細胞分化的方法、競爭性抑制RANKL的方法和抑制骨重吸收的方法。這些方法包括本發(fā)明組合物的給藥方法。還提供治療至少部分以骨質(zhì)損失為特征的疾病的方法。在優(yōu)選的實施方案中，這些方法用于治療骨質(zhì)疏松、溶骨疾病、風濕性關(guān)節(jié)炎和骨骼轉(zhuǎn)移(skeletal metastasis)。
其它目的和特征將在后面的各個部分中分別介紹。
附圖簡述

圖1是描述通過測定TRAP的活性檢測PSGSHKVTLSS肽濃度升高對破骨細胞生成的影響的圖。
縮略語和定義為了便于理解本發(fā)明，對一些術(shù)語定義如下此處所提到的氨基酸是20個遺傳編碼的L-氨基酸，按照常規(guī)縮略如下
此處除非特殊說明，三字母符號和單字母符號縮略語所指的氨基酸不是D-構(gòu)型就是L-構(gòu)型。例如，Arg指的是D-精氨酸和L-精氨酸，R指的是D-精氨酸和L-精氨酸。
除非特別指出，當用一系列單字母和/或三字母縮略語表示多肽序列時，按照慣例，所示序列為從N→C方向。此處的“C”指的是氨基酸殘基的α碳。為了確定上述不同肽和肽類似物的保守性氨基酸的取代情況和描述不同的肽和肽類似物，主要根據(jù)氨基酸側(cè)鏈的物理化學性質(zhì)，按照慣例將氨基酸分成2個主要的類別親水性和疏水性氨基酸。這2大類可以進一步分成能更詳細定義氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的亞類。例如親水性氨基酸類能夠進一步細分成酸性、堿性和極性氨基酸。疏水性氨基酸可以進一步細分成非極性和芳香族氨基酸。氨基酸的不同類別定義如下“親水性氨基酸”指的是根據(jù)Eisenberg等人，1984，J.Mol.Biol.179125-142的標準化疏水性檢測，氨基酸疏水性少于0的氨基酸。通常親水性編碼氨基酸包括Thr(T)、Ser(S)、His(H)、Glu(E)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Lys(K)、和Arg(R)。
“酸性氨基酸”指的是側(cè)鏈pK值小于7的親水性氨基酸。酸性氨基酸在生理pH條件下，因為缺少氫離子一般具有負電荷側(cè)鏈。通常酸性編碼氨基酸包括Glu(E)和Asp(D)。
“堿性氨基酸”指的是側(cè)鏈pK值大于7的親水性氨基酸。堿性氨基酸在生理pH條件下，因為具有氫離子一般具有正電荷側(cè)鏈。通常堿性編碼氨基酸包括His(H)和Arg(A)和Lys(L)。
“極性氨基酸”指的是側(cè)鏈在生理pH條件下不帶電荷的親水性氨基酸，不過該類氨基酸至少含有一個這樣的鍵，兩個原子共享一對電子，其中更接近的原子保有該電子對。通常極性編碼氨基酸包括Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T)。
“疏水性氨基酸”指的是根據(jù)Eisenberg等人，1984，J.Mol.Biol.179125-142的標準化疏水性檢測，氨基酸疏水性大于0的氨基酸。通常疏水性編碼氨基酸包括Pro(P)、Ile(I)、Phe(F)、Val(V)、Leu(L)、Trp(W)、Met(M)、Ala(A)、Gly(G)和Tyr(Y)。
“芳香族氨基酸”指的是側(cè)鏈至少含有1個芳香環(huán)或者異芳香環(huán)的疏水性氨基酸。該芳香環(huán)或者異芳香環(huán)可以含有一個或者多個取代基，如-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-NO、-NH2、-NHR、-NHR、-C(O)R、-C(O)OH、-C(O)OR、-C(O)NH2、-C(O)NHR、-C(O)NRR等，此處的R可以是分別是(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、取代的(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、取代的(C2-C6)炔基、(C5-C20)芳香基團、取代的(C5-C20)芳香基團、(C6-C26)芳香烷基、取代的(C6-C26)芳香烷基、5-20個原子的雜芳香基、取代的5-20個原子的雜芳香基、6-26個原子的雜芳香烷和取代的6-26個原子的雜芳香烷基。通常，芳香族編碼氨基酸包括His(H)、Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)。
“非極性氨基酸”指的是側(cè)鏈在生理pH條件下不帶電荷的疏水性氨基酸，不過該類氨基酸含有這樣的鍵，兩個原子共享一對電子，每個原子保有該電子能力相等(即側(cè)鏈沒有極性)。通常非極性編碼氨基酸包括Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Met(M)、Gly(G)和Ala(A)。
“脂肪族氨基酸”指的是含有脂肪族碳側(cè)鏈的疏水性氨基酸，通常脂肪族編碼氨基酸包括Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)。
“羥基取代的脂肪族氨基酸”指的是含有羥基取代基側(cè)鏈的脂肪族親水性極性氨基酸。通常羥基取代脂肪族編碼氨基酸包括Ser(S)和Thr(T)。
氨基酸殘基Cys(C)并不常見，它可以和其它Cys(C)殘基或者含有巰基的氨基酸形成二硫橋。肽中的Cys(C)殘基(以及其它具有-SH側(cè)鏈的氨基酸)或者以自由-SH的形式存在或者以氧化二硫橋聯(lián)的形式存在，Cys(C)殘基的成鍵與否直接影響著肽的凈疏水性或親水性特性。根據(jù)Eisenberg等人的標準化疏水性檢測(1984，見上文)，Cys(C)的疏水值為0.29。因此可以理解本發(fā)明中將Cys(C)分類為極性親水性氨基酸，雖然常規(guī)分類如上所述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解上述界定的分類并不相互排斥。因此，具有2種或者更多理化性質(zhì)側(cè)鏈的氨基酸可包括在多種分類中。例如具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸可以帶有極性取代基團，如Tyr(Y)，該氨基酸同時具有芳香族疏水特性和極性或者親水性特性。因此可以被歸為芳香族和極性氨基酸。其它的例子有His(H)的側(cè)鏈屬于芳香族和堿性氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員已熟知任何氨基酸的確切分類。不在此再詳細說明。
盡管上述分類以遺傳編碼氨基酸進行了闡明了，取代氨基酸在某些實施方案中優(yōu)選僅限于遺傳編碼氨基酸。事實上，所述的很多化合物可以通過合成的方式產(chǎn)生，它們可能含有一個或者多個常見的非編碼氨基酸。因此，除了天然存在的編碼氨基酸之外，可以用天然存在的非編碼氨基酸和合成氨基酸取代結(jié)構(gòu)(1)核心肽上的氨基酸殘基。
本發(fā)明的化合物中某些常見氨基酸包括但不限于β-丙氨酸(β-Ala)和其它Ω-氨基酸，如3-氨基丙酸、2，3-二胺基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等；α-氨基異丁酸(Aib)、ε-氨基己酸(Aha)、δ-氨基戊酸(Ava)、N-甲基甘氨酸或者肌氨酸(MeGly)、鳥氨酸(Orn)、胍氨酸(Cit)、t-丁基丙氨酸(t-BuA)、t-丁基甘氨酸(t-BuG)、N-甲基異亮氨酸(MeIle)、苯基甘氨酸(Phg)、環(huán)已基丙氨酸(Cha)、正亮氨酸(Nle)、萘基丙氨酸(Nal)、4-氯苯基丙氨酸(Phe(4-C1))、2-氟苯基丙氨酸(Phe(2-F))、3-氟苯基丙氨酸(Phe(3-F))、4-氟苯基丙氨酸(Phe(4-F))、青霉胺(Pen)、1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧基酸(Tic)、β-2-噻吩丙氨酸(Thi)、甲硫氨酸亞砜(MSO)、高精氨酸(hArg)、N-乙酰賴氨酸(AcLys)、2，4-二氨基庚二酸(Dbu)、2，3-二氨基丁酸(Dab)、p-氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))、N-甲基纈氨酸(MeVal)、高半胱氨酸(hCys)、高苯丙氨酸(hPhe)和高絲氨酸(hSer)、羥脯氨酸(Hyp)、高脯氨酸(hPro)、N-甲基化氨基酸和peptoid(N-取代甘氨酸)。
根據(jù)上述分類定義對遺傳編碼和常規(guī)非編碼氨基酸進行分類，總結(jié)在后面的表3中。在本發(fā)明中，表3僅起到說明的目的，不是包羅所有氨基酸殘基的列表。其它氨基酸可以在Fasman，1989，PracticalHandbook of Biochemistry和Molecular Biology，CRC Press，Inc，pp.3-70中找到，并且于此作為參考。
此處用核酸的制備方法或核酸的結(jié)構(gòu)定義“重組核酸”。參考制備方法如一種方法制備的產(chǎn)物，該方法采用重組核酸技術(shù)，例如涉及人對核酸序列的干預(yù)，一般是選擇或者制備?；蛘撸瑢⑻烊换ゲ贿B續(xù)的2個片段融合形成核酸序列。不過不排除天然產(chǎn)物，如天然存在的突變體。因此包括例如用任何非天然存在的載體轉(zhuǎn)化細胞得到的產(chǎn)物，該載體含有用任何寡核酸合成方法得到的核酸。通常采用編碼相同或者保守性氨基酸的冗余密碼子置換密碼子，一般還導入或者去除序列識別位點?；蛘?，將目的功能核苷酸片段連接在一起，生產(chǎn)通常自然界通常不存在的目的功能重組的單個遺傳實體。通常限制性酶識別位點是這種人工操作的靶點，還會一起設(shè)計包括其它特殊的靶點如啟動子、DNA復(fù)制位點、調(diào)節(jié)序列、控制序列或者其它有用的序列。
此處的“多聚核苷酸”和“寡聚核苷酸”是可以相互替換的，是指通過磷酸鍵連接在一起的至少含有2個核苷酸的核酸或者脫氧核酸組成的多聚物。
此處的“序列”指的是單體多聚物線性順序，例如多肽的氨基酸的順序或者多聚核酸的核苷酸順序。
此處的“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”是可以相互替換的，指的是由肽鍵連接的2個或者更多氨基酸組成的化合物。
此處的“重組蛋白質(zhì)”指的是含有天然或突變原始氨基酸序列的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)是通過載有重組DNA分子的細胞基因表達得到的，而不是從天然發(fā)現(xiàn)該基因和/或蛋白質(zhì)的細胞中得到的。換而言之，該基因?qū)Ρ磉_宿主而言是異源的。值得一提的是任何基因的置換、包括向基因中添加編碼親和純化部分的多聚核苷酸，對于定義而言都是非天然的，這些基因不能天然存在于任何細胞中。
此處的“突變蛋白質(zhì)”包括多肽的片段、衍生物和類似物。
此處的“RANK”指的是RANK蛋白質(zhì)、重組RANK蛋白質(zhì)、RANK融合蛋白質(zhì)、上述蛋白質(zhì)的類似物、衍生物和模擬物等。
此處的術(shù)語“動物”包括人類。
短語“防止或者抑制”是抑制或者減弱的影響，表現(xiàn)成其它形式是指與未處理相比，可觀測的特性指標降低?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法檢測體外抑制程度。
術(shù)語“有效量”是指產(chǎn)生統(tǒng)計學顯著效果的物質(zhì)的量。例如治療應(yīng)用的“有效量”是指組合物的量含有的活性化合物在骨折修復(fù)、逆轉(zhuǎn)或者抑制骨質(zhì)疏松癥的骨質(zhì)損失、防止或者推遲骨質(zhì)疏松的發(fā)作、修復(fù)或者防止牙缺損、或者治療或抑制其它骨損失癥狀、疾病或者缺陷的疾病等時，達到臨床顯著增加治愈率所要求的。所述疾病包括上述疾病，但不限定于此?？刹捎贸Ｒ?guī)優(yōu)化技術(shù)確定有效量，該劑量主要取決于所要治療的特定癥狀、患者的狀況、給藥途徑、劑型、醫(yī)生的診斷以及其它本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的因素。誘導治療組和對照組產(chǎn)生統(tǒng)計學上顯著差異的量說明所需的本發(fā)明化合物的劑量(例如，治療骨質(zhì)疏松)。骨質(zhì)的差異可以看到，例如至少1-2％、或者治療組的骨質(zhì)在臨床上出現(xiàn)任何顯著提高。其它評價治愈取得臨床顯著增加的指標還包括本領(lǐng)域熟知的破壞強度和張力檢測、破壞強度和扭轉(zhuǎn)力檢測、4-點彎曲度檢測以及其它生化檢測。通常藥物治療的指導方案是從目的疾病的動物模型試驗中得到。
此處的“治療”包括預(yù)防和治療。即治療一個個體時，對受到骨質(zhì)損失疾病困擾的個體施用本發(fā)明化合物，防止或抑制此類癥狀的發(fā)生。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，申請人發(fā)現(xiàn)代表RANKL的AA″環(huán)部分的多肽通過阻止RANKL誘導破骨細胞前體的細胞分化，發(fā)揮RANKL競爭性拮抗劑的作用。而且發(fā)現(xiàn)破骨細胞的分化抑制作用表現(xiàn)出劑量依賴性。
分別提交于2001年和2002年8月9日的美國專利申請60/311,163和10/215,446確認了負責結(jié)合RANK的RANKL表面，該表面包括外表面環(huán)AA″、CD、DE和EF。RANKL的外(接觸溶劑的)表面環(huán)在TNF家族中具有獨特性，它表現(xiàn)出與眾不同的長度和構(gòu)型AA″環(huán)(RANKL蛋白質(zhì)的170-193殘基)連接著A和A’鏈，CD環(huán)(224-233殘基)連接著C鏈和D鏈，EF環(huán)(261-269殘基)連接E鏈和F鏈，DE環(huán)(245-251殘基)連接著D鏈和E鏈。與一般的TNF家族成員相比，RANKL具有更長的AA″環(huán)和更短的EF環(huán)。AA″環(huán)和CD環(huán)的排列在RANKL分子的上三分之一形成了獨特的表面，反之，DE環(huán)的細微改變在RANKL分子底部形成了受體結(jié)合溝。有關(guān)RANKL環(huán)的詳述和RANK/RANKL相互作用的結(jié)合特異性可以參見分別提交于2001年和2002年8月9日的美國專利申請60/311,163和10/215,446。
因此，申請人考慮抑制破骨細胞分化的含有RSNKL外表面環(huán)序列的多肽及其突變蛋白質(zhì)等的應(yīng)用。并且，這類多肽可以用于治療表現(xiàn)至少部分骨質(zhì)損失的疾病和癥狀。
本發(fā)明提供的多肽含有一個或多個RANKL的外表面AA″、CD、DE或者EF環(huán)，并且具有RANK結(jié)合能力。RANKL環(huán)對應(yīng)的RANKL分子(SEQ ID No6)部分介紹如下AA″含有氨基酸殘基170-193(SEQ ID No2)，CD含有氨基酸殘基224-233(SEQ ID No3)，DE含有氨基酸殘基245-251(SEQ ID No4)，和EF含有氨基酸殘基261-269(SEQ ID No5)，本發(fā)明描述含有AA″環(huán)序列部分的多肽，其包括氨基酸殘基175-185(SEQ ID No1)。
一方面，RANKL環(huán)對應(yīng)人RANKL部分，包括SEQ ID No7和SEQ ID No11肽，其為天然存在的人RANKL的AA″環(huán)的變體。上述2個序列都是人RANKL的變體。SEQ ID No8、SEQ ID No9和SEQ ID No10分別是人RANKL的CD環(huán)、DE環(huán)和EF環(huán)的表面環(huán)的肽序列。
另一方面，本發(fā)明包括的RANK結(jié)合肽由選自SEQ ID No1-SEQ ID No5和SEQ ID No7-SEQ ID No11的肽所組成。另外，本發(fā)明包括選自序列1-序列5和序列7-序列11中的一個或者多個多肽的串連。此外，本發(fā)明包括所述多肽的治療性聯(lián)合使用。本發(fā)明還提供含有RANKL外表面環(huán)并具有競爭性抑制RANKL的活性的肽。
顯然，根據(jù)本發(fā)明，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的傳統(tǒng)合成工藝合成上述多肽。例如可以按照Sheppard等人，Journal ofChemical Society Perkin I，p.538(1981)的方法用肽自動合成儀(如Pharmacia LKB Biotechnology公司，LKB Biolynk 4170或者Milligen、Model 9050(Millien，Millford，MA))化學合成上述肽。該操作工藝步驟是，將N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺添加到氨基功能基團被9-芴甲氧羰基(Fmoc)保護的氨基酸和合成的目的氨基酸酸酐中。Fmoc氨基酸酸酐用于肽合成。用二甲氨基吡啶作為催化劑，將對應(yīng)于C-末端氨基酸殘基的Fmoc氨基酸酸酐羧基固定在Ulrtosyn A樹脂上。然后，用含有哌啶的二甲基甲酰胺洗滌樹脂，并且去除C-末端氨基酸功能基團的保護基團。之后，在該C-末端氨基酸上偶聯(lián)下一個對應(yīng)于目的合成肽的氨基酸。然后重復(fù)去保護步驟。按照相同的步驟連續(xù)將目的氨基酸固定直到完成目的序列的肽鏈為止。用乙酰氨基甲基去除保護性基團，并用溶劑釋放肽。
或者，可使用含有編碼本發(fā)明多肽核酸的適當表達載體合成該多肽。這類DNA分子可以利用遺傳密碼的密碼子-氨基酸關(guān)系用自動DNA序列儀制備。還可以用寡核苷酸探針和傳統(tǒng)的雜交方法得到作為基因組DNA或者cDNA的這類DNA分子，將這類DNA分子整合到表達載體中，包括質(zhì)粒，使其適于在適當?shù)乃拗髦斜磉_該DNA和合成多肽。所述宿主有細菌，如大腸桿菌，酵母細胞、哺乳動物細胞或者昆蟲細胞。哺乳動物表達系統(tǒng)利于糖基化，能夠改善化合物的藥物和/或者免疫學特性。
本發(fā)明的另一方面提供本發(fā)明的多肽的片段、類似物和衍生物。此處所用術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指以保留RANK結(jié)合活性的某種形式修飾后的化合物。只要該片段保留了RANK結(jié)合功能，該片段可以是本發(fā)明的多肽的任何一部分?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的將肽衍生成片段、類似物或者衍生物的任何技術(shù)進行修飾。這些術(shù)語，尤其是“類似物”也專門包括肽，非肽、小分子和其它作用為RANKL模擬物的可結(jié)合RANK的化合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員明白可以進行肽、多肽或者蛋白質(zhì)的氨基酸序列修飾而得到等價的、可能改善的、第二代肽等，其與原始肽氨基酸序列相比，表現(xiàn)出等同或更優(yōu)的功能特征。本發(fā)明相應(yīng)包括這樣修飾的氨基酸序列。修飾改變可包括但不限定于氨基酸的插入、缺失、置換、截短、融合、環(huán)化、二硫鍵橋連、亞基序列的重排以及其它，前提是經(jīng)過這樣修飾的肽序列仍然保留有RANK結(jié)合能力。這類修飾可以改善化合物的半衰期、生物活性、吸收、分布、代謝、排除、毒性以及其它。進行這些改變時需要考慮的一個因素是氨基酸的疏水指數(shù)。Kyte和Doolittle對氨基酸疏水指數(shù)在蛋白質(zhì)相互作用的生物功能上的重要性進行過討論(J.Mol.Biol.，157105-132，1982)。這很容易理解，氨基酸的相對疏水特性對最終蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)具有影響。進而影響到蛋白和酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等的相互作用。
根據(jù)其疏水性和電荷特性，每個氨基酸都被賦有一個疏水指數(shù)，其值如下異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酰氨/谷氨酸/天冬氨酸/天冬氨酸(-3.5)、賴氨酸(-3.9)、精氨酸(-4.5)。如本領(lǐng)域內(nèi)已知，肽或蛋白質(zhì)的某些氨基酸可以被其它具有相似疏水指數(shù)或疏水值的氨基酸所替換，得到的最終的肽或者蛋白質(zhì)具有相似的生物學活性，即始終保持其生物學功能。進行這類改變時，優(yōu)選疏水指數(shù)差異在±2之間的氨基酸彼此取代，更優(yōu)選疏水指數(shù)差異在±1之間的氨基酸進行取代，最優(yōu)選疏水指數(shù)差異在±0.5之間的氨基酸進行取代。
氨基酸也可以根據(jù)其親水性進行取代，美國第4,554,101號專利公布了蛋白質(zhì)最大局部親水性平均值，該值主要受臨近氨基酸的親水性影響，并關(guān)系到蛋白質(zhì)的生物學特性。下面對每個氨基酸都賦予了親水值精氨酸/賴氨酸(+3.0)、天冬氨酸/谷氨酸(+3.0±1)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰氨/谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸/組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸/異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。肽、多肽或者蛋白質(zhì)上的一個氨基酸可以被具有相似親水值的其它氨基酸所代替且仍能夠得到具有相似生物學活性的最終蛋白質(zhì)，即始終保留正確的生物學功能。進行這類改變時，優(yōu)選親水指數(shù)差異在±2之間的氨基酸彼此取代，更優(yōu)選氨基酸的親水指數(shù)差異在±1之間的氨基酸進行取代，最優(yōu)選親水指數(shù)差異±0.5之間的氨基酸進行取代。
如上述概述，可根據(jù)氨基酸側(cè)鏈取代基團的相似性進行本發(fā)明的多肽上的氨基酸取代。例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。為得到保守性氨基酸改變，考慮前述多種特性而最終得到本發(fā)明多肽的沉默改變進行的實例，可以選擇氨基酸天然歸屬類別中的其它成員。氨基酸可以分成下面四類(1)酸性氨基酸；(2)堿性氨基酸；(3)中性極性氨基酸和(4)中性非極性氨基酸。這幾類的代表性氨基酸包括但不限于此(1)酸性(負電荷)氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性氨基酸(正電荷)如精氨酸、組氨酸和賴氨酸；(3)中性極性氨基酸如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰氨和谷氨酰胺；(4)中性非極性氨基酸如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。需要提醒的是如果最終產(chǎn)生功能性序列，則不一定有利的改變也可能有用。
因此，本發(fā)明多肽的片段、衍生物或者類似物可以是下述例子，不過不限定于此(i)用保守或非保守性氨基酸殘基取代一個或者多個氨基酸殘基，并且這些取代氨基酸殘基可能是或不是遺傳密碼編碼的氨基酸；(ii)一個或者多個氨基酸殘基含有取代基團；(iii)成熟蛋白質(zhì)和其它如能增加蛋白質(zhì)半衰期的化合物融合的產(chǎn)物；(iv)該蛋白質(zhì)和其它氨基酸融合，以利于純化、檢測或鑒定，或者(v)該蛋白質(zhì)和其它氨基酸融合，以利于改進組織分布或令蛋白質(zhì)定位于某些位置如細胞膜或者細胞外間質(zhì)；或者(vi)其它分子，可能小的、非肽類分子模擬該多肽的RANK結(jié)合功能。
通過修飾多肽來改進其藥物功效是本領(lǐng)域的標準操作。不完全影響多肽結(jié)合RANK和/或它抑制破骨細胞分化的活性，就可以對其進行修飾性改造。例如RANKL寡聚化已經(jīng)成為推遲蛋白質(zhì)內(nèi)化的有用技術(shù)。另外，環(huán)化也可以穩(wěn)定本發(fā)明的模擬物。與此相似，已有增加多肽穩(wěn)定性或其它有益特性的處理方法，如用D-氨基酸取代L-氨基酸或PEG-加翼可用于實現(xiàn)本發(fā)明的RANKL模擬物。
一方面，可以向多肽序列的N-和/或C-末端中的一端或者兩端添加側(cè)翼殘基。當包括時，這些側(cè)翼殘基應(yīng)不顯著改變核心肽結(jié)合RANK、抑制RANK/RANKL相互作用的能力。側(cè)翼殘基可以含有便于形成二硫鍵的半胱氨酸。因此在實施方案中，可以在本發(fā)明的多肽的每個末端含有分別小于5個氨基酸的側(cè)翼殘基。在優(yōu)選的實施方案中，每個末端的側(cè)翼殘基小于3個，更優(yōu)選沒有側(cè)翼殘基。
這類分子可含有一定數(shù)量本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的修飾。如可取代酰氨連接的通常包括但不限定于下式基團-C(O)NR-、其中R是(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、取代的(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、取代的(C2-C6)炔基、(C5-C20)芳香基團、取代的(C5-C20)芳香基團、(C6-C26)芳香烷基、取代的(C6-C26)芳香烷基、5-20個原子的雜芳香基、取代的5-20個原子的雜芳香基、6-26個原子的雜芳香烷和取代的6-26個原子的雜芳香烷基。
酰氨連接的等電子排列體通常包括但不限定于-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH＝CH-(順式和反式)、-C(O)CH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已經(jīng)熟知含有非酰氨連接的化合物和制備這類化合物的方法(見，如Spatola，March 1983，Vega Data Vol.1，Issue 3；Spatola 1983，“Peptide BackboneModifications InChemstry and Biochemstry of Amino Acids Peptidesand Proteins，Weinstein，de.，Marcel Dekker，New York，p.267(一般綜述)；Morley，1980，Trends Pharm.Sci.1463-468；Hudson等人，1979，Int.J.Prot.Res.14177-185(-CH2NH-、-CH2CH2-)；Spatola等，1986，Life Sci.381243-1249(-CH2-S)；Hann，1982，J.Chen.Soc.PerkinTrans.I.1307-314(-CH＝CH-，順式和反式)；Almquist等人，1980，J.Med.Chem.231392-1398(-COCH2-)；Jennings-White等，Tetrahedron.Lett.232533(-COCH2-)；歐洲專利申請EP45665(1982)CA 9739405(-CH(OH)CH2-)；Holladay等人，1983，Tetrahedron Lett.244401-4404(-C(OH)CH2-)、和Hruby，1982，Life Sci 31189-199(-CH2-S-)。
另外，可以用不會顯著干預(yù)肽活性或結(jié)構(gòu)的肽模擬物或者酰氨模擬部分置換一個或者多個酰氨連接?；蛘?，所有的酰氨連接都可以用肽模擬部分置換。例如，適當?shù)孽０蹦M物參見如Olson等人，1993，J.Med.Chem.363039-3049。
肽和肽類似物可選在一端或者兩端含有1到5個氨基酸殘基或者更長一點的肽或者肽類似物。肽類似物一般含有至少一個修飾的中間連接，如上述的取代的酰氨或者酰氨的等電子體。這些額外的肽或者肽類似物可具有來自RANKL其它部分的氨基酸序列或者完全隨機的序列。肽中的這些隨機序列可以用于檢測生物活性，即它們結(jié)合RANK的能力。
通過分析目的化合物和RANK結(jié)合等方法檢測RANK結(jié)合化合物。一方面，令所述化合物和RANK相接觸以測定其解離率。在本領(lǐng)域中已有多種進行結(jié)合分析的方法。如通過確認化合物和RANK的結(jié)合能力的指標解離率并且利用本領(lǐng)域早已建立的結(jié)合活性和解離活性之間的相互關(guān)系。
例如可以用如125I放射物標記的參照化合物、肽或蛋白質(zhì)，如RANKL或其分離的外表面環(huán)等，并用RANK在1.5ml管中共同孵育。將被檢化合物添加到這些反應(yīng)物中，并逐步增加其濃度。經(jīng)過適當孵育后，分離RANK/化合物的復(fù)合物，如采用層析柱，并用γ計數(shù)器測定結(jié)合有125I標記的肽。確定被檢化合物抑制50％參照肽的結(jié)合的所需量。測定的值規(guī)算成未標記的參照肽結(jié)合的濃度(相對的抑制濃度(RIC)-1＝濃度檢測/濃度參照)。小的RIC-1值表明相對強的結(jié)合。反之，大的RIC-1值表明相對弱的結(jié)合。見，例如Latek等，Proc.Natl.Acad.Sci/USA，Vol.97，No.21，pp.11460-11465，2000。當然，高通量結(jié)合分析如PerkinElmer、Actelion及其它公司提供的商業(yè)服務(wù)同樣適合檢測化合物的結(jié)合性。
用和N-末端-NH2或者C-末端-C(O)OH發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)對肽和肽類似進行封閉，這類N-和/或C-末端“封閉”形式的肽和肽類似也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。這種封閉化合物一般在N-末端乙酰化和/或者C-末端酰氨化或酯化。通常N-末端封閉基團包括R1C(O)-、其中R1是氫原子、(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C5-C20)芳香基團、(C6-C26)芳香烷基團、5-20個原子的雜芳香基團、或6-26個原子的雜芳香烷基團。優(yōu)選N-末端封閉基團包括乙?；?、甲酰和丹酰。一般C-末端封閉基團包括-C(O)NR1R1和-C(O)OR1，其中每個R1分別如上面的定義。優(yōu)選的C-末端封閉基團包括其R1分別為(C1-C6)烷基、優(yōu)選甲基、乙基、丙基或異丙基的那些。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)所述篩選方法確定化合物，通過給予含有上述化合物的組合物提供了防止或抑制骨損失的方法，抑制破骨細胞分化的方法、競爭性抑制RANKL活性的方法。通過對有需要的個體提供有效量的骨形成組合物而使用本發(fā)明的該組合物。該方法和組合物可用于治療以骨質(zhì)損失或變薄為特征的疾病或癥狀。這些疾病和癥狀包括骨質(zhì)疏松、幼年骨質(zhì)疏松、成骨不全、高血鈣、甲狀旁腺功能亢進、骨質(zhì)軟化癥、骨質(zhì)缺乏、溶骨疾病、骨壞死、骨佩吉特氏病、由風濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、皮質(zhì)類固醇治療、轉(zhuǎn)移性骨疾病造成的骨損失、牙周骨損失、癌癥造成的骨損失、衰老相關(guān)的骨質(zhì)損失和其它形式的骨質(zhì)減少。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可以用于治療骨質(zhì)疏松、溶骨疾病、由于類風濕性關(guān)節(jié)炎和骨骼轉(zhuǎn)移造成的骨損失。
為了用于動物個體治療，本發(fā)明的組合物可以制成藥用或者獸醫(yī)用組合物。根據(jù)要進行治療的個體、給藥的模式和所需治療類型如防止、預(yù)防、治療，可將該組合物制備成滿足上述參數(shù)的制劑。其技術(shù)可參考Remington的制藥科學(Pharmaceutical Sciences)，最后一版，Mack出版公司，Easton，PA。
進行本發(fā)明組合物給藥時，可以調(diào)節(jié)下述多種給藥參數(shù)對其進行藥動學和藥效學控制。這些參數(shù)包括給藥的頻率、劑量、間隔模式、途徑?？梢酝ㄟ^對給藥劑量、間隔時間和模式的不同控制達到所要求的活性。
為了對動物或人個體進行給藥，本發(fā)明化合物的劑量一般為0.01-100mg/kg。不過，劑量水平主要取決于疾病或者狀況的天然狀態(tài)、患者狀況、醫(yī)生的判斷以及給藥的頻率和模式。如果采用口服給藥，物質(zhì)吸收將是影響生物利用度的因素。低吸收將造成胃腸道藥物濃度高，并且需要采用更高劑量。
這是可以理解的，物質(zhì)的適宜劑量經(jīng)過相應(yīng)的動物模型檢測評價的，在適合的可接受的動物模型中可得到有效量水平(如ED50)和毒性劑量水平(如TD50)以及致死劑量水平(如LD50或者LD10)。而且，如果一個物質(zhì)在動物檢測中證明有效，將開始進行臨床試驗。
通常用于治療時，本發(fā)明的化合物可單獨或聯(lián)合其它組合物治療骨損失。這些組合物含有抗重吸收物質(zhì)，如二磷酸鹽、降鈣素、雌激素、SERM’s和鈣源或骨形成補充劑，如甲狀旁腺激素或它的衍生物、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)、成骨素、NaF或者抑制素。參見參考文獻美國專利6,080,779。根據(jù)給藥模式、化合物可制成適合的組合物。
本發(fā)明的藥物可制備成適當?shù)南到y(tǒng)給藥或局部或定位給藥的劑型。系統(tǒng)給藥劑型包括不過不限定于，如用于注射(例如，肌肉、靜脈內(nèi)或者皮下注射)或者可以制備成用于透皮、透粘膜、鼻部或者口服給藥的劑型。劑型通常包括稀釋液，某些情況下，還有輔料、緩沖劑，防腐劑等。
用于口服給藥時，該組合物可以以脂質(zhì)體組合物或者微乳化劑的形式給藥。相應(yīng)的形式包括在本領(lǐng)域內(nèi)熟知的糖漿、膠囊、片劑。用于注射時，劑型可以制備成傳統(tǒng)的液體、懸液、適于在注射前溶解或重懸在液體中的固體，或制成乳狀液。適當?shù)馁x形劑包括例如水、鹽水、葡萄糖、甘油等。這類組合物可以含有一定量非毒性輔助物，如濕潤或者乳化劑、pH緩沖劑等，例如醋酸鈉、山梨聚糖單月桂酸酯及其它。
本發(fā)明的組合物可用于對患者局部定位給藥，患者包括人和其它脊椎動物，如家用動物、鼠和家畜類。對需要減少骨損失和/或者增加骨質(zhì)量的位點，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所熟知的多種技術(shù)形式。例如，噴霧、洗液、凝膠、或其它載體如醇、聚乙二醇、酯類、油和硅酮。需要局部用藥的情況包括例如骨折、修復(fù)缺陷或損傷骨復(fù)位。另外，還可以將抗重吸收藥物加到適當?shù)妮d體中，對自體移植物、異種移植物、假體和天然骨的結(jié)合處進行給藥，以輔助移植物或假體和天然骨的結(jié)合。
本發(fā)明的其它實施方案涉及到采用RANKL環(huán)競爭性結(jié)合的分析來篩選RANKL的抑制劑。用前面介紹的目的化合物和RANK結(jié)合分析進行RANK的結(jié)合檢測。一方面，令被檢化合物和RANK接觸并測定其解離率。已知本領(lǐng)域中有多種方法可用于結(jié)合分析。測定化合物和RANK結(jié)合能力的指標，如用本領(lǐng)域已經(jīng)成熟建立的解離率，并將結(jié)合活性和解離率相互關(guān)聯(lián)。例如可通過放射性標記參照化合物進行檢測，如用帶有125I的SEQ ID NO1的AA″環(huán)序列部分的多肽和RANK在1.5ml的管中孵育，以增加的濃度將檢測化合物加入這些反應(yīng)中。經(jīng)過適當孵育后，分離RANK/化合物復(fù)合物，如用層析柱，并用γ計數(shù)器評價結(jié)合的125I標記的肽。檢測化合物抑制50％參照肽的結(jié)合的必需量。將該值規(guī)算成未標記參照肽的結(jié)合濃度(相對抑制濃度(RIC)-1＝濃度檢測/濃度參照)。小的RIC-1值表明相對強的結(jié)合。反之，大的RIC-1值表明相對弱的結(jié)合，例如Latek等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.97，No.21，pp.11460-11465，2000。在這些分析中，可單獨或者聯(lián)合采用SEQ ID No2-5確認的RANKL環(huán)或其片段作為參照化合物。另外，涉及一個或者多個RANKL環(huán)時，也可以采用高通量分析的方法進行結(jié)合分析。
另外，本發(fā)明的目標和優(yōu)點在本領(lǐng)域中是顯而易見的。此處所作出的解釋和闡述目的是使其它領(lǐng)域的技術(shù)人員了解本發(fā)明的原則和應(yīng)用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠接受并應(yīng)用多種形式本發(fā)明。同時可能非常適合某些特殊需要。因此，本發(fā)明所述的特定實施方案，不能完全包括或者限定本發(fā)明。
此處實施例所列舉的所有的出版物和專利申請一并作為參考文獻，每一個出版物或者專利應(yīng)用又可以單獨作為參考文獻。
下面的例子闡述了本發(fā)明，不過不能完全闡述本發(fā)明的各個方面。
實施例實施例1RANKL的部分AA″環(huán)多肽對TRAP活性的作用效果。野生型C3H/HENJ小鼠購自Harlan Industries(Indianapolis，IN)。為了建立破骨細胞前體細胞培養(yǎng)，從4到6周齡小鼠的全骨髓中分離得到骨髓巨噬細胞(BMM)，并在37℃的含5％CO2的組織培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，收集非粘附的細胞，并置于Ficoll Hypaque梯度，收集梯度界面上的細胞。按照65000/cm2，將細胞重新置于α-最小基本培養(yǎng)基中，其補充有10％熱滅活的胎牛血清，在重組鼠M-CSF(10ng.ml)存在下，于37℃，5％CO2的孵箱中培養(yǎng)。該細胞培養(yǎng)物或者用遞增濃度的SEQ ID No1的多肽(AA環(huán)的子部分)進行處理，或者用和檢測化合物具有相同分子量的陰性對照拼湊(scrambled)肽進行處理。
圖1展示了該試驗的結(jié)果。如該圖顯示，通過酒石酸特異性酸性磷酸酶(TRAP)檢測可以看到，向破骨細胞前體中添加的檢測化合物競爭性抑制RANKL誘導破骨細胞分化的能力。上述磷酸酶是一種破骨細胞特異的酶，并且它的活性對應(yīng)于破骨細胞的分化。測定該酶在生色反應(yīng)中切割底物的能力以檢測TRAP活性。
從圖1中同樣可以看到，破骨細胞分化抑制呈劑量依賴性。即隨著培養(yǎng)物中被檢化合物濃度的增加，TRAP的活性被降低。同時，陰性對照肽對TRAP活性沒有影響。
序 列 表<110>Lam，JonathanRoss，F(xiàn).PatrickTeitelbaum，Steven<120>骨抗重吸收肽<130>BJCH 10079<160>611<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>11<212>PRT<213>小家鼠<400>1Pro Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser1 5 10<210>2<211>24<212>PRT<213>小家鼠<400>2Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser1 5 10 15Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala20<210>3
<211>10<212>PRT<213>小家鼠<400>3His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp1 5 10<210>4<211>7<212>PRT<213>小家鼠<400>4Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>5Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe1 5<210>6<211>316<212>PRT<213>小家鼠<400>6Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser Glu1 5 10 15Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His Pro20 25 30Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser35 40 45
Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser50 55 60Ile Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile65 70 75 80Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu85 90 95Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro100 105 110Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys115 120 125Glu Leu Gln His Ile Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala130 135 140Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro Glu145 150 155 160Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser165 170 175Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp180 185 190Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn195 200 205Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His210 215 220Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr225 230 235 240Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys245 250 255Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr260 265 270Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile275 280 285Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala290 295 300Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp305 310 315<210>7<211>24<212>PRT<213>人<400>7Asn Ala Thr Asp Ile Pro Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser1 5 10 15
Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala20<210>8<211>10<212>PRT<213>人<400>8His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu1 5 10<210>9<211>7<212>PRT<213>人<400>9Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>人<400>10Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe1 5<210>11<211>24<212>PRT<213>人<400>11Asn Ala Thr Asp Ile Pro Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser1 5 10 15Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Gly20
權(quán)利要求
1.分離的多肽，含有一個或者多個選自SEQ ID No1-SEQ IDNo5和SEQ ID No7-SEQ ID No11的氨基酸序列，該多肽具有RANK結(jié)合能力。
2.權(quán)利要求1的多肽，具有保守性或非保守性修飾并仍具有結(jié)合RANK的能力。
3.多肽，含有涉及結(jié)合RANK的RANKL序列，其中所述序列基本由一個或者多個選自SEQ ID No1-SEQ ID No5和SEQ IDNo7-SEQ ID No11的氨基酸序列構(gòu)成，并且所述多肽具有結(jié)合RANK的能力。
4.權(quán)利要求3的多肽，其具有保守性或者非保守性修飾并且具有抑制RANKL結(jié)合RANK的能力。
5.一個非RANKL的多肽，含有一個或者多個RANKL的外表面環(huán)，所述多肽具有結(jié)合RANK的能力。
6.多肽，包含一個或者多個RANKL外表面環(huán)，所述多肽具有競爭性抑制RANKL同RANK結(jié)合的活性。
7.權(quán)利要求1的多肽，其中基本由選自SEQ ID No1-SEQ IDNo5和SEQ ID No7-SEQ ID No11的氨基酸序列構(gòu)成。
8.包含權(quán)利要求1、2、3、4、5、6或者7的多肽的片段、類似物、模擬物或者衍生物的化合物，所述化合物具有結(jié)合RANK的能力。
9.藥物組合物，其在可藥用的載體、輔料、助溶劑、穩(wěn)定劑和/或者抗氧化劑中包含有效量的權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7的多肽。
10.藥物組合物，其在可藥用的載體、輔料、助溶劑、穩(wěn)定劑和/或者抗氧化劑中包含有效量的權(quán)利要求8的化合物。
11.抑制破骨細胞分化的方法，包括給予有效量的權(quán)利要求9的藥物組合物。
12.抑制骨重吸收的方法，包括給予有效量的權(quán)利要求9的藥物組合物。
13.競爭性抑制RANKL的方法，所述方法包括給予有效量的權(quán)利要求1-8的化合物。
14.競爭性抑制RANKL的方法，所述方法包括給予有效量的權(quán)利要求9的藥物組合物。
15.治療選自骨質(zhì)疏松、幼年骨質(zhì)疏松、成骨不全、高血鈣、甲狀旁腺功能亢進、骨質(zhì)軟化癥、骨質(zhì)缺乏、溶骨疾病、骨壞死、骨佩吉特病、由風濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、皮質(zhì)類固醇治療、轉(zhuǎn)移性骨疾病造成的骨損失、牙周骨損失、癌癥造成的骨損失、衰老相關(guān)的骨質(zhì)損失和其它形式的骨質(zhì)減少等疾病或癥狀的方法，其中所述方法包括給予有效量的權(quán)利要求9的藥物組合物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中該疾病或癥狀包括骨質(zhì)疏松、溶骨疾病、風濕性關(guān)節(jié)炎和骨骼性轉(zhuǎn)移。
17.多肽，包含(a)涉及結(jié)合RANK的RANKL序列，其中所述序列基本由至少一個選自SEQ ID No1-SEQ ID No5和SEQ IDNo7-SEQ ID No11的氨基酸序列構(gòu)成，并且所述多肽具有RANK結(jié)合能力；及(b)另外的氨基酸殘基，其在所述序列兩側(cè)翼而不消除該序列結(jié)合RANK的能力。
18.權(quán)利要求1的多肽，具有一個或者多個下述修飾(i)其中用保守或者非保守的氨基酸殘基取代該多肽的一個或者多個氨基酸殘基的修飾，這些氨基酸殘基能或者不能被遺傳密碼所編碼；(ii)其中一個或者多個氨基酸殘基包含取代基的修飾；(iii)其中該多肽和其它化合物融合的修飾，如增加該蛋白質(zhì)半衰期的化合物；(iv)其中附加氨基酸融合于該多肽以助于純化或者檢測和鑒定的修飾；或者(v)其中附加氨基酸殘基融合于該多肽以助于改變該蛋白質(zhì)的組織分布或者對特定位點如細胞膜或者胞外區(qū)室定位的修飾。
19.篩選RANKL結(jié)合化合物的方法，所述方法包括對被檢化合物、參考化合物同RANK之間進行結(jié)合分析，其中所述參考化合物基本由選自SEQ ID No1-SEQ ID No5和SEQ ID No7-SEQ IDNo11的至少一個序列構(gòu)成。
20.編碼權(quán)利要求1的多肽的多核苷酸；
21.權(quán)利要求20的多核苷酸，其根據(jù)遺傳密碼簡并性表現(xiàn)出規(guī)則的簡并性。
22.編碼權(quán)利要求20的多肽的多核苷酸，其顯示對權(quán)利要求1多肽的保守性取代。
23.包含權(quán)利要求20、21或者22的多核苷酸的表達載體。
24.包含權(quán)利要求23的表達載體的宿主細胞。
25.權(quán)利要求15的治療疾病的方法，包括給予需治療的個體有效量的一種或者多種藥物組合物以增強其骨生長。
全文摘要
本發(fā)明涉及和RANK結(jié)合且含有RANKL外表面環(huán)的氨基酸序列的肽。本發(fā)明還涉及該肽的片段、類似物以及衍生物。本發(fā)明還涉及含有所述肽的組合物。本發(fā)明還包括抑制破骨細胞分化的方法、抑制骨重吸收的方法以及競爭性抑制RANKL活性的方法。本發(fā)明還提供治療至少部分以骨質(zhì)損失為特征的疾病或者癥狀的方法。
文檔編號C12N5/10GK1635849SQ02823125
公開日2005年7月6日 申請日期2002年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月15日
發(fā)明者J·拉姆, F·P·羅斯, S·L·泰特爾鮑姆 申請人:巴恩斯－猶太醫(yī)院