專利名稱：一種基因消除pcr的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種基因消除PCR的方法，具體涉及一種通過PCR 的方法將基因群體中的非目標(biāo)基因消除從而達(dá)到分離目標(biāo)基因的目的，主要應(yīng)用于生物學(xué)，醫(yī)學(xué)，農(nóng)學(xué)，畜牧獸醫(yī)學(xué)，環(huán)境科學(xué)，食品科學(xué)等與分子生物學(xué)相關(guān)的基因消除和基因分離技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
PCR,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是 1985 年由美國 PE-Cetus公司的科學(xué)家Kary Banks Mulis發(fā)明的一種可在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA 序列的技術(shù)。這項(xiàng)新技術(shù)是根據(jù)生物體內(nèi)DNA序列能進(jìn)行快速復(fù)制的某些特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)在體外對某些特定DNA序列進(jìn)行快速擴(kuò)增，可在短時(shí)間內(nèi)在試管中獲得數(shù)百萬個(gè)特異DNA序列拷貝。PCR技術(shù)的原理是DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3’-0H末端，并以此為起始點(diǎn)，沿模板5’ -3’方向延伸，合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。PCR反應(yīng)的基本成分包括模板DNA(待擴(kuò)增DNA)、引物、4種脫氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和適宜的緩沖液。PCR 反應(yīng)中，通過雙鏈DNA的高溫變性(denaturation)、引物與模板的低溫退火(annealing)和適溫延伸(extension)這三步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)。每一循環(huán)中所合成的新鏈，又都可作為下一循環(huán)中的模板。PCR合成的特定的DNA序列產(chǎn)量隨著循環(huán)次數(shù)呈指數(shù)增加，從而達(dá)到迅速大量擴(kuò)增的目的。PCR技術(shù)操作簡便、結(jié)果可靠，并被世界各國廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、考古學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的基因研究和分析，對分子生物學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了革命性的影響。然而我們使用PCR的目的是用來擴(kuò)增已知或部分已知基因片段，對于那些我們未知的新基因，由于缺少相關(guān)信息，我們就無法有效地對其擴(kuò)增。
抑制性消減雜交技術(shù)(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)是 Diatchenko等于1996年依據(jù)消減雜交和抑制PCR發(fā)展起來的一種分離差異表達(dá)基因的新方法。該方法主要基于抑制PCR,并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化(normalization)和消減雜交 (subtractive hybridization)技術(shù)。所謂抑制PCR就是通過利用含引物序列的雙鏈接頭 (adaptor)充當(dāng)引物模板，使兩端接上同一接頭的非目的雙鏈片段(具有反向末端重復(fù)序列)，在退火時(shí)產(chǎn)生“鍋-柄”結(jié)構(gòu)，無法與引物配對，從而選擇性抑制非目的序列的擴(kuò)增，以達(dá)到抑制非目的片段而選擇性擴(kuò)增目的片段的目的。該方法運(yùn)用了雜交二級動力學(xué)原理， 即高豐度單鏈cDNA在退火時(shí)同源雜交速度快于低豐度單鏈cDNA，標(biāo)準(zhǔn)化步驟平衡了目的基因群中cDNA的豐度，從而使原來在豐度上有差別的單鏈cDNA相對含量達(dá)到基本一致，即低豐度差異表達(dá)的基因不會丟失，而高豐度差異表達(dá)的基因又不會被過量分離。消減雜交
5則扣除了目的基因群(tester)與驅(qū)趕基因群(driver)間的同源序列。SSH技術(shù)的操作流程首先提取2種細(xì)胞或組織的mRNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用含有4個(gè)堿基的限制性核酸內(nèi)切酶(RsaI或HaeIII)酶切，產(chǎn)生大小適當(dāng)?shù)钠蕉薱DNA片段，將tester cDNA分為均等的 2份，各自連接接頭，將過量的driver cDNA分別加到2份tester cDNA中，變性后退火雜交，獲得4種雜交產(chǎn)物單鏈tester cDNA、雙鏈tester cDNA、異源雙鏈cDNA和雙鏈driver cDNA。第一次雜交使單鏈tester cDNA均等化并富集差異表達(dá)基因，然后合并2份雜交產(chǎn)物，另加上新的變性單鏈drivercDNA，再次退火雜交；第二次雜交中只有第一次雜交后剩余的經(jīng)均等化和消減的單鏈tester cDNA,它能與driver cDNA—起形成各種雙鏈分子， 并產(chǎn)生新的雙鏈分子，這種分子的2個(gè)5’端有2個(gè)不同的接頭，使其能在以后的PCR中被有效擴(kuò)增。2次雜交后，填平黏性末端，利用巢氏PCR原理進(jìn)行擴(kuò)增。作為一種快速有效的分離差異表達(dá)基因的技術(shù)，SSH技術(shù)具有高度富集低豐度 cDNA，操作簡便，高效高速等優(yōu)點(diǎn)。但同時(shí)它也存在假陽性高等不可避免的缺點(diǎn)在二次扣除雜交driver-cDNA過量，可掩蓋tester-cDNA中表達(dá)有豐度差異的cDNA ;在SSH原理中認(rèn)為二次雜交后，同時(shí)加上相同接頭的片段鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火，使得片段兩端的反向重復(fù)序列形成類似“鍋柄”的結(jié)構(gòu)而無法擴(kuò)增，然而在我們的實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)“鍋柄”同樣能高效擴(kuò)增。另外一個(gè)例子就是RAPD (random amplified polymorphic DNA)技術(shù),它的原理就是利用單弓I物對模板進(jìn)行擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種基因消除PCR的方法，利用基因消除引物，含有堿基誤配的和Poly (dA)等特制的模板，耐高溫的限制性內(nèi)切酶及PCR組合等可消除混合基因群體中的非目標(biāo)基因。本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)是把非目標(biāo)基因做成基因消除引物，把含目標(biāo)基因的混合基因群體酶切加上帶有一個(gè)堿基誤配的限制性酶切位點(diǎn)及帶有Poly (dA)的接頭，經(jīng)過純化作為模板，在PCR反應(yīng)中，通過基因消除引物與模板退火延伸恢復(fù)正確的酶切位點(diǎn)，然后用耐熱的限制性酶酶切從而消除非目標(biāo)基因的接頭，使其無法得到擴(kuò)增。以上反應(yīng)是利用PCR儀做如下循環(huán)94°C，30秒；60°C，40秒；75°C，8分鐘，經(jīng)過12至18個(gè)循環(huán)，富集目標(biāo)基因，然后常規(guī)PCR進(jìn)一步擴(kuò)增目標(biāo)基因。本項(xiàng)發(fā)明中的限制性引物即可以由非目標(biāo)基因酶切擴(kuò)增制備，也可以根據(jù)非目標(biāo)基因的序列人工合成短核苷酸序列制備。特定的樣品處理，特定的物種均可以工廠化大量制備相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)的基因消除引物供商業(yè)化使用。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種基因消除PCR的方法，其步驟是(I)基因消除PCR模板的制備a.限制性核酸內(nèi)切酶ApeK-I和Mse-I消化含目標(biāo)基因的混合基因群體；b.設(shè)計(jì)并合成四條寡核苷酸鏈01，02，03，04并制備接頭，與上述⑴中a步驟的限制性酶切片段連接；c. Oligo-dT柱子純化上述(I)中b步驟中加上接頭的片段作基因消除PCR模板；(2)基因消除PCR引物的制備a.限制性核酸內(nèi)切酶ApeK-I和Mse-I消化不含目標(biāo)基因的混合基因群體；
b.設(shè)計(jì)并合成四條寡核苷酸鏈05，06，07，08并制備接頭，與上述⑵中a步驟限制性酶切片段連接；c.根據(jù)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與接頭序列設(shè)計(jì)引物05和07對上述(2)中b步驟中加上接頭的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增；d.采用乙醇沉淀法對(2)中c步驟中PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；e.限制性核酸內(nèi)切酶Mse-I消化⑵中d步驟中純化的PCR產(chǎn)物；f. PCR產(chǎn)物清潔試劑盒純化上述⑵中e步驟中酶切產(chǎn)物作基因消除PCR引物；(3)基因消除PCR循環(huán)a.消除非目標(biāo)基因，富集目標(biāo)基因，條件為在94°C條件下預(yù)熱I分鐘30秒；12 至18個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)包括94°C變性30秒，60°C退火40秒，75°C延伸8分鐘。20ul反應(yīng)體系為:40ng基因消除PCR模板，40ng基因消除PCR引物，6pM PCR引物01，4mM dNTP，4ul 5XPhusion HF Buffer,4U ApeK-1,0. 35UPhusion DNA Ploymerase ；b.目標(biāo)基因的進(jìn)一步擴(kuò)增，條件為在94°C條件下預(yù)熱I分鐘30秒；25至35個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)包括94°C變性30秒，54°C退火40秒，72°C延伸2分鐘30秒。20ul反應(yīng)體系為4ul 目標(biāo)基因富集 PCR 產(chǎn)物，2ul 10XPCR Buffer, 4mM dNTP，8pM PCR 引物 01，8pM PCR引物03，0.5U TaKaRa Taq。經(jīng)過循環(huán)之后目標(biāo)基因可在瓊脂糖凝膠上檢測出來。所述的步驟3中目標(biāo)基因富集階段，通過基因消除引物與模板退火延伸恢復(fù)正確的酶切位點(diǎn)， 然后用耐熱的限制性酶酶切從而消除非目標(biāo)基因的接頭，使其無法得到擴(kuò)增。所述的步驟(I)中限制性核酸內(nèi)切酶為NEB公司的ApeK-I和Mse-I。所述的限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)如下ApeK-I : 5，-G ▼ CWGC-3，3，-CGWC AG-S，Mse-I :5，-Tf TAA-3’3，-AAT AT-S,▲表示限制性酶從該處酶切所述的步驟(I)中設(shè)計(jì)的寡核苷酸鏈序列如下01 :5，-TTACCACGACCACCCTATTGCTGCTGC-3’02 :5’ -TAGCAGAAGCAATAGGGTGGTCGTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA A-3，03 :5’ -ACGAGGTGCGGTCTTGGACTACTT-3’04 :5，-CWGAAGTAGTCCAAGACCGCACCTCGT-3，所述的步驟⑴接頭04中W(W為A和T的簡稱)在合成時(shí)各用一半A (腺嘌呤) 和一半T (胸腺嘧啶)。所述步驟(I)中制備接頭的方法按合成報(bào)告單上說明將合成的寡核苷酸溶于去尚子水中，在微量尚心管中分別將01和02，03和04按60ul反應(yīng)體系混合，60ul反應(yīng)體系分別為15ul 01，15ul 02，24ulddH20，6ul 10XPCR Buffer ；15ul 03，15ul 04，24ul ddH20, 6ul 10XPCR Buffer。在PCR儀中95°C加熱5分鐘，然后自然冷卻至室溫(20_25°C，以下相同)。形成的接頭(01/02，03/04)如下
權(quán)利要求
1.一種基因消除PCR的方法，其步驟是(1)基因消除PCR模板的制備a.限制性核酸內(nèi)切酶ApeK-I和Mse-I消化含目標(biāo)基因的混合基因群體；b.設(shè)計(jì)并合成四條寡核苷酸鏈01，02，03，04并制備接頭，與上述(I)中a步驟的限制性酶切片段連接；c.Oligo-dT柱子純化上述(I)中b步驟加上接頭的片段作基因消除PCR模板；(2)基因消除PCR引物的制備a.限制性核酸內(nèi)切酶ApeK-I和Mse-I消化不含目標(biāo)基因的混合基因群體；b.設(shè)計(jì)并合成四條寡核苷酸鏈05，06，07，08并制備接頭，與上述(2)中a步驟的限制性酶切片段連接；c.根據(jù)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與接頭序列設(shè)計(jì)引物05和07對上述(2)中b步驟加上接頭的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增；d.采用乙醇沉淀法對(2)中c步驟PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；e.限制性核酸內(nèi)切酶Mse-I消化⑵中d步驟純化的PCR產(chǎn)物；f.PCR產(chǎn)物清潔試劑盒純化上述(2)中e步驟酶切產(chǎn)物作基因消除PCR引物；(3)基因消除PCR循環(huán)a.消除非目標(biāo)基因，富集目標(biāo)基因，條件為在94°C條件下預(yù)熱I分鐘30秒；12至 15個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性30秒，60°C退火40秒，75°C延伸8分鐘，20ul反應(yīng)體系為40ng基因消除PCR模板，45ng基因消除PCR引物，6pM PCR引物01，4mM dNTP, 4ul 5XPhusion HF Buffer,4U ApeK-1,0. 35UPhusion DNA Ploymerase ；b.目標(biāo)基因的進(jìn)一步擴(kuò)增，條件為在94°C條件下預(yù)熱I分鐘30秒；25至30個(gè)循環(huán)， 每個(gè)循環(huán)包括94°C變性30秒，54°C退火40秒，72°C延伸2分鐘30秒，20ul反應(yīng)體系為 4ul 目標(biāo)基因富集 PCR 產(chǎn)物，2ul 10XPCR Buffer, 4mM dNTP，8pM PCR 引物 01，8pM PCR 引物03，0. 5U TaKaRa Taq，經(jīng)過循環(huán)之后目標(biāo)基因在瓊脂糖凝膠上檢測出來。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(I)中的限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)如下ApeK-I :5，-G TCWGd3，-CGffC ▲ G-5，Mse-I :5’ -TfTAA-Sj3，-AAT ▲ T-5，ApeK-I為耐高溫的限制性內(nèi)切酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(I)中設(shè)計(jì)的寡核苷酸鏈序列如下01 :5’ -TTACCACGACCACCCTATTGCTGCTGC-3’02:5， -TAGCAGAAGCAATAGGGTGGTCGTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3，03:5’ -ACGAGGTGCGGTCTTGGACTACTT-3’04:5’ -CWGAAGTAGTCCAAGACCGCACCTCGT-3’02中設(shè)計(jì)有36個(gè)A的Poly (dA)，用于mRNA純化柱的純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(I)中制備接頭的方法按合成報(bào)告單上說明將合成的寡核苷酸溶于去離子水中，在微量離心管中分別將01和02，03和04按60ul反應(yīng)體系混合，60ul反應(yīng)體系為15ul 01，15ul 02，24ul ddH20，6ul 10XPCR Buffer ；15ul 07，15ul 08，24ul ddH20，6ul 10XPCR Buffer，在PCR儀中95°C加熱5分鐘，然后自然冷卻至室溫，形成的接頭01/02，03/04如下
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(I)中連接酶為T4 DNALigase，50ul反應(yīng)體系接頭與酶切片段的摩爾數(shù)之比約為10 l，5ul 10XT4 Ligase Buffer, lffeiss U T4Ligase,加離子水至 50ul。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(2)中設(shè)計(jì)的寡核苷酸鏈序列如下
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(2)中制備接頭的方法按合成報(bào)告單上說明將合成的寡核苷酸溶于去離子水中，在微量離心管中分別將05和06，07和08按60ul反應(yīng)體系混合，60ul反應(yīng)體系分別為15ul 05，15ul 06，24ul ddH20，6ul IOXPCR Buffer ；15ul 07，15ul08，24ul ddH20，6ul 10 X PCRBuffer,在PCR儀中95°C加熱5分鐘，然后自然冷卻至室溫，形成的接頭05/06，07/08如下 05/06: CGACATTCTG TAGGAAACACTAGGACTTGCTGTAAGACATCCT TTG TGATCCT GAAAT 07/08: CWGGTGACCTATAACAATCGTATCGCAACCCCACTGGATATTG TTAGCATAGCGTTGGG
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(2)中連接酶為T4DNALigase，50ul反應(yīng)體系接頭與酶切片段的摩爾數(shù)之比約為10 l，5ul 10XT4 Ligase Buffer, lffeiss U T4Ligase,加去離子蒸懼水至 50ul。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(2)中基因消除引物由非目標(biāo)基因酶切擴(kuò)增制備，根據(jù)非目標(biāo)基因的序列人工合成短核苷酸序列制備。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基因消除PCR的方法，其特征在于所述的步驟(3)中目標(biāo)基因富集階段，通過基因消除引物與模板退火延伸恢復(fù)正確的酶切位點(diǎn)，然后用耐熱的限制性酶酶切從而消除非目標(biāo)基因的接頭，使其無法得到擴(kuò)增。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因消除PCR的方法，本項(xiàng)發(fā)明可以消除混合基因群體中的非目標(biāo)基因。本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)是把非目標(biāo)基因做成或人工合成短序列基因消除引物，把含目標(biāo)基因的混合基因群體酶切加上帶有一個(gè)堿基誤配的限制性酶切位點(diǎn)及帶有Poly(dA)的接頭，經(jīng)過純化作為模板，在PCR反應(yīng)中，通過基因消除引物與模板退火延伸恢復(fù)正確的酶切位點(diǎn)，然后用耐熱的限制性酶酶切從而消除非目標(biāo)基因的接頭，使其無法得到擴(kuò)增。以上反應(yīng)是利用PCR儀做如下循環(huán)94℃，30秒；60℃，40秒；75℃，8分鐘，經(jīng)過12至18個(gè)循環(huán)，富集目標(biāo)基因，然后常規(guī)PCR進(jìn)一步擴(kuò)增目標(biāo)基因。本發(fā)明高效快速，操作簡便，成本低廉，可重復(fù)性高，分離效果好且假陽性率低。
文檔編號C12N15/10GK102604932SQ201110382308
公開日2012年7月25日 申請日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者呂茹婧, 張婷婷, 桓嬌嬌, 程夢蘭, 董五輩 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)