專利名稱：抗體人源化改造方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種人源化抗體及其人源化改造方法。
背景技術：
P185是由癌基因Her2/erbB_2編碼的一種細胞表面的重要的受體酪氨酸激酶，屬于表皮生長因子受體家族。P185/Her2受體與該家族其他成員類似，由胞外區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三個結(jié)構(gòu)域組成，其中胞外區(qū)(ECD)又分為四個亞區(qū)，其中的I、III亞區(qū)為亮氨酸富含區(qū)，II、IV亞區(qū)為半胱氨酸富含區(qū)(Carpenter G. (1987) Receptors of epidermal growthfactor and other polypeptide mitogens. Annu. Rev. Biochem. 56:881-914)。表皮生長因子家族受體廣泛地分布于多種組織，尤其在上皮組織、間質(zhì)組織以及神經(jīng)發(fā)生組織中表達，在調(diào)節(jié)細胞的増殖、分化、發(fā)育、黏附和遷移中起到了重要的作用。P185/Her2作為表皮生長 因子受體家族的信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡中最重要的ー員，其表達水平的異常與細胞信號轉(zhuǎn)導紊亂、腫瘤的發(fā)生和惡性發(fā)展緊密相關(Nancy EH, Heidi A, Lane N. (2005) ErbB receptors andcancer:the complexity of targeted inhioitors Nat. Rev. Cancer 5:341-354)。近年來P185/Her2 —直作為腫瘤治療領域中的熱點被廣泛研究。1985年，Greene M. I.研究組發(fā)現(xiàn),抗P185/Her2胞外區(qū)的單克隆抗體能夠使已經(jīng)轉(zhuǎn)化的Her2高表達的NIH3T3表型逆轉(zhuǎn)，使腫瘤細胞的表型趨于正常化，同時可以下調(diào)Her2受體的表達水平(Drebin JA, Link VC, Stern DF, Weinberg RA, Greene, MI. (1985)Down-modulationof an oncogene protein product and reversion of the transformed phenotype bymonoclonal antibodies. Cell 41:695-706)。隨后該實驗室又發(fā)現(xiàn)，抗Her2的單克隆抗體能抑制移植入裸鼠體內(nèi)的Her2轉(zhuǎn)化的NIH3T3腫瘤細胞的生長，從而第一次通過體內(nèi)實驗證明了抗Her2單抗可能對Her2高表達腫瘤有臨床治療的價值(Drebin JA, LinkVC, Weinberg RA, Greene MI. (1986) Inhibition of tumor growth by a monoclonalantibody reactive with an oncogene-encoded tumor antigen. Proc Natl Acad Sci USA83:9129-9133)。這ー發(fā)現(xiàn)大大促進了抗Her2單克隆抗體的抗腫瘤作用的研究，也掲示了抗體在腫瘤治療上應用的前景。但是，由于目前雜交瘤技術制備的單克隆抗體都是鼠源抗體，應用于人體時會產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)反應，所以不能直接用于人體內(nèi)的疾病治療。因此必須對單克隆抗體進行人源化改造，以減少和消除鼠源蛋白的免疫原性。最早用于單克隆抗體人源化改造的方法是構(gòu)建嵌合抗體(Vaughan TJ, OsbournJK, Tempest PR. (1998)Human antibodies by design. Nat. Biotechnol 6:535-539)。該方法是將鼠源抗體的可變區(qū)和人抗體恒定區(qū)通過基因工程技術連接起來，即將鼠源抗體的恒定區(qū)基因替換為人抗體恒定區(qū)基因，與抗原結(jié)合的可變區(qū)部分仍然是鼠源抗體。此方法構(gòu)建出的工程化嵌合抗體最大限度的保留了識別靶抗原能力的鼠源抗體可變區(qū)，同時又擁有了人抗體所有的恒定區(qū)的免疫學殺傷效應，而且由于這種嵌合抗體的免疫原性相比原始的鼠源抗體降低了 2/3，所以可以應用于人體治療(Davis TA. (1999) Final reporton the saiety and elficacy of retreatment with rituximab lor patients withnon-Hodgkin’s lymphoma. Blood 94:88a)。但由于其分子中還保留了 1/3的鼠源部分,用于長期臨床治療還有可能發(fā)生人抗鼠抗體反應。因此，為了進ー步降低嵌合抗體的免疫原性，需要對嵌合抗體的鼠源可變區(qū)進行進ー步的人源化改造，獲得全人源化抗體。目前應用較多的全人源化方法是將鼠源抗體可變區(qū)內(nèi)參與抗原結(jié)合的部分與選擇用于做模板的人抗體可變區(qū)的框架區(qū)重新拼接，使抗體可變區(qū)中除高度可變的互補決定區(qū)(CDR)來源于鼠抗體外，其余部分都換成人源的。由于抗體可變區(qū)中參與抗原結(jié)合的一般是其6個互補決定區(qū)(CDR)，故此過程也被稱為“CDR移植”，然后為了克服由于“CDR移植”可能導致的親和カ下降，需通過一系列對框架區(qū)殘基的突變，逐步恢復或提高抗體的抗原結(jié)合能力，從而得到人源化程度更高的重構(gòu)抗體(JonesPT,Dear PH, Foote J. u986)Replacing the complementarity-determining regions ina human antibody with those from a mouse,Riechmann L, Clark M, Waldmann H. (1988)Reshaping human antibodies for therapy, Chothia C, Lesk AM, Tramontano. (1989)AConformations of immunoglobulin hypervariable regions)。已手艮道的構(gòu)建重構(gòu)抗體的方法依照其人源化改造使用的模板的選擇和回復抗體結(jié)合能力的方法，主要又可以分成兩種。其一，通過序列対比，以序列相似性為標準分別選擇相似性最高的抗體輕鏈和重鏈可變 區(qū)的人源抗體為模板序列，在經(jīng)過CDR移植后的輕、重鏈序列基礎上，針對可能影響結(jié)合能力的框架殘基分別構(gòu)建一系列突變體，鑒別合適的突變組合。這些突變體需各自獨立制備及測試其抗原結(jié)合能力，然后將較好的突變組合起來，即需要對各個可能的殘基的突變、篩選的重復循環(huán)實驗，所以步驟繁復，效率低，效果不理想。其ニ，也是目前抗體人源化的ー種通用方法。具體的做法是，將非人源(例如鼠源)抗體的CDR移植于通用的人源抗體可變區(qū)模板VL K I -VH III的構(gòu)架上，通過對ー組選定的關鍵框架區(qū)殘基進行隨機誘變，構(gòu)建抗體Fab的噬菌體文庫，再通過噬菌體親和カ篩選鑒別出最佳框架序列。此方法相比第一種可以更快速地獲得優(yōu)化的框架序列，并可在此基礎上進ー步提高抗體的抗原親和カ；但是由于其選用的是通用模板，雖有普適性，但對不同抗體來講可能不是最優(yōu)的，另外通過構(gòu)建噬菌體庫篩選高親和カ抗體的方法也比較復雜，費時費力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個目的是提供ー種蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白，是如下任一所述蛋白質(zhì)a)由序列表中序列3中自N末端起第1_253位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(Hl_2 Vl+Linker+Vh)b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(Hl-2 VL+Linker+VH+Fc)C)將a)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白質(zhì)；d)將b)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸和/或第254-489位(Fe片段)氨基酸經(jīng)過ー個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白質(zhì)；e)由序列表中序列I中自N末端起第1-253位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(H1-1 Vl+Linker+Vh)
f)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(m-1 VL+Linker+VH+Fc)g)將e)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白質(zhì)；h)將f)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸和/或第254-489位(Fe片段)氨基酸經(jīng)過ー個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白質(zhì)；i)由序列表中序列5中自N末端起第1-253位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(H1-V1 VL+Linker+VH)j)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(H1_V1 VL+Linker+VH+Fc)k)將i)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸經(jīng)過ー個或幾 個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白質(zhì)；I)將j)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸和/或第254-489位(Fe片段)氨基酸經(jīng)過ー個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白質(zhì)。所述編碼基因為如下任一所述I)編碼所述a)所示蛋白的編碼基因為核苷酸序列是序列表中序列4自5'末端起第1-759位核苷酸所示DNA分子；2)編碼所述b)所不蛋白的編碼基因為核昔酸序列是序列表中序列4所不DNA分子;3)編碼所述e)所示蛋白的編碼基因為核苷酸序列是序列表中序列2自5'末端起第1-759位核苷酸所示DNA分子；4)編碼所述f)所不蛋白的編碼基因為核昔酸序列是序列表中序列2所不DNA分子;5)編碼所述i)所示蛋白的編碼基因為核苷酸序列是序列表中序列6自5'末端起第1-759位核苷酸所示DNA分子；6)編碼所述j)所不蛋白的編碼基因為核昔酸序列是序列表中序列6所不DNA分子;7)在嚴格條件下與I)-6)任一限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；8)與I) -6)任一限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組病毒或表達盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體是在pSectag2A載體的多克隆位點插入所述編碼基因得到的。本發(fā)明的另ー個目的是提供ー種抗體。本發(fā)明所提供的抗體，由兩個相同的上述任一所述蛋白組成；所述兩個相同的蛋白通過ニ硫鍵連接。上述任一所述蛋白在制備預防和/或治療腫瘤的藥物中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述任一所述抗體在制備預防和/或治療腫瘤的藥物中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的另ー個目的是提供ー種抗體的人源化改造的方法。本發(fā)明提供的抗體的人源化改造的方法包括如下步驟(I)、按照如下I或II所述方法選擇得到人源化抗體模板I、選擇重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別與待改造抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上的人源化抗體，將其作為預人源化抗體模板；從所述預人源化抗體模板中選擇與待改造抗體的可變區(qū)空間結(jié)構(gòu)相似性值最高的人源化抗體作為人源化抗體模板；
II、選擇滿足如下i )和ii )所示條件的人源化抗體，將其作為預人源化抗體模板；i )重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別與待改造抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上；ii)重鏈可變區(qū)的框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)分別與待改造抗體的重鏈可變區(qū)的框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上；從所述預人源化抗體模板中選擇與待改造抗體的可變區(qū)空間結(jié)構(gòu)相似性值最高的人源化抗體作為人源化抗體模板；所述可變區(qū)空間結(jié)構(gòu)為如下a)和/或b)所示a)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)一起構(gòu)成的空間結(jié)構(gòu)；b)重鏈可變區(qū)中的框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)中的框架區(qū)一起構(gòu)成的空間結(jié)構(gòu)；未知空間結(jié)構(gòu)的抗體，可通過軟件模擬出其空間結(jié)構(gòu)，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)一起構(gòu)成的空間結(jié)構(gòu)，和重鏈可變區(qū)中的框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)中的框架區(qū)一起構(gòu)成的空間結(jié)構(gòu)。(2)、按照如下III或IV所示方法獲得被置換后的人源化抗體模板III、用所述待改造抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)中的至少ー個⑶R氨基酸序列置換所述人源化抗體模板中對應的CDR氨基酸序列，獲得被置換后的人源化抗體模板；(未知⑶R區(qū)的抗體,可通過綜合Kabat等人和Chothia等人的序列定義進行鑒定，將兩種方法鑒定結(jié)果的綜合值作為最終值，即取兩鑒定結(jié)果中的最小值至最大值區(qū)段作為CDR 區(qū))。IV、用所述待改造抗體的抗原結(jié)合區(qū)氨基酸序列置換所述人源化抗體模板中對應的抗原結(jié)合區(qū)氨基酸序列，獲得被置換后的人源化抗體模板；(3)、將所述步驟(2)中的被置換后的人源化抗體模板作為改造后的目的人源化抗體；(4)用基因工程方法表達得到所述改造后的目的人源化抗體。上述方法中，在所述步驟(2)后，所述步驟(3)前，包括如下回變步驟將所述步驟
(2)得到的抗體的框架區(qū)的至少ー個氨基酸殘基替換為所述待改造抗體中相應位置的氨基酸殘基，至得到的抗體空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，將得到的抗體作為改造后的目的人源化抗體。(回變滿足如下兩個條件1)人源化程度高，2)使得到的抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；所述可變區(qū)為重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)；)上述方法中，所述回變步驟中，被替換的氨基酸殘基為影響步驟(2)得到的抗體的CDR區(qū)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或影響步驟(2)得到的抗體的抗原結(jié)合區(qū)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的氨基酸殘基；上述方法中，所述回變步驟中，被替換的氨基酸殘基位于所述步驟(2 )得到的抗體的游標區(qū)和/或被替換的氨基酸殘基位于所述步驟(2)得到的抗體的側(cè)鏈中距離所述CDR氣基酸殘基3埃以內(nèi)；上述方法中，在所述回變后，所述步驟(3)前，包括如下人源突變步驟將所述回變得到的抗體的框架區(qū)內(nèi)非人源的且不同于所述待改造抗體中相應位置氨基酸的氨基酸殘基突變?yōu)槿嗽窗被釟埢瑢⒌玫降目贵w作為改造后的目的人源化抗體。由上述任一所述方法得到的人源化抗體也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的抗體是特異識別腫瘤表面抗原P185HdkbB-2的嵌合抗體ChA21的人源化抗體變異體。本發(fā)明所提供的ChA21的人源化抗體變異體包括原嵌合抗體ChA21中鼠源的單鏈 抗體被完全人源化的scFv、鉸鏈區(qū)和人源的Fe區(qū)。其中被人源化的scFv的氨基酸序列為DIVLTQSPDSLAVSLGERVTINC KSSQTLLYSNNQKNYLA WYQQKPGQSPKLLIS ffAFTRKS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYC QQYSNYPffT FGAGTKLEIKR GGGGSGGGGS GGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKAS GYSFTGYFIN WVKQNPGQRLEffIG HISSSYATSTYNQKFKG KATLTVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVR SGNYEEYAMDY WGQGTLVTVS.下劃線部分分別為抗體的3個輕鏈和3個重鏈順序排列的共6個互補決定區(qū)(⑶Rs)，黑體部分為輕重鏈可變區(qū)之間的連接區(qū)(Linker)。本發(fā)明改造后的抗體構(gòu)架未改變的最初的嵌合抗體相比，與抗原的親和カ相近，并已經(jīng)達到了完全的人源化，具有更好的臨床應用前景。本發(fā)明的人源化抗體改造方法包括如下步驟基于目標抗體的可變區(qū)序列和結(jié)構(gòu)信息的人源抗體模板的選擇首先，將需人源化的目標抗體(ChA21)輕、重鏈可變區(qū)的序列分別通過IgBLAST(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/igblast/)進行序列相似性搜索,將輕、重鏈均有較高相似性(大于50%)且有晶體結(jié)構(gòu)的若干個人源抗體作為候選的人源化模板；再通過分子疊合比較候選模板抗體和目標抗體框架區(qū)的結(jié)構(gòu)相似性，選擇結(jié)構(gòu)相似度最高的一種作為抗體人源化的模板。如果目標抗體沒有晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，可以通過同源模擬獲得模擬分子結(jié)構(gòu)再進行比較。抗原結(jié)合區(qū)的移植首先，選擇目標抗體的抗原結(jié)合區(qū)段。對于沒有晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的抗體，一般是選擇其互補決定區(qū)(⑶R);(抗體的⑶R序列可以通過綜合Kabat等人和Chothia等人的序列定義加以鑒定)對于有抗體和抗原復合物晶體結(jié)構(gòu)的抗體，可以綜合CDR序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)獲得其抗原結(jié)合區(qū)域。然后，將選擇的區(qū)段殘基替換人源模板抗體相應位置上的殘基，得到最初版本的人源化抗P185/Her2抗體序列命名為為H1，并通過計算機同源模擬得到Hl的模擬的空間結(jié)構(gòu)。框架區(qū)殘基回復突變位點的選擇基于模擬的Hl結(jié)構(gòu)，采用計算生物學方法，對ー些重要的框架區(qū)殘基進行突變方向的篩選。這些殘基包括所有游標殘基(Vernier)和所有側(cè)鏈距離⑶R殘基3埃以內(nèi)的框架區(qū)殘基，選擇更符合抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的位點為需要突變的方向。具體到本例中，最初人源抗體Hl的輕鏈可變區(qū)VL的第4和49位殘基以及重鏈可變區(qū)VH的第71和93位殘基，被選擇需突變?yōu)槟繕丝贵w上的相應殘基，即VL第4殘基甲硫氨酸被亮氨酸取代，第49位殘基酪氨酸被絲氨酸取代的第71殘基丙氨酸被纈氨酸取代，第93位殘基蘇氨酸被纈氨酸取代。由此獲得人源化的 抗P185/Her2抗體序列H1-1。根據(jù)改造后親和カ分析結(jié)果和進ー步提高人源化程度的需要，還可對ー些CDR區(qū)以外的非抗原結(jié)合殘基進行人化修飾，如具體到本例子為Hl-I中VL區(qū)的殘基5、21和106以及VH區(qū)的殘基61、62、80和91，則選擇數(shù)據(jù)庫中人源抗體相應位置上出現(xiàn)頻率較高的殘基將它們分別替換，最終獲得比最初版本人源化程度更高的抗P185/Her2抗體序列H1-2。本發(fā)明所提供的方法與現(xiàn)有抗體人源化改造方法相比，有如下優(yōu)點和特異性首先，本方法在人源化模板抗體的選擇上，不同于以往方法分別選擇與輕鏈和重鏈相似的的兩個人源模板序列，而是選擇輕重鏈均與目標抗體有較高相似度的ー種人源抗體作為模版，且候選模板抗體盡量選擇有晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的，通過比較候選模版抗體和目標抗體的整體結(jié)構(gòu)的相似性，最終決定出模板抗體。這種將抗體的輕重鏈作為ー個整體來考慮，所選輕重鏈模板來自于同一個抗體，本身就是來自天然構(gòu)架，相比以往人為組合輕重鏈的方法更有利于輕重鏈框架區(qū)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而且在選擇框架區(qū)殘基突變時，可以不用再考慮是否需要突變輕重鏈界面殘基來使輕重鏈相互作用更穩(wěn)定的問題。其次，按結(jié)構(gòu)相似性選擇模板相比以往單純的通過序列相似性篩選模板更具有結(jié)構(gòu)合理性。因為抗體與抗原的結(jié)合直接取決于抗體互補決定區(qū)的構(gòu)象，而互補決定區(qū)又是搭建于框架區(qū)所構(gòu)建的平臺之上的，所以人源模板與目標抗體的空間結(jié)構(gòu)相似性越高越利于移植后的互補決定區(qū)構(gòu)象的維持，即越利于保持抗體結(jié)合抗原的能力。序列相似性雖然在一定程度上可以代表結(jié)構(gòu)相似性，但并不很精確。例如本發(fā)明實施例一中，具有最聞序列相似性的若干模板卻不是結(jié)構(gòu)相似性最好的。再次，在選擇框架區(qū)殘基突變時，結(jié)合抗體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)分析，可以直觀迅速的作出應突變位點的選擇。根據(jù)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的需要來選擇游標殘基中的那些有可能影響CDR區(qū)結(jié)構(gòu)的殘基以及決定其他一些位于抗體分子表面且可以進ー步人源化的殘基是否突變以及突變的方向，將以往需要多輪突變篩選或是通過噬菌體庫篩選突變的方式大大簡化，將所有突變選擇集中在一起進行結(jié)構(gòu)分析及其可行性，直接一步獲得最終的突變方案。因此相比以往方法，本方法更加簡捷明確。最后，相比于現(xiàn)有人源化方法，本方法的改造效果也更高ー些。通過本方法得到的ChA21抗體人源化的版本H1-2具有與原始抗體相當?shù)目乖Y(jié)合活性，相對親和力約為原始抗體的93%左右。而已報道的通過通用抗體人化方法改造后的抗體的親合力有高有低，水平很不穩(wěn)定(Carter P，Presta L, Gorman CM, Ridgway JB, Henner D, Wong WL, RowlandAM, Kotts C, Carver ME, Shepard HM. (1992)Humanization of an anti_pl85HER2 antibodyfor human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289，Presta LGj Chen H，0Connor SJ，Chisholm V，Meng YGj Krummen L, Winkler M，F(xiàn)errara N，(1997)Humanizationof an anti-VEGF monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and otherdisorders, Cancer Res. 57:4593 - 4599)。為直接比較本方法和通用方法的改造效果，在本發(fā)明實施例中同時應用通用人源化方法中的通用人源模板VL K I -VHIII對ChA21進行人源化改造，得到ChA21的另ー個人源化版本H2-1，通過親和力測定發(fā)現(xiàn)H2-1的親和カ相比原始抗體下降了一倍以上，說明就本例中的抗體ChA21而言，本發(fā)明中的人化方法的改造效果明顯好于現(xiàn)有其他方法。本領域已知有各種不同方法可用于表達和純化人源化的抗體。如大腸桿菌表達系統(tǒng)，操作簡單快速，成本低，但是可溶性抗體表達量低(100ug/L)，表達產(chǎn)物不能正確修飾，容易形成包含體，純化困難，不同突變體克隆之間表達量差異很大，使下一歩抗體親和カ的測定受抗體濃度影響，不易判斷；酵母表達系統(tǒng)，如pPIC9K載體,分泌表達,可用His-tag柱純化，純化較方便，但需要構(gòu)建穩(wěn)定細胞株，周期長，表達量雖然比大腸桿菌系統(tǒng)高(一般在mg/L級別)，但不同突變體克隆之間表達量差異也很大；而本發(fā)明中采用的293T真核瞬時表達系統(tǒng)，以pSectag2A為載體,可分泌表達,產(chǎn)物可用His_tag柱或蛋白A柱純化，因此將設計好的人源化抗體的重組質(zhì)粒DNA經(jīng)脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞，表達產(chǎn)物能正確修飾，純化簡單，表達量較高(3 — 10mg/L)，且不同突變體克隆之間表達量差異小，雖然花費相對較高，但用此系統(tǒng)表達純化的抗體性質(zhì)測定結(jié)果明確、穩(wěn)定。另外，應用ELISA法測定抗體表達量和相對親和力，結(jié)果準確，重復性好，且無需對表達上清進行純化，便于快速鑒定篩 選出人源突變體。


圖I為抗體ChA21輕鏈和重鏈的可變區(qū)氨基酸序列，序列編號依照Kabat規(guī)則排序。下劃線部分為綜合Kabat和Chothia的序列定義劃分出的互補決定區(qū)(⑶Rs)。圖2為抗體ChA21的單鏈可變區(qū)(scFv，PDB號2GJJ)同選定的人源模板抗體huCC49 (PDB號1ZA6)的可變區(qū)的空間結(jié)構(gòu)比對結(jié)果。圖3為抗體ChA21的單鏈可變區(qū)與其識別抗原部分亞區(qū)的復合物結(jié)構(gòu)。圖4用于說明通過ChA21的抗原結(jié)合區(qū)移植獲得的最初版本的人源化抗體Hl的氨基酸序列，以及同原始鼠源抗體和人源模板抗體的可變區(qū)ー級序列比對。圖5是通過計算機同源模擬得到的人源化抗體Hl-I的分子模型。圖6用于說明在人源化抗體Hl序列及結(jié)構(gòu)基礎上進行一系列的框架區(qū)殘基突變的選擇結(jié)果，以及和獲得的新的人源化抗體變異體Hl-I和H1-2的序列的比較?；パa決定區(qū)用方框標出。圖7用于說明以基于通用模板VL K I -VH III獲得的人源化抗體hu4D5 (PDB號1FVC)為人源模板對ChA21進行人源化改造，以及獲得的人源化抗體H2-1的氨基酸序列。圖8為人源化抗體Hl-I和H1-2重組表達載體的構(gòu)建示意圖。圖9為抗體ChA21和其各種人源化突變體的抗原結(jié)合曲線。將各種轉(zhuǎn)染的293T細胞的上清中的抗體的起始濃度都配制成lug/ml，再通過ELISA檢測各種突變體與抗原的結(jié)合曲線。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、嵌合抗體chA21的人源化改造
嵌合抗體chA21的序列早已由L. S. Cheng等人描述(Chen L. S. , Liu A. P. , Liu.J. Construction,expression and characterization of the engineered antibodyagainst tumor surface antigen P185c_erbb_2. Cell Res. 2003，13:35-48),如圖 I 所不。嵌合抗體chA21的結(jié)構(gòu)兩條相同的蛋白鏈通過在Fe區(qū)形成的ニ硫鍵結(jié)合。姆條蛋白鏈依次由輕鏈可變區(qū)(\)、linker、重鏈可變區(qū)(Vh)和Fe區(qū)依次連接組成，其氨基酸序列如SEQ IDN0:9 所示，其中，第 1-114 位為第 115-134 位為 linker，第 135-253 位為 Vh，第 254-489位為Fe。一、人源抗體模板的選擇序列相似性比對將chA21的輕鏈可變區(qū)與人源化抗體的輕鏈可變區(qū)進行氨基酸序列相似性比對，將chA21的重鏈可變區(qū)與人源化抗體的重鏈可變區(qū)進行氨基酸序列相似性比對。通過 IgBLAST (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/igblast/)在蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB,Protein Data Bank)中分別進行序列相似性搜索。具體選擇搜索參數(shù)如下程序blastp ；提交序列來源mouse ;數(shù)據(jù)庫pdb ;比對序列來源human。顯示比對結(jié)果的數(shù)量可以根據(jù) 比對結(jié)果來具體選擇，其他參數(shù)可選擇默認參數(shù)。在搜索的結(jié)果中，選擇與輕、重鏈均有較高序列相似性的抗體作為候選人源化抗體模板，一般選擇相似性在50%以上作為選擇閾值，也可以根據(jù)具體的搜索結(jié)果選擇不同的閾值。在ChA21的比對結(jié)果中，由于序列相似性高于50%的候選模板太多，所以提高選擇閾值，選擇兩條鏈相似性均高于60%的抗體作為候選人源化抗體模板；結(jié)構(gòu)相似性比對再應用PyMOL軟件通過分子疊合(align)比較候選人源化抗體模板和ChA21的可變區(qū)(scFv，PDB號2GJJ)的整體空間結(jié)構(gòu)相似性(即蛋白中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)一起組成的空間結(jié)構(gòu))和框架區(qū)空間結(jié)構(gòu)相似性(即蛋白中重鏈可變區(qū)中框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)中框架區(qū)一起組成的空間結(jié)構(gòu))(由RMS表示其結(jié)構(gòu)間差異的大小)，各候選模板的序列比對和空間結(jié)構(gòu)比對結(jié)果見表I (所有表中的序列編號均采用Kabat序列編號)。選擇結(jié)構(gòu)相似度最高的huCC49 (PDB 1ZA6)(表中看應該是最低)作為嵌合抗體ChA21人源化的模板，兩抗體空間結(jié)構(gòu)的比對見圖2。其中模板IFVC是抗體4D5基于通用人源抗體模板VL k I -VHIII進行人源改造而獲得的已經(jīng)人源化的抗體hu4D5，其框架區(qū)序列與VLk I -VHIII基本一致，基于此通用模板結(jié)構(gòu)對ChA21同時進行人源化改造，用以比較本發(fā)明方法和通用方法的人化改造效果。表I、ChA21可變區(qū)與各候選模板序列和結(jié)構(gòu)相似性比對候選模板輕鏈可變重鏈可變輕鏈框架 s:鏈框架整體空間框架區(qū)空 結(jié)構(gòu)區(qū)序列相 K序列相區(qū)序列相區(qū)序列相結(jié)構(gòu)差異間結(jié)構(gòu)差
—(PDB號)—似度％__似度％__似度％__似度％__(RMS)—異(RMS)
—1ZA6__78. I__61.7__79__73. 6 —_ 0. 666 0. 646 —— 1B4J__64__60. 5__76.5__73. 6__0. 679 __ 0. 662 _
—1I9R__62. 3__61. 7__76. 5__74. I__0. 705 __ 0. 675 _
—3DIF__65. 8__66. I__79__79. 3__0. 778 __0. 691 _
_3FCT__63. 2__60. 8__71. 6__73. 6__0. 841__ 0. 765 _
_ IFVC _58. 8 47. 5 J_71 b J_54 _|_ 0. 881 0. 866 _ ニ、抗原結(jié)合區(qū)的移植選擇ChA21的抗原結(jié)合區(qū)段?？贵wChA21的⑶R序列可以通過結(jié)合Kabat等人和Chothia等人的序列定義加以鑒定，CDR序列劃分結(jié)果見表2。最終劃定的各CDR區(qū)為圖I中帶下劃線的區(qū)段。表2、ChA21的互補決定區(qū)(⑶R)序列劃分結(jié)果
CDR LOOPKabatChothiaCombine
LIL24-L34L24-L34L24-L34
L2L50-L56L50-L56L50-L56
L3L89-L97L89-L97L89-L97
HlH31-H35BH26-H32. . 34 H26-H35B
H2H50-H65H52-H56H50-H65
H3H95-H102H95-H102H95-H102由于抗體ChA21的單鏈可變區(qū)與其識別抗原部分亞區(qū)的復合物晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)已經(jīng)獲得解析，其抗原結(jié)合區(qū)段可以直觀地從復合物結(jié)構(gòu)上獲得，如圖3所示?？梢钥闯鲋劓淐DR2的后半段位于抗體分子的表面，既不參與抗原結(jié)合，對其他CDR區(qū)結(jié)構(gòu)也沒有影響，也不參與抗體輕重鏈之間的相互作用，所以從提高序列人源化程度的要求考慮，將其作為非抗原結(jié)合區(qū)，而不移植ChA21的重鏈⑶R2上的此段序列。將其余⑶R區(qū)域的殘基替換抗體huCC49 (1ZA6)相應位置上的⑶R區(qū)域的殘基，得到最初版本的人源化抗體序列Hl (序列比較結(jié)果見圖4)，并應用蛋白結(jié)構(gòu)模擬軟件MODELLER通過同源模擬得到其模擬的空間結(jié)構(gòu)。(表3中給出的H3為H95-H102，此序列編號為Kabat序號，而非序列實際順序編號，如圖I中所標識的⑶R區(qū)H3序列為H95-H102 (SGNYEEYAMDY)，相對圖4中其位置為101-111(SGNYEEYAMDY)這一段。)三、Hl框架區(qū)殘基的突變選擇(回變)
基于最初版本人源化抗體Hl的模擬的空間結(jié)構(gòu)，對ー些重要的框架區(qū)殘基進行突變方向的篩選首先考慮的ー類殘基是可能影響互補決定區(qū)構(gòu)象或結(jié)構(gòu)的殘基，或是可能直接影響抗原結(jié)合的殘基，根據(jù)之前對于此類框架殘基的研究，列出此類殘基的清單(見表3)，這些殘基包括近30多種對⑶R結(jié)構(gòu)有潛在貢獻的游標殘基(Vernier);另外，在模擬的Hl結(jié)構(gòu)中選擇所有側(cè)鏈距離CDR殘基3埃以內(nèi)的殘基，從結(jié)構(gòu)角度考慮這些殘基也可能直接影響CDR區(qū)殘基的構(gòu)象，而且它們恰好都包括在表3所列的游標殘基之中。通常需要將這些殘基全部突變?yōu)樵伎贵wChA21的相應位點的殘基，稱為“回變”，但這樣做有可能會因為添加了非人源序列的元件而導致免疫原性増大的危險，因此，在對游標殘基的回變選擇過程中，可保留ー些側(cè)鏈位于抗體分子表面的游標殘基，同時對于回變之后可能會導 致回變的殘基與其周圍殘基發(fā)生結(jié)構(gòu)沖突的殘基也應選擇不回變，例如H69Leu->Phe。通過選擇回變得到人源化序列H1-1，其模擬結(jié)構(gòu)如圖5所示。表3、游標殘基突變選擇
權(quán)利要求
1.抗體的人源化改造的方法，包括如下步驟 (1)、按照如下I或II所述方法選擇得到人源化抗體模板 1.選擇重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別與待改造抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上的人源化抗體，將其作為預人源化抗體模板； 從所述預人源化抗體模板中選擇與待改造抗體的可變區(qū)空間結(jié)構(gòu)相似性值最高的人源化抗體作為人源化抗體模板； II、選擇滿足如下i)和ii )所示條件的人源化抗體，將其作為預人源化抗體模板； i)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別與待改造抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上； ii)重鏈可變區(qū)的框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)分別與待改造抗體的重鏈可變區(qū)的框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上； 從所述預人源化抗體模板中選擇與待改造抗體的可變區(qū)空間結(jié)構(gòu)相似性值最高的人源化抗體作為人源化抗體模板； 所述可變區(qū)空間結(jié)構(gòu)為如下a)和/或b)所示a)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)一起構(gòu)成的空間結(jié)構(gòu)山)重鏈可變區(qū)中的框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)中的框架區(qū)一起構(gòu)成的空間結(jié)構(gòu)； (2)、按照如下III或IV所示方法獲得被置換后的人源化抗體模板 III、用所述待改造抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)中的至少ー個CDR氨基酸序列置換所述人源化抗體模板中對應的CDR氨基酸序列，獲得被置換后的人源化抗體模板； IV、用所述待改造抗體的抗原結(jié)合區(qū)氨基酸序列置換所述人源化抗體模板中對應的抗原結(jié)合區(qū)氨基酸序列，獲得被置換后的人源化抗體模板； (3)、將所述步驟(2)中的被置換后的人源化抗體模板作為改造后的目的人源化抗體； (4)用基因工程方法表達得到所述改造后的目的人源化抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述步驟(2)后，所述步驟(3)前，包括如下回變步驟將所述步驟(2)得到的抗體的框架區(qū)的至少ー個氨基酸殘基替換為所述待改造抗體中相應位置的氨基酸殘基，至得到的抗體空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，將得到的抗體作為改造后的目的人源化抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述回變步驟中，被替換的氨基酸殘基為影響步驟(2)得到的抗體的CDR區(qū)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或影響步驟(2)得到的抗體的抗原結(jié)合區(qū)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的氨基酸殘基； 和/或，所述回變步驟中，被替換的氨基酸殘基位于所述步驟(2)得到的抗體的游標區(qū)和/或被替換的氨基酸殘基位于所述步驟(2)得到的抗體的側(cè)鏈中距離所述CDR氨基酸殘基3埃以內(nèi)； 和/或，所述方法中，在所述回變后，所述步驟(3)前，包括如下人源突變步驟將所述回變得到的抗體的框架區(qū)內(nèi)非人源的且不同于所述待改造抗體中相應位置氨基酸的氨基酸殘基突變?yōu)槿嗽窗被釟埢?，將得到的抗體作為改造后的目的人源化抗體。
4.由權(quán)利要求1-3中任一所述方法得到的人源化抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人源化抗體及其人源化改造方法。該抗體是如下任一所述蛋白質(zhì)a)由序列表中序列3中自N末端起第1-253位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明改造后的抗體構(gòu)架未改變的最初的嵌合抗體相比，與抗原的親和力相近，并已經(jīng)達到了完全的人源化，具有更好的臨床應用前景。
文檔編號C12N15/63GK102863533SQ201210175279
公開日2013年1月9日 申請日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月21日
發(fā)明者肖衛(wèi)華, 劉兢, 胡思怡, 常亮 申請人:中國科學技術大學