專利名稱：亞全能干細(xì)胞、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細(xì)胞領(lǐng)域，具體地涉及ー種其來(lái)源于剪斷的人類臍帶或胎盤(pán)的亞全能干細(xì)胞。同時(shí)，本發(fā)明也涉及該亞全能干細(xì)胞的制備方法，以及該亞全能干細(xì)胞的用途。
背景技術(shù)：
人體是由萬(wàn)億個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的。細(xì)胞是人體的基本結(jié)構(gòu)單位和功能單位，由干細(xì)胞分化而來(lái)，因此干細(xì)胞是人體各種組織器官的起源細(xì)胞。干細(xì)胞具有自我復(fù)制和多向分化的特征。在正常生殖生理過(guò)程中，干細(xì)胞由受精卵分化而來(lái)。受精卵最初發(fā)育形成原始胚胎干細(xì)胞，后者具有形成完整個(gè)體的全部潛能。原始胚胎干細(xì)胞進(jìn)一歩分化増殖形成囊胚樣結(jié)構(gòu)，其內(nèi)層細(xì)胞群的細(xì)胞也稱胚胎干細(xì)胞。囊胚內(nèi)層的單個(gè)胚胎干細(xì)胞不能形成ー個(gè)完整的個(gè)體，但具有形成人體各種組織的全能性。囊胚胚胎干細(xì)胞繼續(xù)分化發(fā)育，逐步形成胎兒各器官的功能執(zhí)行細(xì)胞，同時(shí)以不對(duì)稱分裂増殖的模式在機(jī)體組織特別是造血組織，包 括連接胎兒和母體的胎盤(pán)臍帶血、骨髄、外周血、肝和脾中保留有不同分化潛能的干細(xì)胞。在整個(gè)胎兒發(fā)育到成年這個(gè)漫長(zhǎng)而復(fù)雜的過(guò)程中，干細(xì)胞逐級(jí)喪失其全能性，形成亞全能干細(xì)胞(Pluripotent stem cell,PSC)、多能干細(xì)胞(Multipotent stem cell)和專能干細(xì)胞(Specialized stem cell),后者按分化功能分別稱造血干細(xì)胞、血管干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞，等等。這些處于不同發(fā)育階段的干細(xì)胞在人體組織器官的發(fā)育生長(zhǎng)、損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著決定性的作用，因此干細(xì)胞可以用來(lái)新陳代謝、修復(fù)組織器官，使機(jī)體活力旺盛而保持健康狀況。迄今為止，人們對(duì)造血干細(xì)胞等專能干細(xì)胞的了解和臨床使用比較深入，對(duì)胚胎干細(xì)胞的了解也有長(zhǎng)足的進(jìn)展，但對(duì)亞全能干細(xì)胞，即在發(fā)育階段及分化能力上與胚胎干細(xì)胞接近，表達(dá)胚胎干細(xì)胞的許多特征，又具備多能干細(xì)胞的許多生物學(xué)特征，移植到體內(nèi)不產(chǎn)生畸胎瘤，這樣ー類干細(xì)胞了解甚少。但是，亞全能干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞范疇，避免了類似胚胎干細(xì)胞的醫(yī)學(xué)倫理問(wèn)題，其在臨床上具有廣闊現(xiàn)實(shí)的應(yīng)用前景。因此，亞全能干細(xì)胞已經(jīng)成為干細(xì)胞研究的ー個(gè)熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明ー個(gè)目的是提供ー種亞全能干細(xì)胞，其來(lái)源于剪斷的人類臍帶或胎盤(pán)，可以用作基因治療藥物的載體細(xì)胞及用于制備治療細(xì)胞損傷或細(xì)胞衰老疾病的藥物。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供ー種制備亞全能干細(xì)胞的方法。本發(fā)明還有ー個(gè)目的是提供上述亞全能干細(xì)胞的用途。為達(dá)上述目的，本發(fā)明提供了ー種亞全能干細(xì)胞，其特征在于其來(lái)源于剪斷的人類臍帶或胎盤(pán)，表達(dá)標(biāo)志分子⑶151和0CT4，不表達(dá)⑶184，還表達(dá)一些其它胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和血管干細(xì)胞的其它主要特異性免疫標(biāo)志，包括Sox-2、巢蛋白、CD90、CD29、CD13、CD166、CD105、CD44、CD73、CD49e、神經(jīng)節(jié)苷脂⑶2 和 HLA-I。不表達(dá) CD34、CD31、CD45、CD 133、CD 106、CDl lb、CD271、CD41、CD61、CD42b 和 HLA-IL· 其中 0CT4 是胚胎干細(xì)胞的ー種特異性標(biāo)志。CD151屬于ー個(gè)廣泛表達(dá)的表面分子，在部分干細(xì)胞、表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、樹(shù)束狀細(xì)胞等細(xì)胞表達(dá)，在淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞不表達(dá)。CD184是趨化因子受體4 (CXCR4)，在淋巴細(xì)胞、樹(shù)束狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞和⑶34+干細(xì)胞上有表達(dá)本發(fā)明亞全能干細(xì)胞的特征在于其在培養(yǎng)容器中貼壁生長(zhǎng)，能向人體內(nèi)、中、夕卜胚層組織，包括但不限于血管、神經(jīng)、肝臟、心肌、骨、軟骨和脂肪組織分化，注射至動(dòng)物體內(nèi)不產(chǎn)生畸胎瘤。本發(fā)明提供了ー種從剪斷的人類臍帶或胎盤(pán)制備亞全能干細(xì)胞的方法，該方法包括下列步驟a.無(wú)菌采集剪斷的人類臍帶和/或胎盤(pán)；b.進(jìn)行組織破碎，蛋白酶降解組織，過(guò)篩，分離得到原代單個(gè)核細(xì)胞；c.將原代單個(gè)核細(xì)胞接種于裝有干細(xì)胞培養(yǎng)液I或II的培養(yǎng)容器中貼壁生長(zhǎng)，蛋白酶消化后培養(yǎng)擴(kuò)增傳代四代以上，收集干細(xì)胞，分裝后液氮低溫凍存；其中干細(xì)胞培養(yǎng)液I的制備過(guò)程如下50-70%體積的DMEM/F 12培養(yǎng)液和30_50%體積的MCDB-201培養(yǎng)液混合成基礎(chǔ)培養(yǎng)液后，再添加下列終濃度的組分2-10%體積的血清，l(T8mol/L 的地塞米松，10-50mg/mL 的 ITS, O. l-10mmol/L 的谷氨酰胺，1-lOOng/mL 的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和Ι-lOOng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；其中細(xì)胞培養(yǎng)液II的制備過(guò)程如下50-70%體積的DMEM/F 12培養(yǎng)液和30_50%體積的MCDB-201培養(yǎng)液混合，再添加下列終濃度的組分0. 1-5%W/V的人血清白蛋白，1-100 μ g/mL的亞麻酸，1-100 μ g/mL的亞油酸，O. 1-5%體積的非必需氨基酸，10_8mol/L的地塞米松，10-50mg/mL的ITS，O. l-10mmol/L的谷氨酰胺，Ι-lOOng/mL的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和Ι-lOOng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。本發(fā)明提供了ー種從剪斷的人類臍帶或胎盤(pán)制備亞全能干細(xì)胞的方法，該方法包括下列步驟a.無(wú)菌采集剪斷的人類臍帶和/或胎盤(pán)；b.進(jìn)行組織破碎，蛋白酶降解組織，過(guò)篩，分離得到原代單個(gè)核細(xì)胞；c.使用常規(guī)的磁式細(xì)胞分選法，以⑶184陰性、⑶151陽(yáng)性和0CT4陽(yáng)性選擇組合分選，從采集的單個(gè)核細(xì)胞中分選出目的細(xì)胞，分裝后液氮低溫凍存。本發(fā)明制備亞全能干細(xì)胞的方法的特征在于其中所述的蛋白酶是膠原酶I或胰蛋白酶。本發(fā)明提供了亞全能干細(xì)胞在制備用于基因治療的藥物中作為載體細(xì)胞的用途。本發(fā)明也提供了亞全能干細(xì)胞在制備用于治療細(xì)胞損傷或細(xì)胞衰老疾病的藥物中的用途。本發(fā)明也提供了亞全能干細(xì)胞在制備促進(jìn)干細(xì)胞向成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化及刺激造血的藥物中的用途。本發(fā)明也提供了亞全能干細(xì)胞在制備用于治療免疫調(diào)節(jié)異常疾病的藥物中的用途。、
本發(fā)明也提供了亞全能干細(xì)胞在制備用于治療大腦損傷疾病的藥物中的用途。本發(fā)明也提供了亞全能干細(xì)胞在制備用于治療移植物抗宿主病(aGVHD)的藥物中的用途。本發(fā)明的有益效果是I.按照本發(fā)明的制備方法制備的⑶151+⑶184—0CT4+干細(xì)胞可以用作基因治療藥物的載體，轉(zhuǎn)染特定基因后直接移植到體內(nèi)組織，進(jìn)行相關(guān)疾病的基因治療。2.按照本發(fā)明的制備方法制備的⑶151+⑶184_0CT4+干細(xì)胞可以將干細(xì)胞從自體或他人的胎盤(pán)臍帶中分離出來(lái)，制備成適宜的干細(xì)胞產(chǎn)品供醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療使用。 2.按照本發(fā)明的制備方法制備的⑶151+⑶184—0CT4+干細(xì)胞，由于其亞全能性，可以通過(guò)病變局部或靜脈輸注治療多種疾病。為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步說(shuō)明，其中所述的實(shí)施例僅僅是示例本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。


圖I是流式細(xì)胞儀檢測(cè)的干細(xì)胞(第6代)表面免疫標(biāo)志。圖2是流式細(xì)胞儀檢測(cè)的干細(xì)胞胞內(nèi)標(biāo)記檢測(cè)。圖3是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞成脂分化染色圖。圖4是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞成骨分化染色圖。圖5是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞成軟骨分化染色圖。圖6是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞向心肌分化的凝膠電泳圖。圖7是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞向神經(jīng)分化的凝膠電泳圖。圖8是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的凝膠電泳圖。圖9是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ad_GFP48小時(shí)后的熒光照片。圖10是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞對(duì)大鼠出血性腦損傷的治療試驗(yàn)的結(jié)果圖。圖11是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞支持造血干細(xì)胞生長(zhǎng)的圖表。圖12A是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞對(duì)ConA刺激的小鼠脾細(xì)胞增殖的影響的曲線圖。圖12B是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞對(duì)ConA刺激的小鼠脾細(xì)胞分泌IFN- Y的影響的曲線圖。圖12C是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞對(duì)PHA刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)增殖的影響的曲線圖。圖12D是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞對(duì)對(duì)PHA刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分泌IFN-Y的影響的曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面就本發(fā)明中所涉及的培養(yǎng)基、術(shù)語(yǔ)及技術(shù)進(jìn)行說(shuō)明本發(fā)明所用的干細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM/F12 培養(yǎng)液(購(gòu)自 Invitrogen 公司)MCDB-201 培養(yǎng)液(購(gòu)自 Sigma 公司)
本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)解釋表達(dá)指陽(yáng)性率大于等于70%。不表達(dá)指陽(yáng)性率小于等于5%。ITS (insulin transferrin selenium) ITS,膜島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒酸鈉的混合物，Sigma等公司可以購(gòu)買到。非必需氨基酸是人體非必需氨基酸的混合液，Sigma公司有售。本發(fā)明中所用技術(shù)包括流式細(xì)胞儀技術(shù)和磁珠分選，RT-PCR，細(xì)胞培養(yǎng)、傳代等技術(shù)主要參照以下專著或論文韓忠朝主編的《造血干細(xì)胞理論與移植技木》河南科技出版社，2000年出版；Lv LL等.具有支持造血功能和其它潛能的人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和鑒足Usolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stemcells with hematopoiesis-supportive function and other potentials) . Haematologica, 91(8) :1017-26, 2006。除非特別限定，本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的普通含義，所使用的技術(shù)為本領(lǐng)域常規(guī)技木。配制細(xì)胞培養(yǎng)液
細(xì)胞培養(yǎng)液A :5L的DMEM/F12培養(yǎng)液和5L的MCDB-201培養(yǎng)液混合成基礎(chǔ)培養(yǎng)液后，再添加下列終濃度的組分2%體積的胎牛血清，10_8mOl/L的地塞米松，10mg/mL的ITS，O. lmmol/L的谷氨酰胺，Ing/mL的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和Ing/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
_2] 細(xì)胞培養(yǎng)液B:7L的MEM/F 12培養(yǎng)液和3L的MCDB-201培養(yǎng)液混合成基礎(chǔ)培養(yǎng)液后，再添加下列終濃度的組分10%體積的胎牛血清，10_8mOl/L的地塞米松，50mg/mL的ITS，IOmmoI/L的谷氨酰胺，100ng/mL的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和100ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。細(xì)胞培養(yǎng)液C :6L的DMEM/F 12培養(yǎng)液和4L的MCDB-201培養(yǎng)液混合成基礎(chǔ)培養(yǎng)液后，再添加下列終濃度的組分6%體積的胎牛血清，10_8mol/L的地塞米松，30mg/mL的ITS，5mmol/L的谷氨酰胺，50ng/mL的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和50ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。細(xì)胞培養(yǎng)液D 5L的DMEM/F12培養(yǎng)液和5L的MCDB-201培養(yǎng)液混合，再添加下列終濃度的組分
0.1%W/V的人血清白蛋白，I μ g/mL的亞麻酸，I μ g/mL的亞油酸，0. 1%體積的非必需氨基 酸，l(T8mol/L的地塞米松，10mg/mL的ITS,0. lmmol/L的谷氨酰胺，Ing/mL的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和Ing/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。細(xì)胞培養(yǎng)液E :7L的DMEM/F12培養(yǎng)液和3L的MCDB-201培養(yǎng)液混合，再添加下列終濃度的組分5%ff/V的人血清白蛋白，100 μ g/mL的亞麻酸，100 μ g/mL的亞油酸，5%體積的非必需氨基酸，l(T8mol/L的地塞米松,50mg/mL的ITS, 10mmol/L的谷氨酰胺，100ng/mL的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和lOOng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。細(xì)胞培養(yǎng)液F : 6L的DMEM/F12培養(yǎng)液和4L的MCDB-201培養(yǎng)液混合，再添加下列終濃度的組分2. 5%ff/V的人血清白蛋白，50 μ g/mL的亞麻酸，50 μ g/mL的亞油酸，2. 5%體積的非必需氨基酸，10_8mol/L的地塞米松，25mg/mL的ITS，5mmol/L的谷氨酰胺，50ng/mL的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和50ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。實(shí)施例I用貼壁傳代培養(yǎng)法分離⑶151+⑶184_0ct4+亞全能干細(xì)胞取剪斷的人類胎盤(pán)，進(jìn)行⑶151+⑶184_0ct4+干細(xì)胞制品的制備。具體步驟如下I)無(wú)菌采集剪斷的人類胎盤(pán)；2)剪切至〈O. 5厘米的小碎片、將胎盤(pán)機(jī)械剪切成l_5mm3小組織塊，采用O. 5mg/mL膠原酶I 37°C消化I小時(shí)，lmg/mL胰酶37°C消化30分鐘，期間溫和震蕩5次，過(guò)篩，離心收集細(xì)胞懸液，接種于T75cm2培養(yǎng)瓶中，在細(xì)胞培養(yǎng)液A中培養(yǎng)5到7天，呈梭狀樣細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)；3)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后進(jìn)ー步培養(yǎng)傳代純化、擴(kuò)增傳代6代后收獲細(xì)胞、濃縮并用細(xì)胞保存液制備成細(xì)胞混懸液后，部分細(xì)胞送作質(zhì)量檢測(cè)，其余分裝置液氮罐深低溫保存，建⑶151+⑶184_0ct4+干細(xì)胞種子庫(kù)。 分離的⑶151+CD184-0ct4+干細(xì)胞，培養(yǎng)12-72小時(shí)內(nèi)貼壁，培養(yǎng)3 — 5天后增長(zhǎng)速度增快，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞樣克隆形成，此后增生成為形態(tài)相對(duì)均一的梭形細(xì)胞，呈平行排列生長(zhǎng)或旋渦狀生長(zhǎng)。胰蛋白酶消化后傳代，細(xì)胞經(jīng)2 — 4天培養(yǎng)即可鋪滿80%的瓶底表面。經(jīng)傳代擴(kuò)增4周天共收獲約109_1(1。成纖維樣細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示平均約每400個(gè)單個(gè)核細(xì)胞可形成I個(gè)CFU-F。細(xì)胞鑒定采用流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)干細(xì)胞(第6代)免疫標(biāo)志。參考圖I、圖2，檢測(cè)顯示，本方法制備的干細(xì)胞表面⑶151陽(yáng)性率高達(dá)99%以上，但不表達(dá)⑶184、⑶34、CD45、HLA-II等，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)高表達(dá)0CT4和Sox_2。實(shí)施例2用貼壁傳代培養(yǎng)法分離⑶151+⑶184_0ct4+亞全能干細(xì)胞與實(shí)施例I相同，所不同的是所用的細(xì)胞培養(yǎng)液是細(xì)胞培養(yǎng)液B。所得的結(jié)果與實(shí)施例I大體相同。實(shí)施例3用貼壁傳代培養(yǎng)法分離⑶151+⑶184_0ct4+亞全能干細(xì)胞與實(shí)施例I相同，所不同的是所用的細(xì)胞培養(yǎng)液是細(xì)胞培養(yǎng)液C。所得的結(jié)果與實(shí)施例I大體相同。實(shí)施例4用貼壁傳代培養(yǎng)法分離⑶151+⑶184_0ct4+亞全能干細(xì)胞與實(shí)施例I相同，所不同的是所用的細(xì)胞培養(yǎng)液是細(xì)胞培養(yǎng)液D。所得的結(jié)果與實(shí)施例I大體相同。實(shí)施例5用貼壁傳代培養(yǎng)法分離⑶151+⑶184_0ct4+亞全能干細(xì)胞與實(shí)施例I相同，所不同的是所用的細(xì)胞培養(yǎng)液是細(xì)胞培養(yǎng)液E。所得的結(jié)果與實(shí)施例I大體相同。實(shí)施例6用貼壁傳代培養(yǎng)法分離⑶151+⑶184_0ct4+亞全能干細(xì)胞與實(shí)施例I相同，所不同的是所用的細(xì)胞培養(yǎng)液是細(xì)胞培養(yǎng)液F。
所得的結(jié)果與實(shí)施例I大體相同。實(shí)施例7用磁式細(xì)胞分選法分離CD151+CD184_0CT4+亞全能干細(xì)胞從臍帶中分離提取CD151陽(yáng)性細(xì)胞的制備方法是無(wú)菌采集剪斷的臍帶；2)剪切組織至〈O. 5厘米的小碎片、將臍帶機(jī)械剪切成l_5mm3小組織塊,采用5mg/mL膠原酶I 37。C消化I小時(shí)，5mg/mL胰酶替代物(TyrpLE Express)37° C消化30分鐘，期間溫和震蕩6次，加胎牛血清中和胰酶后將組織懸液通過(guò)細(xì)胞篩，離心收集細(xì)胞懸液；然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，先使用CD184+磁珠進(jìn)行陰性選擇得到CD184—細(xì)胞，然后用CD151+
磁珠分離得到⑶151+⑶184—細(xì)胞，0CT4—磁珠分離作為干細(xì)胞種子，置液氮罐保存?zhèn)溆?。?shí)施例8CD151+CD184でCT4+干細(xì)胞具有以下生物學(xué)特性干細(xì)胞的主要生物學(xué)特征是自我更新和多向分化。本發(fā)明研究表明本發(fā)明實(shí)施例1-7所制備的⑶151+CD184_0CT4+干細(xì)胞具有以下生物學(xué)特性I.高増殖能力將實(shí)施例I的所制得的干細(xì)胞從IO6干細(xì)胞起始，置75cm2無(wú)菌塑料培養(yǎng)瓶傳代培養(yǎng)，3-4天便長(zhǎng)滿瓶底，然后以I瓶傳擴(kuò)至3瓶的方式傳代，傳6至7代后干細(xì)胞總數(shù)量可達(dá)109_1(1。這些干細(xì)胞可以傳至20代以上，其細(xì)胞免疫標(biāo)志(表I)表達(dá)無(wú)明顯改變，完全滿足規(guī)?；a(chǎn)和多人次臨床治療的需要。表I :培養(yǎng)不同代數(shù)后的干細(xì)胞免疫標(biāo)志表達(dá)
表面免疫標(biāo)志 P6陽(yáng)性率(％ ) P20陽(yáng)性率(％ )
Nestin FITC98.6798.73
CDI5 1 RE99.2299.96
CD90 FITC99.5794.42
HLA-I FITC99.7994.45
HLA-II FITC2.870.46
CD34 FlTC0.510.05
CD45 FlTC0.370.18
CD4I FITC0.340.38
CD29 PE99.9199.85
CD 13 PE99.7399.54
CD 166 PE99.5294.34
CD31 PE0.820.05CD133 PE1.230.21
CD 105 PE99.7894.7
CD44 PE99.9599.79
CD73 PE10099.72
CD49e PE99.8799.79
CD 106 PE1.091.54
CDlO PE95.9932.21
CDI Ib PE2.022.73
CD42b PE0.170.56
GD2 PE68.3779.02
CD271 PE1.750.78
細(xì)胞內(nèi)免疫標(biāo)志
OCT-4 PE9S.9396.87
Sox2 PE98.5996.36
Nanog FITC94.8295.81
c-Myc PE99.1498.53注P,passage,傳代代數(shù)。2.向三個(gè)胚層組織的分化能力用干細(xì)胞分化培養(yǎng)液對(duì)⑶151+CD184_0CT4+干細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)ー步誘導(dǎo)能使其向多胚層分化I)成脂分化取實(shí)施例I所制得的第六代(P6代)干細(xì)胞在傳代的同時(shí)以2 X W4/cm2的密度接種于24孔板中，每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)液A 0.8ml ;待細(xì)胞達(dá)80%融合，換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液(IMDM, 10%FBS, I μ M 地塞米松，O. 5mM (IBMX)，100 μ M 吲哚美辛和 10 μ g/ml 胰島素)，用上述分化培養(yǎng)基每3 - 4天換液，持續(xù)3周。用油紅O染色。油紅O染色法步驟細(xì)胞PBS清洗兩次，每次5分鐘；用4%多聚甲醛固定15分鐘；PB S漂洗兩次，每次5分鐘；用60%異丙醇漂洗。加入油紅O染色15分鐘，結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢钥闯觯景l(fā)明的亞全能干細(xì)胞可以成脂分化。2)成骨分化取實(shí)施例I所制得的P6代干細(xì)胞在傳代的同時(shí)以2X104/cm2的密度接種于24孔板中，每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)液B O. 8ml ;待細(xì)胞達(dá)80%融合，換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液(高糖DMEM, 10_8M地塞米松，I. 5mg/ml β -磷酸甘油，50 μ g/ml抗壞血酸),以后姆3 4天換一次液；21天后,進(jìn)行von Kossa染色固定后的細(xì)胞用PBS洗漆2遍；加入5%硝酸銀水溶液中10分鐘，紫外光曬10分鐘，蒸餾水洗滌；浸入5%次亞硫酸鈉溶液中，蒸餾水洗，結(jié)果見(jiàn)圖4。
可以看出，本發(fā)明的亞全能干細(xì)胞可以成骨分化。3)成軟骨分化將實(shí)施例I所制得干細(xì)胞制成2. 5X IO5個(gè)細(xì)胞/ml濃度的細(xì)胞離心到15ml離心管，形成高密度微球，用如下培養(yǎng)基培養(yǎng)21天DMEM-HG，I X ITS, I X亞油酸-牛血清白蛋白，IOOnM地塞米松，50 μ g/ml維生素C，和10ng/ml TGF β I.期間，每3-4天換一次液。21天后用石蠟包埋，切片成5 μ m厚，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的番紅O法染色，結(jié)果見(jiàn)圖5?？梢钥闯?，本發(fā)明的亞全能干細(xì)胞可以成軟骨分化。4)向心肌分化以4X103/cm2將實(shí)施例I制得的P3代亞全能干細(xì)胞接種6孔板內(nèi)，細(xì)胞達(dá)到80 %融合后，用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為DMEM-HG，10%體積FBS和6 μ M 5-脫氧雜氮胞苷(5-aza-2' -deoxycytidine)處理24小時(shí)后，換含10%體積的FB S的DMEM-HG培養(yǎng)基培養(yǎng)14天.用RT-PCR心肌特異的標(biāo)志，α -肌動(dòng)蛋白，肌間線蛋白，MyoDl,肌球蛋白和肌鈣蛋白的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖6。心肌特異基因的RT-PCR的引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表2?？梢钥闯觯景l(fā)明的亞全能干細(xì)胞可以向心肌分化。5)向神經(jīng)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基DMEM/F12, Β27,和增加以下條件(I) 20ng/mlEGF, 10ng/ml bFGF,和 10ng/ml PDGF 誘導(dǎo)實(shí)施例 I 制得的干細(xì)胞 7 天；(2) 10ng/mlbFGF, 10ng/ml TOGF和50ng/ml NGF誘導(dǎo)實(shí)施例I制得的干細(xì)胞7天.在十四天，提取細(xì)胞RNA檢測(cè)巢蛋白、GFAP、MAP2、NG2的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖7。神經(jīng)特異基因的RT-PCR的引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表2?？梢钥闯?，本發(fā)明的亞全能干細(xì)胞可以向神經(jīng)分化。6)向肝細(xì)胞分化實(shí)施例I制得的干細(xì)胞在MDM中補(bǔ)充20ng/mlbFGF和20ng/mlHGF中誘導(dǎo)培養(yǎng)，3天換液一次，重新補(bǔ)充上述因子，在14天可以檢測(cè)得到肝特異基因，蛋白AFP、白蛋白的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖8。肝特異基因的RT-PCR的引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表2?？梢钥闯?，本發(fā)明的亞全能干細(xì)胞可以向肝細(xì)胞分化。表2誘導(dǎo)后組織特異性基因的RT-P C R的引物
基囚引物序列(5’—3’)
.CCTGACCCTGAAGTACCCTATC
GC ATTTG C GGTG GAC G AT
·GACCGCTTCGCCAACTACAT Uesmin ,「c T c c A A1 T c CCGC AT C T
CCTGCTGTGCTGTATAACCy0SH1G TCC ATCCC GAAG TC A AT
;G C C G C C T G A G C A A A G T A A AT
M>0LJ AT A G C G G AT G G C G T T G C G C A T G G A C A A G GIG G AT G A A G A G p 011111 TTCTCGGTGTCCTCCTTCTT C A G C T G G C G C A C C T C A A G AT G Nestm AGGG A AGTTGGGCTC AGG ACTGG G C ACG C AG TATG A G GC A ATG CGGTCTTCACCACGATGTT
CTGGCATTGACCTCCCTAA ^C TGTTTC CC TTC C C ATTTT
CCTTGGCTTTGACCCTGACTCA CTGTTGTGG AGCA ATACGGAAAAGCCCACTCCAGCATC CAATCCAGCACATCTC CTC
·GATTGCCTTTGCTCAGTAT Albumm TTG G G jjq TC ATCTTTG TG
CTGTCCCTGTATGCCTCTG
丨 1 nATGTC AC G C AC G ATTTCC 實(shí)施例2-7所制得的干細(xì)胞也進(jìn)行了上述高増殖能力，及成脂、成骨、成軟骨、向
心肌、向肝臟、向肝細(xì)胞的分化試驗(yàn)，結(jié)果大體相同。
實(shí)施例9CD151+CD184_0CT4+干細(xì)胞作為基因治療的載體細(xì)胞本發(fā)明利用攜帯綠色熒光蛋白基因的腺病毒Ad-GFP轉(zhuǎn)染體外擴(kuò)增的實(shí)施例I所制得的PSC，取3 6代PSC，按I X IO5/孔的密度接種于24孔板中培養(yǎng)24h后吸出培養(yǎng)液，加入用培養(yǎng)液稀釋的Ad-GFP,1X108PFU/ml，加入培養(yǎng)孔，另設(shè)孔作為未加入病毒的空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，用流式觀察轉(zhuǎn)染率，并用熒光顯微鏡照相。結(jié)果見(jiàn)圖9 :轉(zhuǎn)染Ad-GFP48小時(shí)后檢測(cè)，轉(zhuǎn)染效率97. 76%。實(shí)施例2-7所制得的干細(xì)胞也進(jìn)行了上述試驗(yàn)，結(jié)果大體相同。由此可見(jiàn)，本發(fā)明的亞全能干細(xì)胞可以作為制備用于基因治療的藥物中的載體細(xì)胞。 實(shí)施例10⑶151+CD184-0ct4+干細(xì)胞對(duì)大鼠出血性腦損傷的治療試驗(yàn)按照實(shí)施例I所述的制備方法制備得到⑶151+⑶184_0ct4+干細(xì)胞。參考Rosenberg 等的方法[Rosenberg GA, et al. , Stroke, 1990，21:801-807],制作大鼠腦出血模型制作。將大鼠麻酔后固定于立體定向儀上，頭頂部去毛消毒后正中縱向切ロ，于前顱偏右旁開(kāi)3. Omm,向后I. 4mm處在盧頁(yè)骨上鉆一小孔，用10 μ I微量進(jìn)樣器進(jìn)針5. 6mm,緩慢分次注入2 μ I含O. 4U膠原酶VII的PBS，留針5min后緩慢拔針，縫合切ロ。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物完全蘇醒后，觀察到提尾懸空時(shí)出血對(duì)側(cè)前肢屈曲、內(nèi)收，自主運(yùn)動(dòng)時(shí)身體向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈，說(shuō)明模型制作成功。在模型制作成功24小時(shí)后進(jìn)行⑶151+⑶184_0ct4+干細(xì)胞移植，大鼠麻醉后固定于立體定向儀上，拆線，在原孔內(nèi)用10 μ I微量進(jìn)樣器進(jìn)針5. 6mm，緩慢分次注入10 μ I細(xì)胞懸液，留針5min后緩慢拔針，縫合切ロ。對(duì)照組用同樣方法注入等量PBS。免疫組織化學(xué)檢測(cè)于PSC移植后28天處死2組大鼠。4%多聚甲醛500ml經(jīng)左心室灌注后，斷頭取腦，置4%多聚甲醛后固定24小時(shí)，冠狀位切取以出血區(qū)域?yàn)橹行牡陌▊?cè)腦室室管膜下區(qū)、基底節(jié)區(qū)和海馬的厚度2mm的腦組織標(biāo)本，觀察移植后的損傷區(qū)的大小。結(jié)果見(jiàn)圖10，圖10是大鼠腦出血28天后腦切片，箭頭所示為損傷區(qū)；Normal是正常組，PBS是PBS注射組，PSC是CD151+CD184でct4+干細(xì)胞治療組。該圖顯示CD151+CD184でct4+干細(xì)胞移植組損傷區(qū)比P B S組明顯小，說(shuō)明⑶151+⑶184_0ct4+干細(xì)胞可以明顯減少大鼠腦出血后對(duì)大腦的損傷。實(shí)施例2-7所制得的干細(xì)胞也進(jìn)行了上述試驗(yàn)，結(jié)果大體相同。實(shí)施例11CD151+CD184でct4+干細(xì)胞支持造血將實(shí)施例I的第6代⑶151+CD184-0ct4+干細(xì)胞以2. OX IO4/孔的濃度種于24孔板，6°CQ20Gy照射后種臍血⑶34+細(xì)胞2. OX 104，共同培養(yǎng)8周，每周半量換液。將換出的細(xì)胞種于甲基纖維素完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)兩周后計(jì)數(shù)集落，大于等于50個(gè)細(xì)胞為ー個(gè)集落。對(duì)照組為單獨(dú)臍血⑶34+細(xì)胞培養(yǎng)組和PSC與臍血⑶34+細(xì)胞共同培養(yǎng)組。見(jiàn)圖11圖表所示，集落形成數(shù)量檢測(cè)結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示。細(xì)胞培養(yǎng)集落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示單獨(dú)臍血⑶34+細(xì)胞培養(yǎng)組兩周后即無(wú)集落形成，而⑶151+CD184_0ct4+干細(xì)胞和臍血⑶34+細(xì)胞共同培養(yǎng)組可維持6周尚可有集落形成，表明⑶151+⑶184_0ct4+干細(xì)胞具有支持長(zhǎng)期造血的能力。實(shí)施例2-7所制得的干細(xì)胞也進(jìn)行了上述試驗(yàn)，結(jié)果大體相同。實(shí)施例12CD151+CD184-0ct4+干細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的功能I. MTT檢測(cè)實(shí)施例I的⑶151+⑶184_0ct4+干細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用T細(xì)胞在PHA刺激下成聚簇/克隆性增埴，在倒置顯微鏡下觀察，CD151+CD184_0ct4+干細(xì)胞共培養(yǎng)條件下的T細(xì)胞聚簇/克隆大小較對(duì)照組縮小，數(shù)量減少。MTT檢測(cè)提示在⑶151+⑶184_0ct4+干細(xì)胞共培養(yǎng)條件下，絲裂原刺激T細(xì)胞增殖受到抑制，増殖指數(shù)減低，差別有顯著意義(P〈0. 01)。通過(guò)比較不同梯度濃度下的T細(xì)胞増殖抑制情況可以發(fā)現(xiàn)在T細(xì)胞與⑶151+⑶184_0ct4+干細(xì)胞比值為4 :1、2 :1和I :1時(shí)的增殖抑制率由30. 36%增加至為41. 14%和51. 92%，說(shuō)明⑶151+⑶184でct4+干細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的增殖抑制作用具有劑量依賴性。2.⑶151+CD184_0ct4+干細(xì)胞抑制ConA刺激后小鼠脾細(xì)胞Y -干擾素的表達(dá)材料與方法I)取C57小鼠脾臟，按常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液106/ml備用。2)取足量實(shí)施例I制備的⑶151+⑶184_0ct4+干細(xì)胞，經(jīng)放射線(銫源)照射后制備以下濃度的懸液(細(xì)胞數(shù)/ml) :1x106，5x105，1x105，5x104，1x104。按下表分組并在96孔板中加入相應(yīng)劑量的小鼠脾細(xì)胞、⑶151+⑶184_0ct4+干細(xì)胞和ConA，每組均設(shè)3重復(fù)孔。
權(quán)利要求
1.一種從剪斷的人類臍帶或胎盤(pán)制備亞全能干細(xì)胞的方法，該方法包括下列步驟 a.無(wú)菌采集剪斷的人類臍帶和/或胎盤(pán)； b.進(jìn)行組織破碎，蛋白酶降解組織，過(guò)篩，分離得到原代單個(gè)核細(xì)胞； c.使用常規(guī)的磁式細(xì)胞分選法，以CD184陰性、CD151陰性和0CT4陽(yáng)性選擇組合分選，從采集的單個(gè)核細(xì)胞中分選出目的細(xì)胞，分裝后液氮低溫凍存，建亞全能干細(xì)胞種子庫(kù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備亞全能干細(xì)胞的方法，其中所述的蛋白酶是膠原酶I或胰蛋白酶；根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備亞全能干細(xì)胞的方法，其中所述的蛋白酶是膠原酶I或膜蛋白酶。
3.一種使用權(quán)利要求I或2所述方法制備的亞全能干細(xì)胞，其特征在于其來(lái)源于剪斷的人類臍帶或胎盤(pán)，表達(dá)標(biāo)志分子⑶151和Sox-2，不表達(dá)⑶34。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的亞全能干細(xì)胞，其特征在于其還表達(dá)標(biāo)志分子0CT4、巢蛋白、CD90、CD29、CD13、CD166、CD105、CD44、CD73、CD49e、神經(jīng)節(jié)苷脂 GD2 和 HLA-1 ;其不表;^CD184、CD31、CD45、CD133、CD106、CDllb、CD271、CD41、CD61、CD42b 和 HLA-II0
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的亞全能干細(xì)胞，其特征在于其在培養(yǎng)容器中貼壁生長(zhǎng)，能向人體內(nèi)、中、外胚層組織分化，注射至動(dòng)物體內(nèi)不產(chǎn)生畸胎瘤。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的亞全能干細(xì)胞，其特征在于所述胚層組織是血管、神經(jīng)、肝臟、心肌、骨、軟骨和脂肪組織。
7.權(quán)利要求3至6中任一權(quán)利要求所述的亞全能干細(xì)胞在制備用于基因治療的藥物中作為載體細(xì)胞的用途。
8.權(quán)利要求3至6中任一權(quán)利要求所述的亞全能干細(xì)胞在制備用于治療細(xì)胞損傷或細(xì)胞衰老疾病的藥物中的用途。
9.權(quán)利要求3至6中任一權(quán)利要求所述的亞全能干細(xì)胞在制備促進(jìn)干細(xì)胞向成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化及刺激造血的藥物中的用途。
10.權(quán)利要求3至6中任一權(quán)利要求所述的亞全能干細(xì)胞在制備用于治療免疫調(diào)節(jié)異常疾病的藥物中的用途。
11.權(quán)利要求3至6中任一權(quán)利要求所述的亞全能干細(xì)胞在制備用于治療大腦損傷疾病的藥物中的用途。
12.權(quán)利要求3至6中任一權(quán)利要求所述的亞全能干細(xì)胞在制備用于治療移植物抗宿主病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種亞全能干細(xì)胞，其來(lái)源于剪斷的人類臍帶或胎盤(pán)，細(xì)胞標(biāo)志是CD151+OCT4+CD184-，其在培養(yǎng)容器中貼壁生長(zhǎng)，能向人體內(nèi)、中、外胚層組織分化。本發(fā)明也公開(kāi)了該亞全能干細(xì)胞的制備方法，及其用于制備治療細(xì)胞損傷或細(xì)胞衰老疾病的藥物中的用途，以及其用作基因治療藥物的載體細(xì)胞的用途。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK102703380SQ20121016671
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2008年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
發(fā)明者趙寶娜 申請(qǐng)人:北京漢氏聯(lián)合生物技術(shù)有限公司