專利名稱：桑樹花青素生物合成三個關(guān)鍵基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，特別是涉及桑樹花青素生物合成三個關(guān)鍵基因黃烷酮3-羥化酶、類黃酮_3’ -羥化酶及二氫黃酮醇-4-還原酶基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
花青素(anthocyanin)屬于黃酮類化合物,是廣泛存在于被子植物(主要是開花植物)中的水溶性天然色素，主要以糖苷的形式存在于植物細(xì)胞的液泡中，在液泡不同的pH值下，使花瓣呈現(xiàn)五彩繽紛的顏色，也是花和果實的主要色素，控制花和果實呈現(xiàn)紅色、粉紅色、藍(lán)色和紫羅蘭色等不同顏色。桑樹的成熟果實桑椹，口味鮮美，色澤艷麗，花青素含量極為豐富，主要成分是矢車菊_3_匍萄糖苷(C3G)和矢車菊-3-蕓香苷(C3Y),是?？捌焚|(zhì)的重要指標(biāo)之一。在花青素生物合成途徑中，黃烷酮3-羥化酶(F3H)催化黃槲皮素形成二氫黃酮醇；類黃酮_3’_羥化酶(F3' H)催化二氫黃酮醇形成二氫槲皮素；二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)分別催化二氫黃酮醇、二氫槲皮素和二氫楊梅素分別生成無色天竺葵素、無色矢車菊素和無色飛燕草素。編碼這三個酶的基因是花青素生物合成途徑的關(guān)鍵基因，直接關(guān)系到花青素的合成。因此桑樹花青素生物合成關(guān)鍵基因黃烷酮3-羥化酶、類黃酮-3'-羥化酶與二氫黃酮醇-4-還原酶基因可應(yīng)用于桑樹花青素生物合成的調(diào)控，改良桑樹的品質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供桑樹花青素生物合成三個關(guān)鍵基因黃烷酮3-羥化酶、類黃酮-3'-羥化酶和二氫黃酮醇-4-還原酶基因的核苷酸序列與氨基酸序列。本發(fā)明所述的桑樹黃烷酮3-羥化酶基因(ife/^/7)、類黃酮-3'-羥化酶基因(MaFS' B和二氫黃酮醇-4-還原酶基因iMaDFR、序列的克隆，依次通過以下步驟得到
1)提取桑椹總RNA，并將提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；
2)根據(jù)薔薇科植物草莓和蘋果的黃烷酮3-羥化酶基因類黃酮-3'-羥化酶基因mF3，M)和二氫黃酮醇-4-還原酶基因(ifeiFT )序列，分別設(shè)計兼并引物，以前述cDNA為模板，擴(kuò)增得到基因片段，連接到T克隆載體pMD19-T simple vector上，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，挑取陽性克隆并測序。上述基因片段采用信息分析的方法預(yù)測基因結(jié)構(gòu)及編碼的氨基酸序列。本發(fā)明同時提供三個基因在不同果色果實中的表達(dá)檢測
1)采用超聲提取不同果色桑椹花青素，利用高效液相色譜檢測花青素的含量；
2)分別提取不同果色果實總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；
3)以肌動蛋白基因作為內(nèi)參，采用半定量PCR技術(shù)檢測三個基因的表達(dá)情況。通過不同果色果實中的表達(dá)檢測結(jié)果，可以判定黃烷酮3-羥化酶基因 類黃酮-3'-羥化酶基因(MaF3' B和二氫黃酮醇-4-還原酶基因(MDFR、在桑樹花青素生物合成中起不可缺少的作用。


圖I為基因PCR電泳圖。M Trans2000 ；1基因片段擴(kuò)增 圖2 #基因PCR電泳圖。M Trans2000 ；1 -MaF3, #基因片段擴(kuò)增 圖3為JfeiFTP基因PCR電泳圖。M Trans2000 ；1 基因片段擴(kuò)增
圖4為四個品種桑果的花青素含量圖(mg/g干重)。I :珍珠白；2 :嘉陵30號；3 :大十；4 :紅果I號
圖5為三個基因在四個品種桑果中的表達(dá)。I :珍珠白；2 :嘉陵30號；3 :大十；4 :紅果 I號
珍珠白為山東省臨清市地方品種
嘉陵30號為重慶市蠶桑品種審定委員會2009年審定品種 大十為廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所于1977年選育 紅果I號為陜西省蠶桑絲綢研究所于2000年選育 本發(fā)明的優(yōu)點是
本發(fā)明提供的花青素生物合成途徑三個關(guān)鍵酶基因黃烷酮3-羥化酶基因類黃酮-3'-羥化酶基因功和二氫黃酮醇-4-還原酶基因(ifeiFT )，分別將其采用基因工程的方法，導(dǎo)入桑樹中，可通過構(gòu)建過表達(dá)或反義轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，改變桑樹中花青素的含量，間接改良桑樹的品質(zhì)，促進(jìn)花青素物質(zhì)的開發(fā)利用。
具體實施例方式實施例I :桑樹黃烷酮3-羥化酶基因(ife/^/7)、類黃酮-3'-羥化酶基因(MaFS' B和二氫黃酮醇-4-還原酶基因(MDFR)片段的克隆
1)以桑樹嘉陵30號為材料，提取桑椹總RNA，并將提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；
2)根據(jù)薔薇科植物草莓和蘋果的黃烷酮3-羥化酶基因類黃酮-3'-羥化酶基因mF3，M)和二氫黃酮醇-4-還原酶基因(ifeiFT )序列，分別設(shè)計兼并引物，以前述cDNA為模板，擴(kuò)增得到基因片段，連接到T克隆載體PMD19-T simple vector上，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，挑取陽性克隆并測序。兼并引物序列如下
F3H-Y 5' -CAGAGAGTTCTTCGCTTTG-3'
F3H-R 5' -CAGAATTGGCTTCTCTCCT-3'
F3f H-W -ATGGTGGTGGAGATGATGGTG-3'
F3f H-R :5' -GCTC(G/T)TTGTAGDGTGAGCCCA-3'
DFR-V 5' -AAAGATGACTGGTTGGATG-3'
DFR-R 5' -CCAAGCTGTACTTGAACTC-3'
步驟I)提取總RNA的桑樹也可用其它桑樹品種或材料，得到相同的結(jié)果。實施例2 :不同果色桑椹中花青素含量的高效液相色譜(HPLC)檢測
I)桑椹花青素的提取采摘成熟桑椹，清洗干凈后置冷凍干燥器中處理24小時，取出后壓碎成粉末狀；配制提取液63%甲醇(含1%TFA)，按照料液比I :24g/mL的比例量取提取液，并將已稱量的桑椹粉末倒入提取液中，將上述混合溶液置于超聲清洗器中，在200 W、40kHZ、43. 2°C黑暗條件下超聲提取40分鐘，室溫8000 rpm離心10分鐘，取上清。用0. 45 y m孔徑的有機(jī)系濾膜過濾上清液，濾出液備用；2)反相高效液相色譜定性檢測花色素苷色譜柱sy_etry C18反相吸附柱(250mmX 4. 6mm, 5 u m)，流動相A為乙腈，流動相B為甲酸水(10/90，v/v)。洗脫程序采用等度洗脫，流動相A B為25% 75%,流速lmL/min，柱溫30°C，檢測波長520 nm,上樣量為10U L。用10%甲酸溶解矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，并配制成lmg/mL母液，將母液分別稀釋成 5 V- g/mL> 10 V- g/mL>20 u g/mL>50 u g/mL> 100 U g/mL 的濃度梯度,根據(jù) HPLC 的峰面積與濃度構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算桑椹中花青素的含量(檢測結(jié)果如圖4所示)。實施例3 :三個基因在不同果色桑椹中的表達(dá)檢測
分別提取不同果色桑椹總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)實施例I獲得的基因片段設(shè)計半定量PCR引物，分別擴(kuò)增不同桑椹的cDNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(檢測結(jié)果如圖5所示)。半定量PCR引物如下
F3H-1 :5, -AAAAGGCGGTTTCATTG-3'
F3H-2 5' -GATTGTTCCTGGATCTGTG-3'
F3f H-I :5' -TGGCAATGGGAAGCACA-3'
F3f H-2 :5' -CGCTCACAAGCCTATCTCG-3'
DFR-I :5' -CCCATTTCTTAGTCCCA-3'
DFR-2 5' -CAACGAACATATCCTCCA-3'
序列表(SEQUENCE LISTING)
序列表I :
〈110〉西南大學(xué)
〈120〉桑樹黃烷酮3-羥化酶基因(MF3m序列 〈130〉
〈140〉
〈141〉
<160>1
〈170〉
<210>1
<211>369
<212>DNA
〈213〉桑樹(Morus alba L)
<400>1
1TTGGAGGTATTGTCAGAAGCCATGGGATTAGAAAAGGAGGCTCTAACCAAGGCTTGTGTG
61GACATGGACCAAAAAGTGGTGATCAATTACTATCCCAAATGTCCCCAACCGGATCTCACT
121CTTGGCCTGAAGCGCCACACAGATCCAGGAACAATCACACTTCTTCTTCAGGACCAGGTT
181GGTGGGCTCCAGGCCACTAGAGATGGAGGAAACACTTGGATCACCGTTCAACCTGTTGAA
241GGTGCCTTTGTGGTCAACCTTGGTGATCATGGTCATTATCTGAGCAATGGAAGGTTCAAG
301AATGCTGATCACCAAGCAGTGGTGAACTCAAACTATAGCAGATTGTCAATAGCTACATTT
361 CAAAACCCA
序列表2
〈110〉西南大學(xué)〈120〉桑樹黃烷酮3-羥化酶基因(MF3m編碼的氨基酸序列〈130〉
〈140〉
〈141〉
<160>1
〈170〉
<210>1<211>123〈212〉 PRT
〈213〉桑樹(Morus alba L)
<400>1
I LEVLSEAMGL EKEALTKACV DMDQKVVINY YPKCPQPDLT LGLKRHTDPG TITLLLQDQV61 GGLQATRDGG NTffITVQPVE GAFVVNLGDH GHYLSNGRFK NADHQAVVNS NYSRLSTATF121 QNP序列表3
〈110〉西南大學(xué)
〈120〉桑樹類黃酮-3'-羥化酶基因(泌烈z ")序列〈130〉
〈140〉
〈141〉
<160>1
〈170〉
<210>1<211>857〈212〉 DNA
〈213〉桑樹(Morus alba L)
<400>1
1ATGGTGGTGGAGATGATGGTGCTAGCGGGAGTATTCAACATCGGAGATTTTGTGCCGGCA
61CTAGATTGGCTAGACTTACAAGGGGTGGCTGCGAGGATGAAGAAGCTCCACAATAGGTTT
121ATGCGTTCTTGACAACAATTATTGAGGAACACAAGGCTAATGTTGGCAAGGGGAAGCAC
I8ICTGACTTGCTCAGCACGTTGCTTTCACTAAAGGATGATGCGGAGGGCGAGGATGAGAAG
241TCACAGACACTGAAATTAAAGCACTGCTTTTGAACATGTTCACAGCTGGTACGGACACT
301CATCAAGTACGGTGGAATGGGCCATTGCGGAACTCATCCGACACCCCAAAATCTTGGCC
361AAGTTCAAGAAGAACTTGACCGCGTCGTGGGCCGCGATAGGCTCGTGAGCGAATTGGAC
421TTGGCCCAATTGACATATCTCCAGGCCGTGGTGAAGGAGACTTTCCGGCTTCATCCCTCC
481CCCCGATGTCTGTACCACGGATGGCAAACGAAAGCTGTGAAATCAACGGTTACCACATC
541CCAAAGGAACCACTCTTCTTGTAAATGTGTGGGCCATAGCACGTGACCCGGCCGAATGG
601CTGATCCACTAGAGTTCAGGCCCGAAAGATTCTTACCGGGAGGCGAAAAGGCGCAAGTA
661GACATAAGAGGGAATGACTTTGAAGTGATTCCATTTGGGGCTGGGCGCAGGATTTGTGCT721GGTATGAGTTTGGGCGTGCGCATGGTCCAGCTACTCACTGCAACCCTGGTTCAGGCATTC781AATTTAGGCCTACCTAATGGACTGGTACCTGAAAAACTCAACATGGATGAAGCATATGGG841 CTCACACTACAAAGAGC序列表4
〈110〉西南大學(xué)
〈120〉桑樹類黃酮-3'-羥化酶基因(MF3, H、編碼的氨基酸序列〈130〉
〈140〉
〈141〉
<160>1
〈170〉
<210>1<211>285〈212〉 PRT
〈213〉桑樹(Morus alba L)
<400>1
I MVVEMMVLAG VFNI⑶FVPA LDffLDLQGVA ARMKKLHNRF DAFLTTIIEE HKANVGKGKH61 ADLLSTLLSL KDDAEGEDEK LTDTEIKALL LNMFTAGTDT TSSTVEffAIA ELIRHPKILA121 KVQEELDRVV GRDRLVSELD LAQLTYLQAV VKETFRLHPS TPMSVPRMAN ESCEINGYHI181 PKGTTLLVNV WAIARDPAEff TDPLEFRPER FLPGGEKAQV DIRGNDFEVI PFGAGRRICA241 GMSLGVRMVQ LLTATLVQAF NLGLPNGLVP EKLNMDEAVG LTLQR序列表5
〈110〉西南大學(xué)
〈120〉桑樹二氫黃酮醇-4-還原酶基因(MDFR)序列〈130〉
〈140〉
〈141〉
<160>1
〈170〉
<210>1<211>535〈212〉 DNA
〈213〉桑樹(Morus alba L)
<400>1 1AAAGATGACTGGTTGGATGTATTTTGTCTCCAAGACTCTAGCCGAGCAAGCGGCATGGAG61ATTTGCAAAGGAACACGACATGAACTTCATTACTATTATTCCAACGCTCGTGATTGGCCC121ATTTCTTAGTCCCACTATGCCTCCAAGTCTCATCACCGGACTTGCACCAATCACCAGAAAI8ITGAAGCTCACTATTTTATCCTAAAGCAAGGACATTACGTTCACTTGGATGACCTCTGCGA241AGCTCATATATTCCTGTACGAGCACCCTAAAGCTGAGGGTCGTTACATCGCAAGTTCACA301TAATACTACAATCTATGAGCTTGTTAAATTGCTGAAGGAAAAATATCCCCAGTATAATAT361CCCACGAAGTTCAAAGGCTTTGAAGAAGACATAGGAAATGTGGAGTTCTCTTCAAGGAA421GTTGAAGGAATTGGGTTTCCAATACAAATACAGCTTGGAGGATATGTTCGTTGGAGCAAT48I TGAGACATGTCGTCAAAAGGGGTTGCTTCCACTTGCTCATGATGAAAGCAAGCCC序列表6
〈110〉西南大學(xué)
〈120〉桑樹二氫黃酮醇-4-還原酶基因(MDFR)編碼的氨基酸序列〈130〉
〈140〉
〈141〉
<160>1
〈170〉
<210>1<211>178〈212〉 PRT
〈213〉桑樹(Morus alba L) <400>1
I KMTGWMYFVS KTLAEQAAffR FAKEHDMNF ITIIPTLVIGP FLSPTMPPSL ITGLAPITRN61 EAHYFILKQG HYVHLDDLCE AHIFLYEHP KAEGRYIASSH NTTIYELVKL LKEKYPQYNI121 PTKFKGFEED IGNVEFSSRK LKELGFQYK YSLEDMFVGAI ETCRQKGLLP LAHDESKP
權(quán)利要求
1.桑樹花青素生物合成三個關(guān)鍵基因，其特征在于黃烷酮3-羥化酶基因(MaF3H)堿基序列如SEQ ID NO: I所示、類黃酮-3 ^ -羥化酶基因(MaF3' H)堿基序列如SEQ ID NO:3所示、ニ氫黃酮醇-4-還原酶基因(MaDFR)堿基序列如SEQ ID NO 5所示。
2.桑樹花青素生物合成三個關(guān)鍵基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于黃烷酮3-羥化酶氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示、類黃酮-3'-羥化酶氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示、ニ氫黃酮醇-4-還原酶氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示。
3.權(quán)利要求I所述桑樹黃烷酮3-羥化酶基因序列應(yīng)用于過表達(dá)或反義調(diào)控黃烷酮3-羥化酶基因(MF3H、的表達(dá)，改良桑樹花青素的含量，獲得新的轉(zhuǎn)基因株系。
4.權(quán)利要求I所述桑樹類黃酮-3'-羥化酶基因M)序列應(yīng)用于過表達(dá)或反義調(diào)控桑樹類黃酮-3'-羥化酶基因功的表達(dá)，改良桑樹花青素的含量，獲得新的轉(zhuǎn)基因株系。
5.權(quán)利要求I所述桑樹ニ氫黃酮醇-4-還原酶基因iMaDFR、序列應(yīng)用于過表達(dá)或反義調(diào)控ニ氫黃酮醇-4-還原酶基因的表達(dá)，改良桑樹花青素的含量，獲得新的轉(zhuǎn)基因株系。
全文摘要
本發(fā)明公開了來源于桑樹的花青素生物合成途徑三個關(guān)鍵基因黃烷酮3-羥化酶(MaF3H)、類黃酮-3′-羥化酶(MaF3′H)和二氫黃酮醇-4-還原酶基因(MaDFR)的基因序列及應(yīng)用。MaF3H基因片段長369bp，編碼了123個氨基酸，MaF3′H基因片段長857bp，編碼了285個氨基酸，MaDFR基因片段長535bp，編碼了178個氨基酸。這三個基因是植物花青素合成路徑中的關(guān)鍵基因，可以應(yīng)用到植物中調(diào)控花青素的含量，改善植物的品質(zhì)。
文檔編號C12N15/53GK102660561SQ20121016664
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者余茂德, 劉長英, 呂蕊花, 吳存容, 張瓊予, 李軍, 王茜齡, 趙愛春, 金筱耘, 魯成 申請人:西南大學(xué)