專利名稱：多能胚胎干細(xì)胞以及獲得它們的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及新型非小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞以及獲得這些非小鼠ES細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
遺傳修飾的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物廣泛用于藥物開發(fā)和作為人體疾病的模型系統(tǒng)。許多這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、特別是功能喪失突變體是通過使用小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞而產(chǎn)生的小鼠模型。概括地說，在ES細(xì)胞內(nèi)的基因靶向使用同源重組現(xiàn)象以破壞或敲除特殊基因的功能。(參見涉及小鼠胚胎干細(xì)胞技術(shù)的美國(guó)專利5，464，764；5，487，992；5，631，153和5，627，059)。存在快速生長(zhǎng)數(shù)量的由在ES細(xì)胞內(nèi)使基因失活而產(chǎn)生的小鼠突變體。產(chǎn)生這些突變體小鼠以了解體內(nèi)公知基因的功能，從而發(fā)現(xiàn)新的基因并建立人體疾病的動(dòng)物模型。(參見，例如Chisaka等(1992)355516-520；Joyner等(1992)在《小鼠體內(nèi)移植后的發(fā)育》(POSTIMPLANTATIONDEVELOPMENT IN THE MOUSE)一書中所述(Chadwick和Marsh編輯，JohnWiley&Sons，英國(guó))pp277-297；Dorin等(1992)《自然》(Nature)359211-215)。
盡管小鼠ES細(xì)胞的發(fā)育為小鼠遺傳學(xué)開創(chuàng)了一個(gè)新紀(jì)元，但是已經(jīng)證實(shí)非小鼠ES細(xì)胞難以分離。推定的細(xì)胞系來源于倉(cāng)鼠、豬和綿羊的胚泡。(參見Doetschman等(1988)《生物學(xué)發(fā)育》(Develop.Biol.)127224-227；Notarianni等(1990)《生育生殖雜志》增刊(J.Reprod.Fertil.Suppl.)4151-56；Notarianni等(1991)《生育生殖雜志》增刊(J.Reprod.Fertil.Suppl.)43255-60；WO94/26884)。然而，還不清楚這些細(xì)胞是否確實(shí)是多能ES細(xì)胞。(參見，例如Gardner和Brook(1997)《國(guó)際生物學(xué)發(fā)育雜志》(Int.J.Dev.Biol.)41235-243)。
Gerhart等報(bào)導(dǎo)了從流產(chǎn)的胚胎中分離人體生殖腺前體細(xì)胞的方法。(參見Beardsley(1998)《美國(guó)科學(xué)》(Scientific American)，在線)。當(dāng)將這些細(xì)胞植入不含功能性免疫系統(tǒng)的小鼠時(shí)，它們顯然可以產(chǎn)生含有各種不同細(xì)胞類型的腫瘤。然而，還不清楚這些分離的人體細(xì)胞是否是多能ES細(xì)胞。
在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域中特別關(guān)注的是大鼠多能細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因大鼠提供了幾種優(yōu)于小鼠模型的優(yōu)點(diǎn)。首先，大鼠較大，使對(duì)它進(jìn)行外科手術(shù)成為可能；且它們可產(chǎn)生大量的用于生物化學(xué)分析的物質(zhì)。大鼠模型的第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于已經(jīng)產(chǎn)生了針對(duì)大鼠模型的大型信息存儲(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)，特別是在神經(jīng)變性疾病、心血管研究和糖尿病領(lǐng)域中。沒有針對(duì)小鼠的可比擬的數(shù)據(jù)庫(kù)。
大鼠也是針對(duì)藥物開發(fā)試驗(yàn)的優(yōu)選的動(dòng)物模型。對(duì)轉(zhuǎn)基因大鼠可以進(jìn)行在轉(zhuǎn)基因小鼠中不能進(jìn)行的復(fù)雜的生理學(xué)測(cè)定。例如，由于大鼠的大小原因，含有人體轉(zhuǎn)基因的大鼠可以在非靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中提供靈長(zhǎng)類特異性分析。在某些情況中，大鼠的生理學(xué)特性使得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生，其表型用于人體疾病模型，而許多攜帶同樣轉(zhuǎn)基因的小鼠不含有疾病表型。例如，首先在小鼠中嘗試了與HLA-B27相關(guān)的人體自身免疫障礙的轉(zhuǎn)基因模型，但是沒有病理學(xué)形成(Taurog等(1988)《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)1414020-30)。然而，轉(zhuǎn)基因HLA-B27大鼠具有非常類似于人體疾病的病理學(xué)特性(Hammer等(1990)《細(xì)胞》(Cell)631099-1112)。因此，大鼠ES細(xì)胞可用于開發(fā)目前僅可能在小鼠中進(jìn)行的所有遺傳操作。如果得到大鼠ES細(xì)胞技術(shù)，那么可以將無效突變引入人類基因的大鼠同源物中并且與人類轉(zhuǎn)基因一起產(chǎn)生可用于取代許多研究中的靈長(zhǎng)類動(dòng)物的“人源化”動(dòng)物。
盡管已經(jīng)進(jìn)行了持續(xù)的研究，但是在衍生大鼠ES細(xì)胞方面還沒有成功。Lannoccone等最初在(1994)《生物學(xué)發(fā)育》(Develop.Biol.)163288-292(還參見Wo 95/06716)中報(bào)導(dǎo)了大鼠胚胎干細(xì)胞的分離方法，但是近來在發(fā)現(xiàn)所述的細(xì)胞系被小鼠ES細(xì)胞污染后撤回了這一公開內(nèi)容。(Brenin等(1997)《生物學(xué)發(fā)育》(Develop.Biol.)，即將出版；Brenin等(1996)在《大腦局部缺血藥理學(xué)》(PHARM.CEREBRALISCHEMIA)一書中所述(Krieglstein編輯，Medpharm ScienfiticPublishers，Stuttgart)pp.555-572)。因此本發(fā)明提供了第一種大鼠ES細(xì)胞的分離群體。
看起來最初培養(yǎng)小鼠細(xì)胞的成功部分是由于偶然選擇小鼠品種的結(jié)果；已經(jīng)將小鼠的129品種用于早期畸胎瘤研究，這是因?yàn)樗鼉A向于睪丸胚細(xì)胞腫瘤。(參見Evans&Kaufman(1981)《自然》(Nature)292154-156；Martin(1981)《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Nat’l Acad.Sci.USA)787634-7638)。我相信這種特殊品種的胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的多能細(xì)胞具有適合于組織培養(yǎng)的固有能力。已經(jīng)證實(shí)其它品種(諸如C57BL/6小鼠)更難以用于衍生ES細(xì)胞系，且近來僅報(bào)導(dǎo)了種系感受態(tài)C57BL/6 ES細(xì)胞系(Ledermann等(1991)《細(xì)胞研究實(shí)驗(yàn)》(Exp.Cell Res.)197254-258)。沒有趨向于形成睪丸畸胎瘤的大鼠品種，這類品種的缺乏可能是難以衍生第一種大鼠ES細(xì)胞系的原因之一。此外，與小鼠相反，在大鼠中經(jīng)實(shí)驗(yàn)誘發(fā)的畸胎瘤通常來源于卵黃囊而不是來源于生殖細(xì)胞；這些細(xì)胞不是多能的，而是保持卵黃囊內(nèi)胚層的特征。這種特征可以導(dǎo)致用形態(tài)上與內(nèi)胚層細(xì)胞類似的細(xì)胞在來自某些ES樣細(xì)胞的大鼠品種的胚泡的培養(yǎng)物中的快速稀釋。
本發(fā)明提供了第一種多能大鼠ES細(xì)胞。此外，本發(fā)明提供了一種可以普遍用于從所有物種產(chǎn)生ES細(xì)胞的方法。
發(fā)明概括本發(fā)明包括一種非小鼠胚胎干細(xì)胞的分離群體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的細(xì)胞是大鼠ES細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種從靶物種獲得胚胎干細(xì)胞的方法，該方法包括下列步驟(a)在有利于來自靶物種胚胎干(ES)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下將從所述靶物種的胚胎中獲得的細(xì)胞與非靶胚胎干細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)；和(b)從所述的靶物種中分離所述的ES細(xì)胞。用于所述共培養(yǎng)的非靶胚胎干細(xì)胞來源于與靶物種不同的種類，如小鼠。靶ES細(xì)胞可以來源于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICMs)或可以是原生殖細(xì)胞(PGCs)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于共培養(yǎng)的非靶胚胎干細(xì)胞缺乏陽(yáng)性選擇標(biāo)記。所述的陽(yáng)性選擇標(biāo)記可以是一種編碼抗生素抗性的基因或一種編碼HPRT抗性(HPRT)的基因。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，用于共培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞攜帶一種陰性選擇標(biāo)記，例如HPRT或單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)?？蛇x擇的是，可以將所述的胚胎細(xì)胞在一種細(xì)胞的飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的飼養(yǎng)層是SNL 76/7細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于共培養(yǎng)方法的非靶ES細(xì)胞是以有絲分裂方式失活的。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括遺傳修飾的非小鼠ES細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的遺傳修飾包括插入一種轉(zhuǎn)基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的遺傳修飾包括破壞一種或多種基因的功能。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明包括含有ES細(xì)胞分離群體或遺傳修飾的ES細(xì)胞的嵌合胚胎。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的嵌合胚胎含有已經(jīng)遺傳修飾以包括轉(zhuǎn)基因的ES細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的嵌合胚胎含有已經(jīng)遺傳修飾以破壞一種或多種基因功能的ES細(xì)胞。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明包括一種含有由靶ES細(xì)胞分離群體產(chǎn)生的細(xì)胞的動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的動(dòng)物含有由已經(jīng)遺傳修飾以包括轉(zhuǎn)基因的大鼠ES細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的動(dòng)物含有由已經(jīng)遺傳修飾以破壞一種或多種基因功能的大鼠ES細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞。
正如顯而易見的，本發(fā)明一個(gè)方面中的優(yōu)選的特征和特性適用于本發(fā)明的任何其它方面。
附圖的簡(jiǎn)要說明附


圖1(A組至D組)是表示大鼠胚泡照片的照相銅版復(fù)印件。附圖lA表示400×放大倍數(shù)，Normarski鏡片觀察到的來自Brown Norway種的正常大鼠胚泡；附
圖1B表示400×放大倍數(shù)，Normarski鏡片觀察到的來自移植延遲10天的Fischer 344種的大鼠胚泡；附
圖1C表示200×放大倍數(shù)的來自移植延遲8天的Long Evans種的一組延遲大鼠胚泡的相差觀察；附
圖1D表示在SNL 76/7成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)3天后貼壁的胚泡。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICMs)在培養(yǎng)物中心是可見的。
附圖2(A組至C組)是表示來源于大鼠胚泡ICMs的培養(yǎng)物的照相銅版復(fù)印件。附圖2A和2B表示FRDB-1細(xì)胞系的第二代培養(yǎng)物的集落。所述集落的形態(tài)類似于在該衍生階段的小鼠ES細(xì)胞。附圖2C表示細(xì)胞系BNRB-1的第三代。所述的集落具有多上皮形態(tài)、即典型的內(nèi)胚層。附圖2A-C是200×放大倍數(shù)的相差顯微照片。
附圖3，A組至E組是所培養(yǎng)胚泡的200×放大倍數(shù)的照相銅版復(fù)印件。附圖3A和3C分別表示培養(yǎng)的大鼠和小鼠胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)堿性磷酸酶(AP)染色情況。附圖3B表示用AP染色的大鼠胚泡衍生的細(xì)胞(BNRB-1系)；附圖3D表示用AP染色的小鼠ES細(xì)胞。附圖3E表示來源于9天Sprague-Dawley胚胎集落內(nèi)的AP陽(yáng)性細(xì)胞。這些細(xì)胞可以來源于原始的生殖細(xì)胞。
附圖4A表示在染色前Long Evans大鼠胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)細(xì)胞培養(yǎng)3天的相差視圖；附圖4B表示用抗SSEA-1抗體染色的培養(yǎng)3天的ICM細(xì)胞的熒光顯微鏡檢情況。附圖4C表示用抗SSEA-1染色的小鼠ES細(xì)胞。SSEA-1是異種表達(dá)的。附圖4D表示來自用SSEA-1染色的BNRB-1細(xì)胞系的集落。對(duì)于SSEA-1標(biāo)記來說，大鼠系也是異種的。
附圖5A表示囊性結(jié)構(gòu)，它類似于在培養(yǎng)物懸浮后由BRNB-1細(xì)胞系形成的小鼠ES細(xì)胞衍生的單純胚狀體。附圖5B表示在大鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)的BNRB-1細(xì)胞系的形態(tài)變化。附圖5C表示在大鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)的小鼠ES細(xì)胞的形態(tài)變化。
附圖6(A組至D組)是表示大鼠胚泡和小鼠ES細(xì)胞的細(xì)胞共培養(yǎng)物形態(tài)的10×放大倍數(shù)的相差照片的照相銅版復(fù)印件。附圖6A描繪了來自在小鼠AB-1ES細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)3天后延遲的Long Evans大鼠胚泡的ICM。所述的ICM細(xì)胞看起來象小鼠ES細(xì)胞，且顯然沒有分化。附圖6B表示通過機(jī)械解離產(chǎn)生的LE大鼠ICM的第二代。粘壁球狀細(xì)胞松散地存在于外植體的邊緣。附圖6C表示7次傳代后LE大鼠的ICM。所述ICM外植體看起來象小鼠ES細(xì)胞，而球狀細(xì)胞極為豐富。相信這些快速生長(zhǎng)的球狀細(xì)胞是內(nèi)胚層。在具有ES形態(tài)的細(xì)胞的幾次傳代后，幾乎沒有堿性磷酸酶(AP)陽(yáng)性細(xì)胞保留下來。附圖6D表示AP染色的早期傳代大鼠ICM。球狀內(nèi)胚層樣細(xì)胞是陰性的。
附圖7，A組至C組，是培養(yǎng)物中大鼠原始生殖細(xì)胞(PGC)照片的照相銅版復(fù)印件。附圖7A表示PGC培養(yǎng)物的10×放大倍數(shù)的相差照片，所述的PGC培養(yǎng)物通過使后腸組織和尿囊從10.5天LE大鼠胚胎中解離并與小鼠ES細(xì)胞共培養(yǎng)兩代而衍生。兩代后(小鼠ES細(xì)胞鋪滿)，通過陰性選擇除去小鼠ES細(xì)胞。使保留下來的大鼠細(xì)胞傳代一次以上并在第17天時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)物檢測(cè)。存活大鼠細(xì)胞是明顯的。附圖7B表示附圖7A中20×放大倍數(shù)的細(xì)胞。附圖7C表示與如培養(yǎng)21天后堿性磷酸酶(AP)染色的附圖7A和7B所示相同的集落。形態(tài)和染色情況表明這些細(xì)胞具有ES細(xì)胞的特性。
本發(fā)明的實(shí)施方式在本申請(qǐng)的上下文中，將各種公開文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請(qǐng)作為可確定的引述文獻(xiàn)進(jìn)行參考。在本申請(qǐng)中引述的這些公開文獻(xiàn)、專利和公開專利說明書的公開內(nèi)容在此引入本公開說明書中以更完整地描述本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的現(xiàn)狀。
本發(fā)明提供了多能胚胎干(ES)細(xì)胞。所述的ES細(xì)胞一般不是小鼠ES細(xì)胞，且盡管在文本中舉例了所分離的大鼠ES細(xì)胞，但是可以將所要求保護(hù)的方法用于任何物種。一般來說，本發(fā)明提供了基本上純化的非小鼠，例如大鼠ES細(xì)胞的群體。產(chǎn)生ES細(xì)胞的方法包括將來自靶物種的胚胎細(xì)胞(例如來自胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICMs)或原始生殖細(xì)胞(PGCs))與非靶ES細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。所述的非靶ES細(xì)胞可以來自任何物種、例如小鼠。優(yōu)選的情況是，所述非靶ES細(xì)胞含有一種陰性選擇標(biāo)記。
除非另有說明，實(shí)施本發(fā)明將包括使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和重組DNA的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)均屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的范圍。參見，例如Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第二版(1989)；《最新分子生物學(xué)方法》(CURRENT PROTOCOLSIN MILECULAR BI0LOGY)(F.M.Ausubel等編輯，1987)；《酶學(xué)方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列叢書(Academic Press，Inc.)；《PCR 2實(shí)施方法》(M J.McPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor編輯，1995)；《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.Freshney編輯，1987)；和《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Harlow等編輯，1987)。
定義本文所用的某些術(shù)語(yǔ)具有特定的含義。
所用的術(shù)語(yǔ)“胚胎干細(xì)胞”或“ES細(xì)胞”指的是可以產(chǎn)生包括種系細(xì)胞在內(nèi)的所有分化細(xì)胞的早期胚胎的細(xì)胞。盡管還沒有從每一物種中分離得到，但是相信所有動(dòng)物均含有ES細(xì)胞。小鼠胚胎干細(xì)胞(鑒定最充分的ES細(xì)胞)來源于胚泡的多能內(nèi)細(xì)胞團(tuán)且其多能性可以由一種合適的培養(yǎng)環(huán)境來維持。已經(jīng)使用飼養(yǎng)細(xì)胞諸如經(jīng)照射的成纖維細(xì)胞或以所建立的畸胎瘤干細(xì)胞系條件化的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的飼養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)物中建立了小鼠ES細(xì)胞系。在有可防止培養(yǎng)物細(xì)胞自發(fā)分化的分化抑制活性(DIA)或白血病抑制因子(LIF)存在的情況下，也可以不用飼養(yǎng)細(xì)胞層使某些小鼠ES細(xì)胞增殖。
術(shù)語(yǔ)“非小鼠”和“靶”ES細(xì)胞指的是來源于任何動(dòng)物而不是小鼠的細(xì)胞。優(yōu)選的非小鼠或靶細(xì)胞是大鼠細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“非靶”ES細(xì)胞指的是來源于任何動(dòng)物而不是靶物種的細(xì)胞。優(yōu)選的非靶ES細(xì)胞是小鼠ES細(xì)胞。
當(dāng)將它們植入宿主胚泡時(shí)，ES細(xì)胞有助于形成嵌合動(dòng)物，且如果嵌合胚細(xì)胞是ES細(xì)胞衍生的，那么所述嵌合動(dòng)物的后代將攜帶ES細(xì)胞的基因組(“種系傳播”)?！肮钡腅S細(xì)胞是那些已經(jīng)證實(shí)由本領(lǐng)域和本文所述公知檢測(cè)試驗(yàn)和方法所確定的多能性細(xì)胞。沒有將多能性細(xì)胞系限定為胚泡衍生的細(xì)胞系；近來，具有至少體外ES細(xì)胞多能性的細(xì)胞系來源于小鼠原始生殖細(xì)胞(參見Matsui等(1992)《細(xì)胞》(Cell)70841-847；Matsui和Hum(1997)《細(xì)胞》(Cell)10(1)63-8；Buehr，M.(1997)《細(xì)胞研究實(shí)驗(yàn)》(Exp.Cell Res.)232194-207)。
可以方便地操作ES細(xì)胞。將它們用作研究細(xì)胞分化的模型，大概是因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生和分泌的因子在控制體內(nèi)早期胚胎發(fā)育方面是重要的原因?？梢詫庠葱訢NA的遺傳操作的ES細(xì)胞用于產(chǎn)生純種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的品系。遺傳操作的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。
“分離的”或“純化的”細(xì)胞群體基本上不含性質(zhì)上與之相關(guān)的細(xì)胞和物質(zhì)。所謂基本上不含或基本上純化的含義是所述群體的至少50％是ES細(xì)胞，優(yōu)選至少70％是ES細(xì)胞，更優(yōu)選至少80％是ES細(xì)胞，且甚至更優(yōu)選至少90％不含性質(zhì)上與之相關(guān)的非多能性ES細(xì)胞。
“細(xì)胞系”或“細(xì)胞培養(yǎng)物”指的是體外生長(zhǎng)或維持的高等真核細(xì)胞?？梢岳斫獾氖羌?xì)胞后代在形態(tài)上、基因型上或表型上與親代細(xì)胞不完全相同。
術(shù)語(yǔ)“胚胎”指的是從動(dòng)物出生前發(fā)育的任何階段獲得的組織。例如，在哺乳動(dòng)物發(fā)育的過程中，受精卵裂解而形成一種稱作“桑椹胚”的桑椹形細(xì)胞群。在8-和16-細(xì)胞階段期間，所述的桑椹胚轉(zhuǎn)化成“胚泡”-一種接近球狀的充滿液體的結(jié)構(gòu)。胚泡的外層細(xì)胞是“滋養(yǎng)外胚層”細(xì)胞且產(chǎn)生胎盤和其它胚外結(jié)構(gòu)。胚胎自身來源于“內(nèi)細(xì)胞團(tuán)”或“ICM”，即在胚泡一極處細(xì)胞的累積。其它胚胎組織來源包括晚期的胚泡和原始生殖細(xì)胞。
正如本文所述，由本發(fā)明者所開發(fā)的方法同樣適用于所有的物種。術(shù)語(yǔ)“靶動(dòng)物”或“靶物種”指的是來源于本發(fā)明的分離ES細(xì)胞的物種。合適的物種包括但不限于大鼠、人、牛和綿羊。
術(shù)語(yǔ)“選擇標(biāo)記”指的是一種其表達(dá)可鑒定用含有標(biāo)記基因的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的基因。合適的標(biāo)記可以是“陽(yáng)性的”或“陰性的”以及“顯性”或“隱性”的?！瓣?yáng)性選擇標(biāo)記”指的是一種編碼在某些條件下僅能夠使攜帶該基因的細(xì)胞存活和/或生長(zhǎng)的產(chǎn)物的基因。例如，表達(dá)所引入的抗生素抗性基因的植物和動(dòng)物細(xì)胞。合適的抗生素抗性基因的非限制性實(shí)例是對(duì)化合物G418產(chǎn)生抗性的新霉素抗性(Neor)基因、潮霉素抗性基因和嘌呤霉素抗性基因。另一種陽(yáng)性選擇標(biāo)記是次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)。攜帶HPRT基因的細(xì)胞在HAT(氨基蝶呤(amniopterin)、次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而HPRT陰性(HPRT-)的細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中死亡。
類似地，術(shù)語(yǔ)“陰性選擇標(biāo)記”指的是一種編碼可誘發(fā)選擇性殺死攜帶該基因的細(xì)胞的產(chǎn)物的基因。陰性選擇標(biāo)記的非限制性實(shí)例包括單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)和HPRT。當(dāng)加入9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤(gancyclovir)或FIAU(1(1，2-脫氧-2-氟-β-D-鼠李呋喃糖基(rabinofuranosyl))-5-碘尿嘧啶時(shí)，攜帶HSV-tk基因的細(xì)胞被殺死且使用5-溴脫氧尿苷(5BdU)殺死攜帶哺乳動(dòng)物tk的細(xì)胞。用6-硫代鳥嘌呤(6TG)可以選擇性地殺死攜帶HPRT標(biāo)記的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記(陽(yáng)性和陰性)的其它實(shí)例是本領(lǐng)域所公知的。
“陽(yáng)性-陰性選擇”指的是選擇攜帶在特異性靶向位點(diǎn)整合的DNA插入片段的細(xì)胞的過程(陽(yáng)性選擇)和還對(duì)攜帶在非靶向染色體位點(diǎn)整合的DNA插入片段的細(xì)胞進(jìn)行選擇的過程(陰性選擇)。
“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”指的是遺傳工程動(dòng)物或遺傳工程動(dòng)物的后代?！扒逗吓咛ァ笔且环N具有攜帶不同基因型的細(xì)胞群體的胚胎。因此，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或嵌合胚胎通常含有來自至少一種無親緣關(guān)系的生物體的物質(zhì)，諸如來自病毒、植物或其它動(dòng)物的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”指的是來自一種已經(jīng)引入另一種生物體基因組的來源的多核苷酸。從任何來源例如從不同生物體、物質(zhì)中分離可以得到轉(zhuǎn)基因或可以通過合成產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因。所述的轉(zhuǎn)基因可以是基因、基因片段或多基因。轉(zhuǎn)基因的合適大小可以由本領(lǐng)域公知的方法來確定。
本發(fā)明提供了大鼠胚胎干細(xì)胞的首次分離群體。本發(fā)明還提供了從非小鼠物種中衍生ES細(xì)胞的新型方法。通過使用新型培養(yǎng)條件，本發(fā)明者已經(jīng)從胚胎組織中衍生了大鼠ES細(xì)胞的分離群體。這些新型方法同樣適用于非大鼠的靶物種。預(yù)先的組中還沒有成功地嘗試通過添加到培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)因子以及飼養(yǎng)細(xì)胞的量和/或種類來培養(yǎng)大鼠ES細(xì)胞。無論培養(yǎng)基如何，如果不分化就不能在培養(yǎng)基中維持上述大鼠細(xì)胞。這些培養(yǎng)的大鼠細(xì)胞不能遺傳進(jìn)嵌合大鼠的種系?？雌饋砗孟蟠笫笈咛ゼ?xì)胞在培養(yǎng)物中達(dá)到了臨界期。在這一階段生長(zhǎng)因子和飼養(yǎng)細(xì)胞不足以促進(jìn)未分化的多能ES細(xì)胞系的衍生。本發(fā)明通過將大鼠胚胎細(xì)胞與非靶ES細(xì)胞系進(jìn)行共培養(yǎng)而克服了這一難題。與ES細(xì)胞系的接觸看起來支持所分離的胚胎細(xì)胞通過這一培養(yǎng)轉(zhuǎn)捩期。一旦過了這一臨界點(diǎn)，所述的大鼠ES細(xì)胞將以其自身為基礎(chǔ)增殖并維持其未分化的多能表型。
Ⅰ．多能胚胎干細(xì)胞的來源使用本文所述的方法，可以從任意物種中分離ES細(xì)胞。本文所述的實(shí)例包括來源于Long Evans(LE)大鼠近交系的ES細(xì)胞，它們獲自Simonsen(近交16代)或獲自Sprague-Dawley大鼠種。當(dāng)將LE ES細(xì)胞候選物注射入一種白化體品種時(shí)，LE大鼠具有合適的包被色(黑色、盔狀)而用于鑒定嵌合體。從這一品種中已經(jīng)獲得了大量胚胎且這些細(xì)胞充分適合于組織培養(yǎng)條件。還可以通過供給者使LE動(dòng)物定時(shí)交配，降低所必須維持動(dòng)物群落的大小和減少培養(yǎng)動(dòng)物到繁殖期的時(shí)間。不同于小鼠，大鼠品種顯著改變胚胎移植的定時(shí)且每一種品種與超數(shù)排卵和延緩的移植過程反應(yīng)不同。對(duì)于這些影響本發(fā)明的變化情況的程度來說，可以通過本領(lǐng)域公知的方法方便地確定它們。
非小鼠的靶ES細(xì)胞可以來源于任意的合適細(xì)胞。非限制性實(shí)例是胚泡(非延期的)、移植已經(jīng)經(jīng)實(shí)驗(yàn)延期的胚泡(晚期胚泡)和原生殖細(xì)胞?？梢詮呐咛グl(fā)育的不同階段、例如第13期胚胎分離PGCs。對(duì)于人來說，可以使用獲自自發(fā)和選擇性流產(chǎn)的細(xì)胞。還可以從由體外受精技術(shù)產(chǎn)生的胚胎中獲得細(xì)胞。
A．胚泡和延期胚泡通過本領(lǐng)域公知的任意方法可以分離胚泡。例如，在交配約4.5天后可以處死定時(shí)交配的雌性動(dòng)物(第0.5天是交配后的早晨)，且通過針對(duì)小鼠所述的方法從子宮中收集胚泡，例如A.Bradley在《畸胎瘤和胚胎干細(xì)胞實(shí)施方法》(E.J.Robertson編輯，1987)中所述。
優(yōu)選的情況是，當(dāng)交配后約3.5天胚胎處于輸卵管中時(shí)，對(duì)定時(shí)交配的雌性動(dòng)物進(jìn)行卵巢切除。正如Buchanan在(1969)《受精繁殖雜志》(J.Reprod.Fert.)19279-283中所述，在進(jìn)行卵巢切除術(shù)后，給動(dòng)物每天注射孕酮(5mg/動(dòng)物/天，皮下注射)。在約6天至約11天以上之間，使用本領(lǐng)域所述的方法(例如A.Bradley，文獻(xiàn)同上)從子宮中收集未移植的胚泡。延期胚泡通常大于正常胚泡且缺乏透明帶層?？梢匀绫疚乃?、優(yōu)選在24孔平板中的各個(gè)孔內(nèi)的飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)胚泡和延期胚泡。
可以將經(jīng)體外受精產(chǎn)生的胚胎培養(yǎng)至胚泡期以用于分離ICMs。
B．原生殖細(xì)胞還可以從胚胎中分離原生殖細(xì)胞。盡管不認(rèn)為胚胎組織的階段是關(guān)鍵的，但是在定向產(chǎn)生大鼠ES細(xì)胞的實(shí)施方案中，在妊娠約9.5天時(shí)處死定時(shí)交配的雌性動(dòng)物并從胚外組織中解剖出胚胎。在這一階段，大鼠胚胎處于第13階段，相當(dāng)于第8.5天時(shí)的小鼠。(通過體節(jié)數(shù)測(cè)定階段)。將胚胎尾區(qū)、優(yōu)選從最后的體節(jié)至尿囊分離入含有胰蛋白酶(0.5％)的單一細(xì)胞懸浮液中并用微量加液器緩慢研磨。如下所述例如將細(xì)胞涂板入含有或不含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板中。在這一階段，在每一大鼠胚胎中存在約幾百PGCs。
Ⅱ．培養(yǎng)條件本發(fā)明使用可促進(jìn)ES細(xì)胞衍生的培養(yǎng)條件。
A．胚胎組織的培養(yǎng)物在使ES細(xì)胞生長(zhǎng)并增殖的任意條件下使初期胚泡(ES細(xì)胞來源于此)在任意合適的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。例如，一種合適的培養(yǎng)基是小鼠ES培養(yǎng)基(含有補(bǔ)充了15％胎牛血清(FBSHyClone)、1X非必需氨基酸、0.1mM 2-巰基乙醇和抗生素的谷氨酰胺和高葡萄糖(Gibco)的DMEM)。
優(yōu)選將原代的原生殖細(xì)胞(PGC)在含有外源性生長(zhǎng)因子例如LIF、SCF和bFGF的小鼠ES培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)?？梢允褂玫钠渌L(zhǎng)因子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地測(cè)定所述生長(zhǎng)因子的合適濃度。正如本文所述，已經(jīng)證實(shí)2000 U/ml LIF(GIbco)、小鼠SCF60ng/mL、人bFGF 20ng/ml(Genzyme)是有效的。此外，可以在由其它物種制備的ES細(xì)胞、例如如本文所述預(yù)先制備的ES細(xì)胞中培養(yǎng)所述的細(xì)胞。
可以在同樣的培養(yǎng)基或缺乏外源性生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第二代的和隨后的PGC培養(yǎng)物。在正常和延期胚泡培養(yǎng)物中，在約3天的培養(yǎng)后內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)是可見的。在用其它細(xì)胞類型將污染減小到最低限度的條件下、例如在約3-5天的培養(yǎng)后除去ICMs。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用微量加液器除去ICM且然后用0.25％的胰蛋白酶分離。將ICM分散成一種單一細(xì)胞懸浮液或更優(yōu)選緩慢分散成小組的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在6孔平皿中培養(yǎng)ICM培養(yǎng)物并通過形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)選擇由分散的ICMs產(chǎn)生的集落。可以將外源性生長(zhǎng)因子(例如bFGF、LIF和SCF)以單獨(dú)或結(jié)合的方式添加到培養(yǎng)物中。
可選擇的是，在一種飼養(yǎng)層、例如以有絲分裂方式失活的SNL 76/7細(xì)胞上培養(yǎng)ICM培養(yǎng)物，所述的SNL 76/7細(xì)胞是一種產(chǎn)生白血病抑制因子(LIF)和干細(xì)胞因子(SCF)的飼養(yǎng)系。不應(yīng)使用誘導(dǎo)分化(改變形態(tài)、缺失堿性磷酸酶(AP)染色)的飼養(yǎng)細(xì)胞。
B．與ES細(xì)胞的共培養(yǎng)衍生胚胎干細(xì)胞中的關(guān)鍵步驟是在有多能胚胎干細(xì)胞存在的情況下培養(yǎng)胚胎組織。不受一種理論的約束，看起來所述的共培養(yǎng)方法由于ES細(xì)胞間的細(xì)胞接觸并由于ES細(xì)胞自身調(diào)節(jié)培養(yǎng)基而是有效的。本發(fā)明者注意到純化生長(zhǎng)因子不足以提供未分化ES細(xì)胞的最佳維持性、多能性和增殖性。對(duì)于具有種系傳播的高可能性的小鼠ES細(xì)胞來說，必須在飼養(yǎng)層上與血清一起培養(yǎng)小鼠ES細(xì)胞。最重要的是，本發(fā)明者還注意到當(dāng)以低密度而不是高密度培養(yǎng)小鼠ES細(xì)胞時(shí)，小鼠ES細(xì)胞分化得極為容易并經(jīng)常分化。這些觀察結(jié)果使得本發(fā)明者要求保護(hù)共培養(yǎng)方法。
如上所述，胚胎組織可以來源于任意的來源，優(yōu)選來源于一種非小鼠供體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的胚胎細(xì)胞是來源于非延期或延期胚泡的ICMs。在另一個(gè)實(shí)施方案中，它們是原生殖細(xì)胞。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，它們是延期胚泡。盡管還可以將1-50、優(yōu)選約5-10個(gè)單一細(xì)胞混入單一培養(yǎng)物，但是使用至少一種胚胎組織細(xì)胞。
可以分離所選擇的胚胎組織細(xì)胞并立即與非靶胚胎干細(xì)胞一起進(jìn)行共培養(yǎng)。優(yōu)選的情況是，在將非靶胚胎干細(xì)胞添加到培養(yǎng)物中前，在體外將胚胎組織進(jìn)行短時(shí)培養(yǎng)，例如大約3天。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在胚胎細(xì)胞開始分化前建立共培養(yǎng)物。可選擇的是，在一種細(xì)胞飼養(yǎng)層、例如STO或SNL76/7細(xì)胞的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)所述的原代胚胎組織培養(yǎng)物。
可以將任意多能胚胎干細(xì)胞用于共培養(yǎng)條件。盡管在共培養(yǎng)物中所需的可能與一種ES細(xì)胞一樣少，但是需要更多的ES細(xì)胞，例如10-100個(gè)。優(yōu)選的是使用與所需一樣少的細(xì)胞來衍生靶ES細(xì)胞，因?yàn)檫^多添加的非靶ES細(xì)胞可以過度競(jìng)爭(zhēng)通常緩慢分離的靶物種胚胎細(xì)胞。優(yōu)選的情況是，非靶ES細(xì)胞是小鼠ES細(xì)胞。已經(jīng)描述了分離小鼠ES細(xì)胞的過程(參見，例如Martin，1981；Ledermann等，1991和Matsui等，1992)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，非靶胚胎干細(xì)胞是具有陰性選擇標(biāo)記基因的小鼠ES細(xì)胞。因此，可以從所述的共培養(yǎng)物中選擇性地除去小鼠ES細(xì)胞。存在大量合適的選擇性標(biāo)記，它們包括例如HPRT和胸苷激酶。其它陰性選擇標(biāo)記基因是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，非靶小鼠ES細(xì)胞是通過敲除或通過天然突變而缺失HPRT的細(xì)胞系。合適的ES細(xì)胞系不能回復(fù)到HPRT陽(yáng)性(HAT抗性)表型。來自靶物種的共培養(yǎng)細(xì)胞是HPRT陽(yáng)性并經(jīng)HAT處理而存活。正如下文實(shí)施例中所述，僅含有HPRT陰性小鼠細(xì)胞的對(duì)照組經(jīng)HAT處理沒有存活。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，已經(jīng)通過γ-照射而以有絲分裂方式使非靶ES細(xì)胞失活。
鑒定來自靶物種的ES細(xì)胞的另一種方法是使用作為共培養(yǎng)來源的胚泡，它們來自野生型雌性大鼠和雄性轉(zhuǎn)基因大鼠雜交的胚泡，其中所述的轉(zhuǎn)基因是一種報(bào)道基因。例如，可以將雌性Sprague-Dawley大鼠與攜帶在一種金屬硫蛋白(metallothionine)啟動(dòng)子的控制下的隨機(jī)插入的穩(wěn)定整合LacZ報(bào)道基因的純合雄性大鼠雜交。LacZ蛋白表達(dá)由此由金屬離子諸如鋅或鎘所誘導(dǎo)。然后將這些從雜交體中分離的胚泡與選擇性非靶ES細(xì)胞一起進(jìn)行共培養(yǎng)。在選擇性殺死所添加的非靶ES細(xì)胞后，可以誘導(dǎo)剩余細(xì)胞在培養(yǎng)物中表達(dá)LacZ。正如下文實(shí)施例中所述，所要求保護(hù)的方法產(chǎn)生了是藍(lán)色的大鼠群體(即表達(dá)LacZ)。
Ⅲ．ES細(xì)胞的鑒定還可以將使用本文所要求保護(hù)方法獲得的ES細(xì)胞用于檢測(cè)ES細(xì)胞表型。由ES細(xì)胞表達(dá)的典型細(xì)胞表面標(biāo)記包括堿性磷酸酶和抗-SSEA-1。體外檢測(cè)試驗(yàn)用于檢測(cè)分化、其中使用形成的胚狀體、隨后使用產(chǎn)生分化細(xì)胞類型的培養(yǎng)物；以及視黃酸誘導(dǎo)的分化。還可以通過表明來源于所分離的單細(xì)胞的亞克隆分化入各種不同細(xì)胞類型的能力并通過在注入整體動(dòng)物時(shí)形成畸胎瘤來證實(shí)推定ES細(xì)胞的多能性。在該過程的任意階段均可以對(duì)所述的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)。
A．組織化學(xué)多能ES細(xì)胞表達(dá)可以使用抗體或比色(酶)試驗(yàn)法經(jīng)組織化學(xué)方式檢測(cè)到的特異性細(xì)胞表面標(biāo)記。本文所用的“抗體”指的是由一種或多種基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的多肽類組成的蛋白質(zhì)。所識(shí)別的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因以及多免疫球蛋白可變區(qū)基因。將輕鏈分類為κ或λ。將重鏈分類為γ、μ、α、δ、或ε，它們依次定義的免疫球蛋白類別分別為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
可以將單克隆或多克隆抗體用于檢測(cè)ES細(xì)胞標(biāo)記?？?SSEA-1識(shí)別未分化小鼠干細(xì)胞表面上的糖脂。堿性磷酸酶(AP)活性是原生殖細(xì)胞、胚泡、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和ES細(xì)胞的特征。附圖6和7表示與小鼠ES細(xì)胞共培養(yǎng)的大鼠ICM和PCMs是AP陽(yáng)性的(參見附圖6D和7C)。AP檢測(cè)試驗(yàn)和SSEA-1抗體均是可經(jīng)商品途徑得到的。
B．胚狀體多能ES細(xì)胞可以在培養(yǎng)物中分化成含有多細(xì)胞類型的胚狀體。ES細(xì)胞是多層的并且由這些多層細(xì)胞產(chǎn)生的胚狀體含有內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織及結(jié)構(gòu)。相反，未分化細(xì)胞(非ES)具有一層上皮層并發(fā)育成由單一細(xì)胞類型上皮細(xì)胞組成的胚狀體。例如，在小鼠ES細(xì)胞中，已經(jīng)證實(shí)去除某些生長(zhǎng)因子或用誘導(dǎo)劑，如視黃酸或3-甲氧基苯甲酰胺處理它們通常伴隨生成復(fù)雜的囊狀胚狀體，在其中可以檢測(cè)到內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的形成。一個(gè)很容易觀察到的多能性指標(biāo)是來自培養(yǎng)皿中自發(fā)收縮的心肌組織胚狀體的形成。一般來說，本文所述的ES細(xì)胞形成具有各種不同細(xì)胞類型、包括自發(fā)收縮的心肌組織的胚狀體。參見，例如實(shí)施例4的第B.2部分。
Ⅵ．使用ES細(xì)胞的基因靶向突變?cè)诶碚撋?，可以將任意特殊物種的品種用作注射該物種ES細(xì)胞的宿主胚泡。然而，實(shí)際上，使用小鼠ES細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明某些相互結(jié)合是不可能的，且宿主的選擇是獲得種系傳播的關(guān)鍵所在。當(dāng)所述大鼠ES細(xì)胞來源于Long Evans品種時(shí)，優(yōu)選的宿主是Fischer 344品種，這是因?yàn)橥ㄟ^觀察色素形成這種白化體品種可以使評(píng)估來自LE ES細(xì)胞的ES細(xì)胞貢獻(xiàn)成為可能。另一方面，可以將來源于白化體大鼠品種(例如Fischer 344)的ES細(xì)胞注入有色宿主品種。Fischer 344白化體動(dòng)物缺乏當(dāng)注入白化體宿主胚泡時(shí)用于檢測(cè)ES細(xì)胞在嵌合體中貢獻(xiàn)的毛色標(biāo)記，從而允許將細(xì)胞系注入有色品種的胚泡，例如Long Evans或DarkAgouti。毛色標(biāo)記是一種便利而非一種必要性，這是因?yàn)橥ㄟ^其它方式可以檢測(cè)ES細(xì)胞衍生的細(xì)胞。存在兩種可能的用于檢測(cè)細(xì)胞的策略1.內(nèi)源性同工酶或分子標(biāo)記；和2.引入的蛋白質(zhì)或遺傳表記。已經(jīng)將GPI的同工酶和其它普遍存在的酶用于鑒定許多大鼠品種并可以通過所建立的技術(shù)在血樣或活體解剖組織中檢測(cè)到它們(參見，例如Robertson，文獻(xiàn)同上)。
一般更為有用的另一種技術(shù)是將分子標(biāo)記引入培養(yǎng)物中的ES細(xì)胞。例如，通過引入β-半乳糖苷酶或酪氨酸酶質(zhì)粒可以生成一種標(biāo)記的細(xì)胞系；通過染色可檢測(cè)β-半乳糖苷酶，且它具有將嵌合體作為胚胎進(jìn)行檢查的優(yōu)點(diǎn)。酪氨酸酶基因可以將白化體細(xì)胞轉(zhuǎn)化成能夠產(chǎn)生色素的細(xì)胞，從而直接使毛色嵌合狀態(tài)顯色。本文描述了ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法且它們是本領(lǐng)域中公知的，β-半乳糖苷酶和酪氨酸酶質(zhì)粒是市售可得的。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以將任何動(dòng)物品種用于胚泡宿主，包括來自來源于ES細(xì)胞的品種。
ES細(xì)胞技術(shù)的能力在于遺傳修飾培養(yǎng)物中的細(xì)胞、分析正確修飾的細(xì)胞、然后從所述細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)物的新種系的能力。為了發(fā)揮ES細(xì)胞所提供的這一強(qiáng)有力的工具的作用，近幾年來用于引入遺傳修飾和用于分析ES細(xì)胞的方法已經(jīng)得到了快速的發(fā)展?；虬邢虿呗允固禺愋曰蛲ㄟ^同源重組而失活。已經(jīng)開發(fā)了選擇技術(shù)以改進(jìn)罕有靶向事件的鑒定并導(dǎo)入微細(xì)突變。(參見，例如Hasrty等(1991)《自然》(Nature)350243-246；美國(guó)專利5，629，159)。使用微量滴定平板和快速DNA制備技術(shù)的ES細(xì)胞分析的有效方法篩選出了數(shù)以千計(jì)的用于極為罕有事件的克隆。根據(jù)本文所述的非小鼠ES細(xì)胞的情況，可以很方便地將產(chǎn)生小鼠中轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的公知方法用于其它物種。
近來ES細(xì)胞技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究方面已經(jīng)取得了重要突破。在三個(gè)新的報(bào)導(dǎo)、包括本發(fā)明者的一個(gè)報(bào)導(dǎo)中，將ES細(xì)胞用于產(chǎn)生表達(dá)在酵母人工染色體(YACs)中克隆的大基因組DNA片段的轉(zhuǎn)基因小鼠。(參見，例如Strauss等(1993)《科學(xué)》(Science)2591904-1907；Brinster(1988)《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Nat’l Acad.Sci.USA)85836-40；Choi等(1993)4(2)117-23和4(3)320)。這項(xiàng)技術(shù)的原理在于期待保持非常可能被正確表達(dá)的基因座的內(nèi)含和組成的基因組轉(zhuǎn)基因。然而，許多基因超過了常規(guī)質(zhì)粒的克隆能力(低于80kb)，而通過顯微注射受精卵的轉(zhuǎn)基因傳統(tǒng)途徑可能因經(jīng)顯微注射吸管推入DNA產(chǎn)生的剪切力而具有DNA大小的上限值。YAC具有超過2000kb的克隆能力。使用公知技術(shù)可以產(chǎn)生經(jīng)YAC轉(zhuǎn)染大鼠ES細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因大鼠。實(shí)際上使用ES細(xì)胞可以破壞任何基因或用YACs可以整體轉(zhuǎn)移任何基因。在大鼠中，涉及神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病等)和心血管疾病的基因是特別優(yōu)選的。
Ⅶ．ES細(xì)胞的應(yīng)用A．涉及AD的基因和遺傳途徑的鑒定通過操作培養(yǎng)條件(例如添加視黃酸、從培養(yǎng)基中除去血清、改變培養(yǎng)底物、添加特異性生長(zhǎng)或抑制因子或用于細(xì)胞表面受體的配體)可以將人和大鼠ES細(xì)胞制成在培養(yǎng)物中分化成神經(jīng)元的成神經(jīng)細(xì)胞?？梢詫⑺龅募?xì)胞制成促進(jìn)某類分化的胚狀體，然后用促進(jìn)神經(jīng)元分化的其它因子處理。為了增加神經(jīng)元的產(chǎn)量，可以通過首先用一種轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞而從其它細(xì)胞類型中選擇成神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)元，其中在所述的轉(zhuǎn)基因中神經(jīng)元或成神經(jīng)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子可啟動(dòng)選擇標(biāo)記、新型細(xì)胞表面大分子或報(bào)道基因(諸如綠色熒光蛋白或LacZ)的表達(dá)。就用選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)染的細(xì)胞而言，向能夠使表達(dá)轉(zhuǎn)基因(而不能使不含有轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞)的細(xì)胞存活和/或生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中添加一種化合物可允許收集神經(jīng)元。就用新型細(xì)胞表面大分子基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞而言，通過大量方法，包括但不限于抗體結(jié)合法、附著底物法并通過提供一種熒光標(biāo)記可以將新型細(xì)胞表面大分子的表達(dá)用作篩選神經(jīng)元。就用報(bào)道基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞而言，通過FACS收集表達(dá)報(bào)道基因的細(xì)胞。神經(jīng)元或成神經(jīng)細(xì)胞還可以通過密度梯度離心或通過使用區(qū)分它們與其它細(xì)胞的內(nèi)在特性而從其它細(xì)胞中得到分離。
可以通過mRNA檢測(cè)法，包括但不限于Northern印跡分析、RNAse保護(hù)法、逆轉(zhuǎn)錄PCR和表達(dá)序列標(biāo)記(ESTs)、寡核苷酸或cDNA的cDNA表達(dá)陣列或微陣列來繪制ES衍生細(xì)胞的基因表達(dá)分布圖。在進(jìn)行這類分析前，可以首先優(yōu)選通過線性擴(kuò)增法來擴(kuò)增mRNA。在神經(jīng)元而不是在其ES細(xì)胞前體中表達(dá)的基因是神經(jīng)元特異性藥物靶向物的候選物。通過對(duì)所述ES細(xì)胞前體進(jìn)行遺傳操作來實(shí)施候選基因的進(jìn)一步分析。例如，通過經(jīng)同源重組的基因靶向可以“敲除”公知涉及AD的基因，諸如preselinins、載脂蛋白E、淀粉樣前體蛋白(APP)。由于ES細(xì)胞是二倍體，所以可以通過篩選基因轉(zhuǎn)化事件或通過以兩者的等位基因?yàn)榘衼硇揎梼煞N基因的拷貝。在另一個(gè)實(shí)例中，通過“敲進(jìn)”法，如cre-lox法和一觸即發(fā)程序在原位修飾同樣的基因。使用這些方法可以進(jìn)行蛋白質(zhì)區(qū)和“基序”的修飾以及特異性突變的導(dǎo)入。在另一個(gè)ES細(xì)胞遺傳操作的實(shí)例中，添加基因作為cDNA構(gòu)建體或作為大基因組轉(zhuǎn)基因(例如來自基因組文庫(kù)的BACs和YACs)。將人基因添加到大鼠細(xì)胞并添加到人細(xì)胞中。所修飾的基因不限于與AD相關(guān)的基因，但是可以包括任何所關(guān)注的基因。
使用例如免疫印跡分析、ELISA、雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳分析和組織化學(xué)分析可以制成所述細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)分布圖。對(duì)于AD，當(dāng)前所關(guān)注的特異性蛋白質(zhì)是APP的片段，如可溶性APP和A-β淀粉狀蛋白。例如，可以將表達(dá)這些基因和其它與AD相關(guān)基因的細(xì)胞用于鑒定候選藥物并用于試驗(yàn)神經(jīng)元中和AD中有關(guān)基因、信號(hào)因子和蛋白質(zhì)特異性相互作用的假說。這類細(xì)胞可以提供基因表達(dá)及其在神經(jīng)元中控制的情況。
B．候選藥物試驗(yàn)中的ES細(xì)胞可以在人和大鼠ES細(xì)胞衍生的神經(jīng)元中試驗(yàn)設(shè)計(jì)成直接影響神經(jīng)元的藥物。結(jié)果對(duì)前期臨床研究和臨床試驗(yàn)具有所預(yù)計(jì)的價(jià)值?？梢酝ㄟ^將大鼠或人ES細(xì)胞衍生的神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，如星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞一起共培養(yǎng)來試驗(yàn)通過其它類型細(xì)胞起作用的藥物。例如，獲得用于共培養(yǎng)的細(xì)胞類型作為原代培養(yǎng)物細(xì)胞系并從人ES細(xì)胞中衍生它們。通過使用類似的培養(yǎng)物也可以測(cè)定藥物的毒性。藥物的作用通過各種不同的試驗(yàn)來評(píng)估，所述的試驗(yàn)包括但不限于生物化學(xué)試驗(yàn)、免疫化學(xué)試驗(yàn)或基因表達(dá)試驗(yàn)?？梢赃z傳修飾ES細(xì)胞以檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNPS)或較大遺傳差異對(duì)藥物功效和直接毒性的影響。分化的細(xì)胞包括在血腦屏障(BBB)模型中，從而檢測(cè)了必須通過BBB的藥物的有效性。
C．ES衍生的細(xì)胞作為大腦的移植物來源于人ES細(xì)胞的神經(jīng)元和與神經(jīng)元相關(guān)的細(xì)胞的潛在應(yīng)用就是修復(fù)由神經(jīng)變性疾病和損傷所破壞的組織。目前的應(yīng)用是帕金森病(PD)的多巴胺能神經(jīng)元紋狀體移植、修復(fù)由局部缺血性中風(fēng)破壞的大腦區(qū)域并為脊髓損傷搭橋。另外的應(yīng)用包括將神經(jīng)元植入大腦區(qū)域或由下列情況影響的身體部位AD、外周神經(jīng)病、ALS(肌萎縮性側(cè)索硬化)和其它神經(jīng)變性疾病，如運(yùn)動(dòng)失調(diào)(三核苷酸重復(fù)性疾病)。所植入的細(xì)胞包括神經(jīng)元和神經(jīng)元支持的細(xì)胞(諸如神經(jīng)膠質(zhì)或成纖維細(xì)胞)或在移植物中相互支持的細(xì)胞結(jié)合體。
這類移植物細(xì)胞是遺傳上未改變的或?qū)⑺鼈冃揎棾僧a(chǎn)生特異性神經(jīng)遞質(zhì)(諸如用于PD的多巴胺)或特異性生長(zhǎng)因子以支持它們自身或其它細(xì)胞。
D．ES細(xì)胞的另外的應(yīng)用為了降低移植排斥的機(jī)會(huì)，可以將ES細(xì)胞遺傳修飾以表達(dá)不同的HLA類型，表達(dá)掩蔽來自宿主免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的分子和/或通過敲除抗原性大分子進(jìn)行遺傳修飾。
可以將本文所述的轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞用于體外篩選或檢測(cè)化合物。在一個(gè)方面中，可以將表達(dá)涉及藥物代謝的基因，如p450基因的ES細(xì)胞，用于測(cè)定化合物對(duì)發(fā)育和/或分化的作用。優(yōu)選的情況是，ES細(xì)胞表達(dá)人p450基因。
還可以將本文所述的遺傳修飾的ES細(xì)胞用于創(chuàng)建用于體內(nèi)篩選潛在療法的疾病的動(dòng)物模型。這類動(dòng)物模型可以包括“人源化”大鼠(或其它通常在實(shí)驗(yàn)室中使用的物種)。這些“人源化”的動(dòng)物是由已經(jīng)遺傳修飾而攜帶與疾病情況相關(guān)的人基因的ES細(xì)胞形成的。這類形成的模型動(dòng)物對(duì)藥物開發(fā)的發(fā)現(xiàn)后的前期臨床來說是有用的。下列實(shí)施例僅用來解釋本發(fā)明而決不構(gòu)成限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1大鼠胚胎組織的分離和培養(yǎng)A．大鼠品種建立繁殖期Brown Norway(BN；Charles River)大鼠的小群落。將約40只BN大鼠飼養(yǎng)在微型分離籠中并充當(dāng)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物。對(duì)于原生殖細(xì)胞發(fā)育過程來說(參見下面的內(nèi)容)，使用定時(shí)交配的Sprague Dawley大鼠(SD；Simonsen)。也使用來自本地供應(yīng)商(Simonsen)的定時(shí)交配的動(dòng)物(F344和Long-Evans)。來自Simonsen的Long-Evans品種是一種約50％為黑色且50％為白色的盔狀大鼠。盡管傳統(tǒng)上是一種異系交配的品種，但是Simonsen動(dòng)物是已經(jīng)通過兄妹交配16代衍生的有效近交品種。對(duì)于胚泡注射來說，開發(fā)了由Fischer344品種產(chǎn)生大量胚泡的技術(shù)。
F344品種和Simonsen LE大鼠產(chǎn)生了大量胚泡并在實(shí)驗(yàn)過程中表現(xiàn)良好。LE動(dòng)物不均勻著色，但可產(chǎn)生所需評(píng)估嵌合體的毛色標(biāo)記。作為用于胚泡注射的宿主品種，AGUS品種和AB2大鼠是可選擇的，因?yàn)樗鼈兪欠强鵂畹陌谆w品種。這些品種的成熟動(dòng)物不能足量商購(gòu)以用于短期設(shè)計(jì)方案?？商娲姆椒ㄊ?，使用F344動(dòng)物開發(fā)胚泡注射的方法，對(duì)此可得到來源豐富的成熟的不含病原體的動(dòng)物(Simonsen)。將來自F344品種的宿主胚泡與LE ES細(xì)胞結(jié)合使用允許方便地觀察ES細(xì)胞在嵌合體中的貢獻(xiàn)。
B．由自然交配產(chǎn)生的胚泡通過動(dòng)情期選擇產(chǎn)生胚泡的雌性交配動(dòng)物。為了更有效地使用所述的動(dòng)物，對(duì)在第0.5天發(fā)現(xiàn)的陰道塞用來檢測(cè)精子的存在，從而允許對(duì)雄性受精能力的檢測(cè)。在交配后第3.5、4.5和5.5天時(shí)通過沖洗來自一組14只受孕動(dòng)物的子宮和卵巢來確定BN品種中發(fā)育的時(shí)間。不同于小鼠的情況，據(jù)測(cè)定，一天時(shí)間就改變各個(gè)動(dòng)物中BN大鼠胚胎的發(fā)育情況。一般來說，在第3.5和4.5天時(shí)在卵巢內(nèi)發(fā)現(xiàn)分裂早期的胚胎，且在4.5和5.5天時(shí)在子宮中出現(xiàn)桑椹胚和胚泡，而在各個(gè)動(dòng)物胚胎中發(fā)現(xiàn)了從受精卵到胚泡期，特別是使用F344和LE大鼠品種更是如此。供應(yīng)商(Simonsen)可以將這些品種的動(dòng)物定時(shí)交配并在交配后第3天時(shí)裝運(yùn)?？梢栽诘?.5天時(shí)從約50％的F344大鼠和約80％的LE大鼠中收集到胚泡。
C．大鼠的超數(shù)排卵為了使大鼠超數(shù)排卵，采用由Armstrong和Opavsky((1988)《生物學(xué)繁殖》39511-518)開發(fā)的方法。給幼小的雌性動(dòng)物植入含有豬促卵泡激素(FSH)的微型滲透泵(Alza Corporation)；在3天后取出所述的泵并使動(dòng)物交配。這種方法可在我們的群落中提供更有預(yù)計(jì)性的胚泡產(chǎn)量，且如果自然交配的動(dòng)物不能產(chǎn)生足夠的胚泡，那么可以將這種方法用于產(chǎn)生注射ES細(xì)胞候選物的宿主胚泡。
D．延期胚泡已經(jīng)預(yù)先衍生出了來自兩個(gè)品種小鼠的延期胚泡的胚胎干細(xì)胞系。在所述的小鼠中，當(dāng)胚胎已經(jīng)下降到輸卵管中時(shí)，在第2.5天時(shí)方便地取出卵巢，這一過程可以在胚泡發(fā)育后阻止移植物。必須將顯著修飾的過程用于大鼠。原始的過程在大鼠中不起作用，而在第2.5天或3.5天從經(jīng)卵巢切除的BN動(dòng)物中獲得非延期胚泡并在隨后3-6天檢測(cè)胚胎。從卵巢切除術(shù)后植入了含有Depo-Provera(一種用于延緩植入小鼠胚泡的孕酮類似物)的微型滲透泵的11只Sprague Dawley動(dòng)物中沒有得到胚胎。這種成功的方法將在第3.5天實(shí)施的卵巢切除術(shù)與每日注射孕酮(5mg/動(dòng)物/天，皮下注射)結(jié)合起來。這種方法看起來對(duì)Long-Evans大鼠特別有效。
E．原生殖細(xì)胞近期報(bào)導(dǎo)具有體外胚胎干細(xì)胞所有特性的細(xì)胞可以來源于第8.5天(第13期)小鼠的原生殖細(xì)胞。從BN、SD、F344和LE大鼠中獲得同期(在第9.5天)的大鼠胚胎，將其解剖并分離尾部(后部至最末體節(jié))并在含有堿性FGF、干細(xì)胞因子和LIF(Matsui等，1992)的培養(yǎng)基中的SNL76/7飼養(yǎng)層上培養(yǎng)它們(參見下文的培養(yǎng)條件)。
實(shí)施例2用于大鼠細(xì)胞的培養(yǎng)基在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中所用的培養(yǎng)基以小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)基為基礎(chǔ)并含有補(bǔ)充了15％胎牛血清(Hyclone)、1X非必需氨基酸(Gibco)和2-巰基乙醇(0.1mM)的高葡萄糖DMEM(Gibco)。條件培養(yǎng)基由Buffalo大鼠肝細(xì)胞(BRLATCC)、小鼠AB-1 ES細(xì)胞(由A.Bradley提供)和我們衍生的大鼠胚泡衍生的細(xì)胞系(BNRB-1)制備。培養(yǎng)基以所述細(xì)胞系培養(yǎng)2天為條件，然后將所述培養(yǎng)基過濾并冷凍以備后來使用。對(duì)于實(shí)驗(yàn)來說，使用的條件培養(yǎng)基為混合了50％新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)基。所用的外源性生長(zhǎng)因子是白血病抑制因子(LIF1000-2000U/mL；Gibco/BRL)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(BFGC20 ng/mL；Genzyme)和干細(xì)胞因子(SCF60 ng/mL；Genzyme)。
將正常和延期胚泡(如附
圖1中所示)置于由產(chǎn)生LIF小鼠成纖維細(xì)胞(SNL76/7)或胚胎大鼠成纖維細(xì)胞制成的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上并培養(yǎng)3-7天。所有結(jié)合的胚泡和幾乎所有的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)均是可見的(附
圖1d)。培養(yǎng)基(LIF；LIF和SCF，或者LIF、SCF、和bFGF)沒有使早期胚泡培養(yǎng)物有明顯差異。在胚泡培養(yǎng)后3-5天通常從每一培養(yǎng)物中取出細(xì)胞的中心團(tuán)、分離并在相同培養(yǎng)基中的相同飼養(yǎng)類型上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)物中經(jīng)常含有各種不同形態(tài)的集落，包括某些類似于小鼠ES細(xì)胞致密集落形態(tài)的某些集落(附圖2)。在傳代培養(yǎng)后大約1周，將類似分離ES細(xì)胞的集落解離并傳代培養(yǎng)。將經(jīng)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞傳代一次且然后進(jìn)行冷凍。細(xì)胞系來源于非延期的Brown Norway胚泡(BNRB-1)、Fischer 344延期的胚泡(FRDB-1)和Long-Evans品種。
將兩類飼養(yǎng)層用于這些實(shí)驗(yàn)。SNL76/7是用作小鼠AB-1 ES細(xì)胞飼養(yǎng)層的小鼠成纖維細(xì)胞系(Soriano等，1991)。SNL76/7細(xì)胞耐新霉素并產(chǎn)生LIF和干細(xì)胞因子。大鼠胚胎成纖維細(xì)胞(REF)由大鼠胚胎經(jīng)用于例如Doetschman等在《胚胎形態(tài)實(shí)驗(yàn)雜志》(J.Embryol Exp.Morph.)8727-45中所述的方法制備。通過用絲裂霉素C處理而使飼養(yǎng)細(xì)胞以有絲分裂方式失活。絲裂霉素C在用于SNL細(xì)胞的濃度為10μg/ml時(shí)對(duì)REF細(xì)胞有毒性，于是使該濃度降至4μg/ml，并將細(xì)胞進(jìn)行短時(shí)間處理。在6孔或24孔組織培養(yǎng)平板、玻璃蓋玻片或玻璃培養(yǎng)載玻片(LabTek)上的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)細(xì)胞。另一方面，用γ-照射可以使飼養(yǎng)層以有絲分裂方式失活(參見Robertson，文獻(xiàn)同上)。
使用報(bào)導(dǎo)用于小鼠的方法由獲自解剖9.5天的Sprague Dawley和Long-Evans(LE)品種大鼠胚胎組織培養(yǎng)原生殖細(xì)胞并如下所述對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行染色。幾種培養(yǎng)物中含有用AP染色的細(xì)胞集落(附圖3e)，且因此它們很可能是PGCs。
A．培養(yǎng)條件對(duì)大鼠胚泡衍生細(xì)胞的影響在一種初步實(shí)驗(yàn)中，用研究可用胚胎干細(xì)胞特征促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或維持細(xì)胞的條件檢測(cè)各種條件培養(yǎng)基和外源性生長(zhǎng)因子。將結(jié)果概括在表1中。將AP染色的程度用于評(píng)估附圖6中所示的培養(yǎng)物。以BRL細(xì)胞為條件的培養(yǎng)基對(duì)大鼠培養(yǎng)物中的AP染色沒有顯著的影響。BRL細(xì)胞產(chǎn)生LIF、SCF和維持未分化態(tài)小鼠ES細(xì)胞的其它因子。類似地，小鼠ES細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)大鼠細(xì)胞也沒有影響。以高密度BNRB-1細(xì)胞為條件的培養(yǎng)基看起來減少了相同細(xì)胞系培養(yǎng)物中的AP染色，從而提示所述的細(xì)胞可以產(chǎn)生使它們分化或抑制未分化細(xì)胞增殖的因子。在到目前為止所檢測(cè)的條件中，僅外源性bFGF看起來具有增加AP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的定性作用。
表1培養(yǎng)條件對(duì)大鼠胚泡衍生的(BNRB-1)細(xì)胞的影響 a由附圖6中所示的培養(yǎng)物評(píng)估染色的程度。評(píng)分表示培養(yǎng)物中染色的相對(duì)量。-/+表示幾乎沒有檢測(cè)到染色。
實(shí)施例3共培養(yǎng)物中大鼠ES細(xì)胞的衍生通過將上述大鼠細(xì)胞系與小鼠ES細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)而衍生多能ES細(xì)胞。在STO飼養(yǎng)層上將非延期胚泡的大鼠ICMs培養(yǎng)3天。3天后，ICMs中存在大約20-50個(gè)細(xì)胞。在分化開始前(通常約4天)，將大鼠ICMs與稱作Del 19.2的小鼠ES細(xì)胞系混合。從Allan Bradley博士處獲得該細(xì)胞系，它在HPRT基因的單(X-連接)拷貝中具有“敲除”的19.2kb。Del 19.2細(xì)胞是HPRT-，不在HAT培養(yǎng)基中存活并不能回復(fù)到HPRT+表型。當(dāng)鋪滿至少兩倍時(shí)用胰蛋白酶?jìng)鞔笫驣CM小鼠ES細(xì)胞共培養(yǎng)物。在約5天至2周之間，加入HAT培養(yǎng)基以殺死小鼠Del 19.2細(xì)胞。大鼠細(xì)胞在HAT處理下存活下來，因?yàn)樗鼈兪荋PRT陽(yáng)性的。獲得數(shù)以百計(jì)的存活集落。如下具體所述，這些集落維持多能ES細(xì)胞的標(biāo)記。
實(shí)施例4共培養(yǎng)前后大鼠細(xì)胞的特征鑒定在與ES細(xì)胞共培養(yǎng)前后通過各種方法來對(duì)大鼠細(xì)胞進(jìn)行特征鑒定。一種細(xì)胞類型在沒有共培養(yǎng)情況下衍生的第一種細(xì)胞系(BNRB-1)中占主導(dǎo)地位。這些細(xì)胞是圓形可收縮的并且松散貼壁(附圖2C)。不同于小鼠ES細(xì)胞，這些細(xì)胞幾乎不趨向于聚集成緊密簇狀(比較附圖3B和3D)。將這種細(xì)胞系用來檢測(cè)屬于小鼠ES細(xì)胞特征的兩種標(biāo)記、堿性磷酸酶活性和階段特異性胚胎抗原SSEA-1的存在。第二種細(xì)胞系(FRDB-1)形成具有更為粘聚形態(tài)的集落(附圖2B、2C)，并已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行了某些標(biāo)記的分析。
A．組織化學(xué)用溶于PBS的4％低聚甲醛固定細(xì)胞以便進(jìn)行AP或抗體染色。為了檢測(cè)堿性磷酸酶的活性，用在有AP的情況下產(chǎn)生黑色反應(yīng)產(chǎn)物的Vectastain AP試劑盒(Vector Lab)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。由左旋咪唑抑制作用來證實(shí)染色的特異性。以1∶50-1∶100的稀釋度使用抗-SSEA雜交瘤上清液(Development Studies Hybridoma Bank)并用熒光素或共軛抗小鼠IgM(Vector Lab)來檢測(cè)抗體結(jié)合程度。用Nomarski光學(xué)顯微鏡(Nikon Diaphot)或熒光顯微鏡(Leitz Laborlux)觀察玻璃蓋玻片上的細(xì)胞生長(zhǎng)情況；用相差或明視野光鏡給組織培養(yǎng)皿中的細(xì)胞拍照。為了定量檢測(cè)AP陽(yáng)性細(xì)胞，將細(xì)胞胰蛋白酶消化、用2％低聚甲醛固定并在懸浮液中用AP試劑盒染色，且用一種血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。
1．堿性磷酸酶堿性磷酸酶(AP)活性是原生殖細(xì)胞、胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和小鼠ES細(xì)胞的特征。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)大鼠胚泡具有AP活性(附圖3A)，與在相同條件下培養(yǎng)的小鼠ICM一樣(附圖3C)。在BNRB-1細(xì)胞中可持續(xù)觀察到AP活性(附圖3B)，而僅有小比例的細(xì)胞。通過左旋咪唑(Vector Lab)來抑制染色，在對(duì)照組小鼠ES細(xì)胞中它也抑制AP活性。
改進(jìn)定量檢測(cè)試驗(yàn)以提供AP染色細(xì)胞比例的確切的測(cè)定值。正如表2中所示，在多次傳代后，BNRB-1系中AP陽(yáng)性細(xì)胞的比例僅為5％。FRBD-1系約有50％為陽(yáng)性。小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)物(AB-1)90％以上為陽(yáng)性。在通過對(duì)培養(yǎng)皿中集落染色的共培養(yǎng)后分析大鼠細(xì)胞。AP陽(yáng)性細(xì)胞的比例看起來幾乎為100％(參見附圖6和7)。
表2共培養(yǎng)前細(xì)胞系中的堿性磷酸酶陽(yáng)性細(xì)胞

B．大鼠細(xì)胞的多能性細(xì)胞多能性的一個(gè)體外重要標(biāo)志是這些細(xì)胞形成由多細(xì)胞類型組成的胚狀體的證明。
共培養(yǎng)前BNRB-1細(xì)胞顯示了體外分化的能力，但是它們沒有顯示出小鼠ES細(xì)胞多能性的程度。當(dāng)在促進(jìn)小鼠ES細(xì)胞分化成胚狀體的條件下培養(yǎng)時(shí)，大鼠細(xì)胞形成發(fā)育成泡囊樣結(jié)構(gòu)的聚集物(附圖5A)。這些結(jié)構(gòu)類似于通過經(jīng)小鼠ES細(xì)胞初步形成內(nèi)胚層而結(jié)合的簡(jiǎn)單胚狀體；然而，不同于小鼠細(xì)胞，大鼠胚胎泡囊不持續(xù)分化成更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。在大多數(shù)情況中，泡囊看起來通過單一上皮層結(jié)合，而某些發(fā)育成多層。當(dāng)重新涂布在飼養(yǎng)層上時(shí)，小鼠胚狀體分化成各種細(xì)胞類型；當(dāng)重新涂布時(shí)，大鼠胚胎泡囊不能進(jìn)一步分化。這種受限制的分化與群體中主要細(xì)胞類型是分化的內(nèi)胚層細(xì)胞的觀點(diǎn)一致。
在某種培養(yǎng)條件下，某些BNRB-1細(xì)胞集落進(jìn)行了形態(tài)分化。在大鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，小鼠ES細(xì)胞失去了其AP染色并分化成類似于上皮細(xì)胞的形態(tài)不同的細(xì)胞類型(附圖5C)。類似地，大鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上的某些大鼠細(xì)胞幾乎沒有表現(xiàn)出對(duì)AP染色并形成類似于上1.共培養(yǎng)前來自大鼠細(xì)胞的胚狀體皮細(xì)胞的集落(附圖5B)。當(dāng)在視黃酸中培養(yǎng)大鼠細(xì)胞時(shí)觀察到了類似的結(jié)果，這可誘發(fā)小鼠ES系中的分化(未顯示出)。
2．共培養(yǎng)后形成的胚狀體共培養(yǎng)后，所分離并重新懸浮的大鼠ES細(xì)胞分化成大量的不同形態(tài)的細(xì)胞類型，包括心臟組織的“搏動(dòng)”團(tuán)。形成搏動(dòng)心臟和其它胚狀體的能力是多能ES細(xì)胞的特征。
然后將這些細(xì)胞植入免疫缺陷宿主動(dòng)物(例如裸大鼠或裸小鼠)以確定它們是否形成了畸胎瘤。將這些細(xì)胞亞克隆并進(jìn)行核型分析且注射入宿主胚泡。
實(shí)施例5共培養(yǎng)物中大鼠ES細(xì)胞的衍生從交配后5天的PVG大鼠中獲得16個(gè)胚泡并涂布進(jìn)單個(gè)器官培養(yǎng)皿的含有2000 U小鼠LIF的1ml ES細(xì)胞培養(yǎng)基(與上述相同但含有20％的胎牛血清)中。所述的培養(yǎng)皿中含有有絲分裂失活的STO細(xì)胞飼養(yǎng)層。當(dāng)ICM細(xì)胞簇明顯時(shí)，將胚泡培養(yǎng)3天。用玻璃吸管從培養(yǎng)皿中取出ICM細(xì)胞并在不含鈣和鎂、含有1mM EGTA的PBS溶液中保溫30分鐘。將分離成小群體細(xì)胞的ICMs置于6孔培養(yǎng)皿內(nèi)的ES培養(yǎng)基(不含LIF)中的飼養(yǎng)層上。向相同的孔中添加1.5×105個(gè)小鼠ES細(xì)胞(HPRT-Del 19.2細(xì)胞)。對(duì)照孔中含有相同數(shù)量的小鼠ES細(xì)胞而非大鼠細(xì)胞。
3天后，用胰蛋白酶(1mM EDTA中0.25％；15分鐘，3℃)解離兩孔中的細(xì)胞。通過標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞保護(hù)法冷凍涂布了大鼠ICMs的十分之九的孔并使用同樣的培養(yǎng)基將保留下來的第十個(gè)孔涂布入含有飼養(yǎng)物的新的6孔室中。類似地，以1∶10的稀釋度使對(duì)照孔傳代。3次以上類似的傳代和以3天間隔的細(xì)胞冷凍(含大鼠細(xì)胞的培養(yǎng)物在第二次傳代時(shí)分成兩部分以生成兩個(gè)孔)后，將兩類培養(yǎng)物胰蛋白酶消化并重新涂布(不用稀釋)入含HAT的ES細(xì)胞培養(yǎng)基的飼養(yǎng)層上。此后，每天改變培養(yǎng)基(含有HAT)，持續(xù)3天。經(jīng)常進(jìn)行培養(yǎng)基的改變，因?yàn)樗劳黾?xì)胞的產(chǎn)物經(jīng)常破壞相同培養(yǎng)皿中的存活細(xì)胞。在第3天，用一種顯微鏡仔細(xì)檢測(cè)培養(yǎng)物。對(duì)照培養(yǎng)物中含有STO飼養(yǎng)細(xì)胞而沒有可見的胚胎干細(xì)胞，這表明所有小鼠HPRT-細(xì)胞已經(jīng)被HAT培養(yǎng)基殺死。
原來含有大鼠ICMs的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中含有大量的細(xì)胞集落。6孔中的一個(gè)孔(“A”)中含有38個(gè)集落，這些集落中含有估計(jì)的100-500個(gè)細(xì)胞；在它們中，3個(gè)看起來全部由已經(jīng)預(yù)先描述為“內(nèi)胚層”的分化的細(xì)胞類型組成，6個(gè)集落由不同形態(tài)細(xì)胞的混合物組成，且剩余的29個(gè)完全由看起來難以在顯微水平下與小鼠ES細(xì)胞區(qū)分的細(xì)胞組成?？住癇”中含有30個(gè)集落；7個(gè)是“內(nèi)胚層”，3個(gè)是混合的，且20個(gè)由ES樣細(xì)胞組成。將所述的集落用AP染色且所有含ES樣細(xì)胞的集落均為AP陽(yáng)性，這表明大鼠細(xì)胞不僅看起來象小鼠ES細(xì)胞，而且顯示出將小鼠細(xì)胞鑒定為ES細(xì)胞的標(biāo)記(附圖7)。
為了確信已經(jīng)在對(duì)照培養(yǎng)物中殺死全部小鼠細(xì)胞，將該培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基更換成不合HAT的ES培養(yǎng)基并用每日改變培養(yǎng)基的方式將所述的培養(yǎng)物維持10天以上。10天后甚至看起來沒有ES細(xì)胞產(chǎn)生，這表明通過HAT處理清除了所有的小鼠ES細(xì)胞。
實(shí)施例6使用大鼠ES細(xì)胞生成的轉(zhuǎn)基因大鼠通過胚泡注射對(duì)如上所述分離的大鼠ES細(xì)胞檢測(cè)體內(nèi)多能性。將LongEvans大鼠ES細(xì)胞注射入來自白化體Lewis品種的宿主胚泡。使所述的胚泡在替代母親中發(fā)育至分娩期并檢測(cè)幼鼠。所述的幼鼠具有棕色皮毛的斑點(diǎn)和有色眼，這顯示了Long Evans ES細(xì)胞的貢獻(xiàn)。
對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，顯而易見的是可以對(duì)上述實(shí)施方案進(jìn)行各種修改和改變而不會(huì)脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。這些修改和改變均屬于本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1．一種分離的非小鼠胚胎干細(xì)胞的群體。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞群體，其中所述的細(xì)胞是大鼠細(xì)胞。
3．一種從靶物種中獲得胚胎干細(xì)胞的方法，該方法包括下列步驟(a)在有利于來自靶物種胚胎干(ES)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下將從所述靶物種的胚胎中獲得的細(xì)胞與非靶胚胎干細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)；和(b)從所述的靶物種中分離所述的ES細(xì)胞。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中步驟(a)中所述的非靶胚胎干細(xì)胞是小鼠的非靶胚胎干細(xì)胞。
5．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中從步驟(a)靶物種的胚胎中獲得的細(xì)胞來源于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICMs)。
6．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中從步驟(a)靶物種的胚胎中獲得的細(xì)胞是原生殖細(xì)胞(PGCs)。
7．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述的靶物種是非小鼠。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的靶物種選自大鼠、綿羊、牛和人組成的組。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述的靶物種是大鼠。
10．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中步驟(a)中所述的非靶胚胎干細(xì)胞缺乏陽(yáng)性選擇標(biāo)記。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的陽(yáng)性選擇標(biāo)記選自抗生素抗性基因或HPRT抗性(HPRT)基因。
12．根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述的陽(yáng)性選擇標(biāo)記是HPRT基因。
13．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中步驟(a)中所述的非靶胚胎干細(xì)胞攜帶一種負(fù)選擇標(biāo)記。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述的陰性選擇標(biāo)記是HPRT或單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)。
15．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中將所述的來自靶物種的胚胎細(xì)胞在一種細(xì)胞的飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述的細(xì)胞飼養(yǎng)層是SNL76/7。
17．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述的非靶胚胎干細(xì)胞是以有絲分裂方式失活的。
18．一種遺傳修飾的非小鼠ES細(xì)胞。
19．權(quán)利要求18的遺傳修飾的ES細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞是大鼠細(xì)胞。
20．權(quán)利要求18的遺傳修飾的ES細(xì)胞，包括一種或多種轉(zhuǎn)基因。
21．一種含有權(quán)利要求1的非小鼠ES細(xì)胞分離群體的嵌合胚胎。
22．根據(jù)權(quán)利要求21的嵌合胚胎，其中所述ES細(xì)胞是大鼠的ES細(xì)胞。
23．一種含有根據(jù)權(quán)利要求3的方法所制備的遺傳修飾的非小鼠ES細(xì)胞的嵌合胚胎。
24．根據(jù)權(quán)利要求23的嵌合胚胎，其中一種或多種基因的功能被破壞。
25．根據(jù)權(quán)利要求23的嵌合胚胎，其中所述的非小鼠ES細(xì)胞是大鼠的ES細(xì)胞。
26．根據(jù)權(quán)利要求23的嵌合胚胎，其中所述的遺傳修飾的非小鼠ES細(xì)胞包括一種或多種轉(zhuǎn)基因。
27．一種含有由權(quán)利要求1的非小鼠ES細(xì)胞分離群體產(chǎn)生的細(xì)胞的動(dòng)物。
28．根據(jù)權(quán)利要求27的動(dòng)物，其中所述的非小鼠ES細(xì)胞是大鼠的ES細(xì)胞。
29．一種含有由遺傳修飾的非小鼠ES細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞的動(dòng)物。
30．根據(jù)權(quán)利要求29的動(dòng)物，其中所述的非小鼠細(xì)胞是大鼠細(xì)胞。
31．根據(jù)權(quán)利要求29的動(dòng)物，其中所述的遺傳修飾的非小鼠ES細(xì)胞包括一種或多種轉(zhuǎn)基因。
32．根據(jù)權(quán)利要求29的動(dòng)物，其中一種或多種基因的功能被破壞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分離的非小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞的群體以及獲得這些ES細(xì)胞的方法。在一個(gè)方面中,通過將來自靶動(dòng)物的胚胎細(xì)胞與非靶ES細(xì)胞、諸如小鼠ES細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)而獲得所述的靶ES細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中,使用陽(yáng)性或陰性選擇標(biāo)記從所述的共培養(yǎng)物中分離大鼠ES細(xì)胞。本發(fā)明還包括遺傳修飾的非小鼠ES細(xì)胞。本發(fā)明還提供了含有所分離的ES細(xì)胞或遺傳修飾的ES細(xì)胞的群體的嵌合胚胎和動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述的遺傳修飾包括引入轉(zhuǎn)基因的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述的遺傳修飾包括破壞一種或多種基因的功能的步驟。
文檔編號(hào)A01K67/027GK1284993SQ98812935
公開日2001年2月21日 申請(qǐng)日期1998年11月25日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月25日
發(fā)明者J·F·洛靈 申請(qǐng)人:Arc基因組研究公司