專利名稱：一株植物乳桿菌在花菜外包葉青貯中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株植物乳桿菌在花菜外包葉青貯中的應用。
背景技術：
花菜(Brassica oleracea)外包葉含有豐富的氨基酸、粗纖維、維生素及ー些微量元素等，是畜禽良好的飼料來源，但在收獲期存在著量大易脫水、腐敗，營養(yǎng)物質(zhì)損耗快的特點，非常不易貯藏?；ú送獍~在我國資源豐富，但除了少部分被利用外，大部分被廢棄，以堆積等形式直接傾入環(huán)境，造成極大的污染和浪費。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1在制備青忙飼料中的應用，所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 5027。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)Z3_I CGMCC No. 5027 的菌落呈現(xiàn)乳白色，邊緣整齊；細胞顯微形態(tài)為短桿狀，無芽孢，革蘭氏染色陽性；接觸酶陰性，氧化酶陰性；具有較強的生長及產(chǎn)酸性能，30°C條件下，在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，菌體濃度可達到IO8 109cfu/mL，pH彡3. 5 ;其碳源發(fā)酵實驗結(jié)果如表I所示；16S rRNA基因序列如序列表中序列I所示。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)Z3-1 CGMCC No. 5027具有以下生物學特性I)在起始pH2. 5 pH9. 0的條件下能夠生長；2)在5°C 10°C或50°C溫度環(huán)境下呈現(xiàn)微弱生長，在15で 45で條件下生長狀況良好；3)在彡6. 5% NaCl的條件下生長狀況良好。在上述應用中，所述青！)&飼料具體可為花菜(Brassica oleracea)外包葉青忙飼料，所述花菜(Brassica oleracea)外包葉青！)&飼料的青忙原料為花菜(Brassicaoleracea)外包葉；所述青貯飼料是將所述青貯原料在厭氧的條件下進行發(fā)酵得到的飼料。 本發(fā)明的另ー個目的是提供ー種青貯飼料的制備方法，包括如下步驟用所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) Z3_I CGMCC No. 5027 對如下 I)或 2)的青忙原料進行固體發(fā)酵，收集所有發(fā)酵產(chǎn)物，得到所述青貯飼料I)花菜(Brassica oleracea)外包葉和麩皮以 66. 51 33. 49-82. 38 17. 62 的質(zhì)量比混合制成的含水量為60% 70%的混合物；2)花菜(Brassica oleracea)外包葉和玉米糝以 66. 45 33. 55-82. 35 17.65的質(zhì)量比混合制成的含水量為60% 70%的混合物；所述青貯飼料是將所述青貯原料在厭氧的條件下進行發(fā)酵得到的飼料。
在上述方法中，所述發(fā)酵按照每克所述青貯原料接種IO5 IO6Cfu所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)Z3_ICGMCC No. 5027 進行。在上述方法中，所述發(fā)酵的溫度為室溫，所述室溫為15。。 25°C。在上述方法中，所述發(fā)酵的時間為30d 60d。上述任一所述方法制備得到的青貯飼料也屬于本發(fā)明保護的范圍。實驗證明，利用植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)Z3_ICGMCC No. 5027青忙花菜(Brassica oleracea)外包葉與麩皮或玉米糝混合成含水量為60% 70%的混合物， 30d或60d開封時未檢測到大腸桿菌、酵母及霉菌，乳酸菌含量較高，pH較低(< 4. 5)，均不含易引起惡臭的丁酸。將含水量較高的花菜外包葉和含水量較低的麩皮或玉米糝混合成含水量為60% 70%的混合物青貯，不僅可以把含水量調(diào)整到適合青貯的水平，還由于混合后的飼料營養(yǎng)成分較為全面、均衡。飼喂此混合青貯飼料能夠在保證干物質(zhì)攝入量的同時，有效增加乳酸菌及其代謝產(chǎn)物的攝入量。應用植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)Z3_ICGMCC No. 5027 青忙花菜外包葉與麩皮或玉米糝混合成含水量為60% 70%的混合物，具有效率高、成本低廉等優(yōu)點，可用于生產(chǎn)綠色環(huán)保生物飼料。


圖I 為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)Z3_ICGMCC No. 5027 發(fā)酵液對革蘭氏陽性及陰性指示菌的抑菌圈。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。MRS液體培養(yǎng)基溶劑為水，溶質(zhì)為蛋白胨10. 0g/L，牛肉膏10. 0g/L，酵母膏5. Og/L,檸檬酸氫ニ銨2. 0g/L,葡萄糖20. 0g/L,吐溫-801. 0g/L,こ酸鈉5. 0g/L,磷酸氫ニ鉀
2.0g/L，硫酸鎂 0. 58g/L，硫酸錳 0. 25g/L，pH 值為 6. 5。MRS固體培養(yǎng)基每升上述MRS液體培養(yǎng)基添加15g瓊脂制備得到的培養(yǎng)基?；ú送獍~為發(fā)育至花菜成熟時期的花菜(Brassica oleracea)外包葉,含水量為81. 1%，切割長度為5cm。麩皮為小麥最外層的表皮,小麥被磨面機加工后得到的,含水量為18. I %。玉米糝將玉米的成熟籽粒去皮后磨成的小顆粒，平均粒徑為1mm，含水量為18. 2%。豆柏含水量為10%。紅薯莖葉為發(fā)育至紅薯成熟時期的紅薯(Ipomoea batatas)莖葉經(jīng)過刈割處理后得到的，平均粒徑為2mm，含水量為75. 5%，切割為5cm長度。實施例I、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) Z3_ICGMCC No. 5027 的分離、純
化與鑒定取河南鄭州地區(qū)青!)&玉米稻桿IOg,加入90mL蒸懼水，用震蕩器震蕩5min,KT1-KT5梯度稀釋。分別從各梯度稀釋液中取20 y L涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，靜置厭氧培養(yǎng)48h，挑取菌落形態(tài)、大小、顔色和光澤度等有明顯差別的單菌落，重復劃線，直至得到純菌落。將菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)24h，IOOOOrpm離心IOmin后，取20 y L上清液，以藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、沙門氏菌(Salmonella enterica)、銅綠假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa)和大腸桿菌(Escherichia coli)分別作為指不菌,用牛津杯雙層平板法進行抑菌試驗，如圖I所示，從中篩選出抑菌效果好的Z3-1菌株。將Z3-1菌株在MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后，觀察菌落的大小、顏色、邊緣狀況及革蘭氏染色鏡檢細菌形態(tài)。利用API 50CH檢測Z3-1菌株對49種不同碳源的同化能力。結(jié)果Z3-1菌株菌落呈現(xiàn)乳白色，邊緣整齊 ；Z3-1菌株細胞顯微形態(tài)為短桿狀，無芽孢，革蘭氏染色陽性；Z3-1菌株接觸酶陰性，氧化酶陰性；Z3-1菌株具有較強的生長及產(chǎn)酸性能，在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，菌體濃度可達到IO8 109cfu/mL，pH く 3. 5。Z3-1菌株的碳源發(fā)酵實驗結(jié)果如表I所示；16S rRNA基因序列如序列表中序列I所示。根據(jù)細胞顯微形態(tài)、碳源發(fā)酵實驗結(jié)果和16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)，將菌株Z3-1鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),并于2011年7月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記編號為CGMCC No. 5027。表I. Z3-1菌株的碳源發(fā)酵實驗結(jié)果
權利要求
1.植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)Z3-1在制備青忙飼料中的應用，所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 5027。
2.根據(jù)權利要求I所述的應用，其特征在于所述青忙飼料為花菜(Brassicaoleracea)外包葉青忙飼料。
3.ー種青貯飼料的制備方法，包括如下步驟用權利要求I所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)Z3_ICGMCC No. 5027 對如下 I)或 2)的青忙原料進行固體發(fā)酵，收集所有發(fā)酵產(chǎn)物，得到所述青貯飼料 1)花菜(Brassicaoleracea)外包葉和麩皮以 66. 51 33. 49-82. 38 17. 62 的質(zhì)量比混合制成的含水量為60% 70%的混合物； 2)花菜(Brassicaoleracea)外包葉和玉米糝以 66. 45 33. 55-82. 35 17. 65 的質(zhì)量比混合制成的含水量為60% 70%的混合物。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵按照每克所述青貯原料接種IO5Cfu IO6Cfu 所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) Z3_ICGMCC No. 5027 進行。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的溫度為室溫，所述室溫為15°C 25°C。
6.根據(jù)權利要求3-5中任一所述的方法,其特征在于所述發(fā)酵的時間為30d 60d。
7.權利要求3-6任一所述方法制備得到的青貯飼料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株植物乳桿菌在花菜外包葉青貯中的應用。所述植物乳桿菌為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No.5027，可用于制備青貯飼料。所述青貯飼料可為花菜(Brassica oleracea)外包葉青貯飼料。實驗證明，應用植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027接種青貯花菜外包葉與麩皮或玉米糝混合成含水量為60％～70％的混合物，30d～60d開封，pH較低，乳酸含量較高，具有效率高、成本低廉等優(yōu)點，可用于生產(chǎn)綠色環(huán)保生物飼料。
文檔編號C12N1/20GK102640886SQ20121011667
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月19日 優(yōu)先權日2012年4月19日
發(fā)明者倪奎奎, 龐會利, 李東霞, 李宗偉, 焦湞, 王雁萍, 談重芳 申請人:鄭州大學