專利名稱：非對(duì)稱多色熒光發(fā)夾探針鏈反應(yīng)在病原菌檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物反應(yīng)技術(shù)，特別是涉及基于非對(duì)稱多色熒光發(fā)夾探針鏈反應(yīng)在病原菌檢測(cè)中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
分子診斷學(xué)方法依據(jù)細(xì)菌核酸特征進(jìn)行檢測(cè)，為臨床病原微生物快速檢測(cè)帶來了新契機(jī)。核酸分子固相雜交法、DNA測(cè)序法、毛細(xì)管電泳分析、基因芯片技術(shù)等檢測(cè)方法的先后建立，將細(xì)菌分子檢測(cè)方法提高到一個(gè)嶄新的階段，但是這些分子診斷學(xué)方法大多需要特殊的大型儀器，技術(shù)難度大，難以在臨床中普及應(yīng)用。因此，針對(duì)上述問題，如能開發(fā)出一種基于新型探針技術(shù)，對(duì)多種病原菌基因組進(jìn)行并行檢測(cè)的快速、特異、簡(jiǎn)便的分子診斷學(xué)方法，對(duì)推進(jìn)分子診斷學(xué)技術(shù)的實(shí)用化顯然具有十分重要的意義。Applied Gene Technologies公司的專利名稱為“發(fā)夾形核酸探針技術(shù)”(NucleicAcid Hairpin Probes),專利號(hào)為6380377涉及到一種莖環(huán)形DNA探針技術(shù),與標(biāo)準(zhǔn)的單鏈核酸探針相比結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，酶反應(yīng)更高效，對(duì)錯(cuò)配更加敏感，產(chǎn)生了更少的非特異性靶位結(jié)合。這些優(yōu)點(diǎn)都提高了基因分析的特異性。與傳統(tǒng)的PCR、固相核酸雜交等技術(shù)相比，該技術(shù)具有更為突出的優(yōu)點(diǎn)檢測(cè)效率高，檢測(cè)速度快，該技術(shù)同時(shí)進(jìn)行分子識(shí)別和級(jí)聯(lián)信號(hào)放大，可在10分鐘內(nèi)完成核酸檢測(cè)；反應(yīng)體系簡(jiǎn)單，無需酶及其他復(fù)雜的分子生物學(xué)試劑；單管反應(yīng)，所有檢測(cè)在單一閉管中進(jìn)行，操作步驟簡(jiǎn)單，并且有效地避免了傳統(tǒng)技術(shù)存在的實(shí)驗(yàn)室污染問題；該方法還適合與其他檢測(cè)方法整合。突光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescenceresonance Energy Transfer, FRET)技術(shù)是指當(dāng)一個(gè)熒光分子(又稱為供體分子)的熒光光譜與另一個(gè)熒光分子(又稱為受體分子)的激發(fā)光譜相重疊時(shí)，且供、受體空間距離相近時(shí)(一般為7 IOnm)，則供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時(shí)供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減，這種現(xiàn)象被稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移。FRET技術(shù)具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，并能避免散射光的影響，比常規(guī)熒光法和共振光散射法具有更強(qiáng)的抗干擾能力。FRET技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物及醫(yī)學(xué)研究等方面。FRET探針即共振能量轉(zhuǎn)移的供-受體對(duì)，主要分為以下幾類熒光蛋白，有機(jī)熒光染料，鑭系染料和量子點(diǎn)，其中有機(jī)熒光染料種類繁多，應(yīng)用廣泛，可根據(jù)需要選擇適合的染料，并可以和其它類探針配對(duì)使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種非對(duì)稱發(fā)夾探針鏈反應(yīng)技術(shù)，巧妙地結(jié)合了分子雜交的高特異性和鏈?zhǔn)骄酆系母咝?，通過DNA聚合釋放的自由能驅(qū)動(dòng)分子級(jí)聯(lián)放大，并將高靈敏的多色熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)引入到鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，從而建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的病原菌DNA檢測(cè)方法。非對(duì)稱多色熒光發(fā)夾探針鏈反應(yīng)在病原菌DNA檢測(cè)中的應(yīng)用，包括液相雜交鏈反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系中同時(shí)加入有非對(duì)稱發(fā)夾探針I(yè)和非對(duì)稱發(fā)夾探針2以及待測(cè)靶序列，其中非對(duì)稱發(fā)夾探針1，包括回文序列、兩條莖臂和連接于一條莖臂上的粘性末端，所述兩條莖臂連接于回文序列的兩端且具有互補(bǔ)的核酸序列，所述回文序列為與待測(cè)靶序列無關(guān)的序列，所述莖臂與其連接的粘性末端具有靶序列的互補(bǔ)核酸序列；其中非對(duì)稱發(fā)夾探針2，包括回文序列、兩條莖臂和連接于一條莖臂上的粘性末端，所述兩條莖臂連接于回文序列的兩端且具有互補(bǔ)的核酸序列，所述回文序列與其相連的一條莖臂具有靶序列，所述另一莖臂上相連的粘性末端具有和非對(duì)稱發(fā)夾探針I(yè)中回文序列的互補(bǔ)核酸序列，所述非對(duì)稱發(fā)夾探針I(yè)的5’端和3’端分別標(biāo)記熒光受體分子和熒光供體分子或非對(duì)稱發(fā)夾探針2的5’端和3’端分別標(biāo)記熒光供體分子和熒光受體分子。
所述熒光供體分子和熒光受體分子分別標(biāo)注于非對(duì)稱發(fā)夾探針2的兩端。所述熒光供體分子為有機(jī)熒光染料FAM和HEX，熒光受體分子為BHQl。所述非對(duì)稱發(fā)夾探針I(yè)的粘性末端位于5’端，所述非對(duì)稱發(fā)夾探針2的粘性末端位于3’端；或者所述非對(duì)稱發(fā)夾探針I(yè)的粘性末端位于3’端，所述非對(duì)稱發(fā)夾探針2的粘性末端5 ’端。優(yōu)選所述非對(duì)稱發(fā)夾探針I(yè)的粘性末端位于5’端，所述非對(duì)稱發(fā)夾探針2的粘性末端位于3’端。 所述粘性末端為6-8個(gè)堿基。所述待測(cè)靶序列為細(xì)菌的16S rDNA序列。所述細(xì)菌為銅綠假單胞菌，所述非對(duì)稱發(fā)夾探針I(yè)、非對(duì)稱發(fā)夾探針2和待測(cè)靶序列分別為PA-HlCGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGTCAAAGTACCCCCACTTTCTCCCTC,PA-H2 ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACGGAGGGAGAAAGTGGGGGT,Tpa :ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG。所述細(xì)菌為肺炎克雷伯菌，所述非對(duì)稱發(fā)夾探針I(yè)、非對(duì)稱發(fā)夾探針2和待測(cè)靶序列分別為KP-Hl GGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTTCAAAGTCTAACTCACCCGTCCGCCAC,KP-H2 AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACCGTGGCGGACGGGTGAGTTAGACTTTG,Tkp :AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACC。非對(duì)稱發(fā)夾其基本原理是兩條特異性自組裝探針由靶核酸特異序列和一回文序列組成，在無靶序列存在的情況下，處于亞穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而一旦加入待測(cè)靶序列，即觸發(fā)無需酶參與的鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)，此時(shí)特異性自組裝探針的靶核酸特異序列部分與對(duì)應(yīng)靶核酸位點(diǎn)結(jié)合，其余探針則兩兩復(fù)性成兩段均為回文序列的部分雙鏈探針，在分子識(shí)別雜交的同時(shí)大幅度地增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了待測(cè)靶序列的快速檢測(cè)。本研究即聯(lián)合非對(duì)稱發(fā)夾探針鏈反應(yīng)技術(shù)和FRET技術(shù)，建立了一種基于非對(duì)稱多色熒光發(fā)夾探針鏈反應(yīng)技術(shù)的病原菌檢測(cè)技術(shù)。在此優(yōu)選的方法中，將有機(jī)熒光染料(FAM和HEX)作為熒光供體，BHQl作為熒光受體分別標(biāo)記于發(fā)夾探針兩端，當(dāng)體系中無靶序列存在時(shí)，發(fā)夾探針處于亞穩(wěn)定狀態(tài)，兩基團(tuán)構(gòu)成FRET對(duì)，無熒光信號(hào)產(chǎn)生；而當(dāng)靶序列加入反應(yīng)體系觸發(fā)鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)時(shí)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生熒光信號(hào)，并且由于是線性放大，熒光信號(hào)強(qiáng)度與靶序列拷貝數(shù)成正比(如圖I所示)。在發(fā)明方法將高靈敏的多色熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)引入到鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，從而建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的病原菌DNA直接檢測(cè)方法，克服了原非對(duì)稱發(fā)夾探針進(jìn)行鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時(shí)瓊脂糖凝膠電泳觀察檢測(cè)結(jié)果靈敏度較低的缺陷。在本發(fā)明的實(shí)施例中，針對(duì)細(xì)菌的特異性核酸靶序列，設(shè)計(jì)多重特異性非對(duì)稱發(fā)夾探針，結(jié)合FRET技術(shù)，提供了一種高效、靈敏的信號(hào)檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)快速并行檢測(cè)細(xì)菌的目的。


圖I.非對(duì)稱發(fā)夾探針鏈反應(yīng)技術(shù)原理圖
圖中H1、H2L、I :發(fā)夾探針I(yè)、發(fā)夾探針2、待測(cè)靶序列；A和a、B和b、C和c為互補(bǔ)
核酸序列， 是熒光受體,★是熒熒光供體，圖2:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，M DL2,000DNA maker, K :KpnPCR 產(chǎn)物，P P. aerPCR 產(chǎn)物，-:空白對(duì)照?qǐng)D3 :PCR擴(kuò)展產(chǎn)物酶切，M DL 2，OOODNAmaker，K* Kpn 酶切產(chǎn)物，P* P. aer 酶切產(chǎn)物，K Kpn PCR 產(chǎn)物，P P. aer PCR 產(chǎn)物，圖4 PA組不同濃度靶序列熒光HCR，其中，A :無靶序列存在；B :靶序列濃度為IuM5C :靶序列濃度為0. 5uM；D :靶序列濃度為0. IuM5E :靶序列濃度為0.05 u M ；F :靶序列濃度為0. 01 u M，圖5 KP組不同濃度靶序列熒光HCR，其中，A :無靶序列存在；B :靶序列濃度為IuM5C :靶序列濃度為0. 5uM；D :靶序列濃度為0. IuM5E :靶序列濃度為0.05 u M ；F :靶序列濃度為0. 01 u M，圖6 PA組不同濃度不對(duì)稱PCR產(chǎn)物的熒光HCR，其中A :1 ii I 單鏈 DNA ；B 2u I 單鏈 DNA ；C 3u I 單鏈 DNA ；D 4u I 單鏈 DNA ；E 5 u I單鏈DN A ;F :6 ill單鏈DN A ；G :無單鏈DNA存在；H :無探針存在圖7 KP組不同濃度不對(duì)稱PCR產(chǎn)物的熒光HCR，其中A :1 ii I 單鏈 DNA ；B 2u I 單鏈 DNA ；C 3u I 單鏈 DNA ；D 4u I 單鏈 DNA ；E 5 u I單鏈DN A ;F :6 ill單鏈DN A ；G :無單鏈DNA存在；H :無探針存在。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的原理如圖I所示。(A)待測(cè)靶序列I從探針Hl的粘性末端開始發(fā)生嚴(yán)格堿基配對(duì)的鏈置換反應(yīng)從而打開探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生新的粘性末端；(B)Hl的粘性末端與H2L的粘性末端發(fā)生反應(yīng)繼續(xù)打開探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，猝滅基團(tuán)和報(bào)告基團(tuán)間距離增大，產(chǎn)生熒光信號(hào)，繼而探針Hl和H2L之間發(fā)生交替雜交反應(yīng)，形成鏈?zhǔn)骄酆象w大幅度放大信號(hào)。本發(fā)明的具體實(shí)施例主要針對(duì)于兩種病原菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按照本發(fā)明的原理，將其應(yīng)用于任何微生體的檢測(cè)，只要找到合適的特異性的待測(cè)靶序列。I、特異性非對(duì)稱HCR發(fā)夾探針的設(shè)計(jì)米用Array Designer 4. 0和Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)非對(duì)稱發(fā)夾式探針，用Omiga 2. 0軟件進(jìn)行探針間、探針與靶序列的互補(bǔ)性分析，設(shè)計(jì)探針的時(shí)候，序列中間需要標(biāo)記猝滅基團(tuán)的位置上對(duì)應(yīng)的堿基需設(shè)計(jì)為T，以便使猝滅基團(tuán)能夠連接到探針上。設(shè)計(jì)的備選探針序列提交Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行特異性分析，并將設(shè)計(jì)好的探針提交http://mfold. rna. albany. edu/網(wǎng)站進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè),進(jìn)一步驗(yàn)證了設(shè)計(jì)探針的特異性和有效性。表I :探針和靶序列設(shè)計(jì) 綠膿桿菌HCR探針
PA-Hl__CGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGTCAAAGTACCCCCACTTTCTCCCTC_
PA-H2L~^CCCCCACTTTCTCCCTCAGGACGGAGGGAGAAAGTGGGGGTACTTTg
Tpa~^CCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG
肺炎克雷伯菌HCR探f
KP-HI~~GGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTTCAAAGTCTAACTCACCCGTCCGCCAC
KP-H2L~^ACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACCGTGGCGGACGGGTGAGTTAGACTTTG
TkpAACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACC2、將提取的基因組DNA進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，制備單鏈PCR產(chǎn)物。引物16S_a 5’端標(biāo)記PO4基團(tuán)，以利于下游進(jìn)行酶切反應(yīng)。反應(yīng)體系如下表2 :PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
reagentper sample vol([jl)
TaKaRa Ex Taq(5U/^il)0.25 IOXPCR buffer(Mg2+ Free) 5
MgC12(25mM)4
dNTP mixture(各 2.5mM)4模板DNA I
16s-s(4uM)4
16s-a(4uM)2
Sterile dd H2029.75
total volume50反應(yīng)條件如下預(yù)變性94°C，5min ;變性 94。。，60s ;退火 53°C，45s ;延伸 72°C，45s ；30 個(gè)循環(huán)；延長(zhǎng) 72°C，10min，4°C保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行I. 0%瓊脂糖凝膠電泳，每孔5. 0 ill上樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，用所設(shè)計(jì)的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳可見明顯目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物可用于酶切實(shí)驗(yàn)。3, A-核酸外切酶消化PCR產(chǎn)物將PCR產(chǎn)物用入-核酸外切酶消化，制備單鏈DNA (ssDNA)。
反應(yīng)體系為取45iil PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加入5 ii I IOXReacton Buffer,再加入IOU入-核酸外切酶。
反應(yīng)條件將反應(yīng)體系置于37°C水浴5min。于80°C水浴中終止反應(yīng)。其結(jié)果如圖3所示，PCR產(chǎn)物經(jīng)入-核酸外切酶消化后，雙鏈DNA大量減少，酶切效率較高，所得單鏈DNA可用于進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。4、不同濃度靶序列熒光HCR實(shí)驗(yàn)3. 0 ill熒光HCR反應(yīng)體系包括40uM的探針H10. I u I ；40uM的探針H2L 0. I ;
3X HBVbuffer I u I ;無菌水0. 8 u I ;不同濃度的靶序列I l.Ou I0反應(yīng)條件如下99°C,8min ;50°C，lh ;4°C保存。將HCR反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至毛細(xì)管內(nèi)，3，OOOrpm離心2min.。將毛細(xì)
管至于導(dǎo)致熒光顯微鏡下觀察熒光并照相。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4、圖5所示，所設(shè)計(jì)的HCR特異性探針均可成功啟動(dòng)雜交鏈反應(yīng)，發(fā)生無需酶作用的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使得發(fā)夾探針結(jié)構(gòu)打開，熒光供體分子在一定波長(zhǎng)的光的激發(fā)光下發(fā)出熒光。當(dāng)初始靶序列濃度大于或等于0. IyM時(shí)，可觀察到明顯熒光，即12iU反應(yīng)體系中靶序列達(dá)0. 4pmol時(shí)可以檢測(cè)到熒光，說明所設(shè)計(jì)的探針具有較好的特異性和敏感性。5、單鏈PCR產(chǎn)物的熒光HCR實(shí)驗(yàn)用以上不對(duì)稱PCR方法制備的單鏈DNA為模板，進(jìn)行熒光HCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系如下表3 :單鏈PCR產(chǎn)物的熒光HCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.非對(duì)稱多色熒光發(fā)夾探針鏈反應(yīng)在病原菌DNA檢測(cè)中的應(yīng)用，包括液相雜交鏈反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系中同時(shí)加入有非對(duì)稱發(fā)夾探針I(yè)和非對(duì)稱發(fā)夾探針2以及待測(cè)靶序列，其中非對(duì)稱發(fā)夾探針1，包括回文序列、兩條莖臂和連接于一條莖臂上的粘性末端，所述兩條莖臂連接于回文序列的兩端且具有互補(bǔ)的核酸序列，所述回文序列為與待測(cè)靶序列無關(guān)的序列，所述莖臂與其連接的粘性末端具有靶序列的互補(bǔ)核酸序列；其中非對(duì)稱發(fā)夾探針2，包括回文序列、兩條莖臂和連接于一條莖臂上的粘性末端，所述兩條莖臂連接于回文序列的兩端且具有互補(bǔ)的核酸序列，所述回文序列與其相連的一條莖臂具有靶序列，所述另一莖臂上相連的粘性末端具有和非對(duì)稱發(fā)夾探針I(yè)中回文序列的互補(bǔ)核酸序列，所述非對(duì)稱發(fā)夾探針I(yè)的5’端和3’端分別標(biāo)記熒光受體分子和熒光供體分子或非對(duì)稱發(fā)夾探針2的5’端和3’端分別標(biāo)記熒光供體分子和熒光受體分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，所述熒光供體分子和熒光受體分子分別標(biāo)注于非對(duì)稱發(fā)夾探針2的兩端。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，所述熒光供體分子為有機(jī)熒光染料FAM和HEX，熒光受體分子為BHQl。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，所述非對(duì)稱發(fā)夾探針I(yè)的粘性末端位于5’端，所述非對(duì)稱發(fā)夾探針2的粘性末端位于3’端。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，所述粘性末端為6-8個(gè)堿基。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，所述待測(cè)靶序列為細(xì)菌的16SrDNA序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，所述細(xì)菌為銅綠假單胞菌，所述非對(duì)稱發(fā)夾探針I(yè)、非對(duì)稱發(fā)夾探針2和待測(cè)靶序列分別為PA-HlCGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGTCAAAGTACCCCCACTTTCTCCCTC,PA-H2 : ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACGGAGGGAGAAAGTGGGGGT，Tpa :ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，所述細(xì)菌為肺炎克雷伯菌，所述非對(duì)稱發(fā)夾探針I(yè)、非對(duì)稱發(fā)夾探針2和待測(cè)靶序列分別為KP-Hl GGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTTCAAAGTCTAACTCACCCGTCCGCCAC,KP-H2 AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACCGTGGCGGACGGGTGAGTTAGACTTTG,Tkp :AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACC。
全文摘要
本發(fā)明涉及“非對(duì)稱多色熒光發(fā)夾探針鏈反應(yīng)在病原菌DNA檢測(cè)中的應(yīng)用”，屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明聯(lián)合非對(duì)稱發(fā)夾探針鏈反應(yīng)技術(shù)和FRET技術(shù)，建立了一種基于非對(duì)稱多色熒光發(fā)夾探針鏈反應(yīng)技術(shù)的病原菌檢測(cè)技術(shù)。當(dāng)體系中無靶序列存在時(shí)，發(fā)夾探針處于亞穩(wěn)定狀態(tài)，兩基團(tuán)構(gòu)成FRET對(duì)，無熒光信號(hào)產(chǎn)生；而當(dāng)靶序列加入反應(yīng)體系觸發(fā)鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)時(shí)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生熒光信號(hào)，并且由于是線性放大，熒光信號(hào)強(qiáng)度與靶序列拷貝數(shù)成正比。在發(fā)明方法將高靈敏的多色熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)引入到鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，從而建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的病原菌DNA直接檢測(cè)方法，克服了原非對(duì)稱發(fā)夾探針進(jìn)行鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時(shí)瓊脂糖凝膠電泳觀察檢測(cè)結(jié)果靈敏度較低的缺陷。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102643910SQ20121010324
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月10日
發(fā)明者夏涵, 府偉靈, 梁盼盼, 黃慶 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院