專利名稱：胸腺素β4四聯(lián)體基因及其在大腸桿菌中表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程領(lǐng)域的基因及其在在大腸桿菌中表達(dá)的方法，具體涉及一種胸腺素β4四聯(lián)體基因及其在大腸桿菌中表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
研究表明胸腺肽β 4 (thymosin β 4, T β 4)是真核生物細(xì)胞中的一種重要的G-actin螯合因子(G-actin sequestering factor),有許多重要生理學(xué)和細(xì)胞學(xué)功能 (Goldstein等.分子醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，11 :421-429)，包括促進(jìn)細(xì)胞遷移、血管形成、細(xì)胞存活、干細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子、特殊蛋白酶、上調(diào)細(xì)胞質(zhì)分子的基因表達(dá)和下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)(Huff等.2001，生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)國(guó)際期刊，33 :205-220)。在皮膚疾病、眼角膜疾病、心臟病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和肺病臨床和應(yīng)用中有著重要的作用。目前科學(xué)研究和醫(yī)用的Τβ 4的來源主要有兩種一是從小牛胸腺提取，二是化學(xué)合成。從小牛胸腺中提取Τβ 4不僅成本高，且受材料來源和提取技術(shù)的限制，其純度不高，含量較低；同時(shí)由于人畜共患疾病，從動(dòng)物牛胸腺中提取的Τβ 4在臨床應(yīng)用存在風(fēng)險(xiǎn)。Τβ 4化學(xué)合成，技術(shù)與成本限制其應(yīng)用。隨著基因工程的發(fā)展，利用基因工程手段生產(chǎn)T β 4成為可能，也將成為一個(gè)新的方向。基因工程手段生產(chǎn)重組T β 4蛋白，可以克服生物原材料提取率低或化學(xué)合成成本高的缺點(diǎn)。文獻(xiàn)《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，2002，34 (4) :502_505》用大腸桿菌中克隆表達(dá)了 Τβ 4，其表達(dá)水平達(dá)菌體總蛋白30%，但其純化步驟較為復(fù)雜，分別經(jīng)過了硫酸銨鹽析、Source RPC反相層析柱和Q Sepharose HP陰離子交換柱來純化目的蛋白。文獻(xiàn)《東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007，26 (4) :295-298》的研究中在大腸桿菌中高效表達(dá)了 His6_Ti3 4，表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的40%，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過一步鎳柱親和層析即可獲得分離純化。文獻(xiàn)《第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29 (16) :1451-1454》選用真核分泌型表達(dá)載體Psec Tag2B，并采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染真核SW480細(xì)胞,采用Western blot法檢測(cè)Τβ 4重組蛋白的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)在真核細(xì)胞中表達(dá)。根據(jù)原核表達(dá)載體生產(chǎn)周期短，表達(dá)蛋白種類簡(jiǎn)單，操作方便的特點(diǎn)，將4 X T β 4基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)目的蛋白，并且對(duì)靶蛋白進(jìn)行純化和分析。利用pET28a載體的多克隆位點(diǎn)的5’端和4ΧΤβ45’端都有6個(gè)組氨酸序列，目的蛋白的N端就帶上了組氨酸標(biāo)簽。因此融合蛋白能夠與Ni-NTA親和柱特異結(jié)合，這樣就可以利用金屬親和層析介質(zhì)純化目的蛋白，操作方便，而且得到的蛋白純度好，得率也很高。純化得到的4ΧΤβ 4蛋白不僅可以作為陽性蛋白在后續(xù)試驗(yàn)中得到應(yīng)用，更重要的是可以為今后利用植物系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白在純化方面提供參考和借鑒。現(xiàn)有技術(shù)中尚未有按植物偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成基因T β 4，對(duì)基因T β 4進(jìn)行串聯(lián)形成四聯(lián)體即4ΧΤβ4以及在大腸桿菌中表達(dá)基因4ΧΤβ4的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種4ΧΤβ 4基因及其在大腸桿菌中表達(dá)的方法。利用基因工程的方法將4ΧΤβ 4基因從植物表達(dá)載體(35S::4XTi3 4)雙酶切下來，膠回收獲得小片段，然后再采用基因工程方法將4XT β 4和雙酶切之后的原核表達(dá)載體(pET-28a)大片段相連接獲得重組質(zhì)粒(pET-28a-4XTi3 4)。采用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，在大腸桿菌中表達(dá)含有4ΧΤβ 4的融合蛋白，該蛋白在皮膚和眼角膜傷口治愈和修復(fù)方面具有重要的生物活性和功能。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—種4ΧΤβ 4基因，其喊基序列如SEQ ID NO. I所不?！N重組載體，包括目的基因和載體，其特征在于，所述目的基因的堿基序列如SEQ ID NO. I所示,所述載體選自質(zhì)粒、粘?；颚粟噙|菌體中的一種。一種如下(a)或(b)的蛋白質(zhì) (a)由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有促細(xì)胞增殖活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。一種在大腸桿菌中表達(dá)4ΧΤβ 4功能蛋白的方法，該方法包括如下步驟步驟一、4ΧΤβ4基因的獲得利用基因工程的方法將4ΧΤβ 4基因從植物表達(dá)載體(35S::4XTi3 4)雙酶切下來，膠回收小片段獲得4ΧΤβ 4基因片段(615bp)。步驟二、原核表達(dá)載體pET28a-4XTP 4的構(gòu)建利用相同的雙酶切原核表達(dá)載體pET_28a膠回收大片段，然后利用DNA連接酶將所述4 X T β 4基因插入到所述pET-28a中，獲得重組載體pET28a_4 X T β 4，將所述重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，經(jīng)復(fù)蘇之后，涂板于含有100mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37 °C倒置培養(yǎng)過夜。步驟三、DH5ci陽性克隆的篩選及測(cè)序鑒定采用煮沸裂解法鑒定陽性克隆，挑取單菌落接種于含有100mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37°C過夜培養(yǎng)后，取2 μ L菌液煮沸5min，作為模板作PCR檢測(cè)，將PCR檢測(cè)中擴(kuò)增出的與所述4XT β 4基因大小一致的菌落挑出保存，取出其中的200 μ L菌液進(jìn)行測(cè)序分析。步驟四、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 :將PCR檢測(cè)和測(cè)序都正確的菌落過夜培養(yǎng)，提取所述重組載體之后，將所述重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，按照上述步驟三的方法對(duì)BL21陽性斑進(jìn)行PCR檢測(cè)。步驟五、目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)從PCR檢測(cè)正確的大腸桿菌BL21的劃線平板中挑取單克隆到50mL含100mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D_為0. 6 ;取出ImL菌液，作為誘導(dǎo)前的對(duì)照，保存在_20°C冰箱中備用；培養(yǎng)基中加入IOOmM IPTG至終濃度為ImM，繼續(xù)培養(yǎng)4h ；取出ImL菌液,和誘導(dǎo)前的菌液一起離心(4°C, 5，OOOrpm, IOmin),棄掉上清,沉淀用 50 μ L 2 X SDS Buffer 重懸；樣品95°C 煮 5min，進(jìn)行 SDS-PAGE 分析。步驟六、4ΧΤβ4蛋白的提取。
優(yōu)選的， 在所述步驟四中，所述轉(zhuǎn)化包括以下步驟步驟(I)，取剛剛用CaCl2法制備的感受態(tài)細(xì)胞，或從_70°C冰箱中取出用CaClji制備的感受態(tài)細(xì)胞于冰上融化IOmin ；步驟⑵，無菌條件下按照每200 μ L菌液加入IOOng已純化的表達(dá)載體DNA，將5 10 μ L所述表達(dá)載體加入所述感受態(tài)細(xì)胞中，用加樣器輕輕混勻，放置冰上30min ；步驟(3)，42°C熱激90s，再放于冰上I 2min ；步驟⑷，加入800 μ L經(jīng)過37°C預(yù)熱的含有卡那霉素100mg/L的LB液體培養(yǎng)基，37 0C，180rpm 復(fù)蘇培養(yǎng) 90min ；步驟(5), 5000rpm離心5min,吸去上清900 μ L,將剩余的100 μ L菌液混勻；步驟(6)，用涂布棒將所述菌液均勻涂于含有100mg/L的卡那霉素的LB固體平板上，37°C倒置16h 24h至長(zhǎng)出菌落，用無菌牙簽從所述LB固體平板上挑取抗性菌落進(jìn)行鑒定。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述LB液體培養(yǎng)基的組分以及各組分的質(zhì)量百分比為酵母提取物為O. 5%，胰蛋白胨為I %，氯化鈉為I %，余量為蒸餾水，該LB液體培養(yǎng)基的pH值為7. O。所述LB固體培養(yǎng)基的組分以及各組分的質(zhì)量百分比為酵母提取物為O. 5%，胰蛋白胨為I %，氯化鈉為I %，瓊脂粉I. 5 %，卡那霉素為O. 01 %，余量為蒸餾水，該LB固體培養(yǎng)基的pH值為7.0。優(yōu)選的，在步驟六中，所述提取包括以下步驟12000rpm,4°C離心5min收集經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)所述4ΧΤβ 4蛋白的菌體,棄上清,菌體
一直保持在冰上；按5 : I 的比例用 PBS(140mM NaCl, 2. 7mM KCl，IOmM Na2HPO4,1. 8mM KH2PO4)溶解離心收集的菌體，超聲波破碎所述菌體，6 X 10s，IOs間隔一次(200w-300w)，樣品一直保持在冰上；用buffer B重懸菌體沉淀(20 200mL細(xì)胞培養(yǎng)物)，所述buffer B的用量為5mL/g所述濕重菌體沉淀，室溫?cái)嚢?5 60min，或者輕輕振蕩，小心避免產(chǎn)生泡沫，溶液呈半透明狀即裂解好；4°C條件下，IOOOOg離心30min，棄掉沉淀，收集上清液用于上柱純化；懸浮50% Ni-NTA溶液，裝柱，避免產(chǎn)生氣泡，Ni-NTA用量為5_10mg蛋白/mL樹月旨;等樹脂自然沉降后，用5倍柱體積的ddH20過柱清洗層析柱，再加入5-10倍柱體積的IXNi-NTA buffer B平衡層析柱；樣品上柱，用5-10倍柱體積的IXNi-NTA buffer B洗柱，流速為lmL/min，收集流出液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)；用5 10倍柱體積的IXNi-NTA buffer C洗柱(主要洗去非結(jié)合的蛋白)，收集流出液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)；用5倍柱體積的I XNi-NTA buffer E洗柱，對(duì)所述4X T β 4蛋白進(jìn)行洗脫，分別用2mL的EP管收集洗脫液，該洗脫液保存于_20°C或直接進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)；按照Bradford法進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定,取2 μ L蛋白樣品加98 μ L Bradford試劑混勻后，在酶標(biāo)儀下(Bio-TEK，USA)測(cè)OD595的吸光值。
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述I XNi-NTA Buffer B的組成成分為8M尿素，O. IM磷酸鈉緩沖液，O. OlM Tris-Cl，其余為蒸餾水，該IXNi-NTA Buffer B的pH值為8.0。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述I XNi-NTA Buffer C的組成成分為8M尿素，O. IM磷酸鈉緩沖液，O. OlM Tris-Cl，其余為蒸餾水，該IXNi-NTA Buffer C的pH值為6. 3。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述I XNi-NTA Buffer E的組成成分為8M尿素，O. IM磷酸鈉緩沖液，O. OlM Tris-Cl，其余為蒸餾水，該IXNi-NTA Buffer E的pH值為4.5。本發(fā)明提供了一種制備4ΧΤβ 4蛋白的新途徑，本發(fā)明利用基因工程的方法將Τβ4基因串聯(lián)成4ΧΤβ4基因，并且利用表達(dá)的4ΧΤβ4融合蛋白中含有的His-tag能夠與Ni-NTA特異結(jié)合的特點(diǎn)，純化得到純度和產(chǎn)量較高的4ΧΤβ 4融合蛋白，該融合蛋白在皮膚和眼角膜傷口治愈和修復(fù)方面具有重要的生物活性和功能。本發(fā)明還提供了一種檢 測(cè)、分析大腸桿菌基因組DNA中是否存在4 X T β 4基因、蛋白樣品中是否含有4 X T β 4蛋白的研究方法。本發(fā)明提供的方法具有生產(chǎn)周期短、表達(dá)的蛋白種類簡(jiǎn)單和操作方便的特點(diǎn)。


圖I是DH5a轉(zhuǎn)化子的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)結(jié)果圖；圖2是BL21轉(zhuǎn)化子的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)結(jié)果圖；圖3是pET-28a_4XT β 4菌株誘導(dǎo)表達(dá)分析圖；圖4是不同時(shí)間誘導(dǎo)的4ΧΤβ 4融合蛋白在原核系統(tǒng)中的表達(dá)分析圖；圖5是4ΧΤβ 4融合蛋白表達(dá)部位的分析圖；圖6是原核系統(tǒng)表達(dá)4ΧΤβ 4融合蛋白的免疫印跡(Western blot)分析圖；圖7是純化4ΧΤβ4目的蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)；圖8是純化的4ΧΤβ 4融合蛋白的淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測(cè)定(MTT)。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如SambiOOk等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I原核表達(dá)載體pET-28a_4 X T β 4的構(gòu)建步驟(I)、pET_28a質(zhì)粒的制備單菌落培養(yǎng)至合適濃度后采用質(zhì)粒提取(小量)試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)抽提質(zhì)粒，具體過程如下挑取I個(gè)單菌落接種于IOmL含有100mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；取過夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液于離心管中，10，OOOg離心90sec，棄上清，加入250 μ LPl溶液，重懸菌體至均勻，室溫放置4min ；加入250 μ L P2溶液，立即溫和顛倒5_10次混勻，4min以內(nèi)至菌體溶解而液體澄清；
加入350 μ L Ρ3溶液，立即溫和顛倒5-10次混勻，出現(xiàn)大量白色羽毛狀沉淀，12, OOOg 離心 5min ；取上清加于柱中，切勿吸到沉淀(可以多管分次過同一個(gè)吸附柱)；10，OOOrpm離心15sec,棄掉收集管中液體,加入500 μ L BI液；10，OOOrpm離心15se c,棄掉收集管中液體,加入500 μ L Wl液；10，OOOrpm離心15sec,棄掉收集管中液體,加入500 μ L Wl液,靜置Imin ;10, OOOrpm離心15sec,棄掉收集管中液體，10, OOOrpm離心Imin ；將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)新的I. 5mL Eppendorf管中，在吸附柱柱中央加入50 μ L Tl溶液；55°C水浴吸附柱 3min, 12, OOOg 離心 Imin ；棄掉吸附柱，凝膠電泳檢測(cè)后_20°C保存?zhèn)溆?。步驟(2)、用BamHI和SacI雙酶切pET_28a質(zhì)粒在離心管中加入pET-28a質(zhì)粒 5yg，10XNEB Buffer BamHI 5 μ L, BamHI 20U,lmg/ml BSA O. 5 μ L，用ddH20補(bǔ)充至終體積為50 μ L ;37°C酶切2h，純化酶切的質(zhì)粒，過柱回收；在離心管中加入BamHI酶切后的 pET_28a 質(zhì)粒 3yg，10XNEB Bufferl 5 μ L,SacI 20U, lmg/ml BSA O. 5 μ L，用 ddH20補(bǔ)充至終體積為 50 μ L ;37°C酶切 2h，取 3 μ L樣品，電泳檢測(cè)酶切是否完全；酶切完畢之后，65°C溫浴15min使酶完全失活。步驟(3)、酶切產(chǎn)物的回收對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖(I %)凝膠電泳,之后采用Gel Extraction Mini Kit (上海華舜生物工程有限公司)純化回收，具體步驟如下用干凈解剖刀片從瓊脂糖膠中切下片段，放入一個(gè)干凈的Eppendorf管中，稱取凝膠重量，按每IOOmg凝膠加入300 μ L SI溶液；55°C水浴lOmin，直到膠完全溶解，每2min顛倒混勻一次促進(jìn)膠溶解；將融化后的液體轉(zhuǎn)移入吸附柱，12，OOOrpm離心30s，倒掉收集管的液體，再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中；在吸附柱中加入500 μ LWl液，靜置lmin，12，OOOrpm離心15s，倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中；重復(fù)上一步驟；12，OOOrpm 離心 Imin ；將吸附柱放入一個(gè)干凈的Eppendorf管中，在吸附膜中央加入30 μ LTl溶液，55°C水浴 lmin, 12, OOOrpm 離心 Imin ；取3UL樣品用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收效果，將酶切后回收的載體片段-20°C保存待用。步驟(4)、目的基因4 X T β 4的獲得用Bam HI和Sac I分別酶切載體35S: :4ΧΤ β 4，反應(yīng)條件同步驟(3)，膠回收酶切后的4ΧΤβ4基因片段(613bp)。步驟(5)、回收片段與載體的連接將回收得到的目的基因片段和載體片段于16°C連接過夜。反應(yīng)體系4ΧΤβ46μ L,pET-28a 2 μ L, IOXligase buffer (連接酶緩沖液)I μ L，T4DNA ligase (T4DNA 連接酶)I μ L ;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，涂抹在含卡那霉素的LB平板上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)14 20h，挑取生長(zhǎng)良好的單克隆陽性菌落，用于菌落PCR和測(cè)序驗(yàn)證。步驟(6)、陽性克隆的篩選及測(cè)序鑒定PCR 擴(kuò)增體系 25 μ L,包括引物 T β 4 F (5 1 -acggtaccatgtctagaatg-3 1 )和T β 4 R (5' -gagctcttaactagtcatag-31 )各 I μ L (10 μ mol/L), O. 3 μ L Taq DNA 聚合酶(5units/ μ L)，2· 5 μ L 的 10XPCR 緩沖液，I. 5 μ L 的 MgCl2 (25mmol/L)，2 μ L 模板(待檢菌液)，I. 5 μ L白勺dNTPs (2. 5mmol/L) , 15. 2 μ L去離子無菌水，上覆20 μ L滅菌石臘油；PCR 條件94 °C IOmin ；94 °C 45s, 60 °C 45s, 72 °C 45min, 35 次循環(huán)；72 °C 延伸IOmin ;電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為590bp ；PCR產(chǎn)物檢測(cè)用帶有 EB(ethidium bromide)的 1.0% (w/v)瓊脂糖膠在 IXTAE電泳緩沖液中電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)紫光下檢測(cè)并拍照，結(jié)果如圖I所示，其中泳 道M為DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道+為含植物表達(dá)載體質(zhì)粒35S: :4ΧΤβ 4的大腸桿菌DH5a作模板的陽性對(duì)照；泳道10為空載體大腸桿菌DH5 a的陰性對(duì)照；其它泳道為獨(dú)立的DH5 a陽性斑1-9。左側(cè)的數(shù)據(jù)為DNA分子量大小標(biāo)準(zhǔn)。步驟(7)、大腸桿菌(BL21)的轉(zhuǎn)化取經(jīng)過PCR和測(cè)序驗(yàn)證正確的陽性克隆，參照步驟(I)提取重組質(zhì)粒pET-28a-4 X T β 4，經(jīng)跑膠驗(yàn)證后，取2 5 μ L該重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行熱激導(dǎo)入BL21感受態(tài)細(xì)胞。挑取單個(gè)克隆，通過PCR進(jìn)行重組子的篩選與鑒定。PCR體系和條件同步驟出)。BL21轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，其中泳道M為DL 2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道+為含植物表達(dá)載體質(zhì)粒35S: :4ΧΤ β 4的大腸桿菌BL21作模板的陽性對(duì)照；泳道8為空載體大腸桿菌DH5ci的陰性對(duì)照；其它泳道為獨(dú)立的BL21陽性斑1-7。左側(cè)的數(shù)據(jù)為DNA分子量大小標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例2 4ΧΤβ 4在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)步驟(I)目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)從新鮮的劃線平板中挑取單克隆到50mL含100mg/L卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，37°C 培養(yǎng)至 OD6tltl 為 O. 6 ;取出ImL菌液，作為誘導(dǎo)前的對(duì)照，保存在-20°C冰箱中備用；培養(yǎng)基中加入IOOmM IPTG至終濃度為ImM，繼續(xù)培養(yǎng)4h ；取出ImL菌液,和誘導(dǎo)前的菌液一起離心(4°C, 5，OOOrpm, IOmin),棄掉上清,沉淀用 50 μ L 2 X SDS Buffer 重懸；樣品95°C煮 5min，用于 SDS-PAGE 分析。步驟(2) SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE制備參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)；樣品經(jīng)過處理后，取出20 μ L上樣，將電泳裝置與電源相接(正極接下槽)，凝膠上所用電壓為8v/cm，當(dāng)染料進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15v/cm ；電泳結(jié)束后，取出一塊凝膠，放于染色液(甲醇水冰乙酸=4. 5 : 4. 5 : 1，按照O. 25g/100mL加入考馬斯亮藍(lán)R-250)中染色過夜，另一塊用于Western blot分析；用脫色液(甲醇水冰乙酸=4.5 4.5 I)脫色至蛋白條帶清晰沒有背景為止，pET-28a-4XTi3 4菌株誘導(dǎo)表達(dá)分析結(jié)果如圖3所示，其中泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I為未經(jīng)TPTG誘導(dǎo)的pET-28a-4X T β 4菌株；泳道6為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的不含目的基因的空載體；泳道2 5為經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后的pET-28a-4XT β 4菌株。左側(cè)的數(shù)據(jù)為蛋白分子量大小標(biāo)準(zhǔn)。步驟(3)、誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目標(biāo)蛋白表達(dá)的影響從表達(dá)目的蛋白的陽性克隆中選取一個(gè)菌株，分析在不同時(shí)間下目的蛋白的表達(dá)情況，確定最佳的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間。用上述誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)該菌株的表達(dá)，分別在誘導(dǎo)后的Oh、2h、4h和6h取出ImL菌液。4°C, 5，OOOrpm,離心IOmin,收集菌體,棄上清。沉淀加入50 μ L的2XSDS Buffer，95°C煮5min，使蛋白變性。通過SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物隨時(shí)間的變化情況，不同時(shí)間誘導(dǎo)的4ΧΤβ 4融合蛋白在原核系統(tǒng)中的表達(dá)分析結(jié)果如圖4所示，其中 泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌株；泳道6為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的不含目的基因的空載體；2-4為依次為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)2h，4h，6h后的蛋白表達(dá)；左側(cè)的數(shù)據(jù)為蛋白分子量大小標(biāo)準(zhǔn)。步驟⑷、目標(biāo)蛋白表達(dá)部位的確定從表達(dá)目的蛋白的陽性克隆中選取一個(gè)菌株，分析目標(biāo)蛋白的溶解性，為下一步純化分析采取的方法作準(zhǔn)備；在該菌株中加入IPTG誘導(dǎo)4h之后，離心(4°C，4，000g，20min)棄上清，沉淀用5mLlysis buffer (裂解緩沖液)重懸，立即放到冰上；重懸液中加入溶菌酶(終濃度為lmg/mL)，冰上放置過夜；超聲波破碎細(xì)胞，超聲6X 10s，IOs間隔一次(200w-300w)，樣品始終都要保持在冰上；41，10，00(^，離心301^11，收集上清，保存在冰上備用；沉淀用5mL lysis buffer重懸,保存在冰上備用；取上述上清和沉淀各5yL，加入等體積的2XSDS Buffer，95 °C煮5min，進(jìn)行SDS-PAGE分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)部位，4XT β 4融合蛋白表達(dá)部位的分析結(jié)果如圖5所示，其中泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I為誘導(dǎo)4h后，經(jīng)超生破碎后的沉淀部分；泳道2誘導(dǎo)4h后，經(jīng)超生破碎后的上清；泳道3為誘導(dǎo)4h后不含目的基因的空載體；左側(cè)的數(shù)據(jù)為蛋白分子量大小標(biāo)準(zhǔn)。步驟(5)、表達(dá)產(chǎn)物的Western印跡分析將表達(dá)目的蛋白的陽性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并且進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離；SDS-PAGE電泳結(jié)束后，取下凝膠，將其中一塊膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)的染色，另一塊膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；蛋白質(zhì)向PVDF膜上轉(zhuǎn)移用轉(zhuǎn)移緩沖液(39mM甘氨酸，48mM Tris Base, O. 037%SDS，20%甲醇)平衡凝膠和PVDF膜30分鐘，室溫下用半干式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移Ih，凝膠兩側(cè)各墊3層Whatman濾紙；PVDF膜蛋白檢測(cè)將PVDF膜浸在封閉液中，37°C緩慢搖動(dòng)、封閉60分鐘(封閉液取5g脫脂奶粉溶于IOOmL的1XPBS);再將濾膜浸泡在洗滌緩沖液中，37°C洗滌兩次，每次15分鐘；加入第一抗體(抗his-tag的抗體)，37°C溫育30分鐘,洗漆三次；加入第二抗體(親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物)，37°C溫育30分鐘，洗滌兩次，加入底物顯色觀察蛋白條帶，4ΧΤβ 4融合蛋白的免疫印跡分析結(jié)果如圖6所示，其中泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道I為未經(jīng)TPTG誘導(dǎo)的pET-28a-4XT β 4菌株，泳道6為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的不含目的基因的空載體，泳道2-5為經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后的pET-28a-4XTi3 4菌株，左側(cè)的數(shù)據(jù)為蛋白分子量大小標(biāo)準(zhǔn)。
步驟(6)、4X T β 4融合蛋白的純化誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，方法同上所述，誘導(dǎo)時(shí)間為4h ；12，OOOrpm，4°C離心5min收集菌體，棄上清，菌體一直保持在冰上；按5 I 的比例用 PBS(140mM NaCl, 2. 7mM KCl, IOmM Na2HP04，I. 8mMKH2P04)溶解離心收集的菌體，超聲波破碎菌體，6X IOsec, IOsec間隔一次(200w_300w),樣品需要一直保持在冰上；用buffer B (8M尿素，O. IM磷酸鈉緩沖液，O. OlM Tris-Cl，其余為蒸餾水，pH值為8. O)重懸菌體沉淀(20 200mL細(xì)胞培養(yǎng)物)，buffer B用量為5mL/g濕重。室溫?cái)嚢?5 60min，或者輕輕振蕩，小心避免產(chǎn)生泡沫。溶液呈半透明狀即裂解好；10，000g，4°C離心30min，棄掉沉淀，收集上清液用于上柱純化；懸浮50% Ni-NTA溶液，裝柱，避免產(chǎn)生氣泡。Ni-NTA用量為5_10mg蛋白/mL樹月旨;等樹脂自然沉降，用5倍柱體積ddH20過柱清洗層析柱，再加入5-10倍柱體積的IXNi-NTA buffer B 平衡層析柱。樣品上柱，用5-10倍柱體積的IXNi-NTA buffer B洗柱，lmL/min流速，收集流出液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)；用5 10倍柱體積的I XNi-NTA buffer C (8M尿素，O. IM磷酸鈉緩沖液，O.OlMTris-Cl，其余為蒸餾水，pH值為6. 3)洗柱(主要洗去非結(jié)合的蛋白)，收集流出液，用于SDS-PAGE檢測(cè)；用5倍柱體積的IXNi-NTA buffer E(8M尿素，0. IM磷酸鈉緩沖液，O.OlMTris-Cl，其余為蒸餾水，pH值為4. 5)洗柱，對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行洗脫，分別用2mL的EP管收集洗脫液，直接SDS-PAGE檢測(cè)；純化4 X T β 4目的蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，其中泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I為ΡΗ8洗脫條件洗脫的流出液；泳道2為ΡΗ6. 3條件洗脫的流出液；3_9 ΡΗ4. 5條件洗脫純化得到的4ΧΤβ 4融合蛋白；左側(cè)的數(shù)據(jù)為蛋白分子量大小標(biāo)準(zhǔn)。步驟(7)、淋巴細(xì)胞增殖的MTT比色法檢測(cè)4ΧΤβ 4融合蛋白的活性用MTT(3_(4,5-dimethylthiazol_2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)法檢測(cè)大腸桿菌表達(dá)的4ΧΤβ 4蛋白生物活性(Mosmann, T. (1983) J. Immunol. Methods65，55-63)，具體操作步驟如下將步驟(6)中純化的4XT β 4融合蛋白經(jīng)濾膜(Millipore, 0. 45 μ m)除菌后,用I XPBS將濃度調(diào)整至0. 5 μ g/ μ L ；將Balb/c小鼠浸入到乙醚中，取出后用大頭釘固定在無菌平板上，用無菌剪刀、鑷子剪開腹部皮膚，打開腹腔，取出脾臟；將脾臟放在200目的銅網(wǎng)上，充分研磨，一邊研磨一邊用含有RPMI 1640(完全)培
養(yǎng)基沖洗；
I, OOOrpm 離心 lOmin,棄上清；細(xì)胞沉淀用2mL紅細(xì)胞裂解液懸浮，吹打5min左右使其充分裂解，加入8mL GKN緩沖液(NaCl 8g，KCl O. 4g，Na2HPO4 ·2Η20 I. 77g，NaH2PO4 ·H2O 0. 69g，葡萄糖 2g，酚紅 0. Olg，溶于IOOOml雙蒸水中)終止反應(yīng)；I, OOOrpm 離心 IOmin,棄上清；沉淀中加入RPMI1640培養(yǎng)基IOmL，洗兩次；用RPMI1640培養(yǎng)基約IOmL懸浮，顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為IO5個(gè)/mL ；按照IO5個(gè)/mL細(xì)胞密度加在96孔板上培養(yǎng)；
反應(yīng)體系試驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(IXPBS)、陽性對(duì)照組(Τβ 4，購(gòu)自上海吉爾生化)、純化的4ΧΤβ 4融合蛋白為樣品組。在含有淋巴細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中加入標(biāo)準(zhǔn)的陽性蛋白T β 4 (I. O μ g) 100 μ L和過濾滅菌后的純化的4ΧT β 4融合蛋白100 μ L，對(duì)照孔加入IXPBSlOOy L，作3個(gè)批次，每批次各設(shè)5個(gè)重復(fù)；輕輕混勻后，置5% C02、37°C孵箱中培養(yǎng)24h ；在無菌條件下向每孔加MTT (5mg/mL母液)溶液10 μ L,輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4h ；在倒置顯微鏡(Olympus CKX31, Japan)下定期地觀察96孔板細(xì)胞，當(dāng)有清晰可見的紫色沉淀產(chǎn)生時(shí)，每一孔中加入150 μ L的DMSO (dimethyl sulfoxide),隨后輕輕地?fù)u動(dòng)96孔板，并將96孔板在室溫下(黑暗)放置15分鐘；在酶標(biāo)儀(Bio-TEK，USA)讀OD57tl的吸光值，以樣品劑量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。依據(jù)所測(cè)定的OD57tl值，利用公式計(jì)算促細(xì)胞增殖率；促細(xì)胞增值率％= (0D y；驗(yàn)-OD對(duì)照)/OD y；驗(yàn)純化的4ΧΤβ4融合蛋白的MTT檢測(cè)結(jié)果如圖8所示，其中4XTM(BL21)為純化的4ΧΤβ4融合蛋白的促淋巴細(xì)胞增值率，Ti3 4(GL Biochem)為購(gòu)于上海吉爾生化的T β 4的促淋巴細(xì)胞增值率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過大腸桿菌表達(dá)并純化的4ΧΤβ 4融合蛋白的促淋巴細(xì)胞增值率為15. 09%，購(gòu)于上海吉爾生化的Τβ 4的促淋巴細(xì)胞增值率為8. 49%。結(jié)果表明，相對(duì)于化學(xué)合成的Τβ 4，通過大腸桿菌表達(dá)并純化的4ΧΤβ 4融合蛋白具有明顯的促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的生物學(xué)作用。
權(quán)利要求
1.一種4ΧΤβ 4基因，其堿基序列如SEQ ID NO. I所示。
2.一種蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.—種重組載體，包括目的基因和載體，其特征在于，所述目的基因的堿基序列如SEQID NO. I所示,所述載體選自質(zhì)粒、粘?；颚耸删w中的一種。
4.一種在大腸桿菌中表達(dá)4ΧΤβ 4功能蛋白的方法，其特征在于，該方法包括如下的步驟 步驟一，將含有權(quán)利要求I所述4ΧΤ β 4基因的克隆載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切，回收所述4 X T β 4基因的DNA片段，獲得帶有相應(yīng)粘性末端的所述4 X T β 4基因，然后將所述帶有相應(yīng)粘性末端的4ΧΤβ 4基因克隆到原核表達(dá)載體中，通過測(cè)序或酶切鑒定確保所述表達(dá)載體中的所述4ΧΤβ 4基因閱讀框架正確； 步驟二，將所述表達(dá)載體用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌中，獲得包含所述4ΧΤβ 4基因表達(dá)載體的大腸桿菌工程菌； 步驟三，提取4ΧΤβ4功能蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的在大腸桿菌中表達(dá)4ΧΤβ4功能蛋白的方法，其特征在于，在所述步驟二中，所述轉(zhuǎn)化包括以下步驟 步驟I，取剛剛用CaCl2法制備的感受態(tài)細(xì)胞，或從-70°C冰箱中取出用CaClji制備的感受態(tài)細(xì)胞于冰上融化IOmin ； 步驟2，無菌條件下按照每200 μ L菌液加入IOOng已純化的表達(dá)載體DNA，將5 10 μ L所述表達(dá)載體加入所述感受態(tài)細(xì)胞中，用加樣器輕輕混勻，放置冰上30min ； 步驟3，42°C熱激90s，再放于冰上I 2min ； 步驟4，加入800 μ L經(jīng)過37°C預(yù)熱的含有卡那霉素100mg/L的LB液體培養(yǎng)基，37°C，180rpm復(fù)蘇培養(yǎng)90min ； 步驟5, 5000rpm離心5min,吸去上清900 μ L,將剩余的100 μ L菌液混勻； 步驟6，用涂布棒將所述菌液均勻涂于含有100mg/L的卡那霉素的LB固體平板上，37°C倒置16h 24h至長(zhǎng)出菌落，用無菌牙簽從所述LB固體平板上挑取抗性菌落進(jìn)行鑒定。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的在大腸桿菌中表達(dá)4XTβ 4功能蛋白的方法，其特征在于，所述LB液體培養(yǎng)基的組分以及各組分的質(zhì)量百分比為酵母提取物為0.5%，胰蛋白胨為I %，氯化鈉為I %，余量為蒸餾水，該LB液體培養(yǎng)基的pH值為7. O。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的在大腸桿菌中表達(dá)4XTβ 4功能蛋白的方法，其特征在于，所述LB固體培養(yǎng)基的組分以及各組分的質(zhì)量百分比為酵母提取物為O. 5%，胰蛋白胨為I %，氯化鈉為I %，瓊脂粉1.5%，卡那霉素為O. 01 %，余量為蒸餾水，該LB固體培養(yǎng)基的pH值為7.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的在腸桿菌中表達(dá)4ΧΤβ4功能蛋白的方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述提取包括以下步驟 4°C條件下，12000rpm離心5min收集經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)所述4XT β 4蛋白的菌體,棄上清，所述菌體一直保持在冰上； 按5 : I的比例用PBS溶解所述離心收集的菌體，超聲波破碎所述菌體，樣品一直保持在冰上，所述PBS的組分以及各組分濃度為140mM NaCl, 2. 7mM KCl，IOmMNa2HPO4,1. 8mMKH2PO4 ；重懸菌體沉淀，室溫?cái)嚢?5 60min，或者輕輕振蕩，至重懸溶液呈半透明狀； .4°C條件下，IOOOOg離心30min，棄掉沉淀，收集上清液用于上柱純化； 懸浮于50% Ni-NTA溶液，裝柱，所述Ni-NTA用量為5_10mg蛋白/mL樹脂； 所述樹脂自然沉降后，用5倍柱體積的ddH20過柱清洗層析柱，再加入5-10倍柱體積 的IXNi-NTA buffer B平衡所述層析柱； 樣品上柱，用5-10倍柱體積的IXNi-NTA buffer B洗柱，流速為lmL/min，收集流出液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)； 用5 10倍柱體積的I XNi-NTA buffer C洗柱，收集流出液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)；用5倍柱體積的I XNi-NTAbufferE洗柱，對(duì)4X T β 4蛋白進(jìn)行洗脫，分別用2mL的EP管收集洗脫液，所述洗脫液保存于_20°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的在大腸桿菌中表達(dá)4ΧΤβ4功能蛋白的方法，其特征在于，所述IXNi-NTA Buffer B的組成成分為:8M尿素，O. IM磷酸鈉緩沖液，O. OlM Tris-Cl，其余為蒸餾水，該IXNi-NTA Buffer B的pH值為8. O0
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的在大腸桿菌中表達(dá)4ΧΤβ4功能蛋白的方法，其特征在于，所述IXNi-NTA Buffer C的組成成分為:8M尿素，O. IM磷酸鈉緩沖液，O. OlM Tris-Cl，其余為蒸餾水，該IXNi-NTA Buffer C的pH值為6. 3 ;所述IXNi-NTA Buffer E的組成成分為:8M尿素，O. IM磷酸鈉緩沖液，O. OlM Tris-Cl，其余為蒸餾水，該IXNi-NTABuffer E的pH值為4.5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胸腺素β4四聯(lián)體基因及其在大腸桿菌中表達(dá)的方法，該基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，該方法包括以下步驟將含有所述4×Tβ4基因的克隆載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切，回收所述4×Tβ4基因的DNA片段，獲得帶有相應(yīng)粘性末端的所述4×Tβ4基因，然后將所述帶有相應(yīng)粘性末端的4×Tβ4基因克隆到原核表達(dá)載體中，通過測(cè)序或酶切鑒定確保所述表達(dá)載體中的所述4×Tβ4基因閱讀框架正確；將所述表達(dá)載體用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌中，獲得包含所述4×Tβ4基因表達(dá)載體的大腸桿菌工程菌；提取4×Tβ4功能蛋白。本發(fā)明提供的4×Tβ4功能蛋白在皮膚和眼角膜傷口治愈和修復(fù)方面具有重要的生物活性和功能。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102643826SQ20121010281
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月10日
發(fā)明者李善爽, 楊桂華, 王曉磊, 趙凌俠, 趙攀峰, 高美鳳, 高蕾 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)