專利名稱：包含mda-7的組合物和方法
包含MDA-7的組合物和方法本申請是國際申請?zhí)枮镻CT/US2004/006147、國際申請日為2004年3月2日、進入中國國家階段的申請?zhí)枮镃N 200480005918. X、發(fā)明名稱為“包含MDA-7的組合物和方法”的中國專利申請的分案申請。
背景技術(shù)：
本申請要求與本發(fā)明具有同樣的名稱和發(fā)明人的2003年3月3日提交的美國專利申請No. 60/452，257，2003年5月30日提交的美國專利申請No. 60/474，529，2003年6月4日提交的美國專利申請No. 60/476，159，2003年7月11日提交的美國專利申請No. 60/486，862，2003 年 10 月 29 日提交的美國專利申請 No. 60/515，285，2003 年 12 月 10日提交的美國專利申請No. 60/528, 506的優(yōu)先權(quán)。這些申請的各個內(nèi)容完整地本文引入作為參考。美國政府依據(jù)國立癌癥研究所授予本發(fā)明的基金CA86587，R41CA88421， P01CA78778, P01CA06294, CA70907 和 P30CA16672 而擁有本發(fā)明的權(quán)利。
A.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總地涉及分子生物學(xué)和基因治療領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及治療癌癥和其它新生血管形成相關(guān)病癥(抗新生血管形成治療)的診斷、預(yù)后和治療性組合物和方法。本發(fā)明還涉及MDA-7的純化方法以及含純化MDA-7的組合物。B.相關(guān)領(lǐng)域所述I.新生血管形成(angiogenesis)血管通過兩個過程構(gòu)建脈管生成，由此在從多能間質(zhì)前體細胞的胚胎發(fā)生過程中建立了原始血管網(wǎng)絡(luò)；和新生血管形成，在此過程中已存在的血管發(fā)出毛細管芽產(chǎn)生新的血管。內(nèi)皮細胞在每個過程都扮演主要角色。它們遷移、增殖然后以緊密的細胞-細胞連接組裝成血管(Hanahan，1997)。當(dāng)內(nèi)皮細胞釋放的酶和白細胞開始侵蝕基底膜時，在內(nèi)皮細胞周圍發(fā)生新生血管形成使內(nèi)皮細胞突出于基底膜。然后這些內(nèi)皮細胞響應(yīng)血管原性刺激開始遷移，形成血管分枝，并且繼續(xù)增殖直到這些分枝互相融合形成新的血管。通常，人類和動物中新生血管形成只在很有限的幾種情況下發(fā)生，例如胚胎發(fā)育、傷口愈合以及黃體、子宮內(nèi)膜和胎盤的形成。然而，異常的新生血管形成與包括癌轉(zhuǎn)移在內(nèi)的很多疾病相關(guān)。事實上，普遍認為腫瘤的生長依賴于血管生成過程的。因此，增加或降低新生血管形成的能力分別對臨床狀況例如傷口愈合(例如移植存活)或癌癥治療有重要的意義?，F(xiàn)有幾方面的直接證據(jù)表明新生血管形成對于實體瘤的生長維持及其轉(zhuǎn)移是必須的(FoIkman, 1989 ；Hon 等，1991 ；Kim 等，1993 ；Millauer 等，1994)。為了刺激新生血管形成，腫瘤上調(diào)它們多種血管原性因子的產(chǎn)生，包括成纖維細胞生長因子(FGF和DTCF)(Kandel等，1991)和血管內(nèi)皮細胞生長因子/血管滲透性因子(VEGF/VPP)的產(chǎn)生。然而，很多惡性腫瘤也產(chǎn)生新生血管形成抑制因子，包括血管抑素(血管抑素)和血小板反應(yīng)素(Chen等，1995 ；Good等，1990 ;0，Reilly等，1994)。推測血管原性表型是這些新生血管形成的正調(diào)控因子和負調(diào)控因子之間凈平衡的結(jié)果(Good等，1990 ;0’ Reilly等，1994 ；Parangi等，1996 ;Rastineiad等，1998)。已鑒定到其它幾種新生血管形成的內(nèi)源性抑制齊U，雖然不是所有這幾種都與腫瘤的存在相關(guān)。這些抑制劑包括，血小板因子4 (Gupta等，1995 ;Maione等，1990),干擾素-α，白細胞介素和/或干擾素-Y誘導(dǎo)的(Voest等，1995)干擾素誘導(dǎo)蛋白質(zhì) 10 (Angiolillo 等，1995 ；Strieter 等，1995)，gro- β (Cao 等，1995)，以及催乳素16kDa的N-末端片段(Clapp等，1993).2.新生血管形成相關(guān)疾病本發(fā)明的方法可用于治療內(nèi)皮細胞相關(guān)疾病和病癥。尤其重要的內(nèi)皮細胞過程是新生血管形成，即上述的血管形成。利用本發(fā)明所述的方法抑制內(nèi)皮細胞增殖可能能夠治療新生血管形成相關(guān)疾病。新生血管形成相關(guān)疾病包括，但不限于，新生血管形成依賴性癌癥，包括例如，實 體瘤,血源性腫瘤例如白血病，以及腫瘤轉(zhuǎn)移；良性腫瘤,例如血管瘤，聽神經(jīng)瘤,神經(jīng)纖維瘤,沙眼，以及膿性肉芽腫；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；牛皮癬；眼血管原性疾病,例如,糖尿病視網(wǎng)膜病變，早熟性視網(wǎng)膜病，黃斑變性，角膜移植排異，新生血管性青光眼，晶狀體后纖維增生，虹膜發(fā)紅Asler-Webber綜合征；心肌新生血管形成；斑塊新生新生血管形成；毛細管擴張癥；血友病關(guān)節(jié)；血管纖維瘤；以及創(chuàng)傷性肉芽腫。本發(fā)明的內(nèi)皮細胞增殖抑制方法可用于內(nèi)皮細胞過分或異常刺激疾病的治療。這些疾病包括，但不限于，腸粘連，動脈粥樣硬化.硬皮病，以及肥厚性瘢痕，即瘢痕瘤.它們還可用于治療以新生血管形成為病理結(jié)果的疾病，例如貓抓傷疾病(Rochele minalia quintosa)和潰瘍(Helobacter pylori)。3.癌癥正常組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是一種細胞增殖和死亡高度協(xié)調(diào)的過程。這種平衡一旦被破壞可能發(fā)展成為生癌狀態(tài)(Solyanik等，1995 ;Stokke等，1997 ;Mumby和Walter, 1991 ；Natoli等，1998 ;Magi_Galluzzi等，1998)。例如，宮頸癌、腎癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和腦癌就是這種結(jié)果導(dǎo)致的許多癌癥中的幾種(Erlandsson, 1998 ；Kolmel, 1998 ;Mangray和King, 1998 ；Mougin等，1998)。事實上，腫瘤的發(fā)生率很高，僅美國每年死于腫瘤的人數(shù)就超過 500，000。原癌基因至少部分地調(diào)節(jié)細胞增殖和細胞死亡的維持。原癌基因可編碼誘導(dǎo)細胞增殖的蛋白質(zhì)(例如，sis, erbB, src, ras和myc),抑制細胞增殖的蛋白質(zhì)(例如，Rb, pl6,pl9，p21，p53，NFl和WTl)或調(diào)節(jié)程序性細胞死亡的蛋白質(zhì)(例如，bcl_2) (Ochi等，1998 ；Johnson和Hamdy, 1998 ；Liebermann等，1998)。然而,這些原癌基因的遺傳重排或突變可能導(dǎo)致原癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)閺娏抑掳┑陌┗?。常常，單點突變就足以使原癌基因轉(zhuǎn)化為癌基因。例如，P53腫瘤抑制蛋白中的點突變可導(dǎo)致野生型p53功能完全喪失(Vogelstein和Kinzler, 1992 ；Fulchi等，1998)并獲得顯性的腫瘤促進功能。當(dāng)前，對于許多普通類型的腫瘤來說幾乎沒有有效的治療方案可供選擇。不同個體的治療方案取決于病人的診斷、疾病的發(fā)展階段以及年齡、性別和健康狀況等因素。最常規(guī)的癌癥治療方案選擇是手術(shù)治療、放射治療和化療。手術(shù)在癌癥的診斷和治療中起著王要作用。一般，需要手術(shù)方法來進行活體檢查和切除癌生長物。然而，如果癌癥已經(jīng)轉(zhuǎn)移和廣泛擴散，手術(shù)不可能治愈，必須采取另外的方法。放療、化療和免疫治療是手術(shù)治療的替代方案(Mayer，1998 ；Ohara, 1998 ;Ho等，1998)。放射治療包括高能放射的精確瞄準以摧毀癌細胞，與手術(shù)很相似，它主要在治療未轉(zhuǎn)移的局部癌細胞時有效。放射治療的副作用包括皮膚刺激、吞咽困難、口干、惡心、腹瀉、脫發(fā)和喪失精力(Curran，1998 ；Brizel, 1998)?；?，用抗癌藥物治療癌癥，是癌癥治療的另外一種方式?？拱┧幬镏委煹挠行酝ǔ驗樗幬镫y以輸送到達實體瘤內(nèi)而受到限制(el-Kareh和SeComb，1997)。化療策略依據(jù)腫瘤組織生長，其中抗癌藥物靶向于快速分裂的癌細胞。大多數(shù)化療方法包括一種以上抗癌藥物的聯(lián)合應(yīng)用，已證明這樣可增加各種癌癥的反應(yīng)率(美國專利5，，824，348 ；美國專利5，633，016和美國專利5，798，339，本文引入作為參考)。化療藥物的主要副作用是它們也影響正常的組織細胞，最可能受影響的細胞是快速分裂的細胞(例如，骨髓、胃腸道、生殖系統(tǒng)和毛囊)?；熕幬锏钠渌靖弊饔脼榭谇粷?、吞咽困難、口干、惡心、腹瀉、嘔吐、疲勞、出血、脫發(fā)和感染。免疫療法，癌癥研究中一個進展快速的領(lǐng)域，也是治療某些類型癌癥的可選方案。例如，免疫系統(tǒng)可以將腫瘤細胞識別為外源物質(zhì)，因此腫瘤細胞成為免疫系統(tǒng)摧毀的目標。 不幸的是，免疫應(yīng)答一般不足以阻止大多數(shù)腫瘤的生長。但是，免疫治療領(lǐng)域最近的研究集中在開發(fā)能增強或補充免疫系統(tǒng)天然防御機制的方法。最近正在研究或應(yīng)用的免疫治療的例子是免疫佐劑(如牛型結(jié)核桿菌、惡性瘧原蟲、二硝基氯苯和芳香族化合物)(美國專利 5，801，005 ;5，739，169 ；Hui 和 Hashimoto, 1998 ；Christodoulides 等，1998)，細胞因子治療(如干擾素，IL-LGM-CSF 和 TNF) (Bukowski 等，1998 ；Davidson 等，1998 ；Hellstrand等，1998)和基因治療(如 TNF、IL-U IL-2、p53) (Qin 等，1998 ;美國專利 5, 830, 880 和5，846，945)以及單克隆抗體(如抗神經(jīng)節(jié)苷脂GM2抗體、抗HER-2抗體、抗pl85抗體)(Pietras 等，1998 ；Hanibuchi 等，1998 ;美國專利 5，824，311)。4.基因治療基因治療是生物醫(yī)藥研究中一個新出現(xiàn)的領(lǐng)域，其焦點集中在通過將治療性重組核酸導(dǎo)入患者的體細胞內(nèi)而治療疾病?，F(xiàn)在有多項基因治療的臨床試驗已開始進行，其中包括各種癌癥、AIDS、囊性纖維化、腺苷脫氨酶缺乏癥、心血管疾病、Gaucher病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的治療。目前，腺病毒是運送基因治療藥物的優(yōu)選運載體。利用腺病毒作為基因治療藥物的優(yōu)點在于其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、能感染非分裂細胞、其基因組易于操作以及與宿主基因組發(fā)生非同源重組的概率低。5.細胞因子IL-IO是免疫系統(tǒng)細胞和一些腫瘤細胞產(chǎn)生的多效性同型二聚體細胞因子(Howard等，1992 ;Ekmekcioglu等，1999)。其免疫抑制功能包括對促炎性細胞因子包括IFNY、TNF α和IL-6合成的強烈抑制(De Waal Malefyt等，1991)。IL-10樣細胞因子家族由lq32染色體上一個很小的195kb基因簇編碼，由一些與IL-IO結(jié)構(gòu)和序列同源的細胞蛋白質(zhì)(IL-10, IL-19, IL-20,MDA-7)組成(Moore 等，1990 ;Kotenko 等，2000 ;Gallagher 等，2000 ；Blumberg 等，2001 ；Dumoutier 等，2000 ；Knapp 等，2000 ； Jiang 等，1995a ； Jiang 等，1996)。MDA-7已被鑒定為IL-10家族成員，也稱為IL-24。染色體定位、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、小鼠和大鼠同源物表達以及推定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)都暗示MDA-7 是細胞因子(Knapp 等，2000 ；Schaefer 等，2000 ；Soo 等，1999 ；Zhang 等，2000)。與GM-CSF, TNF α，和IFN Y的轉(zhuǎn)錄物類似，它們在其3’ UTR中都含有靶向mRNA使其快速降解的富含AU的元件，MDA-7在其3’ UTR有三個AREs (Wang等，2002)。已在人PBMC中鑒定到Mda-7mRNA (Ekmekcioglu等，2001)，雖然以前沒有人MDA-7蛋白具有細胞因子功能的報道，但根據(jù)其基因和蛋白序列的特征，MDA-7已被命名為IL-24(NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號XM001405)。鼠MDA-7蛋白同源物FISP (IL-4-誘導(dǎo)的分泌蛋白)已報道為是Th2特異性的細胞因子(Schaefer等，2001)。如敲除研究所證實的，TCR和IL-4受體的結(jié)合及隨后的PKC和STAT6活化可誘導(dǎo)FISP的轉(zhuǎn)錄。已分析了 FISP的表達特征，但還沒有發(fā)現(xiàn)這個推定的細胞因子的功能。大鼠MDA-7同源物C49a(Mob-5)與mda_7基因有78%的同源性，已證實與傷口愈合有關(guān)(Soo等，1999 ;Zhang等，2000)。Mob_5也是一種分泌蛋白，鑒定為在大鼠轉(zhuǎn)化細胞上的一種可能的細胞表面受體(Zhang等，2000)。因此，可在各物種中表達和分泌mda-7基因和MDA-7分泌蛋白的同源物。但是，沒有數(shù)據(jù)顯示MDA-7具有細胞因子活性。這種活性可通過促進治療性免疫應(yīng)答反應(yīng)或增強抗原的免疫原性用于治療各種疾病和感染。發(fā)明概述 本發(fā)明涉及純化MDA-7的方法和純化的MDA-7，以及含MDA-7蛋白質(zhì)或編碼MDA-7的核酸在治療和預(yù)防性治療以及診斷試驗中應(yīng)用的方法和組合物。本文提供了純化MDA-7的多種實施方式。在有些實施方式中，純化的MDA-7是人MDA-7，可以是全長的、截短的或其片段。在其它實施方式中，MDA-7來自其它動物或來源，例如其它哺乳動物，包括小鼠、大鼠和猴子。在一些實施方式中，MDA-7是糖基化的，而在另外的實施方式中MDA-7是非糖基化的。有些情況下，MDA-7缺少其信號序列，有些情況下，它具有異源信號序列。所有這些MDA-7多肽都可通過本發(fā)明的方法純化。本文所述的純化方法產(chǎn)生純度至少約20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，最高約 100%均一的 MDA-7 蛋白質(zhì)?；蛘?，將MDA-7蛋白質(zhì)純化到至少或至多約20% -95%,30% -90%,40% -80%,50% -75%,20% -50%, 50% -70%, 50% -90%, 70% -90%以及其中的范圍。術(shù)語“均一性”具有蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域技術(shù)人員所知的通常含義并可理解為指特定蛋白質(zhì)的純度水平。當(dāng)與百分數(shù)連用時，指與蛋白質(zhì)總量相比較時MDA-7蛋白質(zhì)所占的百分比(以分子)。術(shù)語“均一的”是指均一水平的形容詞。術(shù)語“約”指蛋白質(zhì)量測定的不精確性，意思包括任何具體試驗的至少一個標準差或?qū)y定的蛋白質(zhì)濃度的校準。例如，如果通過凝膠電泳以考馬斯(coomassie)凝膠染色來測定蛋白質(zhì)濃度和均一性，將MDA-7純化到至少約25%均一性指置于凝膠上的樣品與該分子的總蛋白質(zhì)濃度比較，是至少25%的MDA-7加減考馬斯染料染色的蛋白質(zhì)凝膠的標準差。此外，預(yù)計純化的MDA-7組合物可能含有20 %，25 %，30 %，35 %，40 %，45 %，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，最高約 100%活性的 MDA-7 蛋白質(zhì)。在藥理或藥學(xué)上可接受的溶液或組合物的情況下，就均一性而言提到MDA-7純度時指，與任何污染蛋白質(zhì)相比較該溶液或組合物中有多少比例是MDA-7，此處污染蛋白質(zhì)指不想要的或不需要的蛋白質(zhì)。這種區(qū)別意味著排除有意加入該溶液或組合物中的蛋白質(zhì)的濃度，例如用于誘導(dǎo)針對MDA-7免疫應(yīng)答反應(yīng)的免疫原性多肽的蛋白質(zhì)濃度。在本發(fā)明的很多實施方式中，純化的MDA-7蛋白質(zhì)是活性蛋白。術(shù)語“活性”通常指純化的MDA-7蛋白質(zhì)具有MDA-7的一些活性。這可以用百分比來定量衡量，在一些實施方式中，通過測定MDA-7活性的任何具體試驗，純化的MDA-7蛋白質(zhì)至少約10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，最高約100%具有對照MDA-7多肽一樣的活性。這種活性可定義為包括但不限于下列任何一種結(jié)合活性，功能活性(包括但不限于誘導(dǎo)凋亡，抑制新生血管形成或誘導(dǎo)抗新生血管形成，結(jié)合IL-22，激活STAT3，調(diào)節(jié)PKR，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)的能力)，翻譯后修飾的能力(糖基化)，形成正確的三級結(jié)構(gòu)的能力，正確定位的能力。純化MDA-7蛋白質(zhì)的方法包括很多可單獨使用或相互組合使用的步驟?？蓮谋磉_重組MDA-7或非重組MDA-7 (例如，從內(nèi)源表達MDA-7的基因組基因)的細胞中純化得到MDA-7。對于表達重組MDA-7的細胞，宿主細胞型在MDA-7翻譯后是否修飾中起作用。在具體的實施方式中，利用能使MDA-7糖基化的真核細胞作為宿主細胞或MDA-7蛋白質(zhì)的細胞來源。因此，該細胞可以是真核或原核細胞，具體考慮是哺乳動物、昆蟲、細菌、人或真菌細胞。在有些實施方式中，制備含有MDA-7蛋白質(zhì)的細胞提取物或上清并將其用不同的純化步驟包括層析來純化。
被純化的MDA-7可以是該蛋白質(zhì)的分泌形式，對應(yīng)于SEQ ID NO 2所確定的全長蛋白質(zhì)的氨基酸49-206?；蛘?，該純化的MDA-7可以是全長的，或可以含有一個或多個異源氨基酸區(qū)域，例如異源N-末端區(qū)域或信號序列。而且，該蛋白質(zhì)可以糖基化。MDA-7糖基化可能發(fā)生在不同位置不同程度。考慮純化的MDA-7可以是不統(tǒng)一的糖基化。此外，考慮可將MDA-7純化成為復(fù)合物例如二聚體的一部分。在具體實施方式
中，采用親和層析。在本發(fā)明的方法中，親和層析包含有抗-MDA-7抗體。具體考慮采用抗MDA-7單克隆和多克隆抗體，可采用一種以上的單克隆或多克隆抗體，和同時采用多克隆和單克隆抗體。在其它實施方式中，親和層析涉及MDA-7和不基于蛋白質(zhì)序列的其它分子之間的親和力。本發(fā)明的有些方面采用了結(jié)合糖基化分子的凝集素。在有些情況下，將具有MDA-7親和力的基礎(chǔ)分子與樹脂復(fù)合，所述樹脂可以是非反應(yīng)性物質(zhì)例如瓊脂糖?？筛鶕?jù)本發(fā)明的一些實施方式制作親和樹脂柱。作為本發(fā)明方法的一部分，可使細胞提取物或上清通過該樹脂。在有些實施方式中，經(jīng)過含抗體的親和層析之后，使富集或純化的蛋白質(zhì)暴露于結(jié)合任何污染性抗體的蛋白質(zhì)A?？蓪⒌鞍踪|(zhì)A絡(luò)合于或結(jié)合于非反應(yīng)性結(jié)構(gòu)例如柱子或珠子，從而使蛋白質(zhì)A與富集或純化的MDA-7分離?？刹捎玫钠渌愋偷膶游鰹殡x子交換，尤其是陰離子交換層析。此外，層析包括非反應(yīng)性純化過程，例如尺寸排斥層析。尺寸排斥包括但不限于，凝膠電泳，利用柱中的珠子進行尺寸排斥，或可分辨分子大小的任何其它類型的非反應(yīng)性物理結(jié)構(gòu)。在有些情況下，采用至少1，2，3，4，5或更多不同類型的純化步驟。特別考慮親和層析結(jié)合陰離子交換層析來純化MDA-7。在另外的實施方式中，還采用尺寸排斥層析。在一實施方式中，將樣品進行親和層析，尺寸排斥層析，然后進行陰離子交換層析。每個層析步驟之后，可在樣品中加入蛋白質(zhì)運載體，和/或可將樣品進行透析或尺寸排斥。在有些實施方式中，取決于所用的純化工藝類型，選擇的工藝包括或不包括結(jié)合MDA-7的多肽，例如IL-22或IL-20受體或PKR。因此，特別考慮本發(fā)明的純化方法可用于純化MDA-7單體，MDA-7復(fù)合物一糖基化或未糖基化，以及直接或間接結(jié)合MDA-7的蛋白質(zhì)(單體或作為復(fù)合物)。在具體實施方式
中，在進行層析之前、過程中或之后加入蛋白質(zhì)運載體?？稍谌魏螌游龌蚱渌患襟E之前將該蛋白質(zhì)運載體加入細胞提取物或上清中。在有些情況下，在MDA-7從柱子洗脫之后加入運載體使其穩(wěn)定。在某些實施方式中，所述蛋白質(zhì)運載體是白蛋白。白蛋白可以有很多種來源包括人。在有些實施方式中，白蛋白是BSA。此外，可在純化工藝的后續(xù)步驟中除去該蛋白質(zhì)運載體。在層析過程中，包括陰離子交換和親和層析中，可使用鹽梯度。在本發(fā)明的一些實施方式中，可使用鹽溶液，濃度為 O. 05,0. 1,0. 15,0. 20,0. 25,0. 30. O. 35,0. 40,0. 45,0. 50，O. 55,0. 60,0. 65,0. 70,0. 75,0. 80,0. 85,0. 90,0. 95，I. 00，I. 05，I. 10，I. 15，I. 20. I. 25M 或更高，可遞增多至約 O. 005,0. 010,0. 015,0. 020,0. 025,0. 030,0. 035,0. 040,0. 045,0. 050，O. 055,0. 060,0. 065,0. 070,0. 075,0. 080,0. 085,0. 090,0. 095,0. 100,0. 200,0. 300，O. 400，O. 500M或更多。在一些實施方式中，陰離子交換層析包括高至濃度I. OM的鹽梯度步驟。在另外的實施方式中，用含鹽濃度約O. 9M-1. OM的溶液將MDA-7蛋白質(zhì)從柱子或其它物理結(jié)構(gòu)上洗脫。在本發(fā)明的具體實施方式
中所用的鹽為NaCl。在層析過程中，可以有一個或更多洗滌步驟。在有些情況下，使樹脂與含有MDA-7蛋白質(zhì)的細胞提取物或上清接觸后洗滌樹脂。洗滌液可含有緩沖劑和濃度至多約O. 05，O. I, O. 15,0. 20, O. 25, O. 30. O. 35, O. 40, O. 45, O. 50, O. 55, O. 60, O. 65, O. 70, O. 75 , O. 80,O. 85,0. 90,0. 95，I. OOM或更低的鹽。洗滌步驟之后，可進行洗脫步驟。在有些實施方式中，使用含有IM鹽pH低于5. O的溶液。洗脫液pH至多約5.0，4. 5，4.0，3. 5，3. O或更低。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，洗脫之后進行中和步驟。在具體實施方式
中，中和步驟包括采用緩沖液。本發(fā)明包括含有用本發(fā)明任何方法純化的MDA-7蛋白質(zhì)的組合物。純化的MDA-7蛋白質(zhì)如上所述認為是本發(fā)明的一部分。純化的MDA-7蛋白質(zhì)的使用也是本發(fā)明的一部分。在有些實施方式中，抑制患者新生血管形成的方法包括給予患者有效劑量的藥學(xué)上可接受的含純化的MDA-7蛋白質(zhì)的組合物，其中該蛋白質(zhì)有活性且至少約80%均一。在其它實施方式中，治療癌癥患者的方法包括給予患者有效劑量的藥學(xué)上可接受的含純化MDA-7蛋白質(zhì)的組合物，其中該蛋白質(zhì)有活性且至少約80%均一。在另外的實施方式中，所述方法還包括給患者進行放療或化療。特別考慮患內(nèi)皮細胞癌或黑素瘤的癌癥患者可得益于本發(fā)明的方法。內(nèi)皮細胞表達能與MDA-7結(jié)合的受體。聯(lián)合放療和給予MDA-7導(dǎo)致腫瘤相關(guān)內(nèi)皮的凋亡。因此用MDA-7治療人腫瘤不限于細胞表達MDA-7受體的腫瘤。此外，患有白血病或淋巴瘤的患者因癌細胞表達MDA-7受體也可得益于給予MDA-7。此外，本發(fā)明涉及的方法包括給予患者一種免疫原性分子和含純化MDA-7蛋白的藥學(xué)上可接受的組合物，以誘導(dǎo)患者產(chǎn)生抗該免疫原性分子的免疫應(yīng)答反應(yīng)，其中該蛋白質(zhì)有活性且至少約80%均一。術(shù)語“均一”指在多大程度上MDA-7蛋白質(zhì)已純化到均一。如上所述，該組合物可含有所需要的不認為是污染物的其它蛋白質(zhì)，因此它們不影響MDA-7純度含量的任何參數(shù)。在本發(fā)明另外的實施方式中，患者可對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)的免疫原性分子是病毒、細菌、真菌或腫瘤抗原。在另外的實施方式中，給予患者干擾素。該干擾素可以是IFN-α、IFN-β、IFN-Y或λ IFN。在另外的實施方式中，給予患者細胞因子或其它免疫刺激分子。本發(fā)明另一方法涉及采用MDA-7蛋白質(zhì)來誘導(dǎo)拮抗腫瘤的新生血管形成。腫瘤變成血管化，并誘導(dǎo)了腫瘤周圍的新生血管形成。本發(fā)明使用MDA-7多肽通過誘導(dǎo)抗新生血管形成而抑制或逆轉(zhuǎn)該過程。詞組“誘導(dǎo)抗新生血管形成”指血管化的逆轉(zhuǎn)或抑制或?qū)σ呀?jīng)開始的新生血管形成的抑制。在有些實施方式中，給予腫瘤患者有效劑量的MDA-7多肽以結(jié)合IL-22-受體陽性細胞上的IL-22受體并誘導(dǎo)抗腫瘤新生血管形成。IL-22-受體-陽性細胞是在其表面表達結(jié)合MDA-7的IL-22受體的細胞。因此，在有些實施方式中，給予患者的IL-22-受體-陽性細胞有效劑量的MDA-7。在另外的實施方式中，IL-22-受體-陽性細胞是內(nèi)皮細胞。所以，考慮可給予患者的內(nèi)皮細胞MDA-7多肽。此外,這些細胞不需要與腫瘤或腫瘤細胞相毗鄰(“鄰接”或“相鄰”)。考慮這些細胞可距腫瘤較遠(不鄰近)。而且，在有些實施方式中，MDA-7多肽是分泌形式的MDA-7并且是糖基化的。本發(fā)明還包括在時間和/空間上將MDA-7多次給予癌癥患者包括腫瘤患者的相關(guān)方法和組合物。因此，在本發(fā)明的有些實施方式中，治療腫瘤患者的方法包括將醫(yī)學(xué)上可接受的組合物注射入腫瘤中第一部位和注射入腫瘤中第二部位，該組合物包含i)MDA-7多肽或ii)含受啟動子控制的編碼MDA-7的核酸的腺病毒載體?？紤]給予患者包含MDA-7蛋白質(zhì)或編碼MDA-7的核酸的組合物，給藥次數(shù)至少，至多，或以下數(shù)值1，2，3，4，5，6，7，
8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或更多次。因此，在腫瘤內(nèi)，可在至少或至多1，2，3,4, 5,6, 7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20 個位點注射 MDA-7 組合物(指包含MDA-7蛋白質(zhì)或編碼MDA-7蛋白質(zhì)的核酸的組合物)?！白⑸潼c”指針或其它穿刺裝置與患者接觸的點。注射點沿腫瘤表面或沿腫瘤平面互相相隔可以是，至少或至多，在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180，185，190,200 毫米內(nèi)或更多。特別考慮當(dāng)給予一點以上注射時，兩個或多個或所有注射點可彼此均勻相隔。也考慮可將MDA-7組合物注射在腫瘤外，例如外圍。在有些實施方式中，將該組合物注射在距腫瘤24，20，16，12，8，4，或2毫米內(nèi)。在本發(fā)明的有些實施方式中，給予一次注射，并在第一次注射完成后馬上進行一次后續(xù)注射。或者，在注射之間可相隔一些時間。因此，給予后續(xù)注射可在前次注射后下列時間內(nèi)，至少下列時間內(nèi)或至多下列時間內(nèi):1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60 分鐘或 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，2，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 小時或 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31 天或 1,2,3,4,5周，或 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 個月或更久。此外，本發(fā)明包括使用一種或多種化療、放療、基因治療和/或免疫治療的聯(lián)合治療策略。應(yīng)理解，除非另有說明，純化的MDA-7可從真核細胞或原核細胞純化得到。在有些情況下，MDA-7以MDA-7編碼核酸轉(zhuǎn)染的原核細胞中純化得到。在有些情況下，不使MDA-7糖基化但仍可用于本發(fā)明的一些方法中。在其它實施方式中，MDA-7從原核細胞純化，有些情況下，從哺乳動物細胞純化得到。在具體實施方式
中，MDA-7從小鼠、大鼠、猴子、倉鼠或人細胞中純化得到。在這些細胞中MDA-7可以是內(nèi)源或外源產(chǎn)生的。本發(fā)明其它方法包括用純化的MDA-7治療過度增生性疾病，尤其是癌癥。因此，在本發(fā)明的有些實施方式中，治療患者癌癥的方法包括給予該患者有效劑量的含有純化到一定均一性并有活性的純化MDA-7的藥學(xué)上可接受的組合物。可用作該方法一部分的均一性百分比包括本文所所述的任何百分比。在本發(fā)明的另外實施方式中，還對患者進行放療。本發(fā)明專門包括使細胞放射致敏的方法。術(shù)語“放射致敏”指使細胞對放射更敏感。因此，放射治療前細胞的放射致敏提高了其相對放射治療前未放射致敏的細胞對放射的敏感性。因此，在本發(fā)明的有些實施方式中，方法是采用MDA-7使細胞放射致敏。
放療，一種眾所周知的癌癥治療方法，可在給予患者純化的MDA-7蛋白質(zhì)之前或之后給予患者?？紤]給予患者一次劑量的純化MDA-7蛋白質(zhì)后下列時間內(nèi)，至少或至多5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55 分鐘或 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，30，36，42，48，54，60，66，72，78，86，84，90，96，102，108，114，120，126，130，136，142 小時，或 1，2，3，4，5，6，7 天，或 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 周或更久后對患者進行至少一個療程的放療，或它們的組合治療。在具體實施方式
中，在患者接受一次劑量的純化MDA-7蛋白質(zhì)治療96小時內(nèi)進行放療。對于放療、MDA-7蛋白質(zhì)或兩者，考慮可給予患者多次或多個治療療程。考慮可用純化的MDA-7蛋白質(zhì)和/或放療來治療本文所述的任何癌癥或癌細胞。在具體實施方式
中，待治療的癌癥是胰腺起源的或是黑素瘤。特別考慮可將純化的MDA-7蛋白質(zhì)給予癌癥或腫瘤細胞相毗鄰或位置相近的非癌細胞。在具體實施方式
中，所述方法包括放射致敏癌細胞，該方法包括給予細胞有效劑量的在該細胞中受可操作啟動子控制的編碼MDA-7的核酸的腺病毒載體。也可使用其它載體。此外，采用本發(fā)明的任何其它方法，可給予純化的MDA-7來代替編碼MDA-7多肽的表達構(gòu)建物，或反之亦然。特別考慮所述癌細胞可以是內(nèi)皮細胞，或本文所述的任何其它癌細胞。本發(fā)明還涉及使MDA-7-編碼多聚核苷酸、表達構(gòu)建物或載體與精蛋白形成復(fù)合體的方法。精蛋白是帶電分子，可以和MDA-7核酸分子一起包含在組合物內(nèi)或與MDA-7核酸分子形成復(fù)合物。本發(fā)明的其它方法包括通過給予它莫西芬和純化的MDA-7蛋白質(zhì)或含受啟動子控制的編碼MDA-7的核酸的腺病毒載體，來治療對象或癌癥患者中的癌細胞的方法?？稍诮o予MDA-7蛋白質(zhì)或腺病毒載體的同時給予它莫西芬，或在這之前或之后給予。考慮可在給予患者一次劑量的純化的MDA-7蛋白質(zhì)或腺病毒載體后的下列時間內(nèi)，至少或至多5，10,15,20,25,30,35,40,45,50,55 分鐘或 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，30，36，42，48，54，60，66，72，78，86，84，90，96，102，108，114，120，126，130，136，142 小時或 1，2，3，4，5，6，7 天，或 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 周或更久后給予該患者或?qū)ο笏鞣?，或它們的組合治療。本發(fā)明的另外實施方式包括誘導(dǎo)細胞中STAT3活化的方法，該方法包括給予該細胞有效劑量的純化到一定百分比均一性并有活性的純化MDA-7。可用作該方法一部分的均一性百分比包括本文所述的任何百分比。詞組“STAT3活化”指激發(fā)STAT3多肽的活性。可用本文實施例部分所述的方法檢測STAT3的活化。
本發(fā)明的其它方法涉及利用MDA-7來抑制平滑肌細胞。所以，在有些實施方式中，抑制平滑肌細胞的方法包括給予該細胞有效劑量的含有純化的MDA-7蛋白質(zhì)或含有受啟動子控制的編碼MDA-7的核酸的腺病毒載體的組合物。抑制平滑肌細胞包括誘導(dǎo)該細胞進入凋亡或抑制其遷移。本發(fā)明還涉及治療患者的癌癥或癌細胞的方法，該方法包括給予NF-kB抑制劑和含有純化的MDA-7蛋白質(zhì)或含有受啟動子控制的編碼MDA-7的核酸的腺病毒載體的組合物。NF-kB抑制劑指抑制NF-kB表達或活性的物質(zhì)。在有些實施方式中，該NF-kB抑制劑是蘇靈大。在其它實施方式中，該NF-kB抑制劑是I-kB蛋白質(zhì)或含有編碼I-kB的核酸的載體。具體考慮可給予患者編碼MDA-7和NF-kB抑制劑的單一載體或者可通過不同的載體提供。類似地，可給予患者含有一種或多種載體和/或一種或多種蛋白質(zhì)的單一組合物。本發(fā)明方法還包括用帶電分子精蛋白治療癌癥。在有些實施方式中，本發(fā)明涉及治療癌癥的方法，該方法包括給予癌癥患者有效劑量的一種病毒組合物，該組合物包含 (a)精蛋白分子；和(b)含有受啟動子控制的編碼人MDA-7多肽的核酸的表達構(gòu)建物。在本發(fā)明的有些實施方式中考慮使精蛋白分子與該表達構(gòu)建物形成復(fù)合物。病毒組合物可含有約 IO8, IO9, IO10, IO11, IO12, IO13, IO14, IO15 或更多的病毒顆粒與約 10，20，30，40，50，60，70,80,90,100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300，320，340，360，380，400，420，440，460，480，500，520，540，560，580，600，620，640，660，680，700，720，740，760，780，800，820，840，860，880，900，920，940，960，980，1000或更多μ g精蛋白的比率。在具體實施方式
中，該病毒組合物含有約101°或IO11病毒顆粒與約100 μ g精蛋白，約200 μ g精蛋白，或約300 μ g精蛋白的比率。用于本發(fā)明方法和組合物中的MDA-7肽或多肽考慮至少含有SEQID NO :2的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、156、157、160、170、180、190、200 或
206個連續(xù)氨基酸，或者含有SEQ IDNO 2的全部氨基酸。重組MDA-7多肽可以是經(jīng)修飾的，或者是其末端之一被截短的。在本發(fā)明的某些實施方式中，MDA-7多肽含有SEQID NO :2的
49-206,75-206或100-206位的氨基酸。分泌型MDA-7多肽含有SEQ ID NO 2的49-206位的氨基酸，但前面48個氨基酸缺失，這種分泌形式的多肽被稱為“MDA-7多肽”，可用于本發(fā)明的任何組合物和方法中。另外，MDA-7氨基酸序列還可包含異源氨基酸序列，如分泌信號序列。在某些實施方式中，分泌信號序列是帶正電荷的N-末端區(qū)域，含有一個疏水核心。在另外的實施方案中，該分泌信號可引導(dǎo)MDA-7或其截短形式進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體。表達構(gòu)建物可以是病毒或非病毒載體。認為是本發(fā)明一部分的病毒載體包括，但不限于，腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、多瘤病毒或牛痘病毒?？捎帽景l(fā)明的方法和組合物治療的癌細胞包括來自膀胱、血、骨、骨髓、腦、乳房、結(jié)腸、食道、腸胃、牙銀、頭、腎、肝、肺、鼻咽、頸、卵巢、前列腺、皮膚、胃、睪丸、舌或子宮的細胞。此外，具體地癌癥可以是下列的組織類型，雖然不限于這些瘤，惡性 ’癌;癌，未分化的；巨大和紡錘形細胞癌；小細胞癌；乳頭狀癌；鱗狀細胞癌；淋巴上皮癌；基底細胞癌；毛母質(zhì)癌；轉(zhuǎn)化細胞癌；乳頭狀轉(zhuǎn)化細胞癌；腺癌；促胃液素瘤，惡性；膽管癌；肝細胞癌；組合肝細胞癌和膽管癌；小梁型腺癌；腺樣囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性結(jié)腸息肉??；實體癌；類癌腫瘤，惡性；腮-肺泡腺癌；乳頭狀腺癌；嫌色性癌；嗜酸性癌；嗜氧性腺癌；嗜堿性癌；透明細胞腺癌；粒細胞癌；濾泡狀腺癌；乳頭狀和濾泡狀腺癌；非包封硬化性癌；腎上腺皮質(zhì)癌；子宮內(nèi)膜樣癌；皮膚附屬癌；頂泌腺癌；皮質(zhì)性腺癌；耵聹腺癌；粘液表皮樣癌；囊腺癌；乳頭狀囊腺癌；乳頭狀衆(zhòng)液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印指環(huán)狀細胞癌；滲透導(dǎo)管癌；髓樣癌；小葉癌；炎性癌；佩吉特氏(paget' s)病，乳腺；腺泡細胞癌；腺鱗癌；腺癌《/鱗狀化生；胸腺瘤，惡性；卵巢基質(zhì)瘤，惡性；泡膜細胞瘤,惡性；粒層細胞瘤,惡性；睪丸足細胞瘤,惡性；足細胞癌；睪丸間質(zhì)細胞瘤,惡性；脂質(zhì)細胞瘤，惡性；副神經(jīng)節(jié)瘤,惡性；外乳腺副神經(jīng)節(jié)瘤,惡性；嗜鉻細胞瘤；血管球肉瘤 ’惡性黑素瘤；無黑色素性黑素瘤；表面?zhèn)鞑バ院谒亓?；巨大色素痣中的惡性黑素瘤；上皮樣細胞黑素瘤；藍痣,惡性；肉瘤；纖維肉瘤；纖維組織細胞瘤,惡性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；胚胎型橫紋肌肉瘤；肺泡橫紋肌肉瘤；基質(zhì)肉瘤；混合腫瘤，惡性；繆勒氏(mullerian)混合腫瘤；腎胚細胞瘤；肝胚細胞瘤；癌肉瘤；間質(zhì)瘤，惡性；布倫納氏(brenner)瘤，惡性；葉狀柄腫瘤，惡性；滑液肉瘤；間皮瘤,惡性；無性細胞瘤；胚胎型癌；畸胎瘤，惡性；卵巢甲狀腺腫瘤，惡性；絨毛膜癌；間質(zhì)腎瘤，惡性；血管肉瘤；血管內(nèi)皮瘤，惡性；卡波濟氏(kaposi’ s)肉瘤；血管外皮細胞瘤，惡性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮 質(zhì)旁骨肉瘤；軟骨肉瘤；成軟骨細胞瘤，惡性；間葉細胞軟骨肉瘤；骨巨大細胞瘤；尤文氏(ewing’ s)肉瘤；牙原性腫瘤，惡性；成釉細胞性牙瘤；成釉細胞瘤,惡性；成釉細胞性纖維肉瘤；松果體瘤,惡性；脊索瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤,惡性；室骨膜瘤；星細胞瘤；原漿性星細胞瘤；纖維型星細胞瘤；星形母細胞瘤；成膠質(zhì)細胞瘤；少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤；成少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤；原始神經(jīng)外胚層瘤；小腦肉瘤；成神經(jīng)節(jié)細胞瘤；成神經(jīng)細胞瘤；眼癌；嗅覺神經(jīng)性腫瘤；腦膜瘤,惡性；神經(jīng)纖維肉瘤；神經(jīng)鞘瘤,惡性；粒細胞腫瘤,惡性；惡性淋巴瘤；何杰金氏(hodgkin’ s)?。桓比庋磕[；惡性淋巴瘤，小淋巴細胞的；惡性淋巴瘤，大細胞，擴散；惡性淋巴瘤，濾泡，蕈樣真菌??；其它特定非何杰金氏淋巴瘤；惡性組織細胞增多??；多發(fā)骨髓瘤；肥大細胞肉瘤；免疫增生性小腸疾?。话籽。涣馨蜆影籽?；血漿細胞白血??；紅白細胞白血??；淋巴肉瘤細胞白血?。还撬铇影籽?；嗜堿性白血?。皇仁锛t細胞白血??；單核細胞性白血病；肥大細胞白血病；成巨核細胞白血??；髓樣肉瘤；和毛細胞白血病?？赏ㄟ^以下途徑將組合物給予細胞或?qū)ο箪o脈內(nèi)，皮內(nèi)，動脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，病灶內(nèi)，顱內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，前列腺內(nèi)，胸膜內(nèi)，氣管內(nèi)，鼻內(nèi)，玻璃體內(nèi)，陰道內(nèi)，直腸內(nèi)，表面，瘤內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下，結(jié)膜下，囊泡內(nèi)，粘膜，心包內(nèi)，臍內(nèi)，眼內(nèi)，口服，表面，局部，通過吸入(例如，氣霧劑吸入)，通過注射，通過灌輸，通過連續(xù)灌輸，通過局部灌注洗浴直接靶向細胞，通過導(dǎo)管，通過灌洗，在軟膏中，或在液體組合物中。本發(fā)明的其它方面內(nèi)容具有診斷性或預(yù)后性目的。本發(fā)明包括評價診斷為癌癥或懷疑有癌癥的對象癌癥進程的方法，該方法包括(a)獲得對象的樣品；(b)檢測過度增生組織樣品中的MDA-7表達；(c)檢測過度增生組織樣品中的iNOS表達；和(d)比較iNOS表達水平與MDA-7表達水平。如實施例所示，與MDA-7表達水平升高或處于正常細胞例如非黑素瘤皮膚細胞一般所見水平時的iNOS表達水平相比較，當(dāng)MDA-7表達較低或缺乏時iNOS的表達較高?？捎嬎憔唧w樣品中MDA-7表達水平和iNOS表達水平的相對比率，作為評價或診斷癌癥的一部分。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，可根據(jù)蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄水平來測定MDA-7或iNOS的表達。將該比率與獲自非癌癥細胞的標準品或?qū)φ兆鞅容^。此外，可用MDA-7相對iNOS的比率或水平來評價對癌癥治療的反應(yīng)。iNOS表達降低可作為治療的陽性指示。在有些實施方式中，可用于監(jiān)測MDA-7的治療效果。因此，測定對對象癌癥治療的反應(yīng)的方法包括(a)在以MDA-7治療之前和之后從對象取得樣品；和
(b)比較樣品中的iNOS表達水平。如上所述，以MDA-7治療可包括給予對象有效劑量的純化的活性MDA-7蛋白質(zhì)或包含受啟動子控制的編碼人MDA-7多肽的核酸序列的表達盒?？紤]該方法可用于多種癌癥，但在具體實施方式
中，應(yīng)用于黑素瘤，包括轉(zhuǎn)移性黑素瘤?？筛鶕?jù)患者面談或病歷、初步檢查結(jié)果或其它提示某患者可能患有癌癥或有患癌癥危險的指征/因素懷疑該患者患有癌癥。本發(fā)明還涉及治療卵巢癌患者的方法。本發(fā)明的某些實施方式涉及治療卵巢癌患者的方法，該方法包括給予患者有效劑量的藥學(xué)上可接受的含有MDA-7蛋白質(zhì)的組合物。例如，MDA-7蛋白質(zhì)可以是有活性并且至少80%均一的基本上純化的MDA-7蛋白質(zhì)。其它實施方式涉及治療患有卵巢腫瘤的患者的方法，該方法包括將有效劑量的藥學(xué)上可接受的組合物注射入腫瘤中的第一個位點,和注射入腫瘤中的第二個位點,該組合物包含i) MDA-7多肽或ii)含有受啟動子控制的編碼MDA-7的核酸的腺病毒載體。涉及腺病毒載體使用的 方法在整個說明書中都有討論。只要被論及，這些方法都可用于MDA-7組合物在卵巢癌治療中使用。本發(fā)明的其它實施方式包括治療腫瘤患者的方法，該方法包括給予患者有效劑量的藥學(xué)上可接受的含有誘導(dǎo)腫瘤中APC表達的物質(zhì)的組合物。本發(fā)明考慮能誘導(dǎo)腫瘤中APC表達的任何物質(zhì)。例如，該物質(zhì)可以是小分子、核酸或蛋白質(zhì)性質(zhì)的組合物。在某些實施方式中，該物質(zhì)是MDA-7、MDA-7多肽或含有編碼MDA-7多肽的核酸的表達構(gòu)建物。涉及表達構(gòu)建物使用的方法在整個說明書中都有討論。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這方面可用的表達構(gòu)建物和方法學(xué)的范圍。本發(fā)明考慮使用給予誘導(dǎo)APC表達的物質(zhì)的任何方法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉將該物質(zhì)遞送給患者的可用方法的范圍。例如，可靜脈內(nèi)、瘤內(nèi)或口服給予該物質(zhì)。在本發(fā)明有些實施方式中，還將該組合物定義為可降低腫瘤中β_連環(huán)蛋白表達的組合物。測定腫瘤中連環(huán)蛋白表達的方法包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何方法。這些方法的實施例在本說明書其它地方討論。在本發(fā)明的有些實施方式中，該組合物降低對象中連環(huán)蛋白的表達。例如，β-連環(huán)蛋白表達的降低可發(fā)生在對象的腫瘤中。本發(fā)明其它實施方式包括篩選抗癌化合物的方法，該方法包括(I)使候選藥物與第一種癌細胞接觸；(2)測定第一種癌細胞中APC的表達；和(3)比較第一種癌細胞和沒有接觸該候選藥物的第二種癌細胞中APC的表達，其中若第一種癌細胞中APC表達增加，確認該候選藥物為候選抗癌化合物。這些方法可以包括或不包括測定第一和第二種癌細胞中連環(huán)蛋白的表達并確定與第二個癌細胞相比較，第一種癌細胞中連環(huán)蛋白的表達是否降低。涉及測定連環(huán)蛋白表達的步驟可以獨立或不獨立于涉及APC測定的步驟。本發(fā)明考慮任何候選藥物，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉可用候選藥物類型的廣泛范圍。例如，候選藥物可以是小分子、核酸或蛋白質(zhì)性質(zhì)的組合物，可包括連環(huán)蛋白核糖核酸酶，siRNA,或反義分子。本發(fā)明還包括含有SEQ ID NO 2 175-206位氨基酸的多肽以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列。本說明書其它地方提供了 SEQ ID NO :2的氨基酸序列。具體考慮包括SEQ ID NO 2 175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，和 206 位氨基酸殘基的多肽?？紤] SEQID NO 2 175-206位的氨基酸是連續(xù)的氨基酸殘基。在本發(fā)明的其它實施方式中，該多肽包含SEQ ID NO :2150_206位的氨基酸以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列。在另外的實施方式中，該多肽包含SEQ ID NO :2100-206位的氨基酸以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)靶向序列。在另外的實施方式中，該多肽包含SEQID NO :249-206位的氨基酸以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列。在每一種這些實施方式中，考慮SEQ ID NO :2的氨基酸是連續(xù)的氨基酸殘基。在本發(fā)明的有些實施方式中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列可操作性連接于截短的MDA-7多肽的N末端部分。本文所述的和本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列認為是本發(fā)明MDA-7多肽組成的一方面。本發(fā)明的實施方式可以或可以不包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號。本發(fā)明還考慮包含上述的編碼MDA-7序列的核酸以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列的表達盒。整個說明書都有表達盒的討論，討論表達盒的說明書部分也適用于包含編碼SEQ ID N02氨基酸的核酸的表達盒。此外,本發(fā)明涉及治療癌癥患者的方法,該方法包括給予患者有效劑量的藥學(xué)上可接受的含有MDA-7蛋白質(zhì)和一種或多種選自IL-2，IL-7，和IL-15的白細胞介素的組合物。而且，認為在本發(fā)明的任何方法中可將MDA-7與其它白細胞介素組合使用。已證明某些白細胞介素具有細胞因子活性。這些白細胞介素的例子包括IL-19，IL-20，IL-22，和IL-26。認為在本發(fā)明涉及抑制新生血管形成和刺激免疫應(yīng)答反應(yīng)的方法中，這些具有細胞因子活性的白細胞介素可替代MDA-7。本發(fā)明還涉及抑制或預(yù)防患者中的癌癥局部侵襲和/或轉(zhuǎn)移的方法，包括給予該患者有效劑量的藥學(xué)上可接受的含有MDA-7蛋白質(zhì)的組合物，其中MDA-7抑制或預(yù)防癌癥的局部侵襲和/或轉(zhuǎn)移。本發(fā)明考慮本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的任何給藥方法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員有能力測定癌癥的局部侵襲和/或轉(zhuǎn)移是否被預(yù)防或抑制了。本發(fā)明考慮抑制或預(yù)防任何類型原發(fā)癌的局部侵襲和/或轉(zhuǎn)移的方法。例如，該原發(fā)癌可以是黑素瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺癌、肝癌、成視網(wǎng)膜細胞瘤、星狀細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、牙齦、舌、白血病、成神經(jīng)細胞瘤、頭、頸、乳房、胰腺、前列腺、腎、骨、睪丸、卵巢、間皮瘤、頸部、腸胃道、淋巴瘤、腦、結(jié)腸，或膀胱癌。在本發(fā)明的某些實施方式中，該原發(fā)癌是肺癌。例如，該肺癌可以是非小細胞肺癌。此外，本發(fā)明可用于預(yù)防癌癥或治療初期癌或惡變前的細胞，包括化生、發(fā)育異?；蛟錾?。本發(fā)明也可用于抑制不希望的但是良性的細胞，例如鱗狀化生、發(fā)育異常、良性前列腺增生細胞、增生性病損等。如本文所述的，通過給予本發(fā)明的包含MDA-7多肽以及含MDA-7編碼核酸的構(gòu)建物的方法可阻止、破壞或延遲它們發(fā)展成為癌癥或更嚴重的癌癥形式。任何制備或配制MDA-7的方法都包括在本發(fā)明的方法中。在某些實施方式中，按照本發(fā)明上述小結(jié)的任何方法純化MDA-7。例如，可通過上述的方法將MDA-7從細胞中純化到至少20%均一，其中將含有MDA-7蛋白質(zhì)的細胞提取物或上清進行親和層析，將MDA-7純化到至少20%均一并有活性。
本發(fā)明的其它方面包括抑制或預(yù)防患者中癌癥局部侵襲和/或轉(zhuǎn)移的方法，包括給予該患者有效劑量的藥學(xué)上可接受的含有編碼MDA-7多肽的寡核苷酸的組合物，其中MDA-7多肽抑制或預(yù)防癌癥的局部侵襲和/或轉(zhuǎn)移。在某些實施方式中，該編碼MDA-7多肽的寡核苷酸包括在表達構(gòu)建物中。例如，該表達構(gòu)建物可包含含有受啟動子控制的編碼MDA-7多肽的核酸的腺病毒載體。本發(fā)明還包括其它方法例如治療顯微殘留癌細胞的方法，該方法包括下面步驟，鑒定患有可切除腫瘤的患者，切除該腫瘤，使瘤床接觸MDA-7蛋白質(zhì)或含有在真核細胞中有功能的啟動子和編碼MDA-7多肽的多聚核苷酸的表達載體，其中所述多聚核苷酸受啟動子的轉(zhuǎn)錄控制。本發(fā)明的其它方法是治療患有癌癥對象的方法，該方法包括下面步驟手術(shù)暴露腫瘤并使腫瘤接觸MDA-7多肽或含有在真核細胞中有功能的啟動子和編碼MDA-7多肽的多聚核苷酸的表達載體，其中所述多聚核苷酸受啟動子的轉(zhuǎn)錄控制?；蛘?，給予MDA-7多肽或MDA-7編碼核酸后，切除所有或部分腫瘤。這種輔助治療形式也認為是本發(fā)明的一部分。 本發(fā)明還包括治療患有癌癥對象的其它方法，該方法包括下面步驟以MDA-7多肽或含有在真核細胞中有功能的啟動子和編碼MDA-7多肽的多聚核苷酸的表達載體(其中該寡聚核苷酸受啟動子的轉(zhuǎn)錄控制)灌注腫瘤一段延長的時間。采用MDA-7作為輔助治療也認為是本發(fā)明的一部分。該輔助治療可以和一種或多種其它癌癥治療聯(lián)合使用，其它癌癥治療包括，但不限于，手術(shù)、化療、放療、免疫治療，或基因治療。實施例包括手術(shù)和化療；手術(shù)和放射；手術(shù)和免疫治療；放射和化療；放射和免疫治療；化療和免疫治療；手術(shù)、放射和化療；手術(shù)、化療和免疫治療的聯(lián)合等。此外，化療治療可包括一種以上的化療療法。在本發(fā)明的有些實施例中，可將MDA-7(多肽或編碼核酸)與脫乙酰基紫杉醇(taxotere)、Herceptin和Aa_mda7 —起使用。例如這樣使用對治療例如乳腺癌非常有效。如上所述，Aa_mda7也認為可與它莫西芬一起使用。還提供治療復(fù)發(fā)性癌癥對象的方法，包括(a)選擇患者，根據(jù)(i)曾經(jīng)手術(shù)或放療或化療或免疫療法治療過癌癥；和(ii)治療后癌癥復(fù)發(fā)，和(b)給予該患者MDA-7多肽或含編碼MDA-7多肽的核酸區(qū)段的表達構(gòu)建物，該區(qū)段受在該患者癌細胞中有活性的啟動子的控制，該表達構(gòu)建物在癌細胞中表達MDA-7。隨步驟(b)的后續(xù)步驟(c)給予該患者第二次放療或化療或免疫治療期，從而MDA-7使癌細胞對所述第二次放療或化療或免疫治療敏感，因此也提供了癌癥治療。第一次癌癥治療和第二次癌癥治療可以相同或不同?；颊呖梢允欠侨藙游铮蛉嘶颊?。第一次和/或第二次放療或化療可以是化療，例如白消安、苯丁酸氮芥、順鉬(CDDP)、環(huán)磷酰胺、氮烯唑胺、異環(huán)磷酰胺、氮芥、美法侖、5-FU、Ara-C、氟達拉濱(fIudarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、氨甲蝶呤、阿霉素、博來霉素、放線菌素D、紅比霉素、去甲基毛霉素(idarubicin)、絲裂霉素C、多西紫杉(docetaxel)、紫杉醇、依托泊苷、紫杉醇(paclitaxel)、長春堿、長春新堿、長春烯堿(vinorelbine)、喜樹堿、亞硝脲氮芥或環(huán)己亞硝脲。第一次和/或第二次放療或化療可以是放療，例如X-射線，Y射線，或微波。第一次和/或第二次放療或化療可以特征性所述為DNA損傷治療。免疫治療可包括用革巴向特定蛋白質(zhì)的單克隆抗體例如herceptin(trastuzumab), rituxan(rituximab),Erbitux(cetuximab), ABX-EGF, bexxar, zevalin, oncolym, Mylotarg, LymphoCide, 或Alemtuzumab 來治療。治療的癌癥可以是腦癌、頭頸癌、食道癌、氣管癌、肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、前列腺癌、睪丸癌、皮膚癌、直腸癌、淋巴癌或白血病。所述該表達構(gòu)建物可以是病毒表達構(gòu)建物，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建物、皰疹病毒構(gòu)建物、腺病毒構(gòu)建物、腺病毒相關(guān)病毒構(gòu)建物或牛痘病毒構(gòu)建物。病毒表達構(gòu)建物可以是可復(fù)制型病毒或腺病毒，或復(fù)制缺陷型病毒或腺病毒?；蛘?，表達構(gòu)建物可以是非病毒表達構(gòu)建物，例如包含在脂質(zhì)運載體中的表達構(gòu)建物。所述啟動子可以是CMV IE,RSV LTR, β-肌動蛋白，Ad-El，Ad-E2或Ad-MLP。也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其它基因治療載體和啟動子。步驟(b)和(C)之間的時間段可以是約24小時，約2天，約3天，約7天，約14天，約I月，約2月，約3月，或約6月。復(fù)發(fā)可以是在原發(fā)癌位點或轉(zhuǎn)移位點的復(fù)發(fā)。該對象可在步驟(b)之前已接受過手術(shù)切除，和/或該方法還可包括在步驟(C)之后進行手術(shù)切 除。步驟(b)中給藥可以是瘤內(nèi)或腫瘤脈管系統(tǒng)，腫瘤局部，腫瘤區(qū)域，或全身給藥。步驟
(c)中給藥可以是瘤內(nèi)或腫瘤脈管系統(tǒng)，腫瘤局部，腫瘤區(qū)域，或全身給藥。本發(fā)明還包括誘導(dǎo)抗MDA-7免疫應(yīng)答反應(yīng)的方法和組合物。因此，在本發(fā)明的有些實施方式中，將MDA-7多肽或編碼MDA-7多肽的核酸的全部或部分作為疫苗提供給對象。可用該疫苗預(yù)防或治療涉及MDA-7的任何病癥或疾病，包括癌癥。本發(fā)明的方法和組合物還包括采用抗MDA-7抗體，尤其是中和MDA-7活性的抗體，抗MDA-7抗體包括抑制MDA-7與其受體(例如IL-20R和IL-22R)結(jié)合的抗體?？捎脝慰寺『投嗫寺】贵w及其人源化形式來治療炎性疾病，自身免疫疾病和病癥，包括牛皮癬、炎性大腸病(IBD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和狼瘡。本發(fā)明方法包括給予患者有效劑量的MDA-7抗體(也稱為抗-MDA-7抗體)從而達到治療效益的治療方法。治療效益包括，但不限于，癥狀數(shù)目降低或癥狀嚴重性降低，誘導(dǎo)了緩解，炎癥或炎癥特征降低，痛苦減少。對本發(fā)明一個實施方式所述的任何限制可適用于本發(fā)明的其它實施方式。此外，可用本發(fā)明的任何方法來生產(chǎn)或利用本發(fā)明的任何組合物。雖然本說明書支持“或”的定義只指或者和“和/或”，但除非另有明確的說明，“或”只指或者或可選物是相互排斥的，權(quán)利要求書中的術(shù)語“或”用于表示“和/或”。在整個本申請中，術(shù)語“約”用于表示某數(shù)值包含測定該數(shù)值的裝置和/或方法所產(chǎn)生的標準誤差。除非有明確的說明，本說明書中所用的“一個”或“一種”可以指一個或多個。如本文權(quán)利要求書中所用，當(dāng)“一個”或“一種”與單詞“含有”連用時，可以指一個，也可以指一個以上。本文所用的“另一個”至少是指第二個或更多個。


下面的附圖構(gòu)成本說明書的一部分，用于顯示本發(fā)明的特定方面。通過參考這些附圖中的一個或多個結(jié)合本文特定實施方式的詳細所述可以更好地理解本發(fā)明。圖1A-D. sMDA-7體外抑制內(nèi)皮細胞分化但不抑制增殖。將HUVEC和HMVEC血清饑餓24小時，置于含lng/ml bFGF和所示濃度sMDA_7的2孔室載玻片中(A)。以PBS和血管抑素處理的細胞分別作為陰性和陽性對照。如實施例I所示72小時后檢測增殖(B)，在所示濃度sDMA-7處理的2孔室載玻片中接種肺腫瘤細胞(Hl299和A549)。以PBS和Ad_mda7處理的細胞分別作為陰性和陽性對照。如實施例I所示72小時后檢測增殖。在以PBS，sMDA-7 (50ng/ml)或sMDA_7的免疫耗竭制品處理的包被基質(zhì)膠的96孔板中接種HUVEC并觀察管的形成(C)。所有處理都設(shè)雙復(fù)孔。sMDA-7完全消除了內(nèi)皮微管的形成，而與用PBS處理的對照細胞中看到的相似，sMDA-7蛋白質(zhì)的免疫耗竭導(dǎo)致微管形成恢復(fù)。放大，XlO倍。半定量分析SMDA-7/IL-24處理的HUVEC和HMVEC中的內(nèi)皮微管數(shù)目，顯示在兩種細胞型中sMDA-7都顯著(P = O. 001)抑制微管形成(C)。豎條，標準差。圖2. sMDA-7比內(nèi)皮抑素更有效抑制體外內(nèi)皮細胞分化。將HUVEC接種于包被基質(zhì)膠的含有l(wèi)ng/ml bFGF和所示等摩爾濃度sMDA_7和內(nèi)皮抑素的96孔板中。處理后24小時在顯微鏡下觀察板中的微管形成并計數(shù)微管數(shù)目。PBS處理的細胞作為陰性對照。所有處理都設(shè)雙復(fù)孔。實驗重復(fù)5-6次。sMDA-7而非內(nèi)皮抑素以劑量依賴方式顯著(P =O. 001)抑制內(nèi)皮微管形成，在高于10ng/ml濃度時完全消除了內(nèi)皮微管形成。只在最高濃度(300ng/ml)時觀察到內(nèi)皮抑素對微管形成的抑制。數(shù)值為3次實驗的 平均值。豎條，標準差。圖3. sMDA-7抑制內(nèi)皮細胞遷移。將HUVEC在O. 5% FBS中饑餓過夜，接種到24孔穿孔插片(transwell insert)的上室中置于含有 100ng/ml VEGF和 10ng/ml sMDA-7 的 24孔板中。在高倍顯微鏡下計數(shù)遷移到孔下室的細胞。24小時內(nèi)，與只用VEGF處理的細胞相t匕，SMDA-7顯著(P = O. 001)抑制了 VEGF誘導(dǎo)的HUVEC遷移。PBS處理的細胞作為陰性對照。圖4A-D. MDA-7的抑制活性并非由于HUVEC產(chǎn)生的IFN_y和IP-IO所致。以sMDA_7/IL-24(10ng/ml)處理接種于6孔板中的HUVEC。在所示時間點收集細胞培養(yǎng)上清并通過ELISA分析IFN- Y⑷和IP-IO⑶。以IFN- y orAd_mda7處理的HUVEC的上清分別作為IP-IO和IFN- Y ELISA的陽性對照。PBS處理的細胞的上清作為陰性對照。所有處理都設(shè)雙復(fù)孔。(C)，以等摩爾濃度的sMDA-7，IFN- Y或IP-IO處理接種于基質(zhì)膠包被的96孔板中的HUVEC并分析微管的形成。通過計數(shù)微管數(shù)目測定抑制活性。與IFN-Y或IP-IO相比，sMDA7在低濃度顯著(P = O. 01)抑制微管形成。IFN-γ或IP-IO抑制活性只在高濃度才觀察到。(C).通過計數(shù)微管數(shù)目測定抑制活性。與IFN-Y或IP-IO相比，sMDA7在低濃度顯著(P = O. 01)抑制管的形成。IFN-γ或IP-IO抑制活性只在高濃度才觀察得到。(D)，將以抗-IP-IO或抗-IFN- Y中和抗體預(yù)處理的HUVEC接種于基質(zhì)膠包被的96孔板中，以sMDA-7處理，分析微管形成。sMDA-7顯著抑制了微管形成(P = O. 001)豎條，標準差。圖5. sMDA-7通過IL-22R1抑制內(nèi)皮細胞分化。在接種于含有PBS或所示濃度的sMDA-7、內(nèi)皮抑素或IP-IO的基質(zhì)膠包被的96孔板中之前，以兩種不同濃度的IL-22R1阻抑抗體處理或不處理HUVEC 24小時。第二天，在明視野顯微鏡下檢查細胞中管的形成并定量。以SMDA-7/IL-24處理的HUVEC微管形成受到了抑制但PBS處理的對照細胞未受抑制(A)。然而，存在IL-22R1阻抑抗體時，sMDA-7對HUVEC微管形成的抑制作用以劑量依賴的方式被消除。內(nèi)皮抑素或IP-IO抑制了用IL-22R1抗體預(yù)處理HUVEC的微管形成(B)。豎條，標準差。圖6A-E.新生血管形成和腫瘤生長的體外研究。將包裹在含有60ng bFGF的基質(zhì)膠中的sMDA-7 (12. 5ng)皮下植入無胸腺裸鼠。只含有bFGF的基質(zhì)膠作為陽性對照，含有PBS的基質(zhì)膠作為陰性對照。10天后，收獲基質(zhì)膠，如實施例I所述分析血紅素水平。與對照相比，在含有SMDA-7/IL-24的基質(zhì)膠中觀察到血紅素水平顯著(P = O. 0001)下降(A)。測量了裸鼠中植入A549腫瘤細胞和親代293細胞或293-mda_7細胞的等量(I I)混合物所長出的皮下腫瘤(B)。與含有親代293細胞的腫瘤相比，觀察到含有293-mda-7細胞的腫瘤生長顯著抑制(P = 0.001) (B)。各時間點代表各組的平均腫瘤體積。豎條代表標準差。用western印跡分析檢測含有293-mda_7細胞的腫瘤組織中MDA-7蛋白質(zhì)表達,與含有親代293細胞的腫瘤比較。在實驗結(jié)束時，收獲腫瘤并分析。與含有親代293細胞的動物腫瘤樣品比較，含有293-mda-7細胞的動物腫瘤樣品中的血紅素水平較低(C)。通過在右下腹注射A549腫瘤細胞建立皮下腫瘤(D)。當(dāng)腫瘤可觸知時，以基質(zhì)膠包裹的親代293細胞或基質(zhì)膠包裹的293-mda-7細胞植入每只小鼠右上腹。用卡尺測量腫瘤生長。與以293細胞處理的腫瘤相比，以293-mda-7細胞處理的腫瘤生長抑制更明顯(P = O. 001)。各時間點代表各組的平均腫瘤體積。豎條代表標準差。對腫瘤組織CD31染色的半定量分析顯 示了，與以親代293細胞處理的腫瘤相比，以293-mda-7處理的腫瘤中微管密度的顯著降低(E) ο豎條，標準差。圖7.劑量遞升的I期臨床試驗研究設(shè)計，其中mda-7通過瘤內(nèi)注射給予晚期癌癥患者，采用非復(fù)制型的腺病毒構(gòu)建物(Ad-mda7)。試驗設(shè)計表明每組患者的數(shù)目、病毒的劑量和活組織檢查的時間。圖8.直方圖表明DNA拷貝數(shù)/μ g DNA和瘤內(nèi)注射后小時數(shù)。在注射24小時內(nèi)，MDA-7蛋白質(zhì)表達呈劑量依賴性升高，在96小時時下降。圖9.患者結(jié)果圖表表明通過TUNEL染色顯示凋亡在病灶中心最強烈。病灶外圍切片顯示與未注射病灶相比TUNEL反應(yīng)強烈。圖10.圖示對Ad_mda7誘導(dǎo)的血清細胞因子反應(yīng)動力學(xué)，結(jié)果用血清細胞因子升高百分率對注射后的天數(shù)表示。結(jié)果表明瘤內(nèi)注射Ad-mda7后血清細胞因子出現(xiàn)瞬時升聞。圖11.每組瘤內(nèi)注射Ad_mda7所產(chǎn)生的血清細胞因子反應(yīng)。大多數(shù)患者出現(xiàn)全身細胞因子(IL-6，IL-10, IFN y , TNF α，GM-CSF)的瞬時升高。圖12.接受瘤內(nèi)注射Ad_mda7的患者⑶8+T細胞百分率增加的水平。在mda7處理后15天CD3+CD8+T細胞增加了 30 ±13%。圖13.瘤內(nèi)注射Ad_mda7后患者外周血⑶8+細胞增加。圖14. MDA-7的一步陰離子交換純化。在western印跡中用多克隆抗_MDA_7抗體檢測陰離子交換柱的每個MDA-7峰(1，2，3，4)。圖15.保留時間與分子質(zhì)量的比較。MDA-7復(fù)合物在85_95kDa洗脫。圖16. MDA-7過表達抑制細胞增殖。以PBS、Ad_luc或Ad_mda7處理腫瘤細胞(DU145，LNCaPjPPC-3)和正常細胞s (PrEC)并分析不同時間點的MDA-7表達或細胞活力。測定用PBS、Ad-luc或Ad-mda7處理后腫瘤或正常細胞的增殖。數(shù)值代表三次重復(fù)的平均值。統(tǒng)計學(xué)顯著性設(shè)為P = < O. 05。差錯條代表標準差(SE)。圖17.MDA-7的表達在腫瘤細胞中但不在正常細胞中誘導(dǎo)凋亡。處理后72h收獲以PBS、Ad-Iuc或Ad-mda7處理的腫瘤細胞(DU 145，LNCaP，和PC-3)以及正常內(nèi)皮細胞(PrEC)并以流式細胞計量術(shù)分析處于sub-GO/Gl期的細胞。每種處理停滯2萬個細胞。數(shù)據(jù)顯示為柱狀圖。數(shù)值為三次重復(fù)的平均值。差錯條代表標準差(SE)。圖18. MDA-7導(dǎo)致細胞周期停滯于G2期。以PBS、Ad-Iuc或Ad_mda7處理腫瘤細胞(DU 145，LNCaP，和PC-3)以及正常細胞(PrEC)。處理后72h收獲細胞并以流式細胞計量術(shù)進行細胞周期分析。每種處理停滯2萬個細胞，數(shù)據(jù)顯示為柱狀圖。數(shù)值為三次試驗的平均值。差錯條代表標準差(SE)。圖19A-D.根據(jù)克隆存活試驗測定Ad_mda7引起的放射致敏。用于Ad_mda7和Ad-Iuc的載體濃度對于A549細胞系為ΙΟΟΟνρ/細胞(A);對于H1299細胞系為250 (B)，對于CXD-16(C)和MRC-9細胞系(D)為1500。轉(zhuǎn)染后48小時進行照射。每個數(shù)據(jù)代表三次獨立試驗的平均值。符號代表模擬感染(實心菱形)；Ad_mda7,(實心正方形)；Ad_luc,(實心二角形)。豎條標準差。圖20A-D.通過對 A549 ⑷，H1299 ⑶，CCD-16 (C)和 MRC-9 (D)細胞的 TUNEL 試驗 評估凋亡。轉(zhuǎn)染后48小時照射細胞，照射后兩天或轉(zhuǎn)染后4天收獲細胞。所用載體濃度與圖19所用相同。每個數(shù)據(jù)代表兩次獨立試驗的平均值。豎條標準差。圖21.以 Ad_mda7 或喔氛酷咕唑(Nocodazole) (200ng/ml)處理的 A549 和 H1299的細胞周期分析。噻氨酯噠唑的劑量和暴露時間積累的G2/M期細胞的比例與預(yù)試驗中測定的Ad-mda7轉(zhuǎn)染后48小時相同。所示數(shù)據(jù)代表兩次獨立的試驗。圖22.克隆存活試驗測定噻氨酯噠唑(200ng/ml)誘導(dǎo)的G2/M停滯引起的放射致敏。A549細胞系暴露噻氨酯噠唑后4小時進行照射，H1299細胞系暴露噻氨酯噠唑后3. 5小時進行照射。符號代表只輻射(實心菱形)；噻氨酯噠唑，(空心正方形)豎條標準差。圖23.克隆存活試驗測定姜黃素或姜黃素加Ad-mda7處理的A549和H1299細胞對放射線的敏感性。轉(zhuǎn)染2天后進行照射。轉(zhuǎn)染I天后添加姜黃素。所用載體濃度與圖19所用相同。每個數(shù)據(jù)代表三次獨立試驗的平均值。豎條標準差。圖24. rhMDA-7蛋白質(zhì)殺傷黑素瘤細胞。以0_20ng/ml rhMDA-7處理MeWo細胞，4天后用臺盼藍測定活力。也在抗-MDA-7抗體(兔多克隆Pab或鼠單克隆Mab)或?qū)φ杖薎gG存在時以20ng/ml rhMDA-7處理細胞。圖25A-25B.黑素瘤MDA-7的表達與腫瘤iNOS表達負相關(guān)。iNOS計數(shù)和MDA-7計數(shù)平均值之間呈負相關(guān)(A)。Kendall τ -b相關(guān)性系數(shù)是-O. 209，以P < O. 05顯著區(qū)別于O。iNOS密度和MDA-7密度平均值之間呈負相關(guān)(B)。Kendall τ -b相關(guān)性系數(shù)是-O. 201，P < O. 05顯著區(qū)別于O ;豎條，土標準差。圖26.以rhMDA-7處理人黑素瘤細胞系MeWo 4h后IRF-I和IRF-2的免疫印跡分析。處理包括只有培養(yǎng)基(泳道1，陰性對照);未轉(zhuǎn)染HEK 293細胞上清(泳道2，陰性對照)；5ng/ml rhMDA-7 (泳道 3);和 20ng/ml rhMDA-7 (泳道 4)。膜用抗-IRFl 和 IRF-2 抗體(I 2000稀釋液)免疫印染。所示為一個代表性試驗。圖表顯示以肌動蛋白標準化后細胞溶解物中的IRF-I和IRF-2表達，代表兩次試驗的平均值；豎條，土標準差。圖27. Ad-mda7增強了它莫西芬的抗腫瘤效應(yīng)。圖28. Ad-mda7和MDA-7蛋白質(zhì)調(diào)控了黑素瘤細胞的細胞因子分泌。圖29. Ad-mda7對A549肺轉(zhuǎn)移的作用圖30.以腺病毒載體強效轉(zhuǎn)導(dǎo)PACl細胞。用50或IOOpfu/細胞的Ad-SM22- β -gal (Ad_SM22)或 Ad-RSV-β -gal (Ad-RSV)以所示 MOIs 轉(zhuǎn)導(dǎo)人 H1299 肺癌或PACl細胞。24小時后，將細胞染色檢測β-gal活性并計數(shù)X-gal陽性細胞。所示數(shù)據(jù)為三次計數(shù)的平均植。圖31.MDA-7 抑制 PACl 細胞生長。用 Ad_mda7 或 Ad-Iuc 以所示 MOI 轉(zhuǎn)導(dǎo) PAC1SMC。轉(zhuǎn)導(dǎo)3天后手工計數(shù)一式三份的存活細胞。數(shù)據(jù)表示為平均值土標準差。與對照病毒(Ad-Iuc)比較 P < O. 05 (*) ο圖32A-C. Ad-mda7 凋亡 PACl 誘導(dǎo)。A. Ad_mda7 提高胱冬酶 _3 (caspase3)的活性。用Ad-mda7或Ad-Iuc以100M0I轉(zhuǎn)導(dǎo)PACl細胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時，一組細胞裂解物用于胱冬酶-3活性測定，另一組用于總蛋白質(zhì)定量。胱冬酶-3活性以總蛋白質(zhì)標準化，表示為單位/10 μ g總蛋白質(zhì)。與對照病毒(Ad-Iuc)和未處理對照比較P < O. 05 O) (A)。膜聯(lián)蛋V結(jié)合試驗。用Ad_mda7或Ad-luc以100
MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)PACl細胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)后24小時以FITC標記的膜聯(lián)蛋白V染色。用流式細胞計量術(shù)分析處理的細胞(B)。用Modfit軟件分析早期凋亡細胞百分比。與對照病毒(Ad-Iuc)比較P < O. 05⑷。DAPI染色試驗(C)。用Ad-mda7或Ad-Iuc以100M0I轉(zhuǎn)導(dǎo)PACl細胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)后24、48、72小時以DAPI染色，如果細胞核顯示出染色質(zhì)解凝聚則該凋亡的細胞核計數(shù)為陽性。與對照病毒(Ad-Iuc)比較P < O. 05(*)。圖33. Ad-mda7抑制PACl細胞遷移。以100M0I的Ad_mda7或Ad-Iuc轉(zhuǎn)導(dǎo)匯合的PACl并如實施例22所述處理。直方圖顯示顯微鏡觀察到的向傷害部位遷移的細胞定量計數(shù)。對于+FBS 和-FBS，p<0. 01 ⑷；對于 Ad_mda7 和未處理的或 Ad_luc+FBS，p < O. 01(*)；對于 Ad-mda7 和未處理的或 Ad-luc-FBS, p < O. 05 ( Λ )。圖34. INGN 241生物作用的時間過程和劑量反應(yīng)。在INGN 241的臨床試驗中顯示了 6個不同組的時間過程和劑量。圖35. MDA-7蛋白質(zhì)表達與凋亡誘導(dǎo)相關(guān)。測定了 MDA-7蛋白質(zhì)水平，對10個不同患者的切片進行了 tunel試驗。圖36.評價了患有黑色素細胞瘤患者4的不同腫瘤部位的MDA-7RNA，DNA和蛋白質(zhì)表達水平。圖37.評價了 10個患者MDA-7DNA和RNA從注射位點的擴散。圖38.評價了一些患者不同部位的MDA-7蛋白質(zhì)水平和凋亡程度。圖39.用TUNEL試驗評價了 MDA-7表達的擴散及與凋亡水平的相關(guān)性。圖40.評價了注射點MDA-7DNA (變化)的時間過程。圖41.評價了注射點MDA-7蛋白質(zhì)和凋亡水平(變化)的時間過程。圖42. II期臨床試驗初步結(jié)果。圖43.以 2000vp/ 細胞 Ad_mda7 和 Ad-luc 處理 AsPcI，Capan2 和 MiaPaCa2 胰腺癌細胞72小時，用臺盼藍分析其活力，用膜聯(lián)蛋白V染色分析凋亡。數(shù)據(jù)顯示為平均值+標準差(SD)。圖44.以Ad_mda7或?qū)φ仗幚鞰iaPaCa2細胞，照射40小時后接種進行克隆試驗。圖45.以2000vp/細胞Ad-Iuc或Ad-mda7處理AsPcl和MiaPaCa胰腺癌系細胞，24小時后再用XRT (5Gy)處理。第三天用碘化丙錠處理和以FACS分析評價細胞周期變化。圖46. Ad-mda7激活NF- κ B依賴的報告基因表達。圖47. Ad_mda7在顯性失活Ι_κ Ba穩(wěn)定細胞中的細胞毒作用。
圖48. Ad-mda7顯著抑制顯性失活I(lǐng)- κ B α細胞的生長。圖49A-C. Ad-mda7與蘇靈大(蘇靈大)協(xié)同誘導(dǎo)凋亡。A.只以Ad_mda7以及與蘇靈大聯(lián)合處理細胞的凋亡率。B.以PBS，Ad-luc，或Ad-mda7處理腫瘤(A549 and H1299)和正常(CXD-16)細胞3h。處理后，細胞與所示濃度的蘇靈大一起孵育。72h后，用臺盼藍排斥試驗測定細胞活力。細胞生長百分數(shù)計數(shù)為每組細胞數(shù)的平均值，表示為以PBS，Ad-luc,或只以Ad-mda7處理(設(shè)為100% )的各組的相對值。與PBS和Ad-Iuc處理比較，以Ad-mda7/蘇靈大處理的腫瘤而非正常細胞受到了顯著抑制(P = O. 001)。蘇靈大介導(dǎo)的抑制作用是劑量依賴的。豎條，標準差。C.通過FACS分析凋亡細胞。在各種劑量蘇靈大存在時，以PBS，Ad-luc，或Ad-mda7處理腫瘤細胞(A549 and H1299)和正常(CCD-16)細胞。處理后72h，以碘化丙錠將細胞染色，并進行FACS分析。通過定量處于sub-Gl期的細胞來測定凋亡細胞的百分數(shù)。表示為一式兩份樣品的平均值；在至少兩次獨立的試驗中觀察到相似結(jié)果。豎條，標準差。D.將帶有皮下H1299腫瘤的裸鼠分組(η = 8/組)。與以PBS，蘇靈大，Ad-mda7,或Ad-Iuc/蘇靈大處理的動物比較，以Ad_mda7/蘇靈大處理的動物顯示 出顯著的腫瘤生長抑制。過瘤內(nèi)注射一周三次給予Ad-mda7(3xl09vp),通過i. p.注射每天給予蘇靈大(40mg/kg)。給出的腫瘤體積代表每個時間點每組的平均值。豎條，標準差。圖50.通過以Ad-GFP感染細胞測定5個卵巢癌細胞系(MDAH2774，OVCAR 420, DOV13，HEY，和SK0V3-ip)的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。圖51.以Ad-mda-7感染后抑制了卵巢癌細胞系MDAH 2774和OVCA 420的細胞增殖。圖52.流式細胞計量術(shù)分析表明，5個卵巢癌細胞系中有兩個，MDAH2774和OVCA420，顯示了顯著的生長抑制，其G2/M群體百分數(shù)有顯著增加。圖53. MDA-MB-486乳腺癌細胞的存活。圖54.放射處理前給予Ad_mda7對A549腫瘤生長㈧和小鼠存活的效果⑶。A549細胞(5xl06)作為異種移植腫瘤在裸鼠中生長。以放射(5Gy)，Ad-mda7(三組分中為3xl010vp)或這兩種的組合處理荷瘤小鼠。如實施例27所述測定腫瘤體積，當(dāng)腫瘤達到直徑15mm或發(fā)生潰爛時處死動物。數(shù)據(jù)表示為平均值土標準差(A)。圖55.不同聯(lián)合治療方案對A549腫瘤生長的效果。對荷瘤小鼠按如下處理對照，Ad-mda7(第I天)加照射(第6天)，Ad_mda7 (第5天)加照射(第6天)或照射(第6天)加Ad-mda7 (第7天)。圖56. TUNEL的免疫組化分析。用TUNEL染色測定處理后(第8天)腫瘤中的凋亡，在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)凋亡細胞(X 400倍)，凋亡指數(shù)計為至少1000個癌細胞中的凋亡百分數(shù)。圖57.通過免疫組化陽性染色分析VEGF，bFGF和IL-8蛋白質(zhì)表達。第14天收獲皮下腫瘤。在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)陽性染色細胞(X 400倍)，陽性百分數(shù)計為至少1000個癌細胞中的陽性細胞百分數(shù)(A，B, C)。圖58.通過計數(shù)⑶31陽性血管結(jié)構(gòu)測定微管密度。圖59. HUVECS的克隆存活。生長因子饑餓12小時后，使HUVECS暴露于MDA7蛋白質(zhì)(10ng/ml) (A),血管抑素(100ng/ml ;B),或內(nèi)皮抑素(100ng/ml ;C)12小時。然后將細胞照射(0-6 Gy)、收獲并置于常規(guī)培養(yǎng)基中。14天后將克隆染色并測定存活組分。數(shù)據(jù)顯示為三次獨立試驗的平均值土標準差。圖60. A549細胞(A)和(XD16細胞⑶的克隆存活。細胞血清饑餓12小時，以含有mda7蛋白質(zhì)(10ng/ml)的條件培養(yǎng)基處理。12小時后，將細胞照射(0_6Gy)、收獲并置
于常規(guī)培養(yǎng)基中。孵育14天后，計數(shù)克隆并存活。圖61.靶向性質(zhì)粒構(gòu)建物，包括全長，細胞質(zhì)，核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)部分。圖62. MDA-7的ER靶向部分可阻抑克隆形成。圖63. MDA-7的ER靶向部分是促凋亡部分。圖64. Ad-mda7引起卵巢癌細胞系生長抑制。 圖65. Ad-mda7處理的卵巢癌細胞的細胞周期分析。A =MDAH 2774 ；B =OVCA 420.圖66. Ad-mda7誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡。圖67. MDA-7/IL-24抑制腫瘤細胞遷移。以Ad-Iuc或Ad_mda7處理肺腫瘤細胞(A549和H1299)。轉(zhuǎn)染后6h收獲細胞并接種于穿刺孔單元的上室中。A :48小時后，固定膜并以結(jié)晶紫染色，在明視野顯微鏡下(上圖；X200倍)計數(shù)已遷移到孔下層的細胞數(shù)。以Ad-mda7處理的細胞的遷移能力顯著(P = O. 002)低于PBS或Ad-Iuc處理的細胞(下層)。B :處理后24小時和48小時細胞活力分析未顯示腫瘤細胞增殖受到顯著抑制。豎條代表標準差。圖68. MDA-7/IL-24 抑制腫瘤細胞侵襲。以 PBS, Ad-luc (2500vp/ 細胞)，或Ad-mda7 (2500vp/細胞)或10 μ M LY 294002或I μ g/ml MMP-II抑制劑處理肺腫瘤細胞(H1299和A549)。6h后，收獲細胞，計數(shù)，并加入到基質(zhì)膠包被的孔的上層。37°C孵育細胞使其侵襲。48h后，固定細胞并以結(jié)晶紫染色。在光學(xué)顯微鏡下放大200倍觀察和計數(shù)遷移到孔下層的細胞。以盲法計數(shù)每種處理的侵襲細胞數(shù)，記錄為三次獨立試驗的平均值。以Ad-mda7處理的細胞顯示出比PBS或Ad-Iuc處理的細胞侵襲要差(P = O. 001)。MDA-7介導(dǎo)的抑制作用與以LY 294002和MMP-II抑制劑觀察到的抑制作用相似。豎條代表標準差。圖69. MDA-7/IL-24 抑制肺轉(zhuǎn)移?；铙w外以 PBS，Ad_luc，和 Ad_mda7 處理 A549 肺腫瘤細胞。6h后，收獲細胞，洗滌，重懸于PBS，通過尾靜脈注射入雌裸鼠。每組5只動物。腫瘤細胞注射后3周，吸入CO2窒息處死動物，在解剖顯微鏡下計數(shù)肺腫瘤節(jié)結(jié)。觀察到注射用Ad-mda7處理的腫瘤細胞的動物肺腫瘤顯著(P = O. 01)少于注射用PBS或Ad-Iuc處理的腫瘤細胞的動物。結(jié)果是兩次獨立試驗的平均值。豎條代表標準差。圖70. MDA-7/IL-24抑制肺轉(zhuǎn)移。將荷有實驗性A549肺轉(zhuǎn)移瘤變的小鼠不處理(對照)或以DOTAP Chol. CAT，或DOTAP :Chol_mda7復(fù)合物處理。通過尾靜脈注射每天處理動物共6次劑量。最后一次處理3周后，處死動物，計數(shù)肺腫瘤數(shù)目。以DOTAP Chol-mda7復(fù)合物處理的動物與未處理或以DOTAP =Chol-CAT復(fù)合物處理的動物相比，顯示肺轉(zhuǎn)移受到顯著抑制(P = O. 001)。豎條代表標準差。圖71A-C. DOTAP Cho I-mda-7復(fù)合物抑制皮下腫瘤生長。將荷有皮下腫瘤(A549orUV223m)的裸鼠和C3H小鼠分組，每天(50 μ g/劑)如下處理共6次不處理，PBS, DOTAP Chol-LacZ 復(fù)合物或 DOTAP =Chol-CAT 復(fù)合物，和 DOTAP Chol-mda-7 復(fù)合物。A，A549。B,UV2237m。各時間點代表每組的平均腫瘤體積。豎條代表標準差。C.處理后48小時收獲皮下腫瘤，分析MDA-7蛋白質(zhì)表達。在以DOTAP Cho I-mda-7復(fù)合物處理的腫瘤中，18%的A549腫瘤細胞和13%的UV2237m腫瘤細胞產(chǎn)生了 MDA-7蛋白質(zhì)，而對照腫瘤不產(chǎn)生MDA-7蛋白質(zhì)。圖72.以D0TAP:Chol-mda-7復(fù)合物處理后MDA-7誘導(dǎo)細胞凋亡。收獲未經(jīng)處理或經(jīng)PBS，D0TAP :ChoI-LacZ 或DOTAP :ChoI-CAT 復(fù)合物或DOTAP Chol-mda-7 復(fù)合物處理的動物的皮下腫瘤(A549和UV2237m)，通過TUNEL染色分析凋亡細胞。以DOTAP Cho I-mda-7復(fù)合物處理的腫瘤中發(fā)生凋亡而死亡的細胞百分數(shù)(A549為13%，UV2237m為9% )顯著(P = O. 001)高于其它處理組。豎條代表標準差。圖73. DOTAP Cho I-mda-7復(fù)合物抑制腫瘤血管化。未經(jīng)處理或經(jīng)PBS，DOTAP Chol-LacZ或DOTAP =Chol-CAT復(fù)合物或DOTAP Chol-mda-7復(fù)合物處理的皮下腫瘤(A549和UV2237m)做⑶31染色并進行半定量分析。在DOTAP Chol-mda7處理的腫瘤中，⑶31染色陽性的內(nèi)皮細胞顯著低于(P = 0.01)其它處理組的腫瘤。豎條代表標準差。圖74. DOTAP Cho I-mda-7復(fù)合物抑制實驗性肺轉(zhuǎn)移。以每天劑量(50 μ g/劑)的PBS，DOTAP =Chol-CAT復(fù)合物或DOTAP Chol-mda-7復(fù)合物處理荷有肺腫瘤(A549， UV2237m)的nu/nu或C3H小鼠共6次。與兩個對照組比較，以DOTAP Cho I-mda-7復(fù)合物處理的裸鼠和C3H小鼠中的轉(zhuǎn)移性腫瘤生長受到了顯著(P=<0.05)抑制。豎條代表標準差。說明性實施方式描述A. MDA-7本發(fā)明的組合物和方法利用MDA-7多肽和編碼這些多肽的核酸。MDA-7多肽是另一類推斷的腫瘤抑制因子，已經(jīng)證明可抑制P53野生型、p53缺失型及p53突變型癌細胞的生長。另外，P53缺失型細胞內(nèi)凋亡相關(guān)B基因的表達上調(diào)說明MDA-7能夠以不依賴p53的機制誘導(dǎo)腫瘤細胞的損傷。申請人觀察到腺病毒介導(dǎo)的MDA-7的過量表達可導(dǎo)致雙鏈RNA活化的絲氨酸/蘇氨酸激酶(PKR)快速誘導(dǎo)和活化，從而使eIF-2 α以及其他PKR靶底物磷酸化，誘導(dǎo)凋亡。肺癌細胞中2-氨基嘌呤(2-ΑΡ)對PKR的特異性抑制消除了 Ad-mda7導(dǎo)致的PKR活化，PKR靶底物的磷酸化和凋亡。如PKR缺失型成纖維細胞所顯示，Ad-mda7誘導(dǎo)的凋亡依賴功能性PKR通路。這些特征說明MDA-7作為PKR的誘導(dǎo)劑，具有廣泛的治療、預(yù)后及診斷潛能，因此可作為誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)的增強劑。PKR具有抗病毒和抗細胞功能，可參與某些生理過程的調(diào)節(jié)，如細胞的生長和分化(美國專利 No. 6, 326,466 ；Feng 等，1992 ；Petryshyn 等，1988 ；Petryshyn 等，1984 ；Judware等，1991)、腫瘤抑制(Koromilas等，1992 ；Meurs等，1993)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)(Kumar 等，1994)。PKR的上調(diào)可誘導(dǎo)各種腫瘤細胞系的凋亡。而且，在脊髓發(fā)育不良中，染色體5q上IRF-I基因的關(guān)鍵性致癌性缺失看來與PKR水平的降低有關(guān)(Beretta等，1996)，肺癌和結(jié)直腸癌的免疫組化分析表明與PKR的表達和生存期的延長有關(guān)(Haines等，1992)。PKR看來通過激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而介導(dǎo)抗腫瘤形成活性，從而達到抑制生長和誘導(dǎo)凋亡的作用。這些通路的活化發(fā)生在潛伏的無活性同質(zhì)二聚體形式受活化信號誘導(dǎo)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致其自身磷酸化并活化之后(Vattem等，2001)。PKR—旦活化后就能使各種靶底物磷酸化，這對生長調(diào)控和凋亡誘導(dǎo)很重要(Saelens等，2001 ;Sudhakar等，2000)。免疫系統(tǒng)的刺激與凋亡有關(guān)(Albert 等，1998 ；Chen 等，2001 ；Saif-Muthama 等，2000 ；Restifo 等，2001)。另外，人工誘導(dǎo)的凋亡已證明可增強疫苗的免疫原性，這是因為凋亡細胞的轉(zhuǎn)染活化了樹突狀細胞的刺激效應(yīng)(Sasaki等，2001 ；Chattergoon等，2000)。已在人PMBC中鑒定到Mda-7mRNA (Ekmekcioglu等，2001)，據(jù)報道人MDA-7無細胞因子功能。根據(jù)其基因和蛋白序列的特征，MDA-7已被命名為IL-24(NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號XM 001405)。鼠MDA-7蛋白同源物FISP(IL-4-誘導(dǎo)的分泌蛋白)已報道為Th2特異性的細胞因子(Schaefer等，2001)。如敲除試驗所證實，TCR和IL-4受體結(jié)合及隨后的PKC和STAT6的活化可誘導(dǎo)FISP的轉(zhuǎn)錄。FISP的表達特點已證實，但沒有發(fā)現(xiàn)這個推斷出的細胞因子有何功能。大鼠MDA-7同源物C49a(Mob-5)與mda_7基因有78%的同源性，已證實與傷口愈合有關(guān)(Soo等，1999 ;Zhang等，2000)。Mob_5也是一種分泌蛋白，在大鼠轉(zhuǎn)化細胞鑒定到其推定的細胞表面受體(Zhang等，2000)。因此，mda_7基因和MDA-7分泌蛋白的同源物可在各種動物中表達和分泌。但是，沒有數(shù)據(jù)顯示MDA-7具有細胞因子活性。這種活性可通過增強抗原的免疫原性用于治療各種疾病和感染。Mda-7 cDNA(SEQID NO :1)編碼一種新型的、進化保守的、含206個氨基酸的蛋白 質(zhì)(SEQ ID NO :2)，預(yù)測分子量為23.8kDa。據(jù)推測氨基酸序列含有一個疏水性骨架，位置約為氨基酸26到45，具有信號序列的特征。除了含42個氨基酸殘基的片段與白細胞介素IO(IL-IO)有54%的相同性外，該蛋白質(zhì)的序列與已知的蛋白無顯著同源性。結(jié)構(gòu)分析表明MDA-7 (IL-BKW或IL-20)具有細胞因子家族的結(jié)構(gòu)特征(W0 98/28425，本文已引入作為參考)。其結(jié)構(gòu)特征和一小段氨基酸片段的有限相同性表明MDA-7可能具有細胞外功能。MDA-7的表達與黑素瘤的惡性程度呈負相關(guān)關(guān)系，試驗證明與原發(fā)和轉(zhuǎn)移性黑素瘤相比，正常黑色素細胞內(nèi)mRNA表達水平升高，而裸鼠內(nèi)增強腫瘤形成的處于垂直生長早期的黑素瘤細胞內(nèi)mda-7mRNA的表達水平下降。其他有關(guān)MDA-7的信息和數(shù)據(jù)見專利申請09/615，154，10/017，472，60/404，932，60/370，335，60/361，755 和美國非臨時專利申請于 2003 年 3月 3 日提交的，以 Sunil Chada,Abujiang Pataer,Abner Mhashilkar,Rajagopal Ramesh,Jack RothjPSteve Swisher為發(fā)明人的“包括MDA-7的增強免疫誘導(dǎo)的方法”，所有這些申請本文已引入作為參考。其他研究證明MDA-7表達的升高可在體外抑制腫瘤細胞的生長，并選擇性地誘導(dǎo)人乳腺癌細胞的凋亡和抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(Jiang等，1996和Su等，1998)。Jiang等(1996)報道發(fā)現(xiàn)mda-7在各種起源的腫瘤細胞內(nèi)都是一種強力生長抑制基因，包括乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、宮頸、結(jié)腸、前列腺和結(jié)締組織的腫瘤。用克隆抑制試驗證明MDA-7表達升高可增強對人宮頸癌(HeLa)、人乳腺癌(MCF-7和T47D)、結(jié)腸癌(LS174T和SW480)、鼻咽癌(H0NE-1)、前列腺癌(DU-145)、黑素瘤(HO-1和C8161)、成膠質(zhì)細胞瘤多形體(glioblastome multiforme) (GBM-18 和 T98G)以及骨肉瘤(Saos-2)生長的抑制。Mda-7在正常細胞(HMECs、HBL-100和CREF_Trans6)內(nèi)的過量表達顯示出有限的生長抑制作用，這說明mda-7轉(zhuǎn)基因的作用在正常細胞內(nèi)不明顯。綜上所述，這些數(shù)據(jù)說明MDA-7表達升高所產(chǎn)生的生長抑制作用在體外對腫瘤細胞的作用高于對正常細胞的作用。Su等(1998)報道了對MDA-7抑制癌細胞生長機制的研究。研究報告通過細胞周期分析和TUNEL試驗表明MDA-7在乳腺癌細胞系MCF-7和T47D內(nèi)的異位表達誘導(dǎo)了凋亡，但對正常HBL-100細胞無影響。感染腺病毒mda-7 (“Adnda-7”)的細胞裂解物的Western印跡分析表明凋亡刺激蛋白BAX的表達上調(diào)。Ad-mda-7感染上調(diào)BAX蛋白的表達只發(fā)生在MCF-7和T47D細胞內(nèi)，而不發(fā)生在正常的HBL-100或HMEC細胞內(nèi)。這些數(shù)據(jù)使研究人員得以評價Ad-mda-7活體外轉(zhuǎn)導(dǎo)對MCF-7腫瘤細胞異種移植腫瘤形成的作用。活體外轉(zhuǎn)導(dǎo)可抑制腫瘤異種移植模型中腫瘤的形成和發(fā)展。利用基因治療方法治療癌癥的主要模式是誘導(dǎo)凋亡。這可以通過使癌細胞對其他藥物敏感或通過刺激細胞內(nèi)通路直接誘導(dǎo)凋亡來實現(xiàn)。其他癌癥治療方法利用了腫瘤需要新生血管形成以供應(yīng)其生長所必要的營養(yǎng)素。內(nèi)皮抑制素和新生血管抑制素就是這種治療方法的例子(W0 00/05356 和 WO 00/26368)。申請人:發(fā)現(xiàn)了一種抑制新生血管形成的方法。這種新的方法包括給予編碼人mda-7的核酸。當(dāng)體外添加于增殖的內(nèi)皮細胞時,Ad_mda7具有抑制內(nèi)皮分化的能力。mda-7表達提高的抗-新生血管形成作用使該分子成為新生血管形成相關(guān)疾病尤其是癌癥的理想基因治療方法。考慮可通過病毒或非病毒載體給予包括內(nèi)皮細胞的抗-新生血管形成靶 標細胞編碼mda-7的核酸，也可給予腫瘤細胞。這種聯(lián)合治療使臨床醫(yī)生不但可依靠腫瘤細胞的直接轉(zhuǎn)導(dǎo)而且可依靠抑制新生血管形成的作用。因此，通過利用兩種不同的向不同靶細胞群輸送藥物的療法來饑餓和攻擊腫瘤。新生血管形成相關(guān)疾病包括，但不限于，新生血管形成依賴性癌癥，包括例如，實體瘤,血源性腫瘤例如白血病，以及腫瘤轉(zhuǎn)移；良性腫瘤,例如血管瘤，聽神經(jīng)瘤,神經(jīng)纖維瘤,沙眼，以及膿性肉芽腫；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；牛皮癬；眼血管原性疾病,例如,糖尿病視網(wǎng)膜病變，早熟性視網(wǎng)膜病，黃斑變性，角膜移植排異，新生血管性青光眼，晶狀體后纖維增生，虹膜發(fā)紅Asler-Webber綜合征；心肌新生血管形成；斑塊新生新生血管形成；毛細管擴張癥；血友病關(guān)節(jié)；血管纖維瘤；以及創(chuàng)傷性肉芽腫。本發(fā)明的內(nèi)皮細胞增殖抑制方法可用于內(nèi)皮細胞過分或異常刺激疾病的治療。這些疾病包括，但不限于，腸粘連，動脈粥樣硬化.硬皮病，以及肥厚性瘢痕，即瘢痕瘤.它們還可用于治療以新生血管形成為病理結(jié)果的疾病，例如貓抓傷疾病(Rochele minalia quintosa)和潰瘍(Helobacter pylori)。本發(fā)明的方法可用于治療內(nèi)皮細胞相關(guān)疾病和病癥。尤其重要的內(nèi)皮細胞過程是新生血管形成，即上述的血管形成。利用本發(fā)明所述的方法通過提高MDA-7的表達抑制內(nèi)皮細胞增殖可治療新生血管形成相關(guān)疾病。雖然不受這些構(gòu)建物可操作性的專門理論束縛，但各種動物間mda-7和IL-IO的位于C末端涉及與受體結(jié)合的D-螺旋區(qū)有顯著的氨基酸同源性。因此，尤其優(yōu)選含有該30-35位的氨基酸區(qū)域的分子。因此，在本發(fā)明的一個實施方式中，新生血管形成相關(guān)疾病的治療包括給予治療性肽或多肽。在其他實施方式中，治療包括給予靶細胞包括患病細胞或內(nèi)皮細胞編碼mda-7的核酸表達構(gòu)建物。認為這些靶細胞攝吸該構(gòu)建物，并表達核酸編碼的治療性多肽，因此抑制靶細胞的分化。表達MDA-7的細胞進而可分泌該蛋白與未被表達構(gòu)建物轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染的相鄰細胞相互反應(yīng)。通過這種方式，抑制了腫瘤建立新脈管系統(tǒng)所需的復(fù)雜的相互作用并實現(xiàn)了腫瘤的治療。在本發(fā)明的其他實施方式中，認為可用MDA-7或表達MDA-7的構(gòu)建物治療新生血管形成相關(guān)疾病。本發(fā)明預(yù)期可治療的一些新生血管形成相關(guān)疾病是牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、炎性大腸病(IBD)、骨關(guān)節(jié)炎和肺腫瘤前病變。在其他實施方式中，很多種癌癥的治療都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，黑素瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺癌、肝癌、成視網(wǎng)膜細胞瘤、星狀細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、牙齦、舌、白血病、成神經(jīng)細胞瘤、頭、頸、乳房、胰腺、前列腺、腎、骨、睪丸、卵巢、間皮瘤、頸部、腸胃道、淋巴瘤、腦、結(jié)腸或膀胱癌。在更優(yōu)選的實施方式中，所述新生血管形成相關(guān)疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性大腸病、骨關(guān)節(jié)炎、平滑肌瘤、ademonas、脂肪瘤、血管瘤、纖維瘤、血管閉塞、再狹窄、動脈粥樣硬化、腫瘤前病變、原位癌、口腔毛狀白斑或牛皮癬可能是治療的對象。在本發(fā)明的某些實施方式中，mda-7是作為表達MDA-7多肽的核酸來提供的。在某些具體實施方式
中，所述核酸是病毒載體，其中病毒載體的劑量至少為103，IO4, IO5, IO6,IO7, IO8, IO9, IO10, IO11, IO12, IO13, IO14, IO15或更高的Pfu或病毒顆粒。在某些實施方式中，病毒載體是腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、痘苗病毒載體、腺伴隨病毒載體、多瘤病毒載體、α病毒載體、桿狀病毒載體或皰疹病毒載體。最優(yōu)選的病毒載體是腺病毒載體。在其他特殊的實施方式中，所述核酸是非病毒載體。 在某些實施方式中，表達所述多肽的核酸可操作性連接于啟動子。適于本發(fā)明的啟動子的非限定性例子包括 CMVIE、dectin-1、dectin_2、人 CDllc、F4/80、SM22 和 MHC II類分子的啟動子，但是據(jù)信任何可用于驅(qū)動mda-7基因或本發(fā)明的免疫基因表達的其它啟動子，如本文所所述的那些啟動子，都可用于實施本發(fā)明。本發(fā)明的核酸優(yōu)選通過注射給藥。其他的實施方式包括通過多次注射給予核酸。在某些實施方式中，注射可在患病或腫瘤的局部、區(qū)域或遠離部位。在某些實施方式中，核酸的注射是通過連續(xù)灌注、瘤內(nèi)注射、腹腔注射或靜脈注射。在其他的實施方式中，核酸是在切除腫瘤前、或切除腫瘤后，或者切除腫瘤前后都注射到瘤床部位。另外，核酸可在化療、生物治療、免疫治療、手術(shù)或放療前、期間或之后給予患者。患者優(yōu)選人。在其他的實施方式中，患者是癌癥患者。B.核酸，載體和調(diào)節(jié)信號本發(fā)明涉及mda-7基因相關(guān)的多聚核苷酸或核酸分子及該基因的產(chǎn)物MDA-7。另夕卜，本發(fā)明還涉及與免疫原性分子相關(guān)的多聚核苷酸或核酸分子。這些多聚核苷酸或核酸分子可以從哺乳動物細胞分離并純化。認為分離和純化的MDA-7核酸分子，不論是分泌性或是全長的，都是與mda-7基因產(chǎn)物相關(guān)的核酸分子，可以是RNA或DNA的形式。同樣，與免疫原性分子相關(guān)的核酸分子也可以是RNA或DNA形式。本文所用的術(shù)語“RNA轉(zhuǎn)錄物”指DNA核酸分子轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物-RNA分子。這種轉(zhuǎn)錄物可編碼一種或多種多肽。如本申請書所用，術(shù)語“多聚核苷酸”指核酸分子、RNA或DNA，可從總基因組核酸中分離。因此，“編碼MDA-7的多聚核苷酸”指含MDA-7編碼序列的核酸片段，也可以從基因組總DNA和蛋白質(zhì)分離或純化。當(dāng)本申請書提到MDA-7編碼多聚核苷酸或核酸的功能或活性時，意味著該多聚核苷酸編碼能增強免疫應(yīng)答的分子。另外，“編碼免疫原的多聚核苷酸”指含免疫原編碼序列的核酸片段，也可以從基因組總DNA和蛋白質(zhì)分離或純化。當(dāng)本申請書提到編碼免疫原的免疫基因的功能或活性時，意味著該多聚核苷酸編碼能誘導(dǎo)人體免疫應(yīng)答的免疫原性分子。術(shù)語“cDNA”指以RNA為模板制備的DNA。與基因組DNA或RNA轉(zhuǎn)錄物相比，利用cDNA的優(yōu)勢在于其穩(wěn)定性和能夠用重組DNA技術(shù)操縱序列(見Sambrook, 1989 ；Ausubel,1996)。得到全部或部分基因組序列的一些時，需要時間?；蛘?，cDNA具有優(yōu)點是因為它提供了某多肽的編碼區(qū)，并剔除了內(nèi)含子和其他調(diào)節(jié)序列。
另外認為某給定細胞的給定MDA-7編碼核酸或mda-7基因可由核酸序列略有差異但仍能編碼MDA-7多肽的天然突變體或突變株提供；人的MDA-7多肽是特殊的實施方式。因此，本發(fā)明也包括具有細微氨基酸改變但活性相同的MDA-7衍生物。術(shù)語“基因”簡單地說指功能性蛋白質(zhì)、多肽或肽的編碼核酸單元。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，此功能術(shù)語包括能表達或適于表達蛋白質(zhì)、多肽、功能域、肽、融合蛋白以及突變體的基因組序列、cDNA序列和較小的基因工程基因片段。編碼MDA-7或其他治療性多肽如免疫原的核酸分子含有下列長度，或含有至少下列長度的連續(xù)核酸序列5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、11I、112、113、114、115、116、I17、I18、I19、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、16 3、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、10100、10200、10300、10400、10500、10600、10700、10800、10900、11000、11100、11200、11300、11400、11500、11600、11700、11800、11900、12000或更多個核苷酸、核苷或堿基對。這些序列可與SEQ ID NO I (MDA-7編碼序列)相同或互補?！芭c其他編碼序列有實質(zhì)區(qū)別的”指感興趣基因為核酸片段的部分編碼序列，這個片段不含有天然編碼核酸的大部分，如大的染色體片段或其他功能基因或cDNA編碼區(qū)。當(dāng)然，這是指天然分離的核酸片段，不包括后來人工添加到片段上的基因或編碼區(qū)。在具體實施方式
中，本發(fā)明涉及插入編碼MDA-7蛋白、多肽或肽的DNA序列的分離的DNA片段和重組載體，這些MDA-7蛋白、多肽或肽的氨基酸序列中含有與上述SEQ ID NO:2 一致的連續(xù)氨基酸序列，與MDA-7相應(yīng)的序列命名為“人MDA-7”或“MDA-7多肽”。術(shù)語“與上述SEQ ID NO 2基本一致的序列”指與SEQ ID NO 2的一部分基本對應(yīng)的序列，只有相當(dāng)少的氨基酸是與SEQ ID NO :2的氨基酸不相同，但其生物功能是等價的。
術(shù)語“生物功能等價”是本領(lǐng)域所熟知的，在本文中還有更詳細的定義。因此，如果一個序列的氨基酸有約70%、約71 %、約72%、約73%、約74%、約75%、約76%、約77%、約 78%、約 79%、約 80%、約 81%、約 82%、約 83%、約 84%、約 85%、約 86%、約 87%、約88%、約 89%、約 90%、約 91 %、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%或者約99 %，以及它們之間的任何范圍，如約70 %到約80 %、優(yōu)選約81 %到約90 %;或者更優(yōu)選約91%到約99%與SEQ ID NO 2的氨基酸相同或功能等價，則該序列是“與上述SEQID NO :2基本一致”，只要保留了該蛋白的生物活性。在具體實施方式
中，MDA-7蛋白、多肽或肽或生物功能等價物的生物活性包括增強免疫應(yīng)答。此外，在具體實施方式
中，蛋白質(zhì)、多肽或肽或者生物功能等價物的免疫原、免疫原性分子的生物活性包括免疫原性，這是指該分子能誘導(dǎo)人體的免疫應(yīng)答。在其他某些實施方式中，本發(fā)明涉及分離的DNA片段和重組載體，這些片段和載體的序列內(nèi)含有與上述SEQ ID NO :1基本一致的序列。術(shù)語“與上述SEQ ID NO :1基本一致”與如上所述的含義相同，指該核酸序列與SEQ ID NO :I的一部
分基本對應(yīng)，只有相當(dāng)少的密碼子與SEQ ID NO :1的密碼子不同，但功能是等價的。而且，編碼具有MDA-7活性的蛋白、多肽或肽的DNA片段是最常用的。在具體實施方式
中，本發(fā)明涉及插入有編碼MDA-7多肽或肽的DNA序列的分離的核酸片段和重組載體，這些多肽或肽的氨基酸序列中含有與MDA-7多肽基本上對應(yīng)的連續(xù)氨基酸序列。在其他的實施方式中，本發(fā)明涉及插入有編碼免疫原、蛋白、多肽或肽的DNA序列的分離的核酸片段和重組載體，這些免疫原、蛋白、多肽或肽的氨基酸序列中含有與該免疫原基本上相對應(yīng)的連續(xù)氨基酸序列。設(shè)計本發(fā)明的載體主要用于轉(zhuǎn)化細胞使其含有在調(diào)控性真核細胞啟動子(即可誘導(dǎo)性、可阻抑性、組織特異性啟動子)控制下的mda-7基因。另外，如果無其他原因，為了便于載體的體外操作，該載體內(nèi)可含有選擇性標記。而此選擇性標記在產(chǎn)生重組細胞時可能發(fā)揮重要作用。表I和2，見下，列出了可用于本發(fā)明的各種調(diào)節(jié)信號。表I-可誘導(dǎo)元件
權(quán)利要求
1.分離的或純化的具有SEQID NO 2所示序列的MDA-7蛋白或編碼具有SEQID NO 2所示序列的MDA-7蛋白的核酸表達構(gòu)建物在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于放射致敏對象體內(nèi)的癌細胞，其中所述核酸在細胞內(nèi)可操作的啟動子的控制下。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中所述癌細胞是上皮癌細胞。
3.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中所述編碼MDA-7蛋白的核酸表達構(gòu)建物被包含在病毒載體中。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述病毒載體是腺病毒載體。
5.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中所述MDA-7蛋白被純化成至少95%均一性。
6.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用,其中所述MDA-7蛋白還包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列。
7.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中，在給予所述MDA-7蛋白或表達構(gòu)建物后72小時內(nèi)對所述癌細胞進行輻射處理。
全文摘要
本發(fā)明涉及含MDA-7的組合物和方法。更具體地說，本發(fā)明涉及治療癌癥和其它新生血管形成相關(guān)疾病(抗新生血管形成療法)的診斷、預(yù)后和治療性組合物和方法。本發(fā)明還涉及MDA-7的純化方法。
文檔編號C12N15/24GK102836420SQ201210102438
公開日2012年12月26日 申請日期2004年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月3日
發(fā)明者S·查達, J·B·穆姆, R·拉梅西, A·馬西爾卡, R·E·梅恩, E·格林姆 申請人:得克薩斯州大學(xué)系統(tǒng)董事會, P53股份有限公司