專利名稱：一種乙醛脫氫酶基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙醛脫氫酶基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用，特別涉及一種來(lái)源于玉米，且具有根表達(dá)特異性的乙醛脫氫酶基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著人口增長(zhǎng)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，我國(guó)的糧食需求仍將呈現(xiàn)持續(xù)剛性增長(zhǎng)。在當(dāng)前耕地面積持續(xù)減少和糧食種植面積擴(kuò)大潛力非常有限的形式下，大幅度提高糧食單產(chǎn)成為保障國(guó)家糧食安全的必由之路。通過(guò)優(yōu)化施肥技術(shù)、分階段精確調(diào)控施肥量等栽培耕作措施，可以顯著提高作物產(chǎn)量。同時(shí)，利用作物自身吸收利用養(yǎng)分的遺傳潛力，選育氮高效品種或轉(zhuǎn)基因品種，也是解決糧食問(wèn)題的有效途徑之一。當(dāng)前，提高作物養(yǎng)分效率的遺傳改良和育種工作已經(jīng)引起科學(xué)家的極大重視，許多國(guó)家，國(guó)際研究機(jī)構(gòu)和跨國(guó)育種公司都把這項(xiàng)研究工作列為優(yōu)先發(fā)展領(lǐng)域。然而，作物養(yǎng)分高效性狀的遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，受環(huán)境影響很大，因此通過(guò)傳統(tǒng)的常規(guī)育種途徑培育養(yǎng)分高效利用的品種難度非常大，導(dǎo)致當(dāng)前可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的養(yǎng)分高效利用品種非常缺乏。 隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展，植物遺傳分析和遺傳工程技術(shù)的不斷革新，分子育種策略大大加快了作物新品種的選育。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)或分子標(biāo)記輔助選擇等技術(shù)對(duì)養(yǎng)分高效性狀實(shí)現(xiàn)遺傳操作，將能夠快速有效地培育獲得養(yǎng)分高效利用新品種。近年來(lái)，人們已經(jīng)克隆得到了很多與養(yǎng)分高效利用相關(guān)的基因，比如在植物氮素的吸收利用起到重要作用的氮代謝途徑關(guān)鍵酶的基因，這些關(guān)鍵酶的基因在很多物種中都有研究，比如硝酸還原酶、谷氨酸脫氫酶、GS/G0GAT途徑的谷氨酰胺合成酶以及各種轉(zhuǎn)氨酶，為了研究這些功能基因的作用，最后能夠?yàn)閷?shí)際生產(chǎn)提供良好的種質(zhì)資源，就需要在植物體內(nèi)超表達(dá)這些功能基因，以期望得到良好的表型。這些養(yǎng)分高效候選基因大多數(shù)由異源組成型啟動(dòng)子(如CaMV 35S)驅(qū)動(dòng)，從而在植物中組成型表達(dá)，這可以部分達(dá)到養(yǎng)分高效利用的效果，在作物中比較成功的例子是在玉米中超表達(dá)ZmGSl-3基因，通過(guò)大量表達(dá)谷氨酰胺合成酶使玉米的籽粒數(shù)目與野生型相比顯著增加，從而極大地提高了轉(zhuǎn)基因玉米的氮素利用效率和產(chǎn)量(Antoine et al. , Two Cytosolic Glutamine Synthetase isoforms of maize are specifically involved in the control of grain production. Plant Cell，2006，18 :3252-3274)。不過(guò)類似的成功例子并不多見(jiàn)，主要原因是由于在一些非必要組織中大量表達(dá)外源蛋白，可能會(huì)無(wú)謂消耗植物體內(nèi)的能源，增加植物生長(zhǎng)負(fù)擔(dān)，從而影響植物本身的優(yōu)良性狀。例如在擬南芥中由CaMV 35S啟動(dòng)表達(dá)基因AtGluR2 (谷氨酸受體的基因)，影響了植物對(duì)鈣的敏感性，使地上部出現(xiàn)缺I丐的癥狀，反而對(duì)植物的產(chǎn)量產(chǎn)生影響(Sun etal. ,Overexpression of the AtGluR2 Gene Encoding an Arabidopsis Homolog of Mammalian Glutamate Receptors Impairs Calcium Utilization and Sensitivity to Ionic Stress in Transgenic Plants. Plant Cell Physiology，2001，42 :74-84) 因此，選用器官特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，使目標(biāo)基因在植物特定的發(fā)育階段、部位或特定環(huán)境下表達(dá)，將可能獲得更好的轉(zhuǎn)基因效果。根系是養(yǎng)分吸收的主要器官， 提高根系對(duì)養(yǎng)分的吸收效率，初級(jí)代謝效率，以及通過(guò)根系中柱鞘向地上部運(yùn)輸?shù)男适翘岣唣B(yǎng)分吸收高效利用的關(guān)鍵。因此，發(fā)現(xiàn)根特異性啟動(dòng)子，從而在植物根部特異性高表達(dá)養(yǎng)分高效候選基因，這對(duì)實(shí)現(xiàn)養(yǎng)分高效吸收利用可能比選用組成型啟動(dòng)子具有更佳的效果O

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。本發(fā)明所提供的DNA分子,名稱為ZmANTp,來(lái)源于玉米(Zea mays L.)品種自交系 B73，為如下I)-3)中任一種I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子;所述3)中的DNA分子，與I)或2)限定的DNA分子最好有95%以上的同源性。所述嚴(yán)格條件是在2 X SSC，O. I % SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次 5min. O. 5X SSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次15min。序列表中序列I由1410個(gè)核苷酸組成。含有所述DNA分子(ZmANTp)的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體中，由所述的DNA分子(ZmANTp)啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組載體具體為在P CAMBIA3 3 OI的多克隆位點(diǎn)插入所述DNA分子 (ZmANTp)得到的重組質(zhì)粒。所述多克隆位點(diǎn)具體為限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)Hind III和Nco
I。所述目的基因具體為GUS基因。所述表達(dá)盒由具有啟動(dòng)子功能的所述DNA分子(ZmANTp)，由所述DNA分子啟動(dòng)表達(dá)的目的基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成；所述DNA分子(ZmANTp)以功能性方式與所述目的基因連接，且所述目的基因與所述轉(zhuǎn)錄終止序列連接。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述目的基因具體為GUS基因。所述DNA分子(ZmANTp)在啟動(dòng)目的基因在植物中表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述植物為玉米，具體為玉米品種Hi-II (自交系Hi A 和自交系Hi B的雜交后代)。所述目的基因具體為GUS基因。所述表達(dá)為根特異表達(dá)；所述根主要指根尖，更為具體的，為根尖的中柱鞘細(xì)胞。利用所述的DNA分子(ZmANTp)培育轉(zhuǎn)基因植物的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該方法包括如下步驟1)構(gòu)建目的基因重組表達(dá)載體將目的基因插入到上述含有所述DNA分子(ZmANTp)的所述重組載體，使所述DNA分子(ZmANTp)啟動(dòng)所述目的基因表達(dá)，得到目的基因重組表達(dá)載體；2)將步驟I)構(gòu)建的目的基因重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中，得到在根中特異表達(dá)所述目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。將所述目的基因重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物的方法可為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、Ti質(zhì)粒法、Ri質(zhì)粒法、植物病毒載體法、直接DNA轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、電導(dǎo)法等，在本發(fā)明的實(shí)施例中具體采用的為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述目的植物植物為玉米，具體為玉米品種Hi-II (自交系Hi A和自交系Hi B的雜交后代)。所述目的基因具體為GUS基因。所述目的基因重組表達(dá)載體具體為含有所述DNA分子(ZmANTp)的pCAMBIA3301重組質(zhì)粒。本發(fā)明從玉米品種B73中克隆出了玉米乙醛脫氫酶基因啟動(dòng)子的相關(guān)序列，實(shí)驗(yàn)證實(shí)該序列很強(qiáng)的啟動(dòng)子功能，可驅(qū)動(dòng)目的基因(如報(bào)告基因GUS基因)在幼苗的根中高效特異性表達(dá)，并且表達(dá)部位定位在中柱鞘，這對(duì)于進(jìn)一步研究增強(qiáng)植物對(duì)養(yǎng)分高效吸收利用具有非常重要的意義。


圖I為RT-PCR擴(kuò)增得到ZmANTp啟動(dòng)子的電泳圖譜。其中，泳道I和2均為用引物Antp-F和Antp-R PCR擴(kuò)增得到ZmANTp啟動(dòng)子的電泳圖譜；泳道M為DNA Marker (中科瑞泰 DNA MarkerIII 貨號(hào) 5905683)，分子標(biāo)準(zhǔn)從小到大為 300bp、500bp、800bp、lOOObp、 1500bp、2000bp、3000bp、5000bp。圖2為ZmANTp啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化玉米的過(guò)程示意圖。其中，A為ZmANTp轉(zhuǎn)基因玉米幼胚GUS染色圖；B為ZmANTp轉(zhuǎn)基因玉米幼胚誘導(dǎo)形成的愈傷圖片；C為ZmANTp轉(zhuǎn)基因玉米愈傷誘導(dǎo)成苗的圖片。圖3為部分ZmANTp轉(zhuǎn)基因玉米的分子鑒定圖片。其中，A為部分Ttl代轉(zhuǎn)基因玉米中抗性基因-Bar基因的PCR檢測(cè)圖；B為部分T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米中GUS基因的PCR檢測(cè)圖。A和B中，數(shù)字編號(hào)的泳道中的樣品即來(lái)自對(duì)應(yīng)編號(hào)的轉(zhuǎn)基因玉米，Tub表示內(nèi)參基因 alpha_tubulin40圖4為ZmANTp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的⑶S基因在T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米幼苗中根和葉的⑶S 活性染色比較照片。其中，A表示編號(hào)為1-5-1的T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米株系的根和葉的染色圖表示編號(hào)為1-70的T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米株系的根和葉的染色圖。圖5為ZmANTp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的⑶S基因在T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米幼苗根和葉的⑶S 酶活性定量比較圖。圖6為ZmANTp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的⑶S酶在T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米幼苗根尖中的⑶S染色活性圖。其中，I表示轉(zhuǎn)入pCAMBIA 3301載體的轉(zhuǎn)基因玉米株系(正對(duì)照)；2表示非轉(zhuǎn)基因玉米株系(負(fù)對(duì)照)；3表示編號(hào)為1-5-1的T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米株系；4表示編號(hào)為 1-70的T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米株系。圖7為ZmANTp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的⑶S酶在T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米根不同組織中的⑶S 染色活性橫切剖面圖。其中，I表示轉(zhuǎn)入pCAMBIA 3301載體的轉(zhuǎn)基因玉米株系(正對(duì)照)； 2表示非轉(zhuǎn)基因玉米株系(負(fù)對(duì)照)；3表示編號(hào)為1-5-1的T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米株系；4 表示編號(hào)為1-70的T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米株系。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
菌株與質(zhì)粒大腸桿菌(E. coli)DH5 α、農(nóng)桿菌EHA105均購(gòu)自博大公司。pCAMBIA3301 (pCambia3301):參考文獻(xiàn)李敬娜，劉亞，李翔等.抗草甘膦基因表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)玉米的遺傳轉(zhuǎn)化，華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，25 (4) :44-48。工具酶及生化試劑各種限制性內(nèi)切酶、pGEM-T-Easy載體試劑盒購(gòu)自Promega公司；高保真酶Prime-Star購(gòu)自Takara公司；dNTP混合物購(gòu)自上海生工；T4 DNA連接酶購(gòu)自Promega公司；氨節(jié)青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、和噻孢霉素(Cef)購(gòu)自欣經(jīng)科公司。培養(yǎng)基下述培養(yǎng)基的溶劑均為水。LB液體培養(yǎng)基(I升)10g NaCl，5g酵母提取物，IOg胰蛋白胨，pH7.0。LB固體培養(yǎng)基(I升)1升液體LB培養(yǎng)基加15g瓊脂，pH7. O。YEP液體培養(yǎng)基(I升)10g酵母提取物，IOg蛋白胨，5g NaCl, pH 7. 5。YEP固體培養(yǎng)基(I升)1升YEB液體培養(yǎng)基加15g瓊脂，pH 7. 5。Inf 侵染培養(yǎng)基(I 升)-Ag N6 Salt (即 Chu (N6) Basal Salt Mixture 購(gòu)自 sigma 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為C1416)，5ml N6維生素儲(chǔ)存液(200X)，I. 5ml 2，4-D (2，4-二氯苯氧乙酸)水溶液(lmg/ml) ,0. 7g Proline (脯氨酸)，68. 4g Sucrose (鹿糖)，36g Glucose (葡萄糖)，Iml AS(乙酰丁香酮)水溶液(100mM/ml)，pH 5. 2。CO-C 共培養(yǎng)培養(yǎng)基(I 升)2g N6 Salt (即 Chu (N6) Basal Salt Mixture 購(gòu)自 sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為C1416)，5ml N6維生素儲(chǔ)存液(200X)，I. 5ml 2，4_D水溶液 (lmg/ml) ,0. 7g Proline (脯氨酸)，30g Sucrose (鹿糖)，8g Agar (瓊脂)，Iml 經(jīng)過(guò)濾的 DTT ( 二硫蘇糖醇)水溶液(O. 152g/ml)，Iml AS水溶液(乙酰丁香酮)(100mM/ml), 50 μ I Silver nitrate 水溶液(硝酸銀)(17mg/ml)，Iml 經(jīng)過(guò)濾的 Cysteine (半胱氨酸)(0. 3g/ ml), pH 5· 8。Resting 靜息培養(yǎng)基(I 升)4g N6 Salt (即 Chu (N6)Basal Salt Mixture 購(gòu)自sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為C1416)，，5ml N6維生素儲(chǔ)存液(200X)，I. 5ml 2，4_D水溶液(lmg/ml) ,0. 7g Proline (脯氨酸)，30g Sucrose (鹿糖)，8g Agar(瓊脂)，lml Carbenicillin (羧節(jié)青霉素)水溶液(100mg/ml), 50 μ I Silver nitrate 水溶液(硝酸銀)(17mg/ml)，pH5.8。N6S 選擇培養(yǎng)基(I 升)4g N6 Salt (即 Chu (N6) Basal Salt Mixture 購(gòu)自 sigma 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為C1416)，，5ml N6維生素儲(chǔ)存液(200 X)，I. 5ml 2，4_D水溶液(lmg/ ml) ,0. 7g Prol ine(脯氨酸)，30g Sucrose (鹿糖)，3. 8g Gelrite (植物凝膠)，50 μ I Silver nitrate(硝酸銀)水溶液(17mg/ml), 250 μ I Glufocinate (草丁膦)水溶液 (10mg/ml), Iml Carbenicillin (羧節(jié)青霉素)水溶液(100mg/ml), pH 5.8。N6 維生素儲(chǔ)存液(200X)(1 升):0. 4g 甘氨酸，O. Ig 煙酸，O. 2g VBl，O. Ig VB6。RI 再生培養(yǎng)基(I 升)MS 鹽粉末(西美杰，MURASHIGE and SKOOG BASAL MEDIUM withVITAMINS,產(chǎn)品目錄號(hào)為 M519)，O. Ig Myo-Inositol (肌醇)，60g Sucrose (鹿糖)，3g Gelrite (植物凝膠),500 μ I Glufocinate (草丁膦)水溶液(5mg/ml) ,pH 5· 8。RII 再生培養(yǎng)基(I 升)MS 鹽粉末(西美杰，MURASHIGE and SKOOG BASAL MEDIUM withVITAMINS,產(chǎn)品目錄號(hào)為 M519)，O. Ig Myo-Inositol (肌醇)，30g Sucrose (鹿糖)，3g Gelrite (植物凝膠),350 μ I 6-ΒΑ (6-芐氨基腺嘌呤)水溶液(lmg/ml)，ρΗ5· 8。瓶用培養(yǎng)基(I升)MS 鹽粉末(西美杰，MURASHIGE and SKOOG BASAL MEDIUMwithVITAMINS,產(chǎn)品目錄號(hào)為 M519)，O. Ig Myo-Inositol (肌醇)，30g Sucrose (鹿糖)，3g Gelrite (植物凝膠)，350 μ I NAA (萘乙酸)水溶液(lmg/ml)，pH 5. 8。GUS染液100mg x-Gluc (5_溴_4_氯_3吲哚葡萄糖苷)，溶于Iml DMF( 二甲基甲酰胺)；取50ml濃度為lOOmmol/L的磷酸緩沖液(pH7. O)，加入Iml濃度為50mmol/L的鐵氰化鉀、Iml濃度為50mmol/L的亞鐵氰化鉀和O. Iml的TritonX-IOO,再加入已經(jīng)溶解的 x-Gluc,加高純水到定容至100ml。酶提取液0·05Μ磷酸緩沖液(ρΗ7·0)，0·1 % (O. lg/100ml) SDS, O. OlM EDTA(pH8. 0),20% (體積百分含量)甲醇，O. 1% (體積百分含量)Triton X-100,0. 1% (體積百分含量)巰基乙醇。以上濃度均為終濃度。實(shí)施例I、ZmANT啟動(dòng)子的克隆根據(jù)玉米ZmANT基因組序列的5’側(cè)翼序列(GenBank AC196479. 3)設(shè)計(jì)了 2條引物Antp-F和Antp-R。以玉米(Zea mays L.)品種自交系B73 (國(guó)家種子庫(kù),庫(kù)編號(hào)為 I1G13943)的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Antp-F 5/ -AAGCTTAAGGAGCAAAGCGACTCGGTTAC-3'(劃線部分為 Hind III 的識(shí)別序列，其后的序列為序列I的第1-23位)Antp-R 5/ -CCATGGTGTCGGCGTTGGTAGGTGATGCG-3'(劃線部分為 Nco I 的識(shí)別序列，其后的序列為序列I的第1386-1408位的反向互補(bǔ)序列)擴(kuò)增體系10XPCR反應(yīng)緩沖液5 μ L，dNTP混合物(每種IOmM) I μ L，引物 Antp-F (10 μ Μ) I μ L,引物 Antp-R(10 μ Μ) I μ L,高保真酶 Prime-Star (5U/ μ L) 0· 5 μ L,基因組DNA模板(濃度為IOng/ μ L) 0. 5 μ L，DMSO 2 μ L，滅菌水定容至50 μ L。擴(kuò)增條件98°CImin ；94°C 20s，58。。20s，72。。2min,30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；4°C保存。結(jié)果如圖I所示用引物Antp-F和Antp-R擴(kuò)增得到大小約為1500bp的目的條帶。將擴(kuò)增條帶回收純化后連接到pGEM-T-Easy載體上，得到的重組載體命名為 pGEM-T-ZmANTp。對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明與ZmANT基因的5’側(cè)翼序列 (GenBank AC196479. 3))比較，一致性為100%，表明擴(kuò)增正確。將該片段的前1410bp命名為ZmANTp，其具體的核苷酸序列如序列表中序列I所示。實(shí)施例2、啟動(dòng)子(ZmANTp)功能活性驗(yàn)證一、含有啟動(dòng)子序列的重組表達(dá)載體p3301-ZmANTp-GUS的構(gòu)建根據(jù)引物Antp-F和Antp-R兩端設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，用Hind III和Nco I將ZmANTp 片段從實(shí)施例I構(gòu)建所得的pGEM-T-ZmANTp重組載體上切下，把酶切后回收的ZmANTp片段與經(jīng)Hind III和Nco I酶切的pCAMBIA3301載體片段相連。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5a菌株中，提取質(zhì)粒DNA，用Hind III和NcoI酶切鑒定。對(duì)初步鑒定正確的重組質(zhì)粒 (有大小約為1500bp的酶切目的條帶)進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序表明含有序列I所示1410bp的重組表達(dá)載體命名為p3301-ZmANTp-GUS。在重組表達(dá)載體p3301-ZmANTp-GUS中，序列I所示的ZmANTp位于⑶S基因的上游，在適當(dāng)條件下會(huì)啟動(dòng)⑶S基因的表達(dá)。二、轉(zhuǎn)基因玉米的獲得及鑒定I、轉(zhuǎn)基因玉米的獲得
(I)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌大量提取步驟一構(gòu)建的重組表達(dá)載體p3301-ZmANTp-GUS的質(zhì)粒DNA，取20μ L(約 I μ g)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，在28°C YEP培養(yǎng)基(含卡那霉素100 μ g/ml，利福平125 μ g/ml)上培養(yǎng)兩天。挑選單克隆做菌液PCR鑒定，引物為Antp-F :5' -AAGCTTAAG GAGCAAAGCGACTCGGTTAC-3'和 Antp-Rj' -CCATGGTGTCGGCGTTGGTAGGTGATGCG-3'。將擴(kuò)增出大小約為1500bp目標(biāo)條帶的單克隆農(nóng)桿菌命名為EHA105/p3301-ZmANTp-GUS。同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)入p3301空載體的農(nóng)桿菌對(duì)照(命名為EHA105/p3301)和轉(zhuǎn)入pCAMBIA3301載體的農(nóng)桿菌對(duì)照(EHA105/pCAMBIA3301)。pCAMBIA3301載體自身在⑶S基因的上游有組成型啟動(dòng)子CaMV35S。而所述p3301空載體具體為將pCAMBIA3301載體用Hind III和Nco I雙酶切 (切除了 CaMV35S啟動(dòng)子)后補(bǔ)平粘性末端后直接連接而得的載體。所述p3301空載體中不存在啟動(dòng)GUS基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米幼胚將步驟(I)所得的農(nóng)桿菌EHA105/p3301-ZmANTp-GUS、EHA105/pCAMBIA3301 或 EHA105/p3301繼代2天后的單菌落，在加有相應(yīng)抗生素的YEP培養(yǎng)基劃線，于22°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，將菌落刮入Inf侵染培養(yǎng)基中至OD為O. 3-0. 4，搖3個(gè)小時(shí)后可做侵染備用。將玉米品種Hi-II (C. L. Armstrong, C. E. Green, R. L. Phillips. Development and availability of germplasm with high Type II culture formation response.In Vitro Cell. Dev Biol-Plant, 1996 (32) :179-183)的幼胚放入含有 2ml Inf 侵染培養(yǎng)基和 2μ I 乙酰丁香酮(100mM/ml)的離心管中，用該侵染液洗滌幼胚三次，倒掉侵染液后加入Iml的上述準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌懸浮液(0D600為0. 3-0. 4)到幼胚中，輕輕顛倒離心管20次，侵沒(méi)幼胚垂直靜止10分鐘(22°C黑暗)，幼胚侵染完成。侵染完成后將離心管中的菌液吸干，將幼胚放到CO-C共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，22°C暗培養(yǎng)3天。侵染后的幼胚用⑶S染色確定EHA105/ p3301-ZmANTp-GUS的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率在50%以上，如圖2中A所示。(3)轉(zhuǎn)基因玉米的獲得把共培養(yǎng)后的幼胚轉(zhuǎn)入Resting靜息培養(yǎng)基上，28°C，暗培養(yǎng)7_12天。使侵染后的幼胚得到充分恢復(fù)，長(zhǎng)出新的愈傷。然后使用N6S選擇培養(yǎng)基進(jìn)行四次選擇篩選。在N6S 選擇培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加草丁膦，使四次篩選時(shí)，草丁膦篩選濃度由低到高依次為I. 5mg/ L，2. 5mg/L, 3mg/L, 3mg/L,每輪篩選時(shí)間都為14天。四輪篩選后正常生長(zhǎng)的愈傷為抗性愈傷，如圖2中B所示。將抗性愈傷誘導(dǎo)生苗。誘導(dǎo)之前需經(jīng)過(guò)篩選后的恢復(fù)，恢復(fù)后膨大的細(xì)胞在光下再生成苗，所用培養(yǎng)基為RI再生培養(yǎng)基。之后再在培養(yǎng)基上加6-BA(即RII再生培養(yǎng)基)促進(jìn)分化。當(dāng)再生植株長(zhǎng)到三片葉時(shí)(確定有主莖)，可將幼苗分移到含生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，所用培養(yǎng)基為瓶用培養(yǎng)基，28°C光照(3000Lx，16小時(shí))培養(yǎng)，圖2中C為成苗的圖片。當(dāng)幼苗長(zhǎng)出新的根后(大約三條根)，將幼苗從瓶中取出，用自來(lái)水(室溫)沖凈培養(yǎng)基，移栽于混有營(yíng)養(yǎng)土和蛭石(I I)的花盆中，當(dāng)玉米又長(zhǎng)出2-3片新葉移到大花盆中或大田中，為轉(zhuǎn)基因玉米Ttl代，繼續(xù)培養(yǎng)獲得下一代種子。2、轉(zhuǎn)基因玉米的分子檢測(cè)(I)轉(zhuǎn)基因玉米R(shí)NA提取及反轉(zhuǎn)錄
取步驟I篩選得到的Ttl代轉(zhuǎn)基因玉米的葉片，提取RNA。RNA提取方法參照Trizol 總RNA提取試劑盒(Invitrogen)說(shuō)明書進(jìn)行。對(duì)總RNA進(jìn)行純化，純化體系為50 μ L體系， 包括 30μ g 總 RNA、5y L IOXDNase I 緩沖液、2yL DNase I (5U μ L-1)、0· 5 μ L RNA 酶抑制劑，加DEPC水至50 μ L ;37°C反應(yīng)30min -M /氯仿抽提后用冷無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀，_20°C放置Ih ;離心回收沉淀，用冷的70%乙醇清洗沉淀，真空干燥；用適量的DEPC水溶解。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA在260nm，280nm及230nm處的光吸收值，確定RNA的濃度及純度。按照IOD = 40 μ g RNA計(jì)算RNA產(chǎn)率。0D260/0D280在I. 8 2. O之間視為RNA的純度很高。甲醛變性凝膠電泳，檢測(cè)總RNA的完整性。RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，反轉(zhuǎn)產(chǎn)物稀釋5 10倍，作為PCR模板。(2)轉(zhuǎn)基因玉米PCR檢測(cè)首先，根據(jù)pCAMBIA 3301載體上的抗草丁膦基因-Bar基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物 Bar-F和Bar-R，用這對(duì)引物以上述步驟(I)所得的轉(zhuǎn)基因玉米Ttl代的cDNA作為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。以玉米持家基因alpha-tubulin4作為內(nèi)參基因，其引物為Tub-F和Tub_R。同時(shí)設(shè)置如下三個(gè)對(duì)照正對(duì)照(轉(zhuǎn)入pCAMBIA 3301載體的轉(zhuǎn)基因植株)、負(fù)對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因玉米植株)和空白對(duì)照(以水代替cDNA作為PCR擴(kuò)增模板)。Bar-R 5' -ACTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGT-3'Bar-F 5/ -GCACCATCGTCAACCACTACATCGA-3'Tub-F 5/ -GCTATCCTGTGATCTGCCCTGA-3' Tub-R 5' -CGCCAAACTTAATAACCCAGTA-3'PCR反應(yīng)體系10X緩沖液2. 5 μ L，dNTP混合物(每種IOmM) O. 5 μ L，上下游引物 (濃度均為10 μ Μ)各O. 5 μ L，Taq酶(濃度為5U/ μ L) O. 5 μ L，cDNA模板(濃度為20ng/ μ L) I μ L,滅菌水定容至25 μ L。PCR檢測(cè)結(jié)果如圖3中A所示，正對(duì)照(轉(zhuǎn)入pCAMBIA 3301載體的轉(zhuǎn)基因植株) 擴(kuò)增出大小為300bp左右的目的條帶；負(fù)對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因玉米植株)和空白對(duì)照(以水代替cDNA作為PCR擴(kuò)增模板)均沒(méi)有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生。這說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果可信。轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體p3301-ZmANTp-GUS的Ttl代轉(zhuǎn)基因玉米植株中，擴(kuò)增出大小約為300bp左右目的條帶的植株鑒定為陽(yáng)性，將其中的兩個(gè)編號(hào)為1-5-1和1-70。同時(shí)，轉(zhuǎn)入p3301空載體的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)基因植株的擴(kuò)增目的條帶大小也為300bp左右。其次，將經(jīng)上述Bar基因鑒定陽(yáng)性的Ttl代轉(zhuǎn)基因玉米植株(包括轉(zhuǎn)入 p3301-ZmANTp-GUS、p3301或pCAMBIA 3301的植株)自交授粉，獲得T1代種子，將T1代種子種入大田，每個(gè)轉(zhuǎn)化事件隨機(jī)挑選12粒種子種I行，取幼苗葉片，用上述Bar基因的鑒定方法進(jìn)行鑒定，對(duì)鑒定陽(yáng)性植株進(jìn)行自交授粉，獲得T2代種子，單株收獲，每株隨機(jī)挑選12 粒種子種入大田，取幼苗葉片對(duì)其T2代植株進(jìn)行Bar基因鑒定，選取12株全為陽(yáng)性的后代， 說(shuō)明該轉(zhuǎn)化事件的T2代種子已經(jīng)純合。對(duì)這些T2代純合的植物，選用⑶S基因引物⑶S-F 和GUS-R，用與Bar基因檢測(cè)相同的方法檢測(cè)GUS基因在轉(zhuǎn)基因玉米中的RNA表達(dá)水平。CTS-Fj' -CAGGAAGTGATGGAGCATCAG-3'⑶S-R 5' -TCGTGCACCATCAGCACGTTA-3'⑶S基因檢測(cè)結(jié)果如圖3中B所示，正對(duì)照(轉(zhuǎn)入pCAMBIA 3301載體的轉(zhuǎn)基因植株)擴(kuò)增出大小約為600bp的目的條帶；負(fù)對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因玉米植株)和空白對(duì)照(以水代替cDNA作為PCR擴(kuò)增模板)均沒(méi)有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生。這說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果可信。轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體p3301-ZmANTp-GUS的T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米植株中，擴(kuò)增出大小約為600bp目的條帶的植株鑒定為陽(yáng)性，其中編號(hào)為1-5-1和1-70的兩個(gè)株系中⑶S表達(dá)水平較高。而轉(zhuǎn)入 P3301空載體的T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米植株，由于沒(méi)有啟動(dòng)子啟動(dòng)GUS基因的轉(zhuǎn)錄，致使GUS 基因鑒定結(jié)果均為陰性，即擴(kuò)增產(chǎn)物均沒(méi)有目的條帶。實(shí)施例3、ZmANTp啟動(dòng)子的活性檢測(cè)一、ZmANTp啟動(dòng)子活性分析I、實(shí)驗(yàn)材料實(shí)施例2所得的編號(hào)為1-5-1和1-70的兩個(gè)攜帶有ZmANTp基因的T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米株系，轉(zhuǎn)入P3301空載體的轉(zhuǎn)基因玉米株系，轉(zhuǎn)入pCAMBIA 3301載體的轉(zhuǎn)基因玉米株系(正對(duì)照)，非轉(zhuǎn)基因玉米株系(負(fù)對(duì)照)。2、實(shí)驗(yàn)方法(I)⑶S染色分析FAA配方(IOOml):乙醇50ml，冰醋酸5ml，甲醛10ml，高純水35ml。取步驟I中所述的各個(gè)玉米株系，將其幼苗期的根和葉在GUS染液中37°C避光染色過(guò)夜。其中，葉在染色之前需要在丙酮中脫色30min，倒掉染色液將樣品放入FAA固定液中，浸泡8h，然后轉(zhuǎn)入酒精和叔丁醇中進(jìn)行脫水、透明和浸蠟，包埋蠟塊進(jìn)行切片，觀察⑶S 染色的情況，分析ZmANTp啟動(dòng)子的活性部位。⑶S染色結(jié)果如圖4所示，實(shí)施例2所得的編號(hào)為1-5-1和1_70的兩個(gè)攜帶有 ZmANTp基因的T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米株系染色后，發(fā)現(xiàn)根被染成深藍(lán)色，葉中表達(dá)很微弱； 而轉(zhuǎn)入pCAMBIA 3301載體的轉(zhuǎn)基因玉米株系(正對(duì)照)在地上部和根中都被染成深藍(lán)色， 表達(dá)量類似；非轉(zhuǎn)基因玉米株系(負(fù)對(duì)照)和轉(zhuǎn)入P3301空載體的轉(zhuǎn)基因玉米株系沒(méi)有被染色。這一結(jié)果首先表明ZmANT基因起始密碼子ATG上游1410bp的序列(ZmANTp，序列I) 可以啟動(dòng)報(bào)告基因⑶S在玉米中表達(dá)。其次，從表達(dá)信號(hào)來(lái)看ZmANTp驅(qū)動(dòng)的⑶S基因主要表達(dá)在幼苗的根中，葉中表達(dá)非常微弱。(2)⑶S活性檢測(cè)取步驟I中所述的各個(gè)玉米株系，提取其幼苗期的根和葉的總蛋白，定量檢測(cè)GUS 基因編碼蛋白β_葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)的活性,分析ZmANTp的組織特異性驅(qū)動(dòng)活性。具體操作如下A、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用反應(yīng)終止液(O. 2mol/L Na2CO3)將4_MU(4_甲基傘形酮)配制成O. OOpmol,
6.25pmol、12. 50pmol、50. OOpmol>100. OOpmol>250. OOpmol>500. OOpmol 和 1000. OOpmol 的系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，通過(guò)測(cè)定它們的熒光強(qiáng)度，作出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。B、總蛋白提取與蛋白濃度的測(cè)定I)取O. Ig材料(步驟I中所述的各個(gè)玉米株系幼苗期的根或葉)于I. 5ml離心管中，加入液氮，研成粉末。2)加600 μ L酶提取液，13000rpm 4 V離心lOmin，取上清于一新的離心管中，-20°C保存?zhèn)溆谩?)取50 μ L上清，用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定蛋白的含量。
C、β -葡萄糖苷酸酶的酶促反應(yīng)及其熒光定量I)取50 μ L步驟Β2)制備所得的含⑶S的上清，加入到450 μ L經(jīng)37°C預(yù)熱的檢測(cè)液(2mmol/L 4-MUG溶液)中，迅速充分混勻進(jìn)行反應(yīng)。2)立刻從上述步驟I)的反應(yīng)液中取出50yL，加入到950yL反應(yīng)終止液 (O. 2mol/L Na2CO3)，將該管作為酶促反應(yīng)的O點(diǎn)。3)分別在反應(yīng)10min、20min、30min、45min和60min時(shí),從上述步驟I)的反應(yīng)液中取出50 μ L，轉(zhuǎn)入950 μ L的反應(yīng)終止液中。4)酶促反應(yīng)結(jié)束后，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)365nm、發(fā)射波長(zhǎng)455nm下，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的熒光值。5)根據(jù)步驟4)測(cè)定的熒光值，以及參與反應(yīng)的總蛋白的量，計(jì)算每個(gè)樣品單位時(shí)間內(nèi)GUS活性。其中計(jì)算方法為根據(jù)步驟4)所測(cè)熒光值及步驟A的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到的單位時(shí)間的MU濃度變化，再用單位時(shí)間的MU濃度變化除以步驟B測(cè)得的參加反應(yīng)的樣品蛋白含量，求出單位質(zhì)量的蛋白單位時(shí)間的MU濃度變化，即為單位時(shí)間內(nèi)的GUS活性。具體公式GUS活性=單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)生成的MU/蛋白量(單位nmol4-MU. mirT1. g_1蛋白)。對(duì)實(shí)施例2所得的編號(hào)為1-5-1的攜帶有ZmANTp基因的T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米株系的檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，ZmANTp驅(qū)動(dòng)的GUS基因在幼苗的根中表達(dá)活性是葉中的100倍。 這一結(jié)果表明ZmANTp啟動(dòng)子是一個(gè)在幼苗根中表達(dá)活性很強(qiáng)的啟動(dòng)子。二、ZmANTp啟動(dòng)子活性位點(diǎn)的檢測(cè)為進(jìn)一步說(shuō)明ZmANTp (序列I)在玉米根中的活性位點(diǎn)，取GUS基因表達(dá)水平高的兩個(gè)玉米純合系植株，即實(shí)施例2所得的編號(hào)為1-5-1和1-70的兩個(gè)攜帶有ZmANTp基因的T2代純合轉(zhuǎn)基因玉米株系。同時(shí)以轉(zhuǎn)入pCAMBIA 3301載體的轉(zhuǎn)基因玉米株系作為正對(duì)照，以非轉(zhuǎn)基因玉米株系作為負(fù)對(duì)照。將其幼苗期的根在GUS染液中37°C避光染色過(guò)夜。 然后切片觀察在根中不同組織中的GUS染色情況，分析ZmANTp啟動(dòng)子的活性位點(diǎn)。根⑶S染液結(jié)果如圖6所示轉(zhuǎn)入pCAMBIA 3301載體的轉(zhuǎn)基因玉米株系(正對(duì)照)整個(gè)根都被染成了深藍(lán)色；非轉(zhuǎn)基因玉米株系(負(fù)對(duì)照)整個(gè)根均不被染色；而編號(hào)為 1-5-1和1-70的兩個(gè)T2R純合轉(zhuǎn)基因玉米株系均在根尖部位被染色。這一結(jié)果表明ZmANTp 啟動(dòng)子在植物根尖具有很高的活性。根切片結(jié)果如圖7所示，表明兩個(gè)轉(zhuǎn)基因純合系幼苗根部表現(xiàn)的GUS活性都定位在根的中柱鞘細(xì)胞?？傊?，以上結(jié)果充分說(shuō)明了 ZmANTp啟動(dòng)子是一個(gè)在玉米根尖中高表達(dá)，并且表達(dá)部位主要集中在中柱鞘細(xì)胞中。
權(quán)利要求
1.DNA分子,為如下I) -3)中任一種1)序列表中序列I所不的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子； 所述3)中的DNA分子，與I)或2)限定的DNA分子最好有95%以上的同源性。
2.含有權(quán)利要求I所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于所述重組載體中，由權(quán)利要求I所述的DNA分子啟動(dòng)目的基因的表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在pCAMBIA3301的多克隆位點(diǎn)插入權(quán)利要求I所述DNA分子得到的重組質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒，其特征在于所述表達(dá)盒由權(quán)利要求I所述的DNA分子，由所述DNA分子啟動(dòng)表達(dá)的目的基因，以及終止所述目的基因轉(zhuǎn)錄的終止序列組成。
6.權(quán)利要求I所述DNA分子在啟動(dòng)目的基因在植物中表達(dá)中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為玉米。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于所述表達(dá)為根特異表達(dá)。
9.利用權(quán)利要求I所述的DNA分子培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟1)構(gòu)建目的基因重組表達(dá)載體將目的基因插入權(quán)利要求2-4中任一所述重組載體， 使權(quán)利要求I所述的DNA分子啟動(dòng)所述目的基因表達(dá)，得到目的基因重組表達(dá)載體；2)將步驟I)構(gòu)建的目的基因重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中，得到在根中特異表達(dá)所述目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述目的植物為玉米。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種乙醛脫氫酶基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子為為如下1)-3)中任一種1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；所述3)中的基因，與1)或2)限定的基因最好有95％以上的同源性。本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)目的基因在幼苗根中高效特異性表達(dá)，并且表達(dá)部位定位在中柱鞘，這對(duì)于進(jìn)一步研究增強(qiáng)植物對(duì)養(yǎng)分高效吸收利用具有非常重要的意義。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102604956SQ20121010210
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月9日
發(fā)明者安霞, 張福鎖, 袁力行, 陳范駿, 顧日良 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)