專利名稱：包含有乙醛脫氫酶的解酒藥的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及解酒藥的新用途，具體而言，涉及包含有乙醛脫氫酶的解酒藥用于心臟的保護和心臟病的治療保健食品或藥物。
背景技術(shù)：
心臟被稱為人體“發(fā)動機”，心臟是一個健壯、不知疲倦、努力工作的強力泵。心臟之于身體，如同發(fā)動機之于汽車。如果按一個人心臟平均每分鐘跳70次、壽命70歲計算的話，一個人的一生中，心臟就要跳動26億次。一旦心臟停止跳動而通過搶救不能復(fù)跳，那就意味著，一個人的生命終止了。心臟是人類健康的頭號殺手，全世界1/3的人口死亡是因心臟引起的，而我國，每年有幾十萬人死于心臟病。
由是可見，心臟之于人類的重要意義。保護心臟的方式很多，比如培養(yǎng)健康合理的生活習(xí)慣，保持平和的心態(tài)，堅持適量運動，如果萬一患上心臟病，不得不進行治療，目前常用的心臟病藥物有速效救心丸、復(fù)方丹參片、地奧心血康和天士力復(fù)方丹參滴丸，這些藥物藥效顯著，但是其副作用也不容忽視。
解酒藥發(fā)揮解酒防醉作用的重要成分就是ALDH2，由生物酶技術(shù)生產(chǎn)，它是快速分解乙醛的酶，而乙醛是酒精代謝過程中對人體危害最大的物質(zhì)。
通過研究結(jié)果證實乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase2，ALDH2)高表達可以發(fā)揮心肌保護作用，減少缺氧導(dǎo)致的心肌細胞凋亡。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供解酒藥的新用途，具體而言，就是將包含有乙醛脫氫酶的解酒藥用于心臟的保護和心臟病的治療保健食品或藥物。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種包含有乙醛脫氫酶的解酒藥的新用途，將含有乙醛脫氫酶的解酒藥用于心臟的保護和心臟病的治療保健食品或藥物。
在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，所述的包含有乙醛脫氫酶的解酒藥是指含有乙醛脫氫酶的保健品或藥物，包括海王金樽，安體普，或解酒神茶等。
在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，所述的心臟病包括冠狀動脈粥樣硬化性心臟病以及心力衰竭。其中，所述的心力衰竭是指各種原因引起如缺血性心臟病、風(fēng)濕性心臟病、瓣膜性心臟病、原發(fā)性擴張性心肌病等。
本發(fā)明的原理是由于解酒藥能通過補充ALDH2而減輕心肌缺血/再灌注損傷。以下通過動物實驗說明選擇市面上一種能提高ALDH2的解酒藥(以下簡稱藥物組)，比較該藥物與辛伐他汀(他汀類藥物)對大鼠缺血再灌注后損傷的影響。其中，他汀類藥物是目前臨床上常用、有效的調(diào)脂藥物。另外，近年來，他汀類藥物的非調(diào)脂作用日益受到關(guān)注，臨床研究發(fā)現(xiàn)，早期應(yīng)用他汀類藥物能明顯改善心肌梗死及不穩(wěn)定型心絞痛患者的預(yù)后，降低發(fā)病率、死亡率。
藥物組采用海王金樽(海王集團)，主要成分為牡蠣提取物，提高乙醛脫氫酶活性。通過實驗證明含有乙醛脫氫酶的解酒藥對心臟的保護和心臟病的治療有效。
本發(fā)明所稱的解酒藥除海王金樽外，還包括
1.安體普(原蘇聯(lián)特工使用解酒藥RU21)安體普所含的活性物質(zhì)激勵體內(nèi)產(chǎn)生乙醛脫氫酶，并提高其活性，全面提升機體對乙醛的分解能力，達到主動解酒、清醒護體之功效。
2、內(nèi)蒙古赤峰市杰恩天然生物資源研究開發(fā)部(解酒醒神茶)解酒醒神茶所應(yīng)用的核心技術(shù)乙醛脫氫酶是用生物酶技術(shù)生產(chǎn)的，它能快速分解乙醛所必須的酶。而乙醛是酒精代謝過程中對人體危害最大的物質(zhì)。乙醛脫氫酶直接分解乙醛而達到解酒防醉的目的。作為解酒醒神茶的重要成分，它在解酒防醉過程中的作用是無可取代的。
3.其它用乙醛脫氫酶制成的保健食品或藥物。


圖1為缺血再灌注模型示意圖；圖2為TTC染色法評價藥物對缺血再灌注后心肌保護的作用示意圖；圖3為ALDH2腺病毒顆粒的轉(zhuǎn)染效率示意圖；圖4為RT-PCR測定ALDH2病毒顆粒的轉(zhuǎn)染效率示意圖；圖5為乙醛代謝法測定轉(zhuǎn)染后ALDH2酶活性示意圖；圖6為采用Hoechest 33324法檢測細胞凋亡示意圖；圖7為采用TUNEL法檢測細胞凋亡示意圖；圖8為采用流式細胞儀法檢測細胞凋亡示意圖。
其中，圖1和圖2中的藥即指解酒藥。
具體實施例方式
例1一、實驗材料SD大鼠6-8周齡，體重250g(購于中科院實驗動物中心)伊文思藍國藥集團化學(xué)試劑有限公司四氮唑(TTC)上海靈錦精細化工有限公司氯胺酮手術(shù)器械眼科剪，止血鉗，鑷子，剪毛剪，持針器，三齒撐開器，接扎線，縫合線，刀片小動物呼吸機尼康相機二、實驗過程1.實驗分組SD大鼠分成3組(生理鹽水對照組；藥物組；辛伐他汀組)，每組10只。手術(shù)前三天分別用生理鹽水(1ml/kg體重)灌胃，藥物(50mg/kg)灌胃，腹腔注射辛伐他汀(1mg/kg體重)。
2.術(shù)前準備手術(shù)前半個小時，再次分別用生理鹽水(1ml/kg體重)和藥物(50mg/kg體重)灌胃組，辛伐他汀(1mg/kg體重)采用腹腔注射。觀察大鼠狀態(tài)。
3.建立大鼠缺血再灌注模型3.1大鼠麻醉及固定大鼠腹腔注射氯胺酮(1ml/kg體重)，約2-3分鐘后，大鼠處于麻醉狀態(tài)。此時用皮繩將大鼠四肢和頭部固定于木板上。插入氣管插管，打開呼吸機，呼吸機頻率90，潮氣量0.6。觀察大鼠呼吸頻率、深淺，是否麻醉完全，根據(jù)情況再補注少量氯胺酮。
3.2缺血再灌注酒精清洗大鼠開胸部位，左胸4-5肋間隙處開口，游離表皮和胸大肌和胸小肌，小心避開肋間動脈以防止大量出血，直至清楚暴露4-5肋間隙。鈍性分離肋間隙，撐開器撐開，此時可觀察到跳動的心臟。撕開心包膜，完全暴露心臟。在距冠狀動脈前降支根部1-2mm處(即左心耳與肺動脈圓錐之間)，采用6/0線結(jié)扎，系一個活結(jié)，拉緊結(jié)，結(jié)扎線以下心肌組織外觀蒼白，心前壁跳動減弱。心電圖顯示ST段抬高，放松后心肌組織顏色恢復(fù)，ST段回落，表明模型建立成功。結(jié)扎30min后，松開結(jié)扎線，使冠狀動脈血流再通，再灌注時間為3小時。
4.伊文思藍和四氮唑(TTC)染色評估梗死面積大鼠經(jīng)30min缺血和3小時再灌注后，再度開胸，將原結(jié)扎線收緊，以10g/L的伊文思藍經(jīng)心尖部注入心腔，以區(qū)分缺血區(qū)和非缺血區(qū)，染成藍色的組織為非缺血區(qū)，未著色組織即紅色組織為缺血區(qū)。迅速取下心臟，用生理鹽水洗出心腔和冠脈內(nèi)的血液，吸凈表面水分。在結(jié)扎線水平下將心臟切成1mm左右的薄片5片，將切片浸入0.5mg/ml的TTC磷酸緩沖液中，37℃孵育30min，以區(qū)分缺血區(qū)(缺血心肌，包括缺血梗死區(qū)和缺血未梗死區(qū)心肌)和梗死區(qū)。
5.拍照統(tǒng)計心臟組織用10％的甲醛固定24h，以增強染色顏色對比。經(jīng)以上處理，心肌組織被分區(qū)藍色為正常心肌，淺紅色為缺血區(qū)未梗死心肌，灰白色為缺血梗死心肌。拍照并通過計算機圖像分析軟件計算缺血區(qū)心肌占整個心肌面積的百分比，大于30％者表示模型建立成功，進一步計算梗死心肌占缺血區(qū)心肌的面積百分比來表示梗死程度。數(shù)學(xué)統(tǒng)計分析藥物和辛伐他汀對缺血再灌后心肌細胞損傷的影響。
三、實驗結(jié)果如圖1缺血再灌注模型示意圖所示，三個實驗組中，缺血區(qū)占全心面積的百分比均大于30％，說明建立模型成功。進一步統(tǒng)計分析顯示各組之間缺血區(qū)占全心面積的百分比無顯著差異，說明三組間心肌缺血的程度是相當(dāng)?shù)?，不存在結(jié)扎程度不同而帶來的結(jié)果偏倚。
如圖2 TTC染色法評價藥物對缺血再灌注后心肌保護的作用示意圖所示，圖中分別為辛伐他汀、藥物與生理鹽水(n＝6)對照組在缺血再灌注后的梗死區(qū)/缺血區(qū)的比較。結(jié)果顯示，辛伐他汀(n＝6)和藥物組(n＝6)中細胞梗死率明顯低于生理鹽水對照組(p＜0.001)，二者均能顯著改善缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損害。
四、結(jié)論研究顯示本發(fā)明所提供的藥物與辛伐他汀具有同等的改善缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損害的作用。眾所周知，他汀類藥物是羥甲基戊二酸甲酰輔酶A還原酶抑制劑。
心肌缺血時，內(nèi)皮功能發(fā)生紊亂，中性粒細胞聚集，過氧化反應(yīng)及炎癥反應(yīng)發(fā)生，內(nèi)皮結(jié)構(gòu)破壞，造成血管收縮，血流變慢，局部區(qū)域心肌梗死、心肌細胞凋亡、壞死。他汀類藥物通過增加內(nèi)皮一氧化氮(NO)合成，抑制中性粒細胞聚集，減輕炎癥反應(yīng)及氧化還原反應(yīng)，有效減少梗死面積和緩解心肌缺血再灌注引起的損傷，減輕凋亡、減少壞死細胞數(shù)目。這在本實施例中也得到體現(xiàn)，而藥物的保護作用與辛伐他汀相當(dāng)，這預(yù)示了以該藥物為代表的解酒藥在改善心肌缺血及心梗后改善殘存心肌功能方面具有廣闊臨床應(yīng)用前景。
例2一、實驗?zāi)康耐ㄟ^檢測轉(zhuǎn)染野生和缺失型乙醛脫氫酶2(ALDH2*1/ALDH2*2)基因，對大鼠心肌細胞在缺氧狀態(tài)下發(fā)生凋亡的影響，進一步證明ALDH2對心肌細胞凋亡的保護作用。
二、材料材料與例1相同。
三、實驗步驟
(一)建立細胞缺氧模型，采用與例1相同方法建立細胞缺氧模型。
(二)檢測細胞凋亡，比較轉(zhuǎn)染野生和缺失型乙醛脫氫酶2(ALDH2*1/ALDH2*2)基因后，大鼠心肌細胞在對缺氧所致凋亡的變化。凋亡的測定通過用Hoechest 33324、免疫熒光標記的流式細胞儀(FACS)和TUNEL試劑盒檢測。
四、實驗結(jié)果轉(zhuǎn)染ALDH2野生型和缺失型基因后再缺氧，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)染缺失型的心肌細胞對缺氧性損傷的耐受性明顯差于野生型，細胞凋亡的改變有Hoechest 33324染色中，細胞核溶解和核碎裂P＜0.05，在FACS和TUNEL檢測中，凋亡細胞明顯增加P＜0.05)。
五、結(jié)論通過上述實驗結(jié)果證明，ALDH2酶活性降低可增加心肌細胞對缺氧導(dǎo)致凋亡的易感性，ALDH2對缺氧引起的細胞凋亡損傷具有保護作用。
如圖3ALDH2腺病毒顆粒的轉(zhuǎn)染效率示意圖所示，用攜帶綠熒光蛋白的空載體轉(zhuǎn)染，得到的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率＞50％。
如圖4 RT-PCR測定ALDH2病毒顆粒的轉(zhuǎn)染效率示意圖所示，RT-PCR測定ALDH2病毒顆粒的轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR反應(yīng)轉(zhuǎn)染ALDH2野生型(*1)和缺失型(*2)結(jié)果，為187bp.
如圖5乙醛代謝法測定轉(zhuǎn)染后ALDH2酶活性示意圖所示，用分光光度計(340nm)測定轉(zhuǎn)染ALDH2野生型(*1)和缺失型(*2)后的酶活性，野生型最高，缺失型最低，有顯著性差異，乙醛代謝法測定轉(zhuǎn)染后ALDH2酶活性P＜0.05。
2.ALDH2腺病毒顆粒對缺氧損傷的抗凋亡作用2.1采用Hoechest 33324法檢測細胞凋亡如圖6采用Hoechest 33324法檢測細胞凋亡示意圖所示，經(jīng)Hoechest 33324染色，轉(zhuǎn)染缺失型ALDH2基因再缺氧的心肌細胞中，核固縮核碎裂現(xiàn)象明顯增多。
2.2采用TUNEL法檢測細胞凋亡如圖7采用TUNEL法檢測細胞凋亡示意圖所示，經(jīng)TUNEL-DAB染色，轉(zhuǎn)染缺失型ALDH2基因再缺氧的心肌細胞相對于野生型的凋亡細胞明顯增多。
2.3采用流式細胞儀法檢測細胞凋亡如圖8采用流式細胞儀法檢測細胞凋亡示意圖所示，經(jīng)FITC標記的Annexin-V測定，轉(zhuǎn)染缺失型ALDH2基因再缺氧的心肌細胞相對于野生型的凋亡細胞明顯增多，*P＜0.01相比于對照組，+P＜0.05相比于缺氧組，++P＜0.001相比于ALDH2*1預(yù)處理缺氧組。
酒精的代謝需要人體內(nèi)的兩種酶(乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶)參與。首先乙醇在乙醇脫氫酶的作用下，氧化成乙醛，然后，乙醛又在乙醛脫氫酶的作用下氧化成乙酸，這樣就完成了最終的代謝。乙醛具有擴張人體血管的作用。臉紅和醉酒，是乙醛在體內(nèi)停留引起的。不少人缺少第二種酶，就會引起乙醛在體內(nèi)堆積。
權(quán)利要求
1.一種包含有乙醛脫氫酶的解酒藥的新用途，用于心臟的保護和心臟病的治療保健食品或藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包含有乙醛脫氫酶的解酒藥的新用途，其特征在于所述的解酒藥為含有乙醛脫氫酶保健品或藥物，包括海王金樽，安體普，或解酒神茶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的包含有乙醛脫氫酶的解酒藥的新用途，其特征在于所述的心臟病包括冠狀動脈粥樣硬化性心臟病以及各種心臟病引起的心力衰竭。
全文摘要
本發(fā)明公開一種包含有乙醛脫氫酶的解酒藥的新用途，用于心臟的保護和心臟病的治療保健食品或藥物，其原理是，解酒藥能通過補充ALDH2而減輕心肌缺血/再灌注損傷，該解酒藥為含有乙醛脫氫酶保健品或藥物，包括海王金樽，安體普，或解酒神茶等，所述的心臟病包括冠狀動脈粥樣硬化性心臟病以及各種心臟病引起的心力衰竭等。
文檔編號A23L1/30GK101091793SQ20071004155
公開日2007年12月26日 申請日期2007年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月1日
發(fā)明者葛均波, 孫愛軍, 鄒云增, 王克強, 俞佳艷, 賈劍國, 徐丹令 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院