專利名稱：一種陸生伊薩酵母乙醛脫氫酶基因及其表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種陸生伊薩酵母乙醛脫氫酶基因及其 表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
人類飲酒后90%的乙醇在肝內(nèi)主要通過三個(gè)酶系統(tǒng)被氧化細(xì)胞質(zhì)中的 乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)；微粒體乙醇氧化系統(tǒng)中的細(xì)胞色素 P4502E1 (CYP2E1)；過氧化物酶體中的過氧化物酶。ADH和CYP2E1是乙醇代謝的主要酶，產(chǎn) 生第一個(gè)和主要產(chǎn)物——乙醛，一種具有高細(xì)胞毒性，可誘導(dǎo)基因突變的致癌物質(zhì)；乙醛經(jīng) 乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)轉(zhuǎn)化成乙酸，通過TCA循環(huán)代謝為二氧 化碳和水。乙醛若未被及時(shí)降解會(huì)引起酒精敏感反應(yīng)(表現(xiàn)為臉紅、心搏快速、血壓下降、 頭暈、惡心、嘔吐等)，還能導(dǎo)致器官病變。乙醛脫氫酶是一類依賴輔酶NAD(P)+催化內(nèi)源及外源醛類底物為相應(yīng)的羧酸類、 具有相似的一級(jí)特征結(jié)構(gòu)的氧化還原酶類。該酶廣泛于自然界中，在動(dòng)物、植物和微生物中 均有發(fā)現(xiàn)，具有重要的生理代謝意義。據(jù)報(bào)道截止至2002年，已有555種編碼ALDH的基因 被發(fā)現(xiàn)。迄今發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)至少有12種ALDH同工酶，常見的有ALDH1-ALDH4四種，分別由定 位于不同染色體的4個(gè)基因編碼。其中，位于肝細(xì)胞線粒體內(nèi)的ALDH2，由定位于人12號(hào)染 色體的ALDH2基因編碼，與60%以上的乙醛代謝有關(guān)，可將乙醛轉(zhuǎn)化為毒性較低、無(wú)致癌作 用的乙酸。ALDH2基因在外顯子12處發(fā)生點(diǎn)突變(Glu487 Cys)，引起ALDH2失活。突變基 因ALDH2(2)對(duì)野生型ALDH2(1)為顯性，這樣的ALDH2 (2)純合子和雜合子攜帶者的ALDH2 均無(wú)活性，表現(xiàn)出明顯的遺傳和疾病的多態(tài)性，多見于亞洲人種。這種人飲酒后乙醛不能及 時(shí)代謝，造成乙醛蓄積中毒，引起面紅、頭痛和惡心等不愉快反應(yīng)，但是不易使人酗酒，有力 地保護(hù)了 ALDH2(2)攜帶者。相反，ALDH2(1)純合型能及時(shí)代謝血中乙醛，飲酒出現(xiàn)輕松愉 快感，易成為酗酒人群，引發(fā)酒精性肝病。但若ALDH2(2)攜帶者飲酒后乙醛的天然抑制作 用被其嗜酒個(gè)性所抵消，高濃度的乙醛會(huì)長(zhǎng)期積蓄在體內(nèi)。即使比ALDH2(1)純合型攝入的 酒精量少，雜合型習(xí)慣性飲酒者個(gè)體可能會(huì)有酒精性肝病的較高風(fēng)險(xiǎn)?；诰凭x中存在的ALDH基因多態(tài)性，開發(fā)高活性的ALDH是解酒制品研究的 重點(diǎn)方向之一。通過克隆高活性的ALDH基因，選擇合適的高效表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建生產(chǎn)ALDH的 功能菌株來(lái)研制合適的解酒制品，將不僅有助于乙醛脫氫酶基因缺陷的人群飲酒后快速醒 酒、預(yù)防和治療各種酒精性疾病，還能減輕和消除飲酒對(duì)人體健康的損害和對(duì)社會(huì)的不良 影響。本發(fā)明涉及的菌株陸生伊薩酵母Issatchenkia terricola XJ-2是本發(fā)明人從新 疆馬奶葡萄中分離出的一株產(chǎn)ALDH的菌株，經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索證實(shí)該菌株來(lái)源的ALDH 及其基因未見報(bào)道。因此通用生物信息學(xué)的方法，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的ALDH基因資源 中，通過簡(jiǎn)并PCR、Sitefing-PCR及 SEFAPCR 克隆了 陸生伊薩酵母 Issatchenkia terricola XJ-2的ALDH基因，并實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌中的活性表達(dá)，為解酒制品的開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種真核來(lái)源的編碼乙醛脫氫酶 (ALDH)的功能基因。本發(fā)明的另一目的是提供含有該乙醛脫氫酶基因的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種來(lái)自陸生伊薩酵母Issatchenkia terricola XJ-2的乙醛脫氫酶基因，該基 因序列為SEQ ID NO. 16。本發(fā)明所述乙醛脫氫酶基因的開放閱讀框，該開放閱讀框?yàn)橥暾囊胰┟摎涿富?因開放閱讀框，序列為SEQ ID NO. 17。本發(fā)明所述乙醛脫氫酶基因編碼的乙醛脫氫酶，其氨基酸序列為SEQ IDN0. 18。一種從陸生伊薩酵母Issatchenkia terricola XJ-2克隆乙醛脫氫酶基因的 方法在分析NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)種酵母乙醛脫氫酶蛋白質(zhì)序列的基礎(chǔ)上，通過簡(jiǎn)并PCR、 Sitefinding-PCR及SEFA PCR技術(shù)從陸生伊薩酵母全基因組中克隆出乙醛脫氫酶基因。一種乙醛脫氫酶基因重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體是將本發(fā)明所述的乙醛脫氫 酶基因插入表達(dá)載體所得，優(yōu)選將本發(fā)明所述的乙醛脫氫酶基因插入載體pET_32a所得。本發(fā)明所述的乙醛脫氫酶基因在制備解酒制品中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的基因是一種真核來(lái)源編碼乙醛脫氫酶的基因，在原核宿主中具有高 活性表達(dá)優(yōu)勢(shì)。其堿基組成為堿基數(shù)目百分比
A46029. 15
C31519. 96
G33120. 98
T47229. 91
G+C64640. 94。本發(fā)明人在分析NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)種酵母乙醛脫氫酶氨基酸序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì) 簡(jiǎn)并引物，以陸生伊薩酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)基因組DNA為模板，利用簡(jiǎn)并 PCR、Sitef inding-PCR以及SEFAPCR進(jìn)行擴(kuò)增，拼接所有擴(kuò)增產(chǎn)物獲得全長(zhǎng)3255bp的序列， 其中在191處有起始密碼子ATG，在1766bp處有終止密碼子TAA，具有1578bp完整的開放 閱讀框(ORF)。該ORF序列無(wú)內(nèi)含子，編碼525個(gè)氨基酸。編碼產(chǎn)物分子量為57. 223kD，等 電點(diǎn)pi為5. 7。將該ORF序列兩端分別加上BamHI和XhoI限制酶識(shí)別序列，與經(jīng)相同限制 酶消化的pET-32a連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21 (DE3) pLysS,實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。本發(fā)明的有益效果是1.本發(fā)明運(yùn)用生物信息學(xué)，在分析NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)種酵母乙醛脫氫酶蛋白質(zhì)序 列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過簡(jiǎn)并PCR、Sitefinding-PCR和SEFAPCR技術(shù)，從陸生伊薩 酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)中克隆得到一種新型、高活性的乙醛脫氫酶基因。2.在該基因兩端分別加上BamHI和XhoI限制酶識(shí)別序列，與經(jīng)相同限制酶消化的 pET-32a連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21 (DE3)pLysS,實(shí)現(xiàn)了該陸生伊薩酵母乙醛脫氫酶基因的異源表達(dá)，酶活達(dá)44. 23U/mL。3.利用本發(fā)明基因，實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中的重組表達(dá)，克服了發(fā)酵陸生伊薩酵母 (Issatchenkia terricola XJ-2)生產(chǎn)乙醛脫氫酶產(chǎn)量低的缺點(diǎn)，可提供大量的乙醛脫氫 酶進(jìn)行解酒制品的研究；并且為構(gòu)建安全的乙醛脫氫酶基因工程菌奠定了基礎(chǔ)。


圖1重組陸生伊薩酵母乙醛脫氫酶表達(dá)載體構(gòu)建示意圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 陸生伊薩酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)乙醛脫氫酶基因的克 隆將陸生伊薩酵母(Issatchenkiaterricola XJ-2)接入 IOOmL YPD 培養(yǎng)基，30°C， 200rpm培養(yǎng)17h。離心收集菌體，用《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中的酵母DNA的小量制備方法提 取陸生伊薩酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)的基因組DNA。從NCBI網(wǎng)站中搜索幾種酵母乙醛脫氫酶序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，用 C0DEH0P(Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers)禾呈序選擇其中的兩 處高度保守的氨基酸序列VCGQIIPWN和GEVCCAGS，據(jù)此設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物ALD-Fl (SEQ ID NO. 1)和ALD-Rl (SEQ ID N0. 2)，進(jìn)行簡(jiǎn)并PCR擴(kuò)增兩個(gè)保守區(qū)之間的序列。在50 μ 1 體系中，引物 ALD-Fl (SEQ ID NO. 1)和 ALD-Rl (SEQ ID NO. 2)終濃度各為 0. 8 μ M，dNTPs終濃度為0. 2mM,陸生伊薩酵母基因組DNA 10ng, 2U Pfu DNA聚合酶。擴(kuò)增 程序?yàn)?940C 5min, 35 X (94°C 30s, 55°C 60s, 72°C 60s)，72°C IOmin0 瓊脂糖凝膠電泳，切膠， 采用上海生工試劑盒回收，將回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T vector (TaKaRa, Dalian, China) 連接，轉(zhuǎn)化 Ε. coli DH5a (Novagen，Germany，下同)，涂于含有 50 μ L X-gal/IPTG premix、 100μ g/mL氨芐青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)13-14小時(shí)，挑白色菌落，振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒， 確定連接成功后送到上海生工測(cè)序。乙醛脫氫酶基因保守區(qū)的旁鄰序列由Sitefinding-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。這種技 術(shù)涉及了兩種銜頭 SiteFinderl (SEQ ID N0. 3)和 SiteFinder2 (SEQ ID NO. 4)及與之對(duì) 應(yīng)的銜頭序列引物SFPl (SEQ ID N0. 5)、SFP2 (SEQ ID NO. 6)，還有2個(gè)已知基因特異弓丨 物GSP1、GSP2。以乙醛脫氫酶基因保守區(qū)序列的測(cè)序結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)與SiteFinderl和 SiteFinder2 分別匹配的上游引物 GSP-Rl (SEQID N0. 7), GSP-R2 (SEQ ID NO. 8)和下游 引物 GSP-Fl (SEQ ID NO. 9)，GSP-F2 (SEQ ID NO. 10)。Sitefinding-PCR 擴(kuò)增有 3 輪嵌套 反應(yīng)程序。以SiteFinder-I擴(kuò)增保守區(qū)序列5’端為例(保守區(qū)3’端序列的擴(kuò)增則用 SiteFinder-2 替換 SiteFinder-I 并用特異引物 GSP-Fl，GSP_F2 替換 GSP-Rl，GSP_R2)。在 第一輪反應(yīng)中，利用一個(gè)單一循環(huán)反應(yīng)使SiteFinderl與基因組DNA退火，使SiteFinderl 與保守區(qū)序列 5，端連接。反應(yīng)體系10XPCR buffer 2μ L,2. 5mM dNTP 2 μ L, 5U/ μ LTaq 聚合酶 0· 5 μ L，10 μ M Sitefinderl 1 μ L，基因組 DNA0. 5 μ L，ddH20 14 μ L, ^if 20 μ L ； 擴(kuò)增程序:92°C 2min，95°C lmin，25°C lmin,以 0. 2°C /sec 升溫至 68°C，68°C IOmin0 在隨 后的第二輪反應(yīng)中，以第一輪反應(yīng)產(chǎn)物為模板，利用銜頭序列引物SFPl (SEQ ID N0.5)與 基因特異引物GSP-Rl (SEQ ID N0. 7)對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)體系第一輪反應(yīng)結(jié)束后立即將反應(yīng)產(chǎn)物置冰上加入 10XPCR buffer 0. 5 μ L, 20 μ M SFPl 2. 5 μ L, 10 μ M GSP-Rl 1 μ L, ddH20 1 μ L，共計(jì) 25 μ L ；擴(kuò)增程序94°C lmin，30X (95°C 10s, 68°C 6min)。在第三 輪反應(yīng)中，將第二輪反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，利用銜頭引物SFP2(SEQ IDN0. 6) 與基因特異引物GSP-R2(SEQ ID NO. 8)繼續(xù)使目的片段擴(kuò)增并延伸；反應(yīng)體系10XPCR buffer 5 μ L, 10 μ M SFP2 5 μ L，10 μ M GSP-R2 5 μ L，2· 5mM dNTP4 μ L, 5U/ μ L Taq 聚合酶 1 μ L，ddH20 28 μ L，稀釋100倍的第二輪反應(yīng)產(chǎn)物2 μ L，共計(jì)50 μ L ；擴(kuò)增程序:72°C IOmin, 94°C lmin,30X (95 °C 10s，68 °C 6min)，72 °C IOmin0 PCR 結(jié)束后各取 5 μ L 反應(yīng)液進(jìn)行瓊 脂糖凝膠電泳，確定有特異性條帶出現(xiàn)。將PCR產(chǎn)物純化后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化 Ε. (；01士0!15 0，涂于含有5(^1^ X-gal/IPTG premix、100 μ g/mL 氨芐青霉素 LB 平板，37°C培 養(yǎng)13-14小時(shí)，挑白色菌落，振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，確定連接成功后送到上海生工測(cè)序。
分析測(cè)序結(jié)果，找到保守區(qū)與其旁鄰序列的重疊區(qū)并拼接后提交至NCBI利用 Blastx比對(duì)，從已知序列中推測(cè)出乙醛脫氫酶ORF自起始密碼子ATG開始的大部分片段， 但其3’端距終止子還缺400bp左右的片段。因此采用SEFAPCR法擴(kuò)增該區(qū)域的序列。根 據(jù)Site-finding PCR法所擴(kuò)增保守區(qū)下游序列設(shè)計(jì)嵌套引物SP1-SP5，其中SPl (SEQ ID NO. 11)，SP2 (SEQ ID NO. 12)，SP4(SEQID NO. 14)，SP5 (SEQ ID NO. 15)是根據(jù)已知序列設(shè) 計(jì)的特異性高退火的引物，SP3(SEQ ID NO. 13)是能夠與已知序列部分退火配對(duì)的特殊引 物，是整個(gè)SEFAPCR的關(guān)鍵所在。SEFAPCR有三輪嵌套反應(yīng)程序。第一輪擴(kuò)增是先利用一 個(gè)單一循環(huán)反應(yīng)以SP3為引物在低退火溫度下利用其3’端的6個(gè)堿基在已知序列附近配 對(duì)，并以0.2°C/s的速度升至最高退火溫度向已知序列方向擴(kuò)增；反應(yīng)體系2XGC buffer I 15μ L,2. 5mM dNTP 5 μ L, 5U/ μ L LATaq 聚合酶 0. 3 μ L，基因組 DNA 1 μ L，10 μ M SP3 0. 5μ L, ddH20 8. 2 μ L，共計(jì) 30 μ L ；擴(kuò)增程序94°C 90s, 35°C 3min,以 0. 2°C /min 升溫至 70°C，70°C 5min。反應(yīng)結(jié)束后，取出PCR管加入10 μ M引物SPl 1. 5 μ L，使其在高退火溫 度下擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增程序25X (94°C 30s, 70°C 5. 5min)；隨后利用已有的反應(yīng)體系進(jìn) 行熱不對(duì)稱PCR，在目標(biāo)片段得到大量擴(kuò)增的同時(shí)，使SP3 “回頭”與自身鏈配對(duì)并向5’ 端延伸，獲得5，和3，端都含有和SP2配對(duì)的序列，擴(kuò)增程序:2X (94°C 30s, 70°C 5min)， 94°C 30s, 55°C 30s, 70°C 5min)，共10個(gè)循環(huán)。第二輪反應(yīng)以第一輪反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10倍 為模板，以SP2為唯一引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，使得PCR體系中兩端包含SP2的目標(biāo)條帶 大量擴(kuò)增。反應(yīng)體系2XGC buffer I 15μ L,2. 5mM dNTP 5 μ L, 5U/ μ L LATaq 聚合酶 0. 3 μ L, 10 μ M SP2 1. 5 μ L，稀釋 10 倍的第一輪反應(yīng)產(chǎn)物 1 μ L，ddH20 7. 2 μ L，共計(jì) 30 μ L ； 擴(kuò)增程序30Χ (94°C 3s, 70°C 5. 5min)。第三輪反應(yīng)用于進(jìn)一步甄別目標(biāo)產(chǎn)物，以第二輪 反應(yīng)產(chǎn)物的10倍稀釋液為模板，以SP4為上游引物和SP5(位于SP2和SP3之間)為下游 引物進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR，使得PCR體系中兩端分別包含SP4和SP5的目標(biāo)條帶大量擴(kuò)增； 反應(yīng)體系2 XGCbuffer I 15μ L,2. 5mM dNTP 5 μ L, 5U/ μ L LATaq 聚合酶 0. 3 μ L，10 μ M SP4 1. 5 μ L, 10 μ M SP5 0. 15 μ L,稀釋 10 倍的第二輪反應(yīng)產(chǎn)物 1 μ L, ddH20 7. 05 μ L,共計(jì) 30 μ L ；擴(kuò)增程序:2Χ (94°C 30s, 70°C 5min)，94°C 30s, 55°C 30s, 70°C 5min)，共 10 個(gè)循環(huán)。 PCR結(jié)束后各取5 μ L反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定有特異性條帶出現(xiàn)。將PCR產(chǎn)物純 化后與 PMD19-T vector 連接，轉(zhuǎn)化 Ε. coli DH5 α，涂于含有 50 μ L X-gal/IPTG premix、 100 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)13-14小時(shí)，挑白色菌落，振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒， 確定連接成功后送到上海生工測(cè)序。
用計(jì)算機(jī)軟件DNAMAN分析所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果，找到重疊區(qū)拼接，獲得了 全長(zhǎng)為3255bp的序列(SEQ ID NO. 16)，具有一個(gè)完整的1578bp的開放閱讀框(SEQ ID NO. 17)，即陸生伊薩酵母乙醛脫氫酶基因(ist-ALD)，編碼一個(gè)由525個(gè)氨基酸組成的蛋白 質(zhì)(SEQ ID NO. 18)。實(shí)施例2 陸生伊薩酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)乙醛脫氫酶基因原核 表達(dá)載體的構(gòu)建(圖1)根據(jù)獲得的乙醛脫氫酶基因序列，設(shè)計(jì)兩個(gè)引物，上游引物ALD-F2 (SEQ IDN0. 19) 加上BamHI識(shí)別序列，下游引物ALD-R2 (SEQ ID NO. 20)加上XhoI識(shí)別序列(下劃線部分 為限制酶識(shí)別序列)。按照下列PCR體系加入各成分，擴(kuò)增乙醛脫氫酶基因10XPfu PCR bufferlOyL, 10 μ M ALD-F2 4 μ L，10 μ M ALD-R2 4μ L,2. 5mM dNTPs 8 μ L，基因組 DNAlOng，Pfu DNA 聚 合酶 5U，ddH20 補(bǔ)至 100 μ L。PCR 程序?yàn)?94°C 5min，30X (94°C 30s, 60°C 50s, 72°C 4min)， 72°C IOmin。用上海生工PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，加BamHI、XhoI雙酶切，滅活，乙 醇沉淀，ddH20重溶，與適量的用相同限制酶消化的載體pET-32a連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。 從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取幾個(gè)菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)，小量提取質(zhì)粒，電泳，以 電泳滯后的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，確定連接成功后送到上海生工測(cè)序。實(shí)施例3 陸生伊薩酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)乙醛脫氫酶基因在大 腸桿菌中的表達(dá)將含有i st-ALD表達(dá)質(zhì)粒pET-32a_i st-ALD轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌株 BL21(DE3)pLysS，在含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上于37°C培養(yǎng)10-11小時(shí)后挑 取小菌落，接入添加100 μ g/mL氨芐青霉素和0.2% (w/v)葡萄糖的50mlLB液體培養(yǎng)基， 70-90rpm 30°C培養(yǎng)過夜，按照1 40的體積比取種子液加入到含有100 μ g/mL氨芐青霉 素和0. 2% (w/v)葡萄糖的IOOmL LB液體培養(yǎng)基，37°C 180rpm振蕩2_3小時(shí)至OD6tltl約為 0.6時(shí)加IPTG(終濃度lOOyg/ml)于16°C誘導(dǎo)表達(dá)16h后離心收集菌體。破碎菌體，離 心收集上清液，作為乙醛脫氫酶粗酶液。其酶活測(cè)定方法3mL酶活測(cè)定體系中含有0. IM Tris-HCl 緩沖液(pH 8. 0), 2mM 乙醛，0. 5mM NAD+, 0. IM KCl, 0. IM 2-巰基乙醇以及一定濃 度的粗酶液，在25°C，340nm下測(cè)定NADH的濃度變化。以每分鐘生成1 μ mol NADH所用的 酶量為1個(gè)酶活單位(U)。最終獲得重組乙醛脫氫酶的酶活為44. 23U/mL。
權(quán)利要求
一種來(lái)自陸生伊薩酵母Issatchenkia terricola XJ 2的乙醛脫氫酶基因，其特征在于該基因序列為SEQ ID NO.16。
2.—種權(quán)利要求1所述乙醛脫氫酶基因的開放閱讀框，其特征在于該開放閱讀框?yàn)橥?整的乙醛脫氫酶基因開放閱讀框，序列為SEQ ID NO. 17。
3.權(quán)利要求1所述乙醛脫氫酶基因編碼的乙醛脫氫酶，其特征在于其氨基酸序列為 SEQ ID NO. 18。
4.一種從陸生伊薩酵母Issatchenkia terricola XJ-2克隆乙醛脫氫酶基因的方法， 其特征在于在分析NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)種酵母乙醛脫氫酶蛋白質(zhì)序列的基礎(chǔ)上，通過簡(jiǎn)并 PCR、Sitefinding-PCR及SEFAPCR技術(shù)從陸生伊薩酵母全基因組中克隆出乙醛脫氫酶基 因。
5.一種乙醛脫氫酶基因重組表達(dá)載體，其特征在于該重組表達(dá)載體是將權(quán)利要求1所 述的乙醛脫氫酶基因插入表達(dá)載體所得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的乙醛脫氫酶基因重組表達(dá)載體，其特征在于該重組表達(dá)載體 是將權(quán)利要求1所述的乙醛脫氫酶基因插入載體pET-32a所得。
7.權(quán)利要求1所述的乙醛脫氫酶基因在制備解酒制品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種陸生伊薩酵母乙醛脫氫酶基因及其表達(dá)載體。該基因序列為SEQ ID NO.16，其開放閱讀框序列為SEQ IDNO.17，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.18。將其插入表達(dá)載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)出的重組酶可催化乙醛氧化生成乙酸。本發(fā)明提供了一種新型、高活性的乙醛脫氫酶基因，利用本發(fā)明基因，實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中的重組表達(dá)，克服了發(fā)酵陸生伊薩酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)生產(chǎn)乙醛脫氫酶產(chǎn)量低的缺點(diǎn)，可提供大量的乙醛脫氫酶進(jìn)行解酒制品的研究；并且為構(gòu)建安全的乙醛脫氫酶基因工程菌奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N9/02GK101985625SQ201010535839
公開日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月9日
發(fā)明者別小妹, 呂鳳霞, 姚正穎, 張充, 陸兆新 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)