專利名稱：生產(chǎn)l-苯丙氨酸的工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)L-苯丙氨酸的工程菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)是人體必須的氨基酸之一,廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。低熱量、高甜度的二肽甜味劑阿斯巴甜(Aspartame)的應(yīng)用日益廣泛，作為合成阿斯巴甜兩種原料之一的L-苯丙氨酸的市場(chǎng)需求量迅速增加。另外，L-苯丙氨酸也是抗腫瘤藥物和氨基酸輸液制劑的必需原料，隨著其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用不斷擴(kuò)展，需求量也將不斷增加。傳統(tǒng)的菌株選育是從自然界中篩選有產(chǎn)L-苯丙氨酸能力的菌株,并建立其培養(yǎng)條件開(kāi)始的。但是該方法所能積累的氨基酸種類有限，后來(lái)在確立突變技術(shù)和闡明氨基酸合成系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)制的基礎(chǔ)上發(fā)展為營(yíng)養(yǎng)缺陷變異株、抗藥性菌株的選育，但是采用常規(guī)誘變育種的方法，盲目性大，工作量繁重，不能增加基因的數(shù)量，且突變株一般都攜帶營(yíng)養(yǎng)缺陷，產(chǎn)量進(jìn)一步提高受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供生產(chǎn)L-苯丙氨酸的工程菌及其應(yīng)用。本發(fā)明保護(hù)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌；所述重組質(zhì)粒為將PheA蛋白的編碼基因、aroD蛋白的編碼基因、aroE蛋白的編碼基因和talA蛋白的編碼基因插入出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒；所述大腸桿菌的CICC編號(hào)為10245 ;所述pheA蛋白如序列表的序列I所不；所述aroD蛋白如序列表的序列3所不；所述aroE蛋白如序列表的序列5所不；所述talA蛋白如序列表的序列7所不。所述pheA蛋白的編碼基因可如序列表的序列2所不；所述aroD蛋白的編碼基因可如序列表的序列4所不；所述aroE蛋白的編碼基因可如序列表的序列6所不；所述talA 蛋白的編碼基因可如序列表的序列8所不。所述重組質(zhì)粒中，自上游至下游可依次包括所述pheA蛋白的編碼基因、所述aroD 蛋白的編碼基因、所述aroE蛋白的編碼基因和所述talA蛋白的編碼基因。所述出發(fā)載體具體可為載體PBV220。所述重組質(zhì)粒具體可為將所述pheA蛋白的編碼基因插入所述載體pBV220的 BglII酶切位點(diǎn)、所述aroD蛋白的編碼基因插入所述載體pBV220的EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)之間、所述aroE蛋白的編碼基因插入所述載體pBV220的BamHI和SacI酶切位點(diǎn)之間、 所述talA蛋白的編碼基因插入所述載體pBV220的SacI酶切位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。所述重組菌為具體可為大腸桿菌(Escherichia coli)MF0018。大腸桿菌 (Escherichia coli)MF0018簡(jiǎn)稱大腸桿菌MF0018，已于2012年3月2日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC ;地址中國(guó)武漢，武漢大學(xué)；郵編430072)，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2012051。
以上任一所述重組菌均可用于生產(chǎn)L-苯丙氨酸。本發(fā)明還保護(hù)一種生產(chǎn)L-苯丙氨酸的方法，包括如下步驟將以上任一所述的重組菌進(jìn)行發(fā)酵，得到L-苯丙氨酸。所述發(fā)酵的條件可為37°C、溶氧50-70%、48小時(shí)。所述發(fā)酵采用的發(fā)酵培養(yǎng)基具體如下由溶質(zhì)和水組成；溶質(zhì)及其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度如下=Na2HPO4 · 12H20 20g/L、檸檬酸鈉8g/L、谷氨酸鈉O. 5g/L、酪氨酸O. 8g/L、葡萄糖20g/L和氨芐青霉素50mg/L。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH具體可為7。所述發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)補(bǔ)加葡萄糖控制發(fā)酵體系的葡萄糖含量為 4g/L。所述重組菌具體可以以種子液的方式接種至所述發(fā)酵培養(yǎng)基。所述種子液是將所述重組菌接種至種子培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)得到的。所述種子液的OD61tlnm具體可為30。所述種子液與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積配比具體可為I : 4。所述培養(yǎng)的條件可為37°C、溶氧50-70%、 12小時(shí)。所述種子培養(yǎng)基具體由溶質(zhì)和水組成；溶質(zhì)及其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度如下蛋白胨lg/100mL、氯化鈉lg/100mL、酵母粉O. 5g/100mL和氨節(jié)青霉素50 μ g/mL。所述種子培養(yǎng)基的pH具體可為7。本發(fā)明的提供的工程菌可直接發(fā)酵得到L-苯丙氨酸，發(fā)酵48小時(shí)后，發(fā)酵液中的 L-苯丙氨酸含量高達(dá)75g/L，極具生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。


圖I為載體PBV220的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為重組質(zhì)粒pBV220-pheA的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3為重組質(zhì)粒pBV220-pheA_aroD的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4為重組質(zhì)粒pBV220-pheA-aroD-aroE的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖5為重組質(zhì)粒pBV-pheA-aroD-aroE-talA的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖6為氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC譜圖。
圖7為發(fā)酵液的稀釋液的HPLC譜圖。
圖8為對(duì)照液的稀釋液的HPLC譜圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。大腸桿菌(Escherichia coli)獲自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(www. china-cicc. org,簡(jiǎn)稱CICC),編號(hào)為10245,簡(jiǎn)稱大腸桿菌10245。實(shí)施例I、重組質(zhì)粒 pBV-pheA-aroD-aroE-talA 的構(gòu)建一、重組質(zhì)粒pBV220_pheA的構(gòu)建I、以大腸桿菌10245的基因組DNA為模板，用Fl和Rl組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。Fl :5’ -GAGATCTATGACATCGGAAAACCCGTTACT-3’(下劃線標(biāo)注 BgLII 酶切識(shí)別序列)；Rl :5’ -GAAGATCTTCAGGTTGGATCAACAGGCACTA-3> (下劃線標(biāo)注 BgLII 酶切識(shí)別序列)。Fl和Rl的革E序列如序列表的序列2所不(序列表的序列2所不基因即為pheA基因，編碼序列表的序列I所不的pheA蛋白)。PCR擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性I分鐘、56°C退火I分鐘、72°C延伸I 分鐘30秒，30個(gè)循環(huán)；72°C保溫10分鐘。2、回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(約1200bp)并用限制性內(nèi)切酶BglII進(jìn)行酶切，回收酶切產(chǎn)物。3、用限制性內(nèi)切酶BglII酶切載體pBV220(從北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司購(gòu)得，結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖I)，回收載體骨架(約3. 6kb)。4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pBV220_pheA。重組質(zhì)粒pBV220-pheA的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖2。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pBV220_pheA進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在載體PBV220的BglII酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2所示的pheA基因。二、重組質(zhì)粒 pBV220-pheA_aroD 的構(gòu)建I、以大腸桿菌10245的基因組DNA為模板，用F2和R2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。F2 5，-CGGAATTCATGAAAACCGTAACTGTAAA-3，(下劃線標(biāo)注 EcoRI 酶切識(shí)別序列);R2 5，-CGGGATCCTTATGCCTGGTGTAAAATAGT-3，(下劃線標(biāo)注 BamHI 酶切識(shí)別序列)。F2和R2的革E序列如序列表的序列4所不(序列表的序列4所不基因即為aroD基因，編碼序列表的序列3所不的aroD蛋白)。PCR擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性I分鐘、56°C退火I分鐘、72°C延伸I 分鐘，30個(gè)循環(huán)；72°C保溫10分鐘。2、回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(約800bp)并用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切， 回收酶切產(chǎn)物。3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒pBV220_pheA，回收載體骨架 (約 4. 9kb)。4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pBV220-pheA-aroDo重組質(zhì)粒pBV220-pheA_aroD的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖3。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,對(duì)重組質(zhì)粒pBV220-pheA-aroD進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在重組質(zhì)粒pBV220_pheA的EcoRI和BamHI 酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列4所示的aroD基因。三、重組質(zhì)粒pBV220-pheA-aroD_aroE 的構(gòu)建I、以大腸桿菌10245的基因組DNA為模板，用F3和R3組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。F3 :5’ -CGGGATCCATGGAAACCTATGCTGTTTTTGGTA-3> (下劃線標(biāo)注 BamHI 酶切識(shí)別序列)；R3 5，-GCGTCGACTCACGCGGACAATTCCTCCTGC-3，(下劃線標(biāo)注 SacI 酶切識(shí)別序列)。F3和R3的祀序列如序列表的序列6所不(序列表的序列6所不基因即為aroE基因，編碼序列表的序列5所不的aroE蛋白)。PCR擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性I分鐘、56°C退火I分鐘、72°C延伸I 分鐘，30個(gè)循環(huán)；72°C保溫10分鐘。2、回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(約800bp)并用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI進(jìn)行雙酶切， 回收酶切產(chǎn)物。3、用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI雙酶切重組質(zhì)粒pBV220-pheA-aroD，回收載體骨架(約 5. 7kb)。4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pBV220-pheA-aroD_aroE。重組質(zhì)粒 pBV220-pheA-aroD_aroE 的結(jié)構(gòu)不意圖見(jiàn)圖 4。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pBV220-pheA-aroD-aroE進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在重組質(zhì)粒 pBV220-pheA-aroD的BamHI和SacI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列6所示的aroE基因。四、重組質(zhì)粒pBV220-pheA-aroD-aroE_talA 的構(gòu)建I、以大腸桿菌10245的基因組DNA為模板，用F4和R4組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。F4 :5’ -GCGTCGACATGAACGAGTTAGACGGCAT-3，(下劃線標(biāo)注 SacI 酶切識(shí)別序列);R4 5，-GCGTCGACTTATAGTTTGGCGGCAAGAAG-3，(下劃線標(biāo)注 SacI 酶切識(shí)別序列)。F4和R4的祀序列如序列表的序列8所不(序列表的序列8所不基因即為talA基因，編碼序列表的序列7所不的talA蛋白)。PCR擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性I分鐘、56°C退火I分鐘、72°C延伸I 分鐘10秒，30個(gè)循環(huán)；72°C保溫10分鐘。2、回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(約IOOObp)并用限制性內(nèi)切酶SacI進(jìn)行酶切，回收酶切產(chǎn)物。3、用限制性內(nèi)切酶SacI酶切重組質(zhì)粒pBV220-pheA-aroD-aroE，回收載體骨架 (約 6. 5kb)。4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pBV220-pheA-aroD-aroE-talAo 重組質(zhì)粒 pBV220-pheA-aroD-aroE_talA 的結(jié)構(gòu)不意圖見(jiàn)圖5。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,對(duì)重組質(zhì)粒pBV220-pheA-aroD-aroE-talA進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在重組質(zhì)粒pBV220-pheA-aroD-aroE的SacI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列8所示的talA基因。實(shí)施例2、工程菌的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pBV220-pheA-aroD-aroE_talA電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌10245原生質(zhì)體,然后用Fl和R4組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定(顯示約4kb的特異條帶的為PCR鑒定陽(yáng)性)，得
到重組菌。將一株重組菌命名為大腸桿菌(Escherichia coli)MF0018。大腸桿菌 (Escherichia coli)MF0018簡(jiǎn)稱大腸桿菌MF0018，已于2012年3月2日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC ;地址中國(guó)武漢，武漢大學(xué)；郵編430072)，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2012051。實(shí)施例3、應(yīng)用大腸桿菌MFOO18生產(chǎn)L-苯丙氨酸
一、應(yīng)用大腸桿菌MFOO18生產(chǎn)L-苯丙氨酸I、種子培養(yǎng)(采用30L全自動(dòng)發(fā)酵罐，種子培養(yǎng)基裝液量為15L)將大腸桿菌MF0018接種至種子培養(yǎng)基，發(fā)酵罐控制參數(shù)為37 °C、溶氧 (DO) 50-70%，培養(yǎng)12小時(shí)，得到種子液(種子液的OD61tlnm = 30)。種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基，pH7. O)由溶質(zhì)和水組成；溶質(zhì)及其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度如下蛋白胨lg/100mL、氯化鈉lg/100mL、酵母粉O. 5g/100mL和氨節(jié)青霉素50 μ g/mL。2、發(fā)酵培養(yǎng)(采用30L全自動(dòng)發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量15L)將I體積份種子液接種至4體積份發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵罐控制參數(shù)為37°C、溶氧 (DO) 50-70%，發(fā)酵體系中的葡萄糖含量低于4g/L時(shí)，由發(fā)酵罐自動(dòng)補(bǔ)加700g/L的葡萄糖水溶液，保持發(fā)酵體系的葡萄糖含量為4g/L ;發(fā)酵時(shí)間為48小時(shí)。發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)由溶質(zhì)和水組成；溶質(zhì)及其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度如下 Na2HPO4 ·12Η20 20g/L、檸檬酸鈉8g/L、谷氨酸鈉O. 5g/L、酪氨酸O. 8g/L、葡萄糖20g/L和氨節(jié)青霉素50mg/L。4、將步驟3的發(fā)酵體系離心(4500rpm、15min),收集上清液(發(fā)酵液)。5、將發(fā)酵液用水稀釋至200倍體積后進(jìn)行步驟三的液相檢測(cè)。二、對(duì)照液的制備將大腸桿菌10245代替大腸桿菌MF0018進(jìn)行步驟一的實(shí)驗(yàn)，收集上清液(對(duì)照液)。將對(duì)照液用水稀釋至100倍體積后進(jìn)行步驟三的液相檢測(cè)。三、發(fā)酵液中L-苯丙氨酸濃度的測(cè)定L-苯丙氨酸(phe)濃度的測(cè)定方法采用氨基酸常用測(cè)定方法，即高效液相色譜(HPLC)柱前衍生化方法(Rapid, accurate, senstitive, and reprodicobLe HPLC anaLysis of amino acida. Henderson, J. W,Ricker,R. D. ,BidLingmeyer,B. A. , Woodward, C.，AgiLent TechnoLogier, MSA,2000)。樣品溶液中L-苯丙氨酸濃度(μ g/mL) = fl/f2XC ；fl =樣品溶液中L-苯丙氨酸的峰面積/內(nèi)標(biāo)的峰面積；f2 =氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中L-苯丙氨酸的面積/內(nèi)標(biāo)的峰面積； C =氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中的L-苯丙氨酸(μ g/mL)。色譜柱AgeLaVenysiL AA 柱，(4. 6*250mm, 5 μ m);柱溫40 °C ;監(jiān)測(cè)波長(zhǎng) 254nm ；流動(dòng)相A的制備方法取15. 2g無(wú)水醋酸鈉，加水1850mL，溶解后用冰醋酸調(diào)pH至
6.5,然后加140mL乙腈,混勻，用0. 45 μ m濾膜過(guò)濾；流動(dòng)相B :由4體積份乙腈和I體積份水組成；流速lmL/min。正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液的制備方法取正亮氨酸(NLe) 10mg，加IOmL 0. ImoL/L鹽酸水溶液，溶解。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液購(gòu)買(mǎi)于天津博納艾杰爾科技有限公司，其中苯丙氨酸濃度為 2.5 μmoL/mL0氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的衍生，依次進(jìn)行如下步驟(I)分別量取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣品液各200 μ L，分別置于I. 5mL離心管
(2)每個(gè)離心管中加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液20 μ L ;(3)每個(gè)離心管中加入100 μ L三乙胺乙腈溶液(1.4mL三乙胺中加入8.6mL乙腈， 混勻)和100 μ L異硫氰酸苯酯乙腈溶液(25 μ L異硫氰酸苯酯加入2mL乙腈，混勻)，混勻， 室溫放置I小時(shí)；(4)每個(gè)離心管中加入400 μ L正己烷，振搖后放置IOmin ；(5)取下層溶液(PTC-苯丙氨酸)，用O. 45 μ m針式濾器過(guò)濾；(6)取濾液200 μ L，加800 μ L水稀釋，搖勻，進(jìn)樣10 μ L。梯度洗脫過(guò)程第0-2min的洗脫液為流動(dòng)相A ;第2_14min的洗脫液由流動(dòng)相A 和流動(dòng)相B組成，流動(dòng)相A在洗脫液中的體積份數(shù)由100%線性下降至93% ;第14-29min 的洗脫液由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成，流動(dòng)相A在洗脫液中的體積份數(shù)由93%線性下降至 70 %;第29-32min的洗脫液由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成，流動(dòng)相A在洗脫液中的體積份數(shù)由 70%線性下降至50% ;第32-33min的洗脫液由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成，流動(dòng)相A在洗脫液中的體積份數(shù)由50%線性上升至100% ;第33-39min的洗脫液為流動(dòng)相A ;第39_45min 的洗脫液由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成，流動(dòng)相A在洗脫液中的體積份數(shù)由100 %線性下降至 0% ;第45min的洗脫液為流動(dòng)相B。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC譜圖見(jiàn)圖6。NLe的峰面積為1301485。phe的峰面積為 3770598，保留時(shí)間為 33. 65min。發(fā)酵液的稀釋液的HPLC譜圖見(jiàn)圖7。phe的峰面積為7300825。對(duì)照液的稀釋液的HPLC譜圖見(jiàn)圖8。phe的峰面積為4825418。發(fā)酵液中的L-苯丙氨酸濃度為75g/L，對(duì)照液中的L-苯丙氨酸濃度為21g/L。大腸桿菌MF0018比大腸桿菌10245產(chǎn)L-苯丙氨酸提高約3. 6倍，具有很高的生產(chǎn)價(jià)值。
權(quán)利要求
1.將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌；所述重組質(zhì)粒為將PheA蛋白的編碼基因、 aroD蛋白的編碼基因、aroE蛋白的編碼基因和talA蛋白的編碼基因插入出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒；所述大腸桿菌的CICC編號(hào)為10245 ;所述pheA蛋白如序列表的序列I所不；所述aroD蛋白如序列表的序列3所不；所述aroE蛋白如序列表的序列5所不； 所述talA蛋白如序列表的序列7所不。
2.如權(quán)利要求I所述的重組菌，其特征在于所述PheA蛋白的編碼基因如序列表的序列2所不；所述aroD蛋白的編碼基因如序列表的序列4所不；所述aroE蛋白的編碼基因如序列表的序列6所不；所述talA蛋白的編碼基因如序列表的序列8所不。
3.如權(quán)利要求I或2所述的重組菌，其特征在于所述重組質(zhì)粒中，自上游至下游依次包括所述pheA蛋白的編碼基因、所述aroD蛋白的編碼基因、所述aroE蛋白的編碼基因和所述talA蛋白的編碼基因。
4.如權(quán)利要求I或2或3所述的重組菌，其特征在于所述出發(fā)載體為載體PBV220。
5.如權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組質(zhì)粒為將所述pheA蛋白的編碼基因插入所述載體PBV220的BglII酶切位點(diǎn)、所述aroD蛋白的編碼基因插入所述載體 PBV220的EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)之間、所述aroE蛋白的編碼基因插入所述載體pBV220 的BamHI和SacI酶切位點(diǎn)之間、所述talA蛋白的編碼基因插入所述載體pBV220的SacI 酶切位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求5所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為大腸桿菌(Escherichia coli)MF0018，它的保藏編號(hào)為 CCTCC NO M 2012051。
7.權(quán)利要求I至6中任一所述的重組菌在生產(chǎn)L-苯丙氨酸中的應(yīng)用。
8. 一種生產(chǎn)菌進(jìn)行發(fā)酵，得到L-苯丙氨酸的方法，包括如下步驟將權(quán)利要求I至6中任一所述的重組_苯丙氨酸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了生產(chǎn)L-苯丙氨酸的工程菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌；所述重組質(zhì)粒為將pheA蛋白的編碼基因、aroD蛋白的編碼基因、aroE蛋白的編碼基因和talA蛋白的編碼基因插入出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒；所述大腸桿菌的CICC編號(hào)為10245；所述pheA蛋白如序列表的序列1所示；所述aroD蛋白如序列表的序列3所示；所述aroE蛋白如序列表的序列5所示；所述talA蛋白如序列表的序列7所示。本發(fā)明的提供的工程菌可直接發(fā)酵得到L-苯丙氨酸，發(fā)酵48小時(shí)后，發(fā)酵液中的L-苯丙氨酸含量高達(dá)75g/L，極具生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102604882SQ20121010211
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者吳偉斌, 吳松剛, 施巧琴, 林宜云, 翁雪清, 趙燕玉, 陳炳生, 黃祥峰, 黃維錦, 黃欽耿 申請(qǐng)人:福建省麥丹生物集團(tuán)有限公司