專利名稱：固氮魚腥藻干藻粉的快速激活及其大量生產(chǎn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)，具體涉及一種固氮魚腥藻干藻粉的快速激活及其大量生產(chǎn)的方法。
背景技術(shù)：
固氮魚腥藻(Anabaena azotica)由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫提供(編號FACHB_686),并已在《Jianying Shen, Antonio DiTommaso, Mingquan Shen,Wei Lu， and Zhengming Li ；Molecular basis for differential metabolic responsesto monosulfuron in three nitrogen-fixing cyanobacteria, Weed Science，2009，57 :178_188〉〉、〈〈Jianying Shen, Jing Jiang, Peizhong Zheng ；Effects of Light andMonosulfuron on growth and Photosynthetic Pigments of Anabaena flos—aquae Breb,Water Resource and Protection，2009，I :408_413》、《鄭培忠，沈健英；有機溶劑丙酮對固氮藍(lán)藻生長效應(yīng)的研究，上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010. 4 :33-38))等中公開。固氮魚腥藻能固定大氣中的游離氮，是固氮藍(lán)藻的一種。它生長繁殖迅速，固氮量達(dá)20-55kg/hm2，其藻體沉入土壤后可被作物根系吸收，特有的藻促生長素能促進(jìn)作物茁壯生長，使作物增產(chǎn)10-30%，因此這是一種良好的有機肥。而農(nóng)用化學(xué)肥料和農(nóng)藥的生產(chǎn)、施用又會帶來大量的溫室氣體排放，因此開發(fā)農(nóng)業(yè)生物固氮技術(shù)，降低化肥施用量，是當(dāng)前發(fā)展低碳農(nóng)業(yè)的重要途徑。固氮魚腥藻的用途主要有提取天然色素、藻膽蛋白和多糖，生物固氮及其他方面等。制備成的干藻粉常有萌發(fā)率偏低的缺點，因此稻田的肥效功能未能充分的發(fā)揮。目前為止國內(nèi)外對固氮魚腥藻干藻粉的相關(guān)研究很少，在干藻粉的激活方面，僅見黃有馨等在《固氮藍(lán)藻干藻種制備及其在稻田中的應(yīng)用效果》中提到麥殼或稻殼的附著能提高萌發(fā)效果，而在其他方面的探索則少見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，就是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種固氮魚腥藻干藻粉的快速激活及其大量生產(chǎn)的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種固氮魚腥藻干藻粉的快速激活方法，包括以下步驟a、取定量的磷酸氫二鉀、檸檬酸鐵、鑰酸和碳酸鈣溶解在水中，制備成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并使基礎(chǔ)培養(yǎng)液中各組分的終濃度為磷酸氫二鉀75mg/L、檸檬酸鐵10mg/L、鑰酸10mg/L、碳酸 丐 100mg/L ；b、將固氮魚腥藻干藻粉溶解在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中并用打藻機打碎，制備成固氮魚腥藻溶液；C、將固氮魚腥藻溶液置于基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，添加定量的硝酸鉀、調(diào)節(jié)pH為7-9，在半敞開的狀態(tài)下培養(yǎng)2-3天，實現(xiàn)固氮魚腥藻的快速激活。
所述的添加定量的硝酸鉀是指，使硝酸鉀的濃度達(dá)到380-500mg/L ;所述的調(diào)節(jié)PH為7-9通過氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)；所述的在半敞開的狀態(tài)下培養(yǎng)是用培養(yǎng)皿定時攪拌培養(yǎng)。所述的定時攪拌培養(yǎng)是指每天在同一個時間攪拌一次。
所述的攪拌是指借助滅過菌的三角棒或5ml的移液槍把細(xì)胞打散打勻。上述方法激活的固氮魚腥藻的大量生產(chǎn)方法，通過將激活所得固氮魚腥藻轉(zhuǎn)移到加有葡萄糖或蔗糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)液的不透明的敞口容器中，培養(yǎng)5-7天，得到量產(chǎn)的固氮魚腥藻。所述的加有葡萄糖或蔗糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中各成分的濃度為磷酸氫二鉀75mg/L、梓檬酸鐵10mg/L、鑰酸10mg/L、碳酸|丐100mg/L、葡萄糖130_200mg/L或鹿糖70_130mg/L,余量為水。本發(fā)明針對目前大力推廣低碳農(nóng)業(yè)，減少化肥和農(nóng)藥的施用，提高有機肥的用量和肥效的政策，和固氮魚腥藻干藻粉的萌發(fā)率偏低的弊端，以及固氮魚腥藻不便于收獲的缺陷，提供了一種以固氮魚腥藻干藻粉為原料，外加理化條件高效激活，使其快速生長繁殖，并通過合適的條件刺激，借助塑料膜，大量生產(chǎn)抗逆性較強的高活力的固氮魚腥藻，是一種安全方便的生產(chǎn)微生物菌肥的技術(shù)。本發(fā)明的優(yōu)點在于有效的激活條件大大提高了干藻粉的萌發(fā)比例，縮短了萌發(fā)時間，葡萄糖或蔗糖的使用增強了固氮魚腥藻的抗逆性；固氮魚腥藻干藻粉的高效激活方法及其大量生產(chǎn)方法涉及的工藝簡單；肥料施用安全高效，易于推廣實施；實施后不會對環(huán)境、食品安全造成新的污染；所以本發(fā)明具有極大的理論價值和應(yīng)用價值。


圖I是本發(fā)明中在不同硝酸鉀濃度的激活下，固氮魚腥藻在連續(xù)培養(yǎng)7天的含量。圖2是本發(fā)明中在不同pH的激活下，固氮魚腥藻在連續(xù)培養(yǎng)7天的含量。圖3是本發(fā)明中在不同敞開狀態(tài)的激活下，固氮魚腥藻在連續(xù)培養(yǎng)7天的含量。圖4是本發(fā)明中在不同糖的作用下，固氮魚腥藻在連續(xù)培養(yǎng)7天的含量。圖5是本發(fā)明中固氮魚腥藻的兩類細(xì)胞。圖6-8是本發(fā)明中固氮魚腥藻的透射電鏡圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實施例中所用基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組分和濃度均為磷酸氫二鉀75mg/L、朽1檬酸鐵10mg/L、鑰酸10mg/L、碳酸|丐100mg/L。實施例I稱取0. Olg的固氮魚腥藻干藻粉，溶解在含有IOmL基礎(chǔ)培養(yǎng)液的小燒杯中，用75%酒精滅菌的打藻機打碎3次，每次10s，再把藻液轉(zhuǎn)移到90X15mm的小培養(yǎng)皿中，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗燒杯再倒在培養(yǎng)皿中，最后培養(yǎng)皿補加基礎(chǔ)培養(yǎng)液到35mL。添加硝酸鉀，使其濃度達(dá)到380-500mg/L，用氫氧化鈉和鹽酸將pH調(diào)到7，最后放置在光強為3000±200Lx、溫度為30±2°C的無菌室中培養(yǎng)。一般培養(yǎng)2-3天后固氮魚腥藻開始被大量激活，此時將激活的固氮魚腥藻轉(zhuǎn)移到不透明的敞口容器中，補充適量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，稱取適量蔗糖加到容器中，使其濃度達(dá)到70-130mg/L，再培養(yǎng)5_7天，倒出多余的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，收獲固氮魚腥藻。實施例2稱取O. Olg的固氮魚腥藻干藻粉，溶解在含有IOmL基礎(chǔ)培養(yǎng)液的小燒杯中，用75%酒精滅菌的打藻機打碎3次，每次10s，再把藻液轉(zhuǎn)移到90X15mm的小培養(yǎng)皿中，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗燒杯再倒在培養(yǎng)皿中，最后培養(yǎng)皿補加基礎(chǔ)培養(yǎng)液到35mL。添加硝酸鉀，使其濃度達(dá)到380-500mg/L，用氫氧化鈉和鹽酸將pH調(diào)到9，最后放置在光強為3000 ± 200Lx、溫度為30±2°C的無菌室中培養(yǎng)。一般培養(yǎng)2-3天后固氮魚腥藻開始被大量激活，此時將激活的固氮魚腥藻轉(zhuǎn)移到不透明的敞口容器中，補充適量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，稱取適量蔗糖加到容器中，使其濃度達(dá)到70-130mg/L，再培養(yǎng)5_7天，倒出多余的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，收獲固氮魚腥藻。實施例3稱取O. Olg的固氮魚腥藻干藻粉，溶解在含有IOmL基礎(chǔ)培養(yǎng)液的小燒杯中，用75%酒精滅菌的打藻機打碎3次，每次10s，再把藻液轉(zhuǎn)移到90X15mm的小培養(yǎng)皿中，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗燒杯再倒在培養(yǎng)皿中，最后培養(yǎng)皿補加基礎(chǔ)培養(yǎng)液到35mL。添加硝酸鉀，使其濃度達(dá)到380-500mg/L，用氫氧化鈉和鹽酸將pH調(diào)到9，最后放置在光強為3000 ± 200Lx、溫度為30±2°C的無菌室中培養(yǎng)。一般培養(yǎng)2-3天后固氮魚腥藻開始被大量激活，此時將激活的固氮魚腥藻轉(zhuǎn)移到不透明的敞口容器中，補充適量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，稱取適量葡萄糖加到容器中，使其濃度達(dá)到130-200mg/L，再培養(yǎng)5_7天，倒出多余的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，收獲固氮魚腥藻。以上實施例不是對本發(fā)明的限制，具體實施時可以在權(quán)利要求限定的范圍內(nèi)按一定比例配制大體積的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，如IOOmL基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加13-20mg葡萄糖或7_13mg蔗糖，加O. 03g固氮魚腥藻干藻粉；1L基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加100-200mg葡萄糖或70_150mg蔗糖，加O. 30g固氮魚腥藻干藻粉等。圖I是本發(fā)明中在不同硝酸鉀濃度的激活下，固氮魚腥藻在連續(xù)培養(yǎng)7天的含量。圖2是本發(fā)明中在不同pH的激活下，固氮魚腥藻在連續(xù)培養(yǎng)7天的含量。圖3是本發(fā)明中在不同敞開狀態(tài)的激活下，固氮魚腥藻在連續(xù)培養(yǎng)7天的含量。圖4是本發(fā)明中在不同糖的作用下，固氮魚腥藻在連續(xù)培養(yǎng)7天的含量。圖5是本發(fā)明中固氮魚腥藻的兩類細(xì)胞。 圖6-8是本發(fā)明中固氮魚腥藻的透射電鏡圖。
權(quán)利要求
1.一種固氮魚腥藻干藻粉的快速激活方法，其特征在于，包括以下步驟 a、取定量的磷酸氫二鉀、檸檬酸鐵、鑰酸和碳酸鈣溶解在水中，制備成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并使基礎(chǔ)培養(yǎng)液中各組分的終濃度為磷酸氫二鉀75mg/L、檸檬酸鐵10mg/L、鑰酸10mg/L、碳酸鈣 100mg/L ； b、將固氮魚腥藻干藻粉溶解在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中并用打藻機打碎，制備成固氮魚腥藻溶液； C、將固氮魚腥藻溶液置于基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，添加定量的硝酸鉀、調(diào)節(jié)pH為7-9，在半敞開的狀態(tài)下培養(yǎng)2-3天，實現(xiàn)固氮魚腥藻的快速激活。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的固氮魚腥藻干藻粉的快速激活方法，其特征在于所述的添加定量的硝酸鉀是指，使硝酸鉀的濃度達(dá)到380-500mg/L ;所述的調(diào)節(jié)pH為7-9通過氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)；所述的在半敞開的狀態(tài)下培養(yǎng)是用培養(yǎng)皿定時攪拌培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固氮魚腥藻干藻粉的快速激活方法，其特征在于所述的定時攪拌培養(yǎng)是指每天在同一個時間攪拌一次。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的固氮魚腥藻干藻粉的快速激活方法，其特征在于所述的攪拌是指借助滅過菌的三角棒或5ml的移液槍把細(xì)胞打散打勻。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法激活的固氮魚腥藻的大量生產(chǎn)方法，其特征在于通過將激活所得固氮魚腥藻轉(zhuǎn)移到加有葡萄糖或蔗糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)液的不透明的敞口容器中，培養(yǎng)5-7天，得到量產(chǎn)的固氮魚腥藻。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的固氮魚腥藻的大量生產(chǎn)方法，其特征在于所述的加有葡萄糖或蔗糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中各成分的濃度為磷酸氫二鉀75mg/L、檸檬酸鐵10mg/L、鑰酸10mg/L、碳酸韓100mg/L、葡萄糖130_200mg/L或鹿糖70_130mg/L,余量為水。
全文摘要
一種固氮魚腥藻干藻粉的快速激活方法是a、取定量的磷酸氫二鉀、檸檬酸鐵、鉬酸和碳酸鈣制備成基礎(chǔ)培養(yǎng)液；b、將固氮魚腥藻干藻粉溶解在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，制備成固氮魚腥藻溶液；c、將固氮魚腥藻溶液置于基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，添加定量的硝酸鉀、調(diào)節(jié)pH為7-9，培養(yǎng)2-3天，實現(xiàn)固氮魚腥藻的快速激活。上述方法激活的固氮魚腥藻的大量生產(chǎn)方法是將激活所得固氮魚腥藻轉(zhuǎn)移到加有葡萄糖或蔗糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)液的不透明的敞口容器中，培養(yǎng)5-7天，得到量產(chǎn)的固氮魚腥藻。本發(fā)明的方法采用有效的激活條件大大提高了干藻粉的萌發(fā)比例，縮短了萌發(fā)時間，葡萄糖或蔗糖的使用增強了固氮魚腥藻的抗逆性。
文檔編號C12N1/12GK102628027SQ20121010168
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月9日
發(fā)明者萬旗東, 沈健英 申請人:上海交通大學(xué)