專利名稱：利用木糖代謝產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用木糖代謝產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
丁二酸(succinic acid)又稱琥珀酸，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、食品和塑料等行業(yè)，作為C4平臺(tái)化合物，可用于合成1，4_ 丁二醇、四氫呋喃、Y-丁內(nèi)酯等有機(jī)化學(xué)品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)類生物可降解材料，被美國(guó)能源部認(rèn)為是未來 12種最有價(jià)值的生物煉制產(chǎn)品之一。 丁二酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，利用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化可再生資源(葡萄糖、木糖等)，由于原料來源廣泛且價(jià)格低廉，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過程中可以吸收固定CO2，能有效緩解溫室效應(yīng)，開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，今年來成為研究的熱點(diǎn)。丁二酸的生產(chǎn)菌株主要集中在Anaerobiospirillumsucciniciproducens'ActinobaciIlus succinogenes^Mannheimia succiniciproducens、重組谷氨酸棒桿菌和重組疋COli0利用野生菌株生產(chǎn)丁二酸雖然獲得了較高的產(chǎn)物濃度，但培養(yǎng)過程培養(yǎng)基成本較高，且甲酸、乙酸等副產(chǎn)物積累較多，阻礙了其工業(yè)化進(jìn)程。E. coli由于遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡(jiǎn)單和生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于研究以獲得產(chǎn)丁二酸優(yōu)秀菌株。E. coli野生菌株生產(chǎn)丁二酸雖然獲得了較高的產(chǎn)物濃度，但培養(yǎng)過程培養(yǎng)基成本較高，且甲酸、乙酸等副產(chǎn)物積累較多，因此可以敲除或失活其中的乳酸脫氫酶(LDH)基因和丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性以減少副產(chǎn)物的生成。但是，由于敲除了 PFL基因，導(dǎo)致菌株不能生產(chǎn)乙酸，從而使伴隨乙酸生成的ATP減少，最終導(dǎo)致重組大腸桿菌不能利用木糖代謝生長(zhǎng)，并且生產(chǎn)丁二酸。玉米芯是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中比較常見的廢棄物，由于其成分含有大量纖維素，因此其水解液對(duì)微生物發(fā)酵來說，是一種很好的可持續(xù)利用的綠色碳源，但其水解液含有高濃度木糖，因此大腸桿菌NZNlll不能利用玉米芯水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。姜岷等將玉米芯按料液比I : 5 (質(zhì)量體積比)配制玉米芯料液，物料粒徑250 380 u m, H2SO4用量3% (體積分?jǐn)?shù))，水解溫度126°C，反應(yīng)時(shí)間215 h，利用活性炭吸附及Ca (OH) 2中和等方式，對(duì)玉米芯多組分糖液進(jìn)行脫毒脫鹽處理，總糖質(zhì)量濃度為50 g/L，其中木糖占80%以上。稻草秸桿是重要的一類可再生生物質(zhì)資源。目前，除了在造紙業(yè)工業(yè)方面的利用，絕大多數(shù)被廢棄，嚴(yán)重浪費(fèi)了資源并且污染了環(huán)境。其主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，因此其水解液對(duì)微生物發(fā)酵來說，是一種很好的可持續(xù)利用的綠色碳源，但其水解液含有高濃度木糖，因此不能利用木糖的大腸桿菌菌株不能利用稻草秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，陶文沂等通過稀硫酸121°C處理稻草秸桿I h，再用20 g/L的NaOH于121°C處理秸桿Ih，葡萄糖和木糖二者總質(zhì)量濃度都達(dá)50 g/L左右。甘蔗渣是甘蔗制糖時(shí)榨糖之后剩下的主要成分，因此其水解液對(duì)微生物發(fā)酵來說，是一種很好的可持續(xù)利用的綠色碳源，但其水解液含有高濃度木糖，因此不能利用木糖的大腸桿菌菌株不能利用稻草秸桿水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，約含有50%的纖維素通過粉碎以及堿/氧化法預(yù)處理可得到總糖質(zhì)量為50 g/L，其中木糖占80%以上。在大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶生成草酰乙酸，在此過程中沒有ATP的生成,但是在subtil is中,磷酸烯醇式丙酮酸是通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶生成草酰乙酸的，在此過程中有ATP的生成，并且Millard等在大腸桿菌中過量表達(dá)萬.coli /7/7C和/7^,研究發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)/7/7C可以使琥拍酸作為混合酸發(fā)酵的主要產(chǎn)物，且產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高3. 5倍，而過量表達(dá)/74對(duì)發(fā)酵結(jié)果沒有影響，但在/7/7C缺陷菌株中，的過量表達(dá)能夠提高琥珀 酸的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)目的在于提供了一種基于ATP生物合成系統(tǒng)改造后的大腸桿菌菌株的構(gòu)建方法，達(dá)到菌株的構(gòu)建方法簡(jiǎn)單方便，構(gòu)建得到的菌株發(fā)酵方法簡(jiǎn)單可行，易于工業(yè)化，產(chǎn)酸能力強(qiáng)的目的，從而大大降低了生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。利用木糖代謝產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟
(1)以缺乏乳酸脫氫酶基因(A/M)，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的A.cWiNZNlll菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同時(shí)缺乏IdhA,pfIB和PPC的感受態(tài)菌株；
(2)單獨(dú)純化擴(kuò)增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(/7^)基因，或者純化擴(kuò)增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，以及選擇自蘋果酸酶Cs/d)基因、蘋果酸脫氫酶基因或丙酮酸羧化酶基因這三種基因中的一種，構(gòu)建得到單獨(dú)過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及選擇自蘋果酸酶、蘋果酸脫氫酶或丙酮酸羧化酶這三種酶中的一種的表達(dá)質(zhì)粒；
(3)將步驟(2)所述的質(zhì)粒導(dǎo)入步驟(I)得到的感受態(tài)菌株，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；
(4)利用步驟(3)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子單獨(dú)過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及選擇自蘋果酸酶、蘋果酸脫氫酶或丙酮酸羧化酶這三種酶中的一種，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝木糖的能力，得到可利用木糖代謝產(chǎn)丁二酸基因工程菌。具體的，利用本發(fā)明所述的上述方法可以細(xì)分為下述幾個(gè)具體方法。A、過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，得到能夠高效利用木糖生長(zhǎng)并產(chǎn)丁二酸的大腸桿菌coli BA204
以缺乏乳酸脫氫酶基因(7過乂)，丙酮酸甲酸裂解酶基因ipflB、活性的萬.coli NZNlll菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同時(shí)缺乏IdhA'pflB和PPC的感受態(tài)菌株；
合成一對(duì)5’端帶有酶切位點(diǎn)的引物，以Bacillus subti I is基因組DNA為模板，純化擴(kuò)增出的Pd基因后，表達(dá)質(zhì)粒pTrc99a用與引物所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)一致的酶雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-/ cA ； 將質(zhì)粒pTrc99a-/ cA導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PPC)基因的NZNlll菌株的感受態(tài)，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為Escherichia coli BA204 ；
利用AscAericAia coli BA204過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶,恢復(fù)其在厭氧條件下代謝木糖的能力。重組質(zhì)粒pTrc99a-/ d的構(gòu)建圖譜如圖3所示。B、過量共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和蘋果酸酶，得到能夠高效利用木糖生長(zhǎng)并產(chǎn)丁二酸的大腸桿菌coli BA205
以缺乏乳酸脫氫酶基因(7過乂)，丙酮酸甲酸裂解酶基因ipflB、活性的萬.coli NZNlll菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同時(shí)缺乏IdhA'pflB和PPC的感受態(tài)菌株；
合成一對(duì)5’端帶有相同酶切位點(diǎn)的引物，以subti I is基因組DNA為模板，純化擴(kuò)增出的基因后，已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTrcgga-sfbJ用與引物所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)一致的酶單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒；
將質(zhì)粒pTrcgga-sfbJ-pcA導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZNlll菌株的感受態(tài)，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為coliBA205 ；
利用AscAericAia coli BA205共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和蘋果酸酶,恢復(fù)其在厭氧條件下代謝木糖的能力。重組質(zhì)粒pTrcgga-sfbJ-pd的構(gòu)建圖譜如圖4所示。C、過量共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和蘋果酸脫氫酶，使其能夠高效利用木糖生長(zhǎng)并產(chǎn)丁二酸，獲得大腸桿菌AscAericAia coli BA206
以缺乏乳酸脫氫酶基因(7過乂)，丙酮酸甲酸裂解酶基因ipflB、活性的萬.coli NZNlll菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同時(shí)缺乏IdhA'pflB和PPC的感受態(tài)菌株；
合成一對(duì)5’端帶有相同酶切位點(diǎn)的引物，以subti I is基因組DNA為模板，純化擴(kuò)增出的基因后，已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTrc99a- t*用與引物所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)一致的酶單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a- ￡*-/7c々；
將質(zhì)粒pTrc99a- ￡*-/7cA導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZNlll菌株的感受態(tài)，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為coli BA206 ；利用AscAericAia coli BA206共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和蘋果酸脫氫酶,恢復(fù)其在厭氧條件下代謝木糖的能力。重組質(zhì)粒pTrc99a- ￡*-/ d的構(gòu)建圖譜如圖5所示。D、過量共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和丙酮酸羧化酶，使其能夠高效利用木糖生長(zhǎng)并產(chǎn)丁二酸，獲得大腸桿菌AscAericAia coli BA207
以缺乏乳酸脫氫酶基因(7過乂)，丙酮酸甲酸裂解酶基因ipflB、活性的萬.coli NZNlll菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同時(shí)缺乏IdhA'pflB和PPC的感受態(tài)菌株；
合成一對(duì)5’端帶有相同酶切位點(diǎn)的引物，以subti I is基因組DNA為模板，純化擴(kuò)增出的基因后，已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTrc99a-/ _Fc用與引物所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)一致的酶單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-/7_Fc-/7cA ；
將質(zhì)粒pTrc99a-/7_Fc-/7cA導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZNlll菌株的感受態(tài)，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為coli BA207 ；利用coli BA207共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和丙酮酸羧化酶,恢復(fù)其在厭氧條件下代謝木糖的能力。重組質(zhì)粒pTrc99a-/7_Fc-/ d的構(gòu)建圖譜如圖6所示。本發(fā)明的有益效果在于
首先，厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)大量諸如乙酸等對(duì)菌株有毒害作用的副產(chǎn)物，因此考慮兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段進(jìn)行產(chǎn)酸發(fā)酵。也可以選擇性地采用膜分離技術(shù)，達(dá)到分離菌體的目 的，再進(jìn)而用于厭氧發(fā)酵。具體步驟如下采用兩階段發(fā)酵模式，劃線-80°C凍存管保藏的菌液到含有氨芐青霉素的平板，挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落到5 ml LB培養(yǎng)基的試管，1% (v/v)接種量接入三角瓶中，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD6tltl至0. 8-1. 0左右時(shí)用0. 3 mM的IPTG誘導(dǎo)至0D_=3左右時(shí)，按接種量10%轉(zhuǎn)接至血清瓶中厭氧發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)果表明，新構(gòu)建的和大腸桿菌ATP生物合成途徑有關(guān)的基因工程菌coli BA 204、Escherichia coli BA ^Escherichia coli BA 取 Escherichia coli BA 207 f灰復(fù)了厭氧條件下代謝木糖的能力，并高效利用木糖產(chǎn)丁二酸。其次，本發(fā)明通過分子生物學(xué)手段改造大腸桿菌的ATP生物合成途徑，提高ATP供給，補(bǔ)充木糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程中的能量供給，使重組大腸桿菌能夠持續(xù)利用木糖生長(zhǎng)并使其高效合成丁二酸的方法未見公開，而這種應(yīng)用將大大推進(jìn)丁二酸產(chǎn)業(yè)的進(jìn)步和發(fā)展。


圖I線性DNA片段的電泳鑒定圖。圖2同源重組陽(yáng)性重組子的電泳鑒定圖。圖3重組質(zhì)粒pTrc99a-/ c々的構(gòu)建圖譜。圖4重組質(zhì)粒的構(gòu)建圖譜。圖5重組質(zhì)粒pTrc99a- ￡*-/ c々的構(gòu)建圖譜。圖6重組質(zhì)粒pTrc99a-/7j^-/7cA的構(gòu)建圖譜。圖7 PCR產(chǎn)物pck的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。圖8重組質(zhì)粒pTrc99a-/ cA的單雙酶切鑒定圖。圖9重組質(zhì)粒pTrcgga-sfbJ-pcA的單雙酶切鑒定圖。圖10重組質(zhì)粒pTrc99a- ￡*-/ d的單雙酶切鑒定圖。圖11重組質(zhì)粒pTrc99a-/7_FC-/ d的單雙酶切鑒定圖。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明，但對(duì)本發(fā)明沒有限制。本發(fā)明所述的安普霉素抗性基因的來源是pIJ773，獲得自南京師范大學(xué)邵蔚藍(lán)教授處。本發(fā)明所述的能夠誘導(dǎo)表達(dá)\重組酶的質(zhì)粒的來源是pKD46,購(gòu)自Introvegen公司。本發(fā)明所述的能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生FLP重組酶的質(zhì)粒的來源是pCP20,購(gòu)自Introvegen公司。本發(fā)明所述的subtilis基因組的來源是購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
本發(fā)明所述的表達(dá)質(zhì)粒用pTrc99a的來源是購(gòu)自Introvegen公司。本發(fā)明所述的出發(fā)菌株'E. coli NZNlll的感受態(tài)菌株的來源有兩處
(1)Biotechnol Bioeng, 2001，74:89 95。申請(qǐng)人首先通過查閱到該生物材料的上述文獻(xiàn)出處，并聯(lián)系了發(fā)表人系美國(guó)芝加哥大學(xué)的David P. Clark教授，并郵件請(qǐng)求其贈(zèng)與該生物材料，并免費(fèi)獲得了該生物材料；且申請(qǐng)人保證從本申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料；
(2)該生物材料還在中國(guó)專利(申請(qǐng)?zhí)?6198547.X，申請(qǐng)日1996. 10. 31，授權(quán)曰2003年I月I日，授權(quán)公告號(hào)CN1097632C)的專利文獻(xiàn)中公開并獲得授權(quán)。本發(fā)明所述的引物的設(shè)計(jì)及合成自行設(shè)計(jì)并外包金斯瑞生物技術(shù)公司合成。 實(shí)施例I
本實(shí)施例說明構(gòu)建過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表達(dá)質(zhì)粒，恢復(fù)重組菌株在厭氧條件下代謝木糖的能力，得到菌株AscAericAia coli BA204。I、以缺乏乳酸脫氫酶基因UdhA、,丙酮酸甲酸裂解酶基因ipflB、活性的疋coliNZNlll菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同時(shí)缺乏IdhA,pfIB和PPC的感受態(tài)菌株。利用同源重組技術(shù)敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因以兩側(cè)帶有FRT位點(diǎn)的安普霉素抗性基因?yàn)槟０?，利用高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，并設(shè)計(jì)兩端帶有PPC同源片段的擴(kuò)增引物，成功擴(kuò)增出線性DNA同源片段； 在出發(fā)菌株NZNlll中導(dǎo)入能夠誘導(dǎo)表達(dá)入重組酶的質(zhì)粒，使在電轉(zhuǎn)入線性DNA片段后，可以抑制菌體內(nèi)部的核酸外切酶，防止線性片段的分解，同時(shí)進(jìn)行同源重組，通過抗性篩選獲得陽(yáng)性重組子；導(dǎo)入能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生FLP重組酶的質(zhì)粒，在誘導(dǎo)后，利用一對(duì)平板，進(jìn)行平行點(diǎn)樣，能夠在無抗性平板上生長(zhǎng)，但不能在抗性平板上生長(zhǎng)的均極為已經(jīng)敲除抗性的NZNlll菌株。具體的方法
(I)利用LB培養(yǎng)基，于37°C、有氧條件下培養(yǎng)大腸桿菌NZNlll至OD6tltl=O. 4 0. 6，制備成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。(2)將質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)入感受態(tài)的大腸桿菌NZN111。電擊條件為200 Q，25 U F,電擊電壓2. 3 kV，電擊時(shí)間4 5 ms。電擊后迅速將菌體加入預(yù)冷I mL的SOC培養(yǎng)基，150r/min、30°C培養(yǎng)I h之后涂布于帶氨芐青霉素(amp)的LB培養(yǎng)基平板篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子大腸桿菌 NZNlll (pKD46)。(3)在LB培養(yǎng)基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于30°C下誘導(dǎo)質(zhì)粒pKD46表達(dá)出入重組酶，制成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。(4)以兩側(cè)帶有FRT位點(diǎn)的安普霉素抗性基因?yàn)槟０?，利用高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，以質(zhì)粒PIJ773為模板，并設(shè)計(jì)兩端帶有PPC同源片段的擴(kuò)增引物，擴(kuò)增出線性DNA同源片段，引物序列如下
上游帶同源臂引物H1-P1，下劃線為同源片段
5’ -ATGAACGAACAATATTCCGCATTGCGTAGTAATGTCAGTATGCTCGGCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3，。下游帶同源臂引物H2-P2，下劃線為同源片段
5， -AGCACGAGGGTTTGCAGAAGAGGAAGATTAGCCGGTATTACGCATACCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3，。反應(yīng)體系帶同源臂的上下游引物(100 pmol/ii L)各0. 5 ii L ;模板DNA(100ng/iiL) 0.5 u L ； 10 X buffer 5 u L ；dNTPs (10 mM)各 I y L ;DMS0 (100%) 2.5 u L ；Pyrobest DNA 聚合酶(2. 5 U/ u L) I u L ；ddH20 36/35. 5 uL ;總體積 50 u L。反應(yīng)條件94°C，2min ； (94°C 45 sec ；50°C 45 sec ；72°C 90 sec;10 個(gè)循環(huán))；(94°C 45 sec ；50°C 4 5 sec ；72°C 90 sec;15 個(gè)循環(huán))；72°C，5 min。線性DNA片段的鑒定如圖2。(5)電轉(zhuǎn)線性DNA片段至已誘導(dǎo)表達(dá)入重組酶的大腸桿菌NZNlll (pKD46)感受態(tài)，并涂布于帶安普霉素的LB平板篩選出陽(yáng)性重組子，并進(jìn)行了 PCR鑒定，電泳圖如圖3所
/Jn o(6)陽(yáng)性重組子制成感受態(tài)后倒入能誘導(dǎo)表達(dá)FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20，于42°C熱激表達(dá)FLP重組酶后即可消除安普霉素抗性。利用一對(duì)平板，進(jìn)行平行點(diǎn)樣，能夠在無抗性平板上生長(zhǎng)，但不能在抗性平板上生長(zhǎng)的均極為已經(jīng)敲除抗性的菌株。2、構(gòu)建過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過程包括
(I) 合成帶有Sac I和Xba I酶切位點(diǎn)的引物，
上游引物5’ - CGAGCTCATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3’ ；
下游引物5’ - GCTCTAGAGCATTCCGTCAATTAAAACAAG -3’。(2)以Bacillus subtilis基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5 min ； (94°C 45 s，55°C 45 s，72°C 100 s，35 個(gè)循環(huán))；72°C，10 min。純化擴(kuò)增出的Pd基因和表達(dá)質(zhì)粒pTrc99a分別用feci和油<31雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-/ d PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖如圖7所示；質(zhì)粒pTrc99a_/ c左的雙酶切電泳鑒定如圖8所示。3、將質(zhì)粒pTrc99a_/7d導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZNlll菌株的感受態(tài)，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為如ricAia coliBA204。實(shí)施例2
本實(shí)施例說明構(gòu)建共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和蘋果酸酶的表達(dá)質(zhì)粒，恢復(fù)重組菌株在厭氧條件下代謝木糖的能力，得到菌株coli BA205。I、以缺乏乳酸脫氫酶基因(7￡*乂),丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的疋coliNZNlll菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同時(shí)缺乏IdhA ,pflB和PPC的感受態(tài)菌株(同實(shí)施例I)。2、構(gòu)建共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和蘋果酸酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過程包括 (I)合成上下游都帶有歷'fldIII酶切位點(diǎn)的引物，
上游引物5’ - CCCAAGCTTATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3’ ；
下游引物5’ - CCCAAGCTTGCAITCCGTCAATTAAAACAAG-3’。(2)以Bacillus subtilis基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5 min ； (94°C 45 s，55°C 45 s，72°C 100 s，35 個(gè)循環(huán))；72°C，10 min。純化擴(kuò)增出的基因和表達(dá)質(zhì)粒pTrcgga-sfbJ分別用/ZifldIII單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrcgga-sfbJ-pd重組質(zhì)粒的單雙酶切鑒定圖如圖9所示。
3、將質(zhì)粒pTrcgga-sfbJ-pd導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZNlll菌株的感受態(tài)，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為coliBA205。實(shí)施例3
本實(shí)施例說明構(gòu)建共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和蘋果酸脫氫酶的表達(dá)質(zhì)粒，恢復(fù)重組菌株在厭氧條件下代謝木糖的能力，得到菌株coli BA206。I、以缺乏乳酸脫氫酶基因UdhA、,丙酮酸甲酸裂解酶基因ipflB、活性的疋coliNZNlll菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧 化酶(PPC)基因，得到同時(shí)缺乏IdhA ,pflB和PPC的感受態(tài)菌株(同實(shí)施例I)。2、構(gòu)建共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和蘋果酸脫氫酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過程包括
(I)合成上下游都帶有歷'fldIII酶切位點(diǎn)的引物，
上游引物5’ - CCCAAGCTTATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3’ ；
下游引物5’ - CCCAAGCTTGCAITCCGTCAATTAAAACAAG-3’。(2)以Bacillus subtilis基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5 min ； (94°C 45 s，55°C 45 s，72°C 100 s，35 個(gè)循環(huán))；72°C，10 min。純化擴(kuò)增出的基因和表達(dá)質(zhì)粒pTrc99a- t*分別用//iflt/III單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a- ￡ft-/7d重組質(zhì)粒pTrc99a- ￡ft-/7c々的單雙酶切鑒定圖如圖10所示。3、將質(zhì)粒pTrc99a- ￡*-/7cA導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZNl 11菌株的感受態(tài)，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為coliBA206。實(shí)施例4
本實(shí)施例說明構(gòu)建共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和丙酮酸羧化酶的表達(dá)質(zhì)粒，恢復(fù)重組菌株在厭氧條件下代謝木糖的能力，得到菌株coli BA207。I、以缺乏乳酸脫氫酶基因(JdhA、,丙酮酸甲酸裂解酶基因ipflB、活性的疋coliNZNlll菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同時(shí)缺乏IdhA ,pflB和PPC的感受態(tài)菌株(同實(shí)施例I)。2、構(gòu)建共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和丙酮酸羧化酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過程包括
(I)合成上下游都帶有歷'fldIII酶切位點(diǎn)的引物，
上游引物5’ - CCCAAGCTTATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3’ ；
下游引物5’ - CCCAAGCTTGCAITCCGTCAATTAAAACAAG-3’。(2)以Bacillus subtilis基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5 min ； (94°C 45 s，55°C 45 s，72°C 100 s，35 個(gè)循環(huán))；72°C，10 min。純化擴(kuò)增出的基因和表達(dá)質(zhì)粒pTrc99a-/ _Fc分別用//iflt/III單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-/7j^-/ d重組質(zhì)粒pTrc99a-/7j^-/ <^的單雙酶切鑒定圖如圖11所示。3、將質(zhì)粒pTrc99a-/7_7c-/7cA導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZNl 11菌株的感受態(tài)，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為coliBA207。
實(shí)施例5
本實(shí)施例說明實(shí)施例I的新構(gòu)建的重組大腸桿菌BA204與出發(fā)菌株大腸桿菌NZNlll發(fā)酵產(chǎn)酸能力的對(duì)比。大腸桿coli BA204能夠高效利用木糖發(fā)酵,并大量積累丁二酸，采用兩階段發(fā)酵方式，其特征在于按1% (v/v)接種量從凍存管接入三角瓶中，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD6tltl至0. 4 0. 6左右用0. 3 mM的IPTG誘導(dǎo)至0D6(I(I=3左右時(shí)，按接種量10%轉(zhuǎn)接至血清瓶中厭氧發(fā)酵，發(fā)酵48 h。有氧階段培養(yǎng)基為L(zhǎng)B+ Amp (氨芐青霉素50 u g/mL)。厭氧階段培養(yǎng)基為L(zhǎng)B+木糖(20 g/L) +堿式碳酸鎂0.48 g+Amp (氨芐青霉素50U g/mL)+0. 3 mM IPTG。發(fā)酵結(jié)果見表I。表I Escherichia coli BA204與出發(fā)菌株發(fā)酵產(chǎn)酸的結(jié)果比較
權(quán)利要求
1. 一種利用木糖代謝產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟 (I)以缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的大腸桿菌菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，得到同時(shí)缺乏ldhA'pflB和PPC的感受態(tài)菌株； (2)單獨(dú)純化擴(kuò)增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，或者純化擴(kuò)增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，以及選擇自蘋果酸酶基因、蘋果酸脫氫酶基因或丙酮酸羧化酶基因這三種基因中的一種，構(gòu)建得到單獨(dú)過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及選擇自蘋果酸酶、蘋果酸脫氫酶或丙酮酸羧化酶這三種酶中的一種的表達(dá)質(zhì)粒； (3)將步驟(2)所述的質(zhì)粒導(dǎo)入步驟(I)得到的感受態(tài)菌株，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子； (4)利用步驟(3)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子單獨(dú)過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者過量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及選擇自蘋果酸酶、蘋果酸脫氫酶或丙酮酸羧化酶這三種酶中的一種，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝木糖的能力，得到可利用木糖代謝產(chǎn)丁二酸基因工程菌。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用木糖代謝產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。本發(fā)明通過分子生物學(xué)手段改造大腸桿菌的ATP生物合成途徑，過量表達(dá)與該途徑有關(guān)的酶的活性，有效的提高了大腸桿菌胞內(nèi)ATP的總量，使重組大腸桿菌能夠利用木糖代謝生長(zhǎng)，大幅度提高了丁二酸的合成效率。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102618477SQ20121010220
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月18日
發(fā)明者劉嶸明, 姜岷, 梁麗亞, 陳可泉, 韋萍, 馬江鋒 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)