專利名稱：多基因多區(qū)域的特異性捕獲方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因測序技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多基因多區(qū)域的特異性捕獲方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)今世界，核酸測序技術(shù)取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展，人類基因組計劃及許多動物、植物及微生物的基因組序列相繼測序完成。測序技術(shù)由原來的第一代Sanger測序法，逐步發(fā)展出高通量測序技術(shù)。高通量測序技術(shù)可以同時對上百萬甚至上千萬個相同或不同DNA短片段^0-500bp)同時進(jìn)行測序，并產(chǎn)生龐大的序列數(shù)據(jù)。然而,這些龐大數(shù)據(jù)的處理對科學(xué)家提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。對一個基因組測序來說，可能測序完成只需要兩三天的時間，但是要把數(shù)據(jù)處理完需要一周或者更多的時間。這就大大延遲了基因組測序的速度。新一代測序技術(shù)催生了豐富多彩的基因組圖譜。然而，對于許多研究而言，尤其是那些需要對上億人批量測序來確認(rèn)DNA序列與各種疾病相關(guān)的遺傳變異時，一個完整的人類基因組重測序依然價格昂貴。何況與疾病相關(guān)的變異大都發(fā)生于蛋白編碼區(qū)，這僅占人類基因組的2%。因此，以成本效益至上的目標(biāo)區(qū)域測序方法是今后發(fā)展的重點(diǎn)之一，依托這些方法研究高信息量區(qū)域可大大降低成本。有些研究不必要知道全部的基因組序列，而是對特定的基因組區(qū)域進(jìn)行研究，比如外顯子、SNP區(qū)域或與疾病相關(guān)的區(qū)域，因此極大的提高了數(shù)據(jù)處理的速度。而要達(dá)到特定區(qū)域的序列研究，就要首先解決如何對它們的高效捕獲。
目前基因捕獲有三種方法基于芯片的雜交捕獲方法；基于in-solution的雜交捕獲方法；用分子倒置探針來分離特異基因組區(qū)域的方法?；谛酒碾s交捕獲方法，基因組DNA首先被打斷，然后與定制的序列捕獲芯片雜交，沒有雜交上的被洗掉。富集的目標(biāo)群體隨后被洗脫并擴(kuò)增，然后用高通量測序儀測序。這種方法的幾大優(yōu)勢定向捕獲基因組目標(biāo)區(qū)(目前一塊芯片最長可捕獲5MB的指定基因組區(qū)域；數(shù)據(jù)可靠；只要你選擇出想要捕獲的區(qū)域就會設(shè)計并合成一塊定制的序列捕獲芯片，使用方便省力。但是基因組DNA的需要量比較多，對于稀有的珍貴基因組不適用，其特異性不及in-solution方法?；趇n-solution的雜交捕獲方法的流程為基因組DNA打斷——精選大小合適的文庫與RNA誘餌共孵育24小時形成RNA-DNA雜合體——洗脫磁珠——PCR擴(kuò)增——測序。I)極佳的特異性高達(dá)90%的讀出序列來源于RNA"誘餌"捕獲，其中和靶向序列完全重合的超過50% ；2)優(yōu)秀的均一性對基因組大片段序列，至少和捕獲序列重合一半以上的RNA"誘餌"超過80%，即使對小片段的外顯子序列，這一數(shù)字也超過60% ；3)卓越的重現(xiàn)性2組技術(shù)重復(fù)試驗間的差異率不到10-5 ；4)可以精確地檢測SNP。綜上所述，實(shí)驗結(jié)果完美驗證了基于液相序列捕獲的高通量平行靶向測序技術(shù)的特異性，準(zhǔn)確性，重現(xiàn)性和廣泛的應(yīng)用前景。但是因為所用的誘餌是RNA，所以需要很高的操作要求，試劑或者器具都需要用無RNA酶的。而且操作步驟比較
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分子倒置探針分離特異基因組區(qū)域的方法，這種溶液中(in-solution)捕獲方法能夠?qū)Υ蠼M分的基因組位點(diǎn)進(jìn)行定向重測序。這種通量可以達(dá)到1Mb，甚至更高。應(yīng)用高度多重復(fù)合的單鏈80聚體庫來環(huán)化同時環(huán)化目標(biāo)基因組區(qū)域。這種捕獲技術(shù)可以用一組通用引物擴(kuò)增所有的靶標(biāo)。如圖I所示，一個捕獲寡核苷酸包含兩個單鏈捕獲臂序列，這兩個臂序列可以與目標(biāo)序列的兩端側(cè)翼序列分別互補(bǔ)，從而使靶標(biāo)序列環(huán)化。連接兩個臂序列的寡聚核苷酸序列是一個固定序列。每一個環(huán)化反應(yīng)中包含有一個40bp的序列，它可以和捕獲核苷酸序列互補(bǔ)。這個序列提供下游擴(kuò)增用的通用引物序列。這種技術(shù)捕獲區(qū)域能達(dá)到800bp，同時滿足靈敏性和高度特異性的要求。尿喃唳糖基化酶(uracil glycosylase)是存在于多種生物體內(nèi)的一種重要的DNA修復(fù)酶，對于DNA復(fù)制中錯配的尿嘧啶及因胞嘧啶脫氨基造成的尿嘧啶有移除作用，在保持基因組完整性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。 不足之處是需要一個40bp載體寡核苷酸，這個寡核苷酸的3’端必須精確的與基因組片段的3’端對接。核酸酶活性能夠?qū)⒍嘤嗟?’端的序列切除。這些分子機(jī)制使捕獲臂的設(shè)計復(fù)雜化并使這個方法用標(biāo)準(zhǔn)引物設(shè)計軟件很棘手。要將這個技術(shù)推廣到研究者，使其設(shè)計能夠覆蓋任何給定人類基因組靶序列的捕獲臂是很大的挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種進(jìn)行多基因多區(qū)域捕獲特異核酸靶標(biāo)的試劑盒，解決了現(xiàn)有技術(shù)中基因捕獲技術(shù)中的種種不足之處。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種進(jìn)行多基因多區(qū)域捕獲特異核酸靶標(biāo)的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括第一引物、捕獲組分和第二引物所述第一引物用于進(jìn)行待捕獲的目的基因區(qū)域序列第一次單向PCR擴(kuò)增，所述第一引物一端與標(biāo)記有生物素的第一接頭DNA片段相連，并與待捕獲的目的基因區(qū)域序列互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸單鏈序列；所述捕獲組分包括親和素和與親和素結(jié)合的固相載體；所述親和素用于捕獲第一次單向PCR擴(kuò)增后的目的基因區(qū)域序列，并與所述第一次單向PCR擴(kuò)增后的目的基因區(qū)域序列上的生物素相結(jié)合；所述第二引物用于對親和素結(jié)合后的目的基因區(qū)域序列進(jìn)行第二次單向PCR擴(kuò)增，所述第二引物一端與第二接頭DNA片段相連，并與所述目的基因區(qū)域序列互補(bǔ)結(jié)合，且與第一引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方向相反。優(yōu)選的，所述固相載體為微球。優(yōu)選的，所述固相載體為磁性微球。優(yōu)選的，所述親和素選自卵白親合素、鏈親合素、卵黃親合素及類親合素。優(yōu)選的，所述第一接頭DNA片段具有SEQ No 1的連續(xù)核苷酸序列，且5’端通過生物素進(jìn)行標(biāo)記；第二接頭DNA片段具有SEQ No 2的連續(xù)核苷酸序列。優(yōu)選的，所述第一引物由第一接頭DNA片段、ACTG堿基組和用于特異性擴(kuò)增目的基因靶向序列，含有目的基因的至少15個連續(xù)的核苷酸序列的特異性引物連接而成；所述第二引物由第二接頭DNA片段、ACTG堿基組和用于特異性擴(kuò)增目的基因靶向序列，含有目的基因的至少15個連續(xù)的核苷酸序列的特異性引物連接而成。優(yōu)選的，所述第一引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增的第一 PCR反應(yīng)體系包括PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2、TaqDNA聚合酶、待捕獲的目的基因區(qū)域序列作為模板DNA，所述第一 PCR反應(yīng)體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度I IOX ;dNTPsO. 01 I. 5mM ；引物序列終濃度為O. 01 2 μ M ; 模板DNAO. 01 IOng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶O. 01 I. OU/ μ L ;MgCl2終濃度為 0.5 5mM。優(yōu)選的，所述第二引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增的第二 PCR反應(yīng)體系包括PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2、TaqDNA聚合酶、待捕獲的目的基因區(qū)域序列作為模板DNA，所述第二 PCR反應(yīng)體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度I IOX ;dNTPsO. 01 I. 5mM ；引物序列終濃度為O. 01 2 μ M ;模板DNAO. 01 IOng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶O. 01 I. OU/ μ L ;MgCl2終濃度為 O. 5 5mM。本發(fā)明的另一目的在于提供一種進(jìn)行多基因多區(qū)域捕獲特異核酸靶標(biāo)的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(I)將待捕獲的基因組隨機(jī)打斷后采用第一引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增；所述第一引物一端與標(biāo)記有生物素的第一接頭DNA片段相連，并與待捕獲的目的基因區(qū)域序列互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸單鏈序列；(2)使用捕獲組分對進(jìn)行第一次單向PCR擴(kuò)增后的目的基因區(qū)域序列進(jìn)行捕獲；所述捕獲組分包括親和素和與親和素結(jié)合的固相載體；所述親和素與所述第一次單向PCR擴(kuò)增后的目的基因區(qū)域序列上的生物素相結(jié)合；(3)使用第二引物對親和素結(jié)合后的目的基因區(qū)域序列進(jìn)行第二次單向PCR擴(kuò)增；所述第二引物一端與第二接頭DNA片段相連，并與所述目的基因區(qū)域序列互補(bǔ)結(jié)合，且與第一引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方向相反；(4)將第二次單向PCR擴(kuò)增后的目的基因區(qū)域序列除去親和素生物素復(fù)合物，獲得兩端帶有相同或不同DNA接頭的單鏈DNA文庫。本發(fā)明的又一目的在于提供一種進(jìn)行多基因多區(qū)域捕獲特異核酸靶標(biāo)的試劑盒在基因測序方面的應(yīng)用。如本文所用，術(shù)語“親和素”包括卵白親合素(Avidin，A)、鏈霉親合素(Streptavidin, SA)、卵黃親合素及類親合素等。該術(shù)語還包括野生型、突變型以及衍生型的親和素。如本文所用，術(shù)語“生物素”(biontin，B)廣泛分布于動、植物組織中，常從含量較高的卵黃和肝組織中提取，分子 量244. 31Kd。生物素分子有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中I環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親和素結(jié)合的主要部位；11環(huán)為噻吩環(huán)，C2上有一戊酸側(cè)鏈，其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的惟一結(jié)構(gòu)，經(jīng)化學(xué)修飾后，生物素可成為帶有多種活性基團(tuán)的衍生物——活化生物素。如本文所用，術(shù)語“固相載體” 一般選擇可結(jié)合如親和素或鏈霉親和素等大分子蛋白質(zhì)；生物大分子固相化后仍應(yīng)保持活性，而且為有利于反應(yīng)充分進(jìn)行，最好其活性基團(tuán)朝向反應(yīng)溶液。接頭DNA片段的序列如下接頭A :5’ -/BioTEG/GAGGATCCAGAATTCTCGAGTT-3，；接頭B :5，-CTCGAGAATTCTGGATCCTC-3，；捕獲引物包括第一引物和第二引物，均由接頭DNA片段+ACTG堿基組+與待擴(kuò)增的基因組DNA片段配合的特異性引物(specific primer)組成。即第一引物的結(jié)構(gòu)為接頭A+ACTG+specific primer ;第二引物的結(jié)構(gòu)為接頭 B+ACTG+specific primer ;兩引物中特異性引物根據(jù)所要捕獲的不同基因而不同。將捕獲引物設(shè)計成三部分接頭部分、中間部分和末尾部分；其各部分作用不同。其中中間部分為ACTG堿基組，中間部分加上ACTG，其目的是為了在測序開始時用這四個已知的堿基進(jìn)行糾正；ACTG 4個堿基順序任意排列。特異性引物要求設(shè)計成相同或相近的退火溫度，因此長度不固定。特異性引物根據(jù)所要捕獲的不同基因的差異進(jìn)行設(shè)計。接頭和特異性引物依據(jù)普通引物設(shè)計原則(I)長度15_30bp,—般不大于38,否則PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最佳作用溫度(74度)，從而降低產(chǎn)物的特異性。(2)G十C含量應(yīng)在45% — 55%之間，PCR擴(kuò)增中的復(fù)性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5-10度。(3)堿基分布的隨機(jī)性應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基。尤其是不應(yīng)在其3’端出現(xiàn)超過3個的連續(xù)G或C，否則會使引物在G十C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。(4)引物自身不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)。(5)引物之間兩個引物之間不應(yīng)有多于4個的互補(bǔ)或同源堿基，不然會形成引物二聚體，尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。(6)特異性與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于70%，或少于連續(xù)8個的互補(bǔ)堿基。(7)引物的3’端引物的3’端很大程度上影響Taq酶的延伸效應(yīng)，3’端不應(yīng)發(fā)生錯配。引物的3’端堿基最好選用A、G、C，而盡可能地避免選用T，尤應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)2個以上的T。(8)避開引物的二級結(jié)構(gòu)區(qū)某些引物無效的原因是引物重復(fù)區(qū)二級結(jié)構(gòu)的影響。本發(fā)明提出多基因多區(qū)域兩步單向擴(kuò)增捕獲特異核酸靶標(biāo)方法，這種方法既集合了 in-solution的高特異性的優(yōu)點(diǎn)，由具有操作簡單、省時省力的優(yōu)點(diǎn)，又具有用樣品量少的優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)選的多基因多區(qū)域兩步單向擴(kuò)增捕獲特異核酸靶標(biāo)方法可以采用如下的步驟進(jìn)行(I)首先將基因組用超聲破碎儀進(jìn)行隨機(jī)打斷；(2)將單引物加入破碎的基因組中進(jìn)行單向PCR擴(kuò)增。單引物由DNA特異引物在5’端與接有生物素的接頭DNA相連；(3)用鏈霉親和素磁珠將攜帶生物素(Bio)的單鏈目的片段DNA進(jìn)行捕獲；(4)用特異性引物對捕獲的DNA進(jìn)行第二次單向PCR擴(kuò)增；(5)除去帶有生物素的單鏈，獲得兩端帶有相同或不同DNA接頭的單鏈DNA文庫(文庫DNA相同序列分子也可以是不同系列的分子)；
(6)文庫DNA用于測序或其它任何應(yīng)用。相對于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(I)本發(fā)明方法的特異性與基于in-solution捕獲方法的特異性更好。(2)引物設(shè)計容易，整個操作更簡單。(3)均一性和覆蓋率更高。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述圖I為現(xiàn)有技術(shù)中分子倒置探針分離特異基因組區(qū)域方法的流程示意圖；圖2為本發(fā)明進(jìn)行多基因多區(qū)域捕獲特異核酸靶標(biāo)的方法流程示意圖；圖3為本發(fā)明進(jìn)行多基因多區(qū)域捕獲特異核酸靶標(biāo)的方法覆蓋度結(jié)果；圖4為本發(fā)明采用的捕獲引物的結(jié)構(gòu)示意圖；在序列結(jié)構(gòu)組成上，所述捕獲引物由接頭DNA片段+ACTG堿基組+與待擴(kuò)增的基因組DNA片段配合的特異性引物(specificprimer)組成。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對上述方案做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗中的條件。實(shí)施例一、基因組DNA的提取和純化I、向 200 μ I 全血中添加 400 μ I Lysis Solution 和 20 μ I Proteinase Ksolution,混勻獲得均一懸液。2、在56°C水浴鍋中孵育lOmin。3、添加200 μ I無水乙醇并混勻。4、將制備的裂解混合物轉(zhuǎn)移到 Gene JET Genomic DNA Purification Column。6000g 離心 lmin,棄掉廢液。將 Gene JET Genomic DNA Purification Column 轉(zhuǎn)移到 2ml
新的收集管。5、加500μ1 Wash buffer 1,8000g離心Imin棄掉廢液后將純化柱放回收集管。6、加 500 μ I Wash buffer II 到 Gene JET Genomic DNA Purification Column,12000g 離心 3min。
7、將空柱子 12000g 離心 lmin。
8、Gene JET Genomic DNA Purification Column 轉(zhuǎn)移到新的 1.5ml 的 EP 管。9、添加 100 μ I 的雙蒸水或 Elution buffer 到 Gene JET Genomic DNAPurification Column 的中心，室溫孵育 2min,8000g 離心 lmin。10、棄掉純化柱，純化的DNA或者立即用于下游實(shí)驗或者儲存在_20°C。二、基因組DNA純度檢測(Nanodrop)I、雙擊電腦屏幕上的Nanodrop圖標(biāo)，啟動軟件.2、選擇所需的測量模式，屏幕上會彈出初始化儀器的提示.往儀器的加樣孔中加入2微升的蒸餾水，合上上蓋使形成液柱，然后點(diǎn)擊確定以開始初始化，可以聽見電磁閥開合的聲音.3、五六秒后屏幕上的提示信息消失，表示初始化完成.用擦鏡紙將蒸餾水擦干凈，加入2-3微升的Buffer，合上上蓋并點(diǎn)擊Blank.4、Blank完成后，用擦鏡紙將Buffer擦干凈即可以開始上樣，點(diǎn)擊Measure開始測量。三、基因組DNA 的片段化(fragmentization)基因組DNA樣品從不同的來源獲得，從細(xì)菌到哺乳動物。當(dāng)0D260/280的nanodrop檢測值在I. 8-2. 0，濃度大約O. 3 μ g/ μ I。將超聲破碎儀的功率設(shè)置成200W，破碎5秒，停5秒，破碎次數(shù)200次。四、引物設(shè)計接頭A :5’ -/BioTEG/GAGGATCCAGAATTCTCGAGTT-3，；接頭B :5，-CTCGAGAATTCTGGATCCTC-3，；所述的特異性引物(specific primer),為用于特異性擴(kuò)增目的基因祀向序列,含有目的基因的至少15個連續(xù)的核苷酸序列；如進(jìn)行PCR擴(kuò)增血管性血友病基因的1-5個外顯子的特異性引物具有SEQ No 5 14的連續(xù)核苷酸序列。
權(quán)利要求
1.一種進(jìn)行多基因多區(qū)域捕獲特異核酸靶標(biāo)的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括第一引物、捕獲組分和第二引物 所述第一引物用于進(jìn)行待捕獲的目的基因區(qū)域序列第一次單向PCR擴(kuò)增，所述第一引物一端與標(biāo)記有生物素的第一接頭DNA片段相連，并與待捕獲的目的基因區(qū)域序列互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸單鏈序列； 所述捕獲組分包括親和素和與親和素結(jié)合的固相載體；所述親和素用于捕獲第一次單向PCR擴(kuò)增后的目的基因區(qū)域序列，并與所述第一次單向PCR擴(kuò)增后的目的基因區(qū)域序列上的生物素相結(jié)合； 所述第二引物用于對親和素結(jié)合后的目的基因區(qū)域序列進(jìn)行第二次單向PCR擴(kuò)增，所述第二引物一端與第二接頭DNA片段相連，并與所述目的基因區(qū)域序列互補(bǔ)結(jié)合，且與第一弓I物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方向相反。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述固相載體為微球。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述固相載體為磁性微球。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述親和素選自卵白親合素、鏈親合素、卵黃親合素及類親合素。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述第一接頭DNA片段具有SEQNo 1的連續(xù)核苷酸序列，且5’端通過生物素進(jìn)行標(biāo)記；第二接頭DNA片段具有SEQ No 2的連續(xù)核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述第一引物由第一接頭DNA片段、ACTG堿基組和用于特異性擴(kuò)增目的基因靶向序列，含有目的基因的至少15個連續(xù)的核苷酸序列的特異性引物連接而成；所述第二引物由第二接頭DNA片段、ACTG堿基組和用于特異性擴(kuò)增目的基因靶向序列，含有目的基因的至少15個連續(xù)的核苷酸序列的特異性引物連接而成。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述第一引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增的第一PCR反應(yīng)體系包括PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2, TaqDNA聚合酶、待捕獲的目的基因區(qū)域序列作為模板DNA，所述第一 PCR反應(yīng)體系終濃度組成為 PCR緩沖液終濃度I 10 X ； dNTPs O. 01 I. 5mM ; 弓I物序列終濃度為O. OI 2 μ M ; 模板 DNA O. 01 lOng/μ L ;TaqDNA 聚合酶 O. 01 I. OU/ μ L ; MgCl2 終濃度為O. 5 5mM。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述第二引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增的第二PCR反應(yīng)體系包括PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2, TaqDNA聚合酶、待捕獲的目的基因區(qū)域序列作為模板DNA，所述、第二 PCR反應(yīng)體系終濃度組成為、 PCR緩沖液終濃度I 10 X ； dNTPs O. 01 I. 5mM ; 弓I物序列終濃度為O. OI 2 μ M ; 模板 DNA O. 01 lOng/μ L ;TaqDNA 聚合酶 O. Ol I. OU/ μ L ; MgCl2 終濃度為O. 5 5mM。
9.一種進(jìn)行多基因多區(qū)域捕獲特異核酸靶標(biāo)的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟 (1)將待捕獲的基因組隨機(jī)打斷后采用第一引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增；所述第一引物一端與標(biāo)記有生物素的第一接頭DNA片段相連，并與待捕獲的目的基因區(qū)域序列互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸單鏈序列； (2)使用捕獲組分對進(jìn)行第一次單向PCR擴(kuò)增后的目的基因區(qū)域序列進(jìn)行捕獲；所述捕獲組分包括親和素和與親和素結(jié)合的固相載體；所述親和素與所述第一次單向PCR擴(kuò)增后的目的基因區(qū)域序列上的生物素相結(jié)合； (3)使用第二引物對親和素結(jié)合后的目的基因區(qū)域序列進(jìn)行第二次單向PCR擴(kuò)增；所述第二引物一端與第二接頭DNA片段相連，并與所述目的基因區(qū)域序列互補(bǔ)結(jié)合，且與第一弓I物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方向相反； (4)將第二次單向PCR擴(kuò)增后的目的基因區(qū)域序列除去親和素生物素復(fù)合物，獲得兩端帶有相同或不同DNA接頭的單鏈DNA文庫。
10.一種進(jìn)行多基因多區(qū)域捕獲特異核酸靶標(biāo)的試劑盒在基因測序方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種進(jìn)行多基因多區(qū)域捕獲特異核酸靶標(biāo)的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括第一引物、捕獲組分和第二引物；所述第一引物用于進(jìn)行待捕獲的目的基因區(qū)域序列第一次單向PCR擴(kuò)增，所述第一引物一端與標(biāo)記有生物素的第一接頭DNA片段相連，并與待捕獲的目的基因區(qū)域序列互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸單鏈序列；所述捕獲組分包括親和素和與親和素結(jié)合的固相載體；所述親和素用于捕獲第一次單向PCR擴(kuò)增后的目的基因區(qū)域序列，并與所述第一次單向PCR擴(kuò)增后的目的基因區(qū)域序列上的生物素相結(jié)合；所述第二引物用于對親和素結(jié)合后的目的基因區(qū)域序列進(jìn)行第二次單向PCR擴(kuò)增，所述第二引物一端與第二接頭DNA片段相連，并與所述目的基因區(qū)域序列互補(bǔ)結(jié)合，且與第一引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方向相反。該試劑盒特異性好，操作更簡單，均一性和覆蓋率更高。
文檔編號C12N15/10GK102634507SQ20121010331
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月10日
發(fā)明者何越, 楊楠, 臧伯瑋, 艾洪新 申請人:凱晶生物科技(蘇州)有限公司