專利名稱：使用葡萄糖脫氫酶的葡萄糖濃度測定方法及葡萄糖傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測定試料液(例如血液等的生化試料或其調(diào)整液)的葡萄糖濃度的技術(shù)。
背景技術(shù)：
對于糖尿病患者，為了管理血糖值而在平日掌握自己的血糖值是很重要的。而由于頻繁地到醫(yī)院去是非常麻煩的，所以那種患者自己可以進(jìn)行簡單的血糖值測定，而且在外出時(shí)也可以輕松地進(jìn)行血糖值測定的可以放在手掌里那樣大小的便攜式的簡易血糖值測定裝置就得到了應(yīng)用。
在使用便攜式的簡易血糖值測定裝置時(shí)，將提供有酶反應(yīng)場的葡萄糖傳感器裝在血糖測定裝置上，通過向葡萄糖傳感器供給血液(試樣)而進(jìn)行血糖值的測定。在這種情況下，一般使用切開測定者的皮膚后采血、而將該血液作為試料液供給至葡萄糖傳感器的方法。在這種方法中，從減小采血對于測定者的負(fù)擔(dān)的角度看，由于要采取的血液量最好較少，所以為了能用少量的血液(試樣)而能夠進(jìn)行血糖值測定，進(jìn)行了各種各樣的研究改進(jìn)。
葡萄糖傳感器被作成例如在基板上形成電極及試藥層的同時(shí)，以將該試藥層收容到內(nèi)部的形態(tài)設(shè)置毛細(xì)管的結(jié)構(gòu)(參照圖2及圖3)。雖然試藥層是作為包含氧化還原酶和電子傳遞物質(zhì)而構(gòu)成的，但是普遍使用GOD或PQQGDH作為氧化還原酶，使用鐵氰化鉀作為電子傳遞物質(zhì)(例如日本國特開2000-65778號公報(bào))。在這種葡萄糖傳感器中，利用毛細(xì)管向試藥層供給試樣時(shí)，在毛細(xì)管的內(nèi)部構(gòu)筑液相的反應(yīng)體系。這時(shí)，由氧化還原酶催化例如葡萄糖的氧化反應(yīng)，而又催化電子傳遞物質(zhì)的還原反應(yīng)。
與此相對，在簡易血糖值測定裝置中，利用葡萄糖傳感器的電極，通過對反應(yīng)體系施加電壓從而測定響應(yīng)電流值。該響應(yīng)電流值，起因于還原型的電子傳遞物質(zhì)的量(與葡萄糖的濃度相關(guān)的量)，被作為計(jì)算葡萄糖濃度時(shí)的基礎(chǔ)。在計(jì)算葡萄糖濃度時(shí)，采用電量檢測法或電流檢測法。電量檢測法是試樣中的幾乎全部的葡萄糖反應(yīng)后、取得計(jì)算用的響應(yīng)電流值的累積值、根據(jù)累積值(電量)計(jì)算葡萄糖濃度的方法。而電流檢測法則是在反應(yīng)開始經(jīng)過一段時(shí)間后取得響應(yīng)電流值、根據(jù)該響應(yīng)電流值計(jì)算葡萄糖濃度的方法。
由于GOD與葡萄糖的反應(yīng)速度較小(Km(米氏常數(shù))較大)，所以在使試樣中的大部分葡萄糖反應(yīng)而取得運(yùn)算用的電量的電量檢測法中，測定時(shí)間顯著地增長。因此，在使用 GOD作為氧化還原酶以短時(shí)間測定葡萄糖濃度的情況下，要利用電流檢測法。
但是，在電流檢測法中，在葡萄糖濃度較小的情況下，在取得響應(yīng)電流值的階段， 也許酶反應(yīng)幾乎結(jié)束了，所得到的響應(yīng)電流值要小，低濃度區(qū)域的測定精度變差。在微量試樣時(shí)，由于葡萄糖的絕對量小，所以會產(chǎn)生同樣的問題。為了消除這種缺陷，使所使用的酶量變少即可。但是，在酶量較少的情況下，由于葡萄糖的反應(yīng)速度較小，所以在一定以上的葡萄糖濃度的試樣中，葡萄糖反應(yīng)量之差不能反映出葡萄糖濃度之差。其結(jié)果是，若酶量較少，則在高濃度區(qū)域不能以響應(yīng)電流值之差得到葡萄糖濃度之差，分解能惡化。因此，可以說電流檢測法是測定范圍小、不適于微量試樣的測定的方法。
而且，GOD與電子傳遞物質(zhì)的反應(yīng)性也不那么大。因此，為了縮短測定時(shí)間，需要多量地使用電子傳遞物質(zhì)。其結(jié)果是，難以使葡萄糖傳感器(正確地說是試藥層和毛細(xì)管) 小型化，隨之也要使必要的試樣量增多。從這點(diǎn)上來看，可以說使用GOD的方法也不適于測定微量試樣的情形。
根據(jù)這些情況，在使用GOD的電流檢測法中，可以精度良好地測定葡萄糖的試樣量，最小為0.6yL，測定時(shí)間最小為15秒，測定范圍限于葡萄糖濃度為10 600mg/dL。
另一方面，在采用PQQGDH作為氧化還原酶的情況下，若采用電量檢測法，即使是 0. 3μ L的微量試樣，也可以測定血糖值，這是已知的。可是，如上所述，由于電量檢測法是利用試樣中的幾乎全部的葡萄糖來計(jì)算葡萄糖濃度的方法，所以與電流檢測法相比，在葡萄糖高濃度區(qū)域存在著測定時(shí)間相對地變長的傾向。例如，為了確保實(shí)用上所需要的最低限的測定范圍(10 600mg/dL)，需要確保15 30秒的測定時(shí)間。
為了縮短測定時(shí)間，也可以考慮增加試藥層中的酶和電子傳遞物質(zhì)的含量，在這樣情況下試藥層的溶解性惡化。所以，在向毛細(xì)管供給試樣時(shí)，在毛細(xì)管中構(gòu)筑均勻液相的反應(yīng)體系變得困難。其結(jié)果是，由于每個(gè)葡萄糖傳感器(每次測定)的溶解程度之差而使再現(xiàn)性惡化，或變得容易受到血液中的血球成分的影響等，而產(chǎn)生測定精度惡化的問題。特別是，由于鐵氰化鉀對血液的溶解性小，所以在使用鐵氰化鉀作為電子傳遞物質(zhì)的情況下， 測定精度的惡化顯著。另外，鐵氰化鉀保存穩(wěn)定性差，容易向還原體轉(zhuǎn)化，所以如果含量增多的話，與背景的增大相關(guān)聯(lián)，這次是葡萄糖低濃度領(lǐng)域的測定精度降低。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于確保測定范圍大、并且可以短時(shí)間且高精度地測定微量試樣。
在本發(fā)明的第1方面中，提供一種利用包含酶及電子傳遞物質(zhì)的反應(yīng)體系而測定葡萄糖濃度的方法，其中，使用結(jié)合有細(xì)胞色素C的葡萄糖脫氫酶作為上述酶，使用Ru化合物作為上述電子傳遞物質(zhì)。
作為細(xì)胞色素C來說，優(yōu)選使用由屬于伯克霍爾德氏屬的微生物所產(chǎn)生的細(xì)胞色素C。作為細(xì)胞色素C來說，可以使用在還原條件化的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中分子量約為43kDa的細(xì)胞色素C。
在本發(fā)明的第2方面中，提供一種利用包含酶及電子傳遞物質(zhì)的反應(yīng)體系而測定葡萄糖濃度的使用了葡萄糖脫氫酶的葡萄糖濃度測定方法，其中，使用源自伯克霍爾德氏屬的葡萄糖脫氫酶作為上述酶，使用Ru化合物作為上述電子傳遞物質(zhì)。
在本發(fā)明的葡萄糖濃度測定方法中，例如一方面對反應(yīng)體系給予刺激，另一方面檢測針對該刺激的響應(yīng)，根據(jù)該響應(yīng)的檢測量計(jì)算葡萄糖濃度。在這種情況下，例如以電壓的方式給予刺激，以電流或光學(xué)特性得到響應(yīng)。
在本發(fā)明的第3方面中，提供一種葡萄糖傳感器，其具有第1及第2電極、包含酶及電子傳遞物質(zhì)的試藥層，在向上述試藥層供給葡萄糖溶液而構(gòu)筑反應(yīng)體系的同時(shí)，利用上述第1及第2電極給予該反應(yīng)體系以刺激，其特征在于使用結(jié)合有細(xì)胞色素C的葡萄糖脫氫酶作為上述酶，使用Ru化合物作為上述電子傳遞物質(zhì)。
作為細(xì)胞色素C來說，優(yōu)選使用由屬于伯克霍爾德氏屬的微生物所產(chǎn)生的細(xì)胞色素C。作為細(xì)胞色素C來說，可以使用在還原條件化的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中分子量約為43kDa的細(xì)胞色素C。
在本發(fā)明的第4方面中，提供一種葡萄糖傳感器，其具有第1及第2電極、包含酶及電子傳遞物質(zhì)的試藥層，在向上述試藥層供給葡萄糖溶液而構(gòu)筑反應(yīng)體系的同時(shí)，利用上述第1及第2電極給予該反應(yīng)體系以刺激，其特征在于使用源自伯克霍爾德氏屬的葡萄糖脫氫酶作為上述酶，使用Ru化合物作為上述電子傳遞物質(zhì)。
在本發(fā)明中，可以使用具有葡萄糖脫氫酶活性并且在還原條件化的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中分子量約為60kDa的具有α亞單位的酶作為葡萄糖脫氫酶。葡萄糖脫氫酶也可以是在還原條件化的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中分子量約為14kDa的、亞單位的酶。
在本發(fā)明中，例如可以使用下述化學(xué)式所示的配位化合物作為Ru化合物。
[Ru(NH3)5X]11+
作為上述化學(xué)式中的X來說，可以舉出NH3、鹵素離子、CN、吡啶、煙酰胺、或H20。在例示的物質(zhì)之中，優(yōu)選使用X是NH3或鹵素離子的Ru配位化合物。另一方面，在化學(xué)式中的η+表示由X的種類所決定的Ru配位化合物的價(jià)數(shù)。
由于還原型(II)不穩(wěn)定，所以Ru配位化合物通常作為氧化型(III)而存在。所以，即使在葡萄糖傳感器的試藥層中混入了氧化型Ru配位化合物的狀態(tài)下并且曝露在光或水中，也不容易被還原。另外，Ru配位化合物具有難以結(jié)晶化、可以適當(dāng)?shù)鼐S持微粉末狀態(tài)的特性。從這點(diǎn)來看，可以說Ru配位化合物的溶解性高。因此，在考慮耐曝露性或保存穩(wěn)定性等的情況下，對于試藥層而言，優(yōu)選以氧化型含有Ru配位化合物。
本發(fā)明的葡萄糖傳感器的結(jié)構(gòu)是，例如設(shè)置有試藥層，而且還具備用于保持試料液的液保持空間。在這種情況下，就試藥層來說，以固體層的方式構(gòu)成的同時(shí)，在液保持空間保持試料液的狀態(tài)下，氧化還原酶及電子傳遞物質(zhì)的至少一部分溶解于試料液中。即，葡萄糖傳感器的結(jié)構(gòu)優(yōu)選是，在試料供給后，在液保持空間內(nèi)，由葡萄糖、氧化還原酶及電子傳遞物質(zhì)以液相構(gòu)筑反應(yīng)體系。
就液保持空間的容量來說，為了可以測定微量試料液，例如設(shè)定為0. 1 0. 5μ L。 在這種情況下，試藥層中的氧化還原酶的含量，例如設(shè)為相當(dāng)于葡萄糖脫氫酶活性1.0 10. OU的量。將一個(gè)酶單位(U)定義為，在標(biāo)準(zhǔn)檢定條件(pH6. 0、37°C )下，在作為DCIP的吸收波長的600nm處，隨著時(shí)間變化測量基于DCIP (2,6- 二氯酚靛酚)還原的退色時(shí)，每分鐘氧化ΙμΜ葡萄糖的量(摩爾吸光系數(shù)為4. 76X1000 μ M/cm)。另一方面，試藥層中的電子傳遞物質(zhì)的含量是換算為例如液保持空間被試料液充滿時(shí)的電子傳遞物質(zhì)的濃度后、相當(dāng)于1. 0 5.量。
液保持空間的結(jié)構(gòu)是由毛細(xì)管力而使試料液移動的結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明中所說的屬于伯克霍爾德氏屬的微生物，只要是可以產(chǎn)生具有葡萄糖脫氫酶活性的α亞單位、或包含細(xì)胞色素C(i3亞單位)的酶(以下，有時(shí)簡稱為“GDH”)的微生物，則不作特別限定，但是，在其中，優(yōu)選為洋蔥伯克霍爾德氏菌，特別優(yōu)選是洋蔥伯克霍爾德氏菌KSl (以下，有時(shí)簡稱為“KS1株”)。KSl株是從溫泉附近的土壤中分離的新菌株，但從其菌學(xué)的性質(zhì)來看，確定為洋蔥伯克霍爾德氏菌，于平成12年9月25日以微生物委托號第FERM BP-7306號寄存于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物寄托中心(亍 305-8566日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)。KSl株可以產(chǎn)出包含α亞單位(分子量約為60kDa)、β亞單位(相當(dāng)于細(xì)胞色素C)(分子量約為43kDa)、γ亞單位 (分子量約為14kDa)的GDH。但是，分子量是在還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中測定的。
細(xì)胞色素C(包含β亞單位)是電子傳遞蛋白質(zhì)，從提高電子傳遞速度的觀點(diǎn)來看，對于具有葡萄糖脫氫酶活性的亞單位(包含α亞單位)，以結(jié)合細(xì)胞色素C的形態(tài)，作為GDH(以下，有時(shí)簡稱為“CyGDH”)使用是優(yōu)選的。就細(xì)胞色素C來說，不限于源自屬于伯克霍爾德氏屬的微生物的細(xì)胞色素C( β亞單位)，只要是與具有葡萄糖脫氫酶活性的亞單位結(jié)合可以發(fā)揮電子傳遞功能，也可以是源自其它的微生物或活體細(xì)胞的細(xì)胞色素C。
α亞單位是如已經(jīng)敘述那樣具有葡萄糖脫氫酶活性的亞單位。由α亞單位和Υ 亞單位構(gòu)成的⑶H(以下有時(shí)簡稱為“α⑶H”)，與沒有γ亞單位的⑶H相比，與葡萄糖的反應(yīng)速度大(Vmax/Km值大)。對于這一點(diǎn)，由本發(fā)明者們確認(rèn)了。因此，從提高與葡萄糖的反應(yīng)速度的觀點(diǎn)來看，在使用α亞單位的情況下，以使Y亞單位與α亞單位結(jié)合的形態(tài)， 作為GDH使用是優(yōu)選的。
另外，在本專利申請的范圍，有時(shí)根據(jù)來源菌種限定α亞單位、細(xì)胞色素C(包含 β亞單位)或Y亞單位，但這只不過是用于限定各亞單位的簡便方法而已。即，即使在將包含作為目的的亞單位的表達(dá)編碼的載體轉(zhuǎn)入宿主，將從該宿主產(chǎn)出的GDH作為葡萄糖脫氫酶使用的情況下，在不同點(diǎn)僅僅是GDH(亞單位)的起源時(shí)，為了慎重起見，在此再確認(rèn)一下，這種情況屬于本發(fā)明的技術(shù)范圍。


圖1是表示在濃度測定裝置上安裝了本發(fā)明的葡萄糖傳感器的狀態(tài)的圖，對于濃度測定裝置來說，用框圖來表示，而對于葡萄糖傳感器來說，用平面圖來表示。
圖2是表示葡萄糖傳感器的一個(gè)例子的全體立體圖。
圖3是圖2的葡萄糖傳感器的分解立體圖。
圖4是表示在葡萄糖濃度的測定中、施加于第1及第2電極之間的電壓值及響應(yīng)電流值的隨時(shí)間變化的一個(gè)例子的圖。
圖5是表示在葡萄糖濃度的測定中、施加于第1及第2電極之間的電壓值及響應(yīng)電流值的隨時(shí)間變化的其它例子的圖。
圖6Α 圖6D是表示在使用Ru配位化合物構(gòu)成了試藥層的情況下、葡萄糖濃度與反應(yīng)開始5秒鐘后的響應(yīng)電流值之間關(guān)系的圖。
圖7Α 圖7D是表示在使用鐵配位化合物構(gòu)成了試藥層的情況下、葡萄糖濃度與反應(yīng)開始5秒鐘后的響應(yīng)電流值之間關(guān)系的圖。
圖8Α 圖8D是表示在使用Ru配位化合物構(gòu)成了試藥層的情況下、葡萄糖濃度與反應(yīng)開始10秒鐘后的響應(yīng)電流值之間關(guān)系的圖。
圖9Α 圖9D是表示在使用鐵配位化合物構(gòu)成了試藥層的情況下、葡萄糖濃度與反應(yīng)開始10秒鐘后的響應(yīng)電流值之間關(guān)系的圖。
圖IOA 圖IOD是將血細(xì)胞比容(Hct)的影響作為從反應(yīng)開始經(jīng)過特定時(shí)間后的 Bias (HCt42%基準(zhǔn))而進(jìn)行了評價(jià)的圖。
具體實(shí)施方式
以下，參照附圖對用于實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方式進(jìn)行說明。
圖1所示的濃度測定裝置1是使用本發(fā)明的葡萄糖傳感器2來測定血液等包含葡萄糖的試料液中的葡萄糖濃度的裝置。這種濃度測定裝置1是大致具有電壓施加部3、電流值測定部4、檢測部5、控制部6、運(yùn)算部7及顯示部8而構(gòu)成的。
葡萄糖傳感器2是按照一次性使用而構(gòu)成的，如圖2及圖3中清楚表示的那樣，具有蓋板20、隔板21及基板22。
在蓋板20上設(shè)置孔部23，在隔板21上設(shè)置與連通23的同時(shí)設(shè)置前端部2 開放的寬度窄的狹縫對。在蓋板20及隔板21層疊在基板22的上面22a的狀態(tài)下，由狹縫M 規(guī)定了毛細(xì)管25。該毛細(xì)管25的容量例如設(shè)定為0. 1 0. 5 μ L，而通過狹縫M的前端開口部2 及孔部23與外部相連通。前端開口部2 構(gòu)成試料液導(dǎo)入口 25a，由該試料液導(dǎo)入口 2 供給的試料液，通過毛細(xì)管現(xiàn)象在毛細(xì)管25內(nèi)向孔部23移動。
在基板22的上面2 上，設(shè)置第1電極沈、第2電極27及試藥層28。
第1及第2電極沈、27作為整體沿基板22的長方向延伸，它們的端部^a、27a在基板22的短方向延伸?；?2的上面2 按照第1及第2電極沈、27的端部^aJ6b、 27a、27b露出那樣地被絕緣膜四所覆蓋。
試藥層28例如為固體狀，橫跨在第1及第2電極沈、27的端部^a、27a間地來設(shè)置。該試藥層觀例如含有相對多量的氧化型Ru化合物(電子傳遞物質(zhì))及相對少量的 GDH(葡萄糖脫氫酶)。試藥層中的GDH的含量，例如設(shè)定為相當(dāng)于葡萄糖脫氫酶活性1. 0 10. OU的量，試藥層中的Ru化合物的含量，例如設(shè)定為換算成毛細(xì)管25被試料液充滿時(shí)的 Ru化合物的濃度而相當(dāng)于1. 0 5. 的量。
氧化型Ru化合物，只要作為電子傳遞體而起作用即可，但使用下述化學(xué)式所示的 Ru化合物是優(yōu)選的。
[Ru(NH3)5X]11+
作為上述化學(xué)式中的X來說，可以舉出NH3、鹵素離子、CN、吡啶、煙酰胺、或H20。在例示的物質(zhì)中，優(yōu)選使用X為NH3或鹵素離子的Ru配位化合物。另一方面，化學(xué)式中的η+ 表示由X的種類所決定的Ru配位化合物的價(jià)數(shù)。
在試藥層觀中，Ru化合物相對于GDH的比率被設(shè)定得較大，Ru化合物給予試藥層 28的溶解性的影響較大。另一方面，作為Ru化合物，用化學(xué)式表示的Ru配位化合物難以結(jié)晶化，可以適當(dāng)?shù)鼐S持微粉末的狀態(tài)，而溶解性高。因此，試藥層觀全體的溶解性較高，通過血液的供給可以很容易地溶解。所以，在葡萄糖傳感器2中，即使如上述范圍那樣將毛細(xì)管25的容積設(shè)定得較小，在供給血液時(shí)，在毛細(xì)管25內(nèi)也可以適當(dāng)?shù)貥?gòu)筑近乎均勻的液相的反應(yīng)體系。
另一方面，作為GDH來說，優(yōu)選使用將作為電子傳遞蛋白質(zhì)的細(xì)胞色素C與具有葡萄糖脫氫酶活性的亞單位結(jié)合的物質(zhì)。具有葡萄糖脫氫酶活性的亞單位和細(xì)胞色素C，優(yōu)選使用源自例如屬于伯克霍爾德氏屬的微生物、例如洋蔥伯克霍爾德氏菌KSl株的物質(zhì)。當(dāng)然，具有葡萄糖脫氫酶活性的亞單位和細(xì)胞色素C，不限于屬于伯克霍爾德氏屬的微生物， 而既可以是在可以發(fā)揮所要求的功能的范圍內(nèi)而源自其它的微生物或活體細(xì)胞的物質(zhì)，也可是從屬于伯克霍爾德氏屬的微生物中取得作為目的的亞單位的表達(dá)編碼的同時(shí)、將包含該表達(dá)編碼的載體轉(zhuǎn)入宿主、而從宿主中產(chǎn)出的物質(zhì)。
在使用屬于伯克霍爾德氏屬的KSl株作為微生物的情況下，具有葡萄糖脫氫酶活性的亞單位，作為分子量約為60kDa的α亞單位而得到，細(xì)胞色素C，作為分子量約為 43kDa的β亞單位而得到。利用該KSl株，可以產(chǎn)出在α亞單位和β亞單位上結(jié)合了作為分子量約為14kDa的、亞單位的GDH。但是，分子量是在還原條件下在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中測定的值。在這種情況下，從提高與葡萄糖的反應(yīng)速度的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選使用在 α亞單位上結(jié)合了 Y亞單位的aGDH。另一方面，從提高電子傳遞速度的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選使用在α⑶H結(jié)合了 β亞單位(細(xì)胞色素C)的Cy⑶H。
圖1所示的電壓施加部3是在第1電極沈的端部26b和第2電極27的端部27b 之間施加電壓的部分。電壓施加部3，通過將葡萄糖傳感器2安裝在設(shè)置于葡萄糖濃度測定裝置1上的安裝部(省略了圖示)上，借助第1及第2接觸件3a、3b，與葡萄糖傳感器2的端部^b、27b導(dǎo)通。作為電壓施加部3來說，例如可以使用干電池或充電池等的直流電源。
電流值測定部4是在向反應(yīng)體系施加電壓時(shí)測定例如與由還原型的Ru化合物放出的電子量相關(guān)的響應(yīng)電流值的部件。
檢測部5是在將葡萄糖傳感器2安裝在葡萄糖濃度測定裝置1上之后、向試藥層觀供給試料液、檢測能否進(jìn)行葡萄糖濃度測定的部件。
控制部6是控制電壓施加部3、而選擇在第1及第2電極沈、27之間施加電壓的狀態(tài)(閉回路)或不施加電壓的狀態(tài)(開回路)的部件。
運(yùn)算部7是根據(jù)由電流值測定部4測定的響應(yīng)電流值、進(jìn)行試料液中的葡萄糖濃度的運(yùn)算的部件。
另外，檢測部5、控制部6及運(yùn)算部7各自由例如CPU及ROM或RAM等的存儲器構(gòu)成，但通過將多個(gè)存儲器連接在一個(gè)CPU上而構(gòu)成檢測部5、控制部6及運(yùn)算部7的整體也可以。另外，由運(yùn)算部7而得到的計(jì)算結(jié)果，由顯示部8來顯示。顯示部8例如可以由IXD 等組成。
下面，除了參照圖1至圖3外、還參照圖4及圖5來說明試料液中的葡萄糖濃度測定的步驟。
如圖1中所清楚地表示的那樣，首先在葡萄糖濃度測定裝置1上安裝葡萄糖傳感器2。這樣的話，葡萄糖傳感器2的第1電極沈的端部26b與濃度測定裝置1的第1接觸件3a相接觸，第2電極27的端部27b與第2接觸件北相接觸。如先前提到的那樣，在這種狀態(tài)下，第1及第2電極沈、27可以與電壓施加部3導(dǎo)通。在實(shí)際的測定中，在向葡萄糖傳感器2供給試料液之前起，基于控制部6的控制，由電壓施加部3在第1及第2電極沈、 27間施加電壓。將施加電壓值例如設(shè)定在100 500mV的范圍內(nèi)。
接著，通過葡萄糖傳感器2的試料液導(dǎo)入口 25a，供給血液等試料液。試料液由于毛細(xì)管現(xiàn)象而在葡萄糖傳感器2的毛細(xì)管25內(nèi)移動。在該過程中，試藥層觀被試料液所溶解，構(gòu)筑成液相反應(yīng)體系。在反應(yīng)體系中，例如葡萄糖被GDH氧化的同時(shí)，Ru化合物成為還原型。
在通過2個(gè)端部26b、27b在第1及第2電極沈、27間施加定電壓的狀態(tài)下，試藥層觀中所存在的還原型的Ru化合物向第1電極沈的端部26a側(cè)移動，在該端部26a放出電子成為氧化型的Ru化合物。因此，在由電壓施加部3在第1及第2電極沈、27間供給定電壓的狀態(tài)下，由還原型Ru化合物賦予的電子量通過第1電極沈及第1接觸件3a在電流值測定部4作為響應(yīng)電流而被測定。
另一方面，在電流值測定部4所測定的響應(yīng)電流值，在檢測部5被監(jiān)控，如圖4所示，當(dāng)響應(yīng)電流值超過閾值I1 (例如為0. 1 3. 0 μ A)的時(shí)刻、，檢測部5檢測到試料液被供給到試藥層觀、試藥層觀溶解了。
在檢測部5檢測到試料液被供給的情況下，電流值測定部4測定從該檢測開始經(jīng)過一定時(shí)間(例如、、優(yōu)選為10秒以下，更優(yōu)選為5秒以下)的時(shí)刻、時(shí)的運(yùn)算用的響應(yīng)電流值I2O
另外，如圖5所示，可以在檢測部5檢測到試料液被供給了這種情況之后經(jīng)過一定時(shí)間(例如、、優(yōu)選為10秒以下，更優(yōu)選為3秒以下)的時(shí)刻、為止，暫時(shí)停止施加電壓。在此之后，可以將從時(shí)刻^開始再施加電壓，另一方面，從再施加電壓之后經(jīng)過一定時(shí)間(例如t2-、優(yōu)選為3秒以上，更優(yōu)選為3秒 5秒)的時(shí)刻t2時(shí)的響應(yīng)電流值作為運(yùn)算用的響應(yīng)電流值I2而采用。
另一方面，在運(yùn)算部7，根據(jù)運(yùn)算用的響應(yīng)電流值I2，計(jì)算試料液中的葡萄糖濃度。 葡萄糖濃度的運(yùn)算，是通過將響應(yīng)電流值換算為電壓之后、通過將該電壓值代入事先作好的表示電壓值和葡萄糖濃度之間關(guān)系的校對曲線上來進(jìn)行運(yùn)算的。校對曲線在例如被數(shù)字化后而與實(shí)行運(yùn)算的程序一起存儲在ROM中。
在本實(shí)施方式中，使Ru化合物與特定的⑶Η( α⑶H或Cy⑶H等)相組合，構(gòu)成試藥層28。在這種試藥層觀中，供給試料液時(shí)的反應(yīng)速度(包含酶反應(yīng)速度及電子傳遞速度 (Vmax/Km)的兩者)較大，例如在Cy⑶H時(shí)Vmax/Km約為2100mM。所以，即使在葡萄糖濃度小的情況下，葡萄糖反應(yīng)也以最大速度進(jìn)行，在單位時(shí)間內(nèi)生成的反應(yīng)生成物的量與葡萄糖濃度的大小無關(guān)而是相同的。另外，即使葡萄糖濃度為1000mg/dL左右，由于不足1秒與全部的葡萄糖反應(yīng)就結(jié)束了，即使試樣量很少，也可以得到多的反應(yīng)生成物，所以與葡萄糖濃度的大小無關(guān)，可以在短時(shí)間內(nèi)到達(dá)終點(diǎn)。其結(jié)果是，由后述的實(shí)施例可以清楚，可以既減少作為測定對象的試料液(例如血液)的量，又可以將測定時(shí)間(圖4及圖5的、-tQ) 設(shè)定得較短。此外，即使在測定葡萄糖濃度大的微量試樣的情況下，多次測定同一濃度的葡萄糖濃度時(shí)的響應(yīng)電流值的偏差小，也可以確保測定范圍大。
如上所述，由于試藥層觀的溶解性高，所以即使在為了測定微量試料而減小毛細(xì)管的尺寸的情況下，在供給試料液時(shí)，在毛細(xì)管25中，可以構(gòu)筑近乎均勻的液相反應(yīng)體系。 所以，即使在使用作為試料液的血液(試樣)的情況下，也不太受血球成分的影響，可以以良好的再現(xiàn)性測定響應(yīng)電流值。
Ru配位化合物等的Ru化合物，由于氧化型穩(wěn)定而難以向還原型變化，所以使用Ru 化合物的生物傳感器的保存穩(wěn)定性高，背景小。所以，即使在使用葡萄糖濃度小的試料或微量試料測定葡萄糖濃度的情況下，測定精度也不會惡化。
在本實(shí)施方式中，在葡萄糖傳感器與濃度測定裝置的組合中，說明了葡萄糖濃度的測定方法，但本發(fā)明的葡萄糖濃度的測定方法也可以使用具備了酶固定化電極的測量器來實(shí)現(xiàn)。
實(shí)施例
以下，在利用酶反應(yīng)的葡萄糖濃度的測定中，將Ru配位化合物與α GDH或CyGDH 組合而構(gòu)成了試藥層的葡萄糖傳感器，即使是對于微量試樣，也實(shí)際證實(shí)了反應(yīng)速度大 (測定時(shí)間短)、測定范圍寬、而再現(xiàn)性優(yōu)異、不容易受血細(xì)胞比容(Hct)的影響。
(葡萄糖傳感器的制作)
作為葡萄糖傳感器來說，使用了在基板上形成有第1電極、第2電極、試藥層及毛細(xì)管的葡萄糖傳感器(參照圖2及圖幻。通過絲網(wǎng)印刷將碳墨印到基板上后使其干燥而形成了第1及第2電極。毛細(xì)管的容量基本上設(shè)定為0.3 μ L。但是，對于試樣中的Hct的影響，如后述那樣，對于將毛細(xì)管的容量設(shè)定為0. 4μ L及0. 5μ L的情況也進(jìn)行了研究。試藥層采用由電子傳遞層及含酶層構(gòu)成的2層構(gòu)造。電子傳遞層是通過將0. 4 μ L的包含電子傳遞物質(zhì)的第1材料液涂敷在基板上后對第1材料液進(jìn)行送風(fēng)干燥(3(TC、10% Rh)而形成的。含酶層是通過將0. 3 μ L的包含氧化還原酶的第2材料液涂敷在電子傳遞層上后對第 2材料液進(jìn)行送風(fēng)干燥(30 、10% Rh)而形成的。
第1材料液是通過將下述表1中的① ④按照序號的順序混合了的混合液放置 1 3日后、向該混合液中添加電子傳遞物質(zhì)來調(diào)制的。第2材料液是通過將氧化還原酶溶解于0. 1% CHAPS中來調(diào)制的。
作為電子傳遞物質(zhì)來說，使用[RU(NH3)6]Cl3(Aldrich公司制造)(以下簡稱為 “ Ru”或“Ru 配位化合物”)或 K3[Fe (III) (CN)6](于力，4 于 7 夕(株)制“28637-75”)(以下簡稱為“i^erri”)，作為氧化還原酶來說，使用Cy⑶H、α⑶H或PQQGDH。如上所述，Cy⑶H 由α亞單位、β亞單位及γ亞單位春成，α⑶H由α亞單位及γ亞單位構(gòu)成。PQQGDH 以PQQ(吡咯喹啉醌)為輔酶。
表1 第一材料液的組成(除了電子傳遞物質(zhì))
權(quán)利要求
1.一種葡萄糖濃度測定方法，利用第1電極、第2電極和包含酶及電子傳遞物質(zhì)的反應(yīng)體系測定葡萄糖濃度的方法，其特征在于使用結(jié)合有細(xì)胞色素C的葡萄糖脫氫酶作為所述酶，使用Ru化合物作為所述電子傳遞物質(zhì)，所述Ru化合物，伴隨著由于所述酶的作用葡萄糖被氧化，由氧化型變成還原型，并且， 通過向所述第1電極放出電子再次恢復(fù)成氧化型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖濃度測定方法，其特征在于所述細(xì)胞色素C源自于洋蔥伯克霍爾德氏菌KSl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖濃度測定方法，其特征在于所述細(xì)胞色素C，在還原條件化的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，分子量約為43kDa。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖濃度測定方法，其特征在于一方面對所述反應(yīng)體系給予刺激，另一方面檢測對該刺激的響應(yīng)，根據(jù)該響應(yīng)的檢測量，計(jì)算葡萄糖濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖濃度測定方法，其特征在于所述葡萄糖脫氫酶，包括具有葡萄糖脫氫酶活性、且在還原條件化的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中、分子量約為 60kDa的α亞單位。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖濃度測定方法，其特征在于所述葡萄糖脫氫酶，具有在還原條件化的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中、分子量約為14kDa的、亞單位。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖濃度測定方法，其特征在于所述Ru化合物是下述化學(xué)式所示的配位化合物，[Ru(NH3)5X]11+所述化學(xué)式中的X是NH3、鹵素離子、CN、吡啶、煙酰胺、或H20，η+表示由X的種類所決定的Ru配位化合物的價(jià)數(shù)。
8.—種葡萄糖濃度測定方法，其是利用第1電極、第2電極和包含酶及電子傳遞物質(zhì)的反應(yīng)體系測定葡萄糖濃度的使用了葡萄糖脫氫酶的葡萄糖濃度測定方法，其特征在于使用源自洋蔥伯克霍爾德氏菌KSl的葡萄糖脫氫酶作為上述酶，使用Ru化合物作為上述電子傳遞物質(zhì)，所述Ru化合物，伴隨著由于所述酶的作用葡萄糖被氧化，由氧化型變成還原型，并且， 通過向所述第1電極放出電子再次恢復(fù)成氧化型。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的葡萄糖濃度測定方法，其特征在于一方面對所述反應(yīng)體系給予刺激，另一方面檢測對該刺激的響應(yīng)，根據(jù)該響應(yīng)的檢測量，計(jì)算葡萄糖濃度。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的葡萄糖濃度測定方法，其特征在于所述葡萄糖脫氫酶，包括具有葡萄糖脫氫酶活性、且在還原條件化的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中、分子量約為 60kDa的α亞單位。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的葡萄糖濃度測定方法，其特征在于所述葡萄糖脫氫酶，具有在還原條件化的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中、分子量約為14kDa的、亞單位。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的葡萄糖濃度測定方法，其特征在于所述Ru化合物是下述化學(xué)式所示的配位化合物，[Ru(NH3)5X]11+所述化學(xué)式中的X是NH3、鹵素離子、CN、吡啶、煙酰胺、或H20，η+表示由X的種類所決定的Ru配位化合物的價(jià)數(shù)。
13.—種葡萄糖傳感器，其具有第1及第2電極、包含酶及電子傳遞物質(zhì)的試藥層，在向所述試藥層供給葡萄糖溶液從而構(gòu)筑反應(yīng)體系的同時(shí)，利用所述第1及第2電極給予該反應(yīng)體系以刺激，其特征在于使用結(jié)合有細(xì)胞色素C的葡萄糖脫氫酶作為所述酶， 使用Ru化合物作為所述電子傳遞物質(zhì)，所述Ru化合物，伴隨著由于所述酶的作用葡萄糖被氧化，由氧化型變成還原型，并且， 通過向所述第1電極放出電子再次恢復(fù)成氧化型。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的葡萄糖傳感器，其特征在于所述細(xì)胞色素C源自于洋蔥伯克霍爾德氏菌KSl。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的葡萄糖傳感器，其特征在于所述細(xì)胞色素C，在還原條件化的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，分子量約為43kDa。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的葡萄糖傳感器，其特征在于所述葡萄糖脫氫酶，包括具有葡萄糖脫氫酶活性、且在還原條件化的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中、分子量約為60kDa的 α亞單位。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的葡萄糖傳感器，其特征在于所述葡萄糖脫氫酶，具有在還原條件化的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中、分子量約為14kDa的、亞單位。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的葡萄糖傳感器，其特征在于所述Ru化合物是下述化學(xué)式所示的配位化合物，[Ru(NH3)5X]11+所述化學(xué)式中的X是NH3、鹵素離子、CN、吡啶、煙酰胺、或H20，η+表示由X的種類所決定的Ru配位化合物的價(jià)數(shù)。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的葡萄糖傳感器，其特征在于設(shè)置有所述試藥層，而且還具備用于保持試料液的液保持空間， 所述試藥層，作為固體層而構(gòu)成的同時(shí)，在所述液保持空間保持了試料液的狀態(tài)下，所述氧化還原酶及電子傳遞物質(zhì)的至少一部分溶解于所述試料液中。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的葡萄糖傳感器，其特征在于所述液保持空間的容量是0.1 0. 5 μ Lo
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的葡萄糖傳感器，其特征在于所述試藥層中的酶含量是相當(dāng)于葡萄糖脫氫酶活性1. 0 10. OU的量。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的葡萄糖傳感器，其特征在于所述試藥層中的電子傳遞物質(zhì)的含量，換算為所述液保持空間被試料液充滿時(shí)的電子傳遞物質(zhì)的濃度，是相當(dāng)于1.0 5.量。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的葡萄糖傳感器，其特征在于所述液保持空間的結(jié)構(gòu)是通過毛細(xì)管力使試料液移動的結(jié)構(gòu)。
24.一種葡萄糖傳感器，其具有第1及第2電極、包含酶及電子傳遞物質(zhì)的試藥層，在向所述試藥層供給葡萄糖溶液從而構(gòu)筑反應(yīng)體系的同時(shí)，利用所述第1及第2電極給予該反應(yīng)體系以刺激，其特征在于使用源自洋蔥伯克霍爾德氏菌KSl的葡萄糖脫氫酶作為所述酶， 使用Ru化合物作為所述電子傳遞物質(zhì)，所述Ru化合物，伴隨著由于所述酶的作用葡萄糖被氧化，由氧化型變成還原型，并且， 通過向所述第1電極放出電子再次恢復(fù)成氧化型。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的葡萄糖傳感器，其特征在于所述葡萄糖脫氫酶，包括具有葡萄糖脫氫酶活性、且在還原條件化的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中、分子量約為60kDa的 α亞單位。
26.根據(jù)權(quán)利要求M所述的葡萄糖傳感器，其特征在于所述葡萄糖脫氫酶，具有在還原條件化的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中、分子量約為14kDa的、亞單位。
27.根據(jù)權(quán)利要求M所述的葡萄糖傳感器，其特征在于所述Ru化合物是下述化學(xué)式所示的配位化合物，[Ru(NH3)5X]11+所述化學(xué)式中的X是NH3、鹵素離子、CN、吡啶、煙酰胺、或H20，η+表示由X的種類所決定的Ru配位化合物的價(jià)數(shù)。
28.根據(jù)權(quán)利要求M所述的葡萄糖傳感器，其特征在于設(shè)置有所述試藥層，而且還具備用于保持試料液的液保持空間， 所述試藥層，作為固體層而構(gòu)成的同時(shí)，在所述液保持空間保持了試料液的狀態(tài)下，所述氧化還原酶及電子傳遞物質(zhì)的至少一部分溶解于所述試料液中。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的葡萄糖傳感器，其特征在于所述液保持空間的容量是0.1 0. 5 μ Lo
30.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的葡萄糖傳感器，其特征在于所述試藥層中的酶含量是相當(dāng)于葡萄糖脫氫酶活性1.0 10. OU的量。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的葡萄糖傳感器，其特征在于所述試藥層中的電子傳遞物質(zhì)的含量，換算為所述液保持空間被試料液充滿時(shí)的電子傳遞物質(zhì)的濃度，是相當(dāng)于1.0 5.量。
32.根據(jù)權(quán)利要求M所述的葡萄糖傳感器，其特征在于所述液保持空間的結(jié)構(gòu)是通過毛細(xì)管力使試料液移動的結(jié)構(gòu)。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用包含酶和電子傳遞物質(zhì)的反應(yīng)體系測定葡萄糖濃度的技術(shù)。在本發(fā)明中，提供了使用結(jié)合有細(xì)胞色素C的葡萄糖脫氫酶或源自屬于伯克霍爾德氏屬的微生物的葡萄糖脫氫酶作為酶、使用Ru化合物作為電子傳遞物質(zhì)的葡萄糖濃度測定方法。在本發(fā)明中，還提供了使用結(jié)合有細(xì)胞色素C的葡萄糖脫氫酶或源自屬于伯克霍爾德氏屬的微生物的葡萄糖脫氫酶作為酶、使用Ru化合物作為電子傳遞物質(zhì)的葡萄糖傳感器。
文檔編號C12Q1/00GK102533939SQ201210001930
公開日2012年7月4日 申請日期2003年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月17日
發(fā)明者山岡秀亮, 星島光博, 辻本朋吾 申請人:愛科來株式會社