專利名稱：區(qū)分大腸桿菌0157∶h7和其它菌株的多態(tài)性位點(diǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)涉及微生物學(xué)和食品科學(xué)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，發(fā)明人從14個(gè)大腸桿菌(Escherichia Coli)菌株及其多態(tài)性序列中發(fā)現(xiàn)了gnd基因和相應(yīng)的6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-PGD)蛋白，并發(fā)明了一套新的生物技術(shù)工具、診斷方法和食物檢測(cè)技術(shù)。
背景技術(shù)：
大腸桿菌O157H7是一種食物傳播的強(qiáng)毒性人類病原菌。它可以引起一系列疾病(包括無(wú)癥狀和有癥狀的階段)，如輕度腹瀉，便血/出血性腸炎，以及發(fā)生在腸炎后的具有潛在致命可能的溶血性尿毒綜合癥(HUS)。(Wilson等，傳染病雜志，1741021-1027，(1996)；Karch等，臨床微生物學(xué)雜志，331602-1605，(1995)；Rodrigue等，傳染病雜志，1721122-1125，(1995)；Riley等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，308681-685，(1983)；Kaarmali等，Lancet，1619-620，(1983)；Neill等，Arch Intem Med，1452215-2217，(1985)；Neill等，小兒醫(yī)學(xué)，8037-40，(1987)；Tarr等，傳染病雜志，162553-556，(1990))。雖然某些情況下其它大腸桿菌菌株也被認(rèn)為是致病菌，但大腸桿菌0157H7強(qiáng)烈的致病能力是其區(qū)別于其他品系的顯著特征。
HUS定義為下列三種病的綜合癥非免疫性微血管溶血性貧血癥，血小板減少癥和急性腎衰竭。HUS主要是10歲以下兒童的疾病。然而，老年人也容易由于腸胃感染大腸桿菌O157H7而引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥。(Martin等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，3231161-1167(1990)；Siegler等，小兒醫(yī)學(xué)，9435-40(1994)；Tarr和Hickman，小兒醫(yī)學(xué)，804145(1987)；Tarr等，美國(guó)傳染病雜志，129582-586(1989)；Tarr等，傳染病雜志，162553-556(1990)；Carter等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，3171496-1500(1987)；以及Ryan等，傳染病雜志，154631-638(1986))在腸胃感染大腸桿菌O157H7的兒科病例中，約有10％-15％會(huì)發(fā)生HUS。(Bell等，JAMA，2721349-1353(1994)和Bell等，小兒醫(yī)學(xué)，100E12(1997))。患HUS的兒童中大約有3/4需要輸血，大約有1/2需要透析治療。(Tarr等，美國(guó)傳染病雜志，129582-586(1989)；(Brandt等，小兒醫(yī)學(xué)雜志，125519-526(1994)；以及Tarr等，美國(guó)傳染病雜志，129582-586(1989))。盡管我們可以診斷出O157H7的感染，而且還采用了現(xiàn)代的兒科特別護(hù)理，仍然有大約5-10％的感染者會(huì)死亡。(Brandt等，小兒醫(yī)學(xué)雜志，125519-526(1994)和Tarr等，美國(guó)傳染病雜志，129582-586(1989))。對(duì)O157H7爆發(fā)的調(diào)查證明這個(gè)病菌的感染劑量是很低的。例如，在Portland的Oregon的一個(gè)湖中，它的O157H7含量低得無(wú)法檢測(cè)出，可是游客們只要少量接觸它就足以染病。(Keene等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，331579-584(1994))。又如1994年在西北太平洋地區(qū)一次與意大利臘腸有關(guān)的O157H7爆發(fā)中，調(diào)查人員得出結(jié)論認(rèn)為那些染病的人僅僅攝入了2-45個(gè)大腸桿菌O157H7活菌體。(Tilden等，美國(guó)公共健康雜志，861142-1145(1996))。
大腸桿菌O157H7常見于各種未經(jīng)有效滅菌處理的食物和環(huán)境載體中。受污染的土地上出產(chǎn)的熟牛肉的跨地區(qū)流散(Bell等，JAMA，2721349-1353(1994)和Riley等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，308681-685(1983))；鹽腌的、經(jīng)過(guò)發(fā)酵但沒有煮過(guò)的意大利臘腸(Tilden等，美國(guó)公共健康雜志，661142-1145(1996))；地方供水(Swerdlow等，國(guó)際醫(yī)學(xué)年報(bào)，117812-819(1992))和游泳池水(Keene等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，331579-584(1994))；未經(jīng)巴斯德消毒的蘋果汁(匿名作者，Morb Mortal Wkly Rep，45975(1996))；未經(jīng)巴斯德消毒的牛奶(Keene等，傳染病雜志，176815-818(1997))以及生菜(Ackers等，傳染病雜志，1771588-1593(1998))曾導(dǎo)致過(guò)大規(guī)模O157H7感染。有報(bào)道說(shuō)，不當(dāng)?shù)氖澄锾幚矸椒ㄊ菍?dǎo)致人類感染的一個(gè)重要因素。(Mead等，Arch Intern Med，157204-208(1997))。
大腸桿菌O157H7沒有莢膜多糖，但它表達(dá)一種名為157的由不同長(zhǎng)度之重復(fù)的四糖單位構(gòu)成的O側(cè)鏈抗原。這些四糖單位構(gòu)成了抗原性的O157脂多糖(LPS)。和其它大腸桿菌菌株不同，在MacConkey瓊脂培養(yǎng)基上(其中用山梨醇代替乳糖作為碳源)過(guò)夜培養(yǎng)的O157H7不能發(fā)酵山梨醇(Wells等，臨床微生物學(xué)雜志，18512-520(1983)；March等，臨床微生物學(xué)雜志，23869-872(1986))。大腸桿菌O157H7不能合成β-葡萄糖苷酶，這是另一個(gè)代謝上的重要區(qū)別。(Ratnam等，臨床微生物學(xué)雜志，262006-2012(1988))。不能發(fā)酵山梨醇的大腸桿菌O157H7幾乎總會(huì)表達(dá)一種H7鞭毛抗原，但是在美國(guó)發(fā)現(xiàn)的不能發(fā)酵山梨醇的大腸桿菌O157H7有時(shí)也不表達(dá)H7抗原。(Slutsker等，國(guó)際醫(yī)學(xué)年報(bào)，126505-513(1997))。在德國(guó)和捷克共和國(guó)境內(nèi)發(fā)現(xiàn)了另一種能表達(dá)O157抗原的大腸桿菌O157H7變種，它是能發(fā)酵山梨醇但不能運(yùn)動(dòng)的病原菌。(Bielaszewska等，臨床微生物學(xué)雜志，362135-2137(1998)；Gunzer等，臨床微生物學(xué)雜志，301807-1810(1992))。這類不能發(fā)酵山梨醇的變種很難用山梨醇-MacConkey瓊脂篩選技術(shù)來(lái)進(jìn)行鑒定。
目前的診斷方法包括檢測(cè)大腸桿菌在MacConkey瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特征(如上所述)，以及利用一種O157LPS的特異性血清試劑。具體地說(shuō)，如果一種微生物在山梨醇-MacConkey瓊脂培養(yǎng)基上外形象是典型的大腸桿菌，不能發(fā)酵山梨醇，可以和一種O157LPS側(cè)鏈的特異性血清試劑反應(yīng)但不能與對(duì)照(陰性)試劑反應(yīng)，我們就認(rèn)為它能產(chǎn)生志賀毒素，并推測(cè)它是致病性大腸桿菌O157H7。在臨床上不需要檢測(cè)H7抗原和產(chǎn)生毒素的表型，因?yàn)槟切┎荒馨l(fā)酵山梨醇、非黏液狀的、能和一種特異性O(shè)157抗原鑒定試劑反應(yīng)而不和負(fù)對(duì)照試劑反應(yīng)的大腸桿菌，幾乎總是可以產(chǎn)生毒素的。(Strockbine等，“檢測(cè)和亞種鑒定方法概要”，Escherichia coil O157H7和其它產(chǎn)生Shiqa毒素的大腸桿菌，第33章，Kaper和O′Brien編著，Washington，DCASM出版社，1998331-356；和Tarr，“產(chǎn)生志賀毒素的大腸桿菌感染挑戰(zhàn)和機(jī)遇”，大腸桿菌O157H7和其它產(chǎn)生志賀毒素的大腸桿菌，第39章，Kaper and O′Brien編著，Washington，DCASM出版社，1998393-402)。
最近人們建立了一些替代診斷方法。其中一種包括檢測(cè)釋放出來(lái)的志賀毒素。這些檢測(cè)方法要么利用志賀毒素和鞘脂糖配體結(jié)合(globotriaosylceramide)的能力(Basta等，臨床微生物學(xué)雜志，271617-1622(1989))(Biocarb，Gaithersburg，MO)，要么利用酶免疫分析法(Meridian Diagnostics，Cincinnati，Ohio)(Kohl等，臨床微生物學(xué)雜志1，352051-2054(1997))；Park等，微生物感染疾病診斷，2669-72(1996))。這些檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)在于它們除了檢測(cè)大腸桿菌O157H7以外還能檢測(cè)其他產(chǎn)生志賀毒素的大腸桿菌。有些診斷方法也包括使用探針或者引物，通過(guò)雜交、酶切、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來(lái)檢測(cè)O157H7序列。(參見美國(guó)專利5,738,995；5,747,257和5,756,293)。
各種鑒定食物中的強(qiáng)致病性大腸桿菌的方法也已建立。(Bennett等，應(yīng)用微生物學(xué)通訊22237-243(1996)；Bennett等，應(yīng)用微生物學(xué)通訊，20375-379(1995)；Blanco等，微生物學(xué)，12385-394(1996)；Bolton等，應(yīng)用微生物學(xué)通訊，23317-321(1996)；Doyle和Schoeni，應(yīng)用與環(huán)境微生物，532394-2396(1987)；Feldsine等，J AOAC Int，80517-529(1997)；Feldsine等，J AOAC Int，80530-543(1997)；Feldsine等，J AOAC Int，8043-48(1997)；Feldsine等，J AOAC Int，8037-42(1997)；Jinneman等，食品保護(hù)雜志，58722-726(1995)；Johnson等，應(yīng)用與環(huán)境微生物，61386-388(1995)；Kim和Doyle，應(yīng)用與環(huán)境微生物，581764-1767(1992)；Notermans等，國(guó)際食品微生物學(xué)雜志，1331-40(1991)；Okrend等，食品保護(hù)雜志，53936-940(1990)；Padhye和Doyle，應(yīng)用與環(huán)境微生物，572693-2698(1991)；Pawelzik，Acta Microbiol Hung，38315-320(1991)；Ratnam和March，加拿大醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)雜志，13443-46(1986)；Read等，Epidemiol lnfec，10511-20(1990)；Sequel，加拿大醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)雜志，143519-521(1990)；Tortorello和Stewart，應(yīng)用與環(huán)境微生物，603553-3559(1994)；Vernozy-Rozand等，Revue de Medecine Veterinaire，149239-244(1998)；Vernozy-Rozand等，Revue de Medecine Veterinaire，148879-882(1997)；Vernozy-Rozand等，應(yīng)用微生物學(xué)通訊，25442-446(1997)；Willshaw等，應(yīng)用微生物學(xué)雜志，75420-428(1993)；Yu和Bruno，應(yīng)用與環(huán)境微生物，62587-592(1996))。這些技術(shù)中許多包括疏水性載網(wǎng)膜過(guò)濾法(Doyle和Schoeni，應(yīng)用與環(huán)境微生物，532394-2395(1987))，計(jì)量棒免疫測(cè)定法(Padhye和Doyle，應(yīng)用與環(huán)境微生物，572693-2698(1991))，多元聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)法(Jinneman等，食品保護(hù)雜志，58722-728(1995))，標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)技術(shù)，免疫磁珠分離法(Bennett等，應(yīng)用微生物學(xué)通訊，22237-243(1996)；Blanco等，微生物學(xué)，12385-394(1996)；Karch等，臨床微生物學(xué)雜志，34516-519(1996)；Vernozy-Rozand等，應(yīng)用微生物通訊，25442-446(1997)；Willshaw等，應(yīng)用微生物雜志，75420-426(1993)；Yu和Bruno，應(yīng)用與環(huán)境微生物，62587-592(1996))或者它們的組合。不過(guò)對(duì)大腸桿菌致病菌株，特別是O157H7的起源仍需要更好的了解，也需要新方法來(lái)快速檢測(cè)在受感染個(gè)體和傳染媒介中是否存在這些致病菌。這些傳染媒介包括，但不僅限于食物和水源。
發(fā)明概述在本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了14個(gè)大腸桿菌菌株的gnd基因和相應(yīng)的6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-PGD)蛋白。發(fā)明人還在這些基因和蛋白中發(fā)現(xiàn)了一些多態(tài)現(xiàn)象，這些多態(tài)現(xiàn)象可以用于鑒定某一特定的大腸桿菌菌株和/或區(qū)分不同的大腸桿菌菌株。特別是其中一個(gè)涉及發(fā)生在第218位氨基酸的異亮氨酸替代蘇氨酸的多態(tài)現(xiàn)象，可以用于將有強(qiáng)致病力的O157H7以及O55H7菌株與致病力弱的O157H7菌株區(qū)分開。因?yàn)镺55H7和O157H7只有大約82％的同源性，強(qiáng)致病力的O157H7菌株和O55H7可以從好幾個(gè)不同的位點(diǎn)進(jìn)行區(qū)分。通過(guò)檢測(cè)第218位是否存在多態(tài)性和鑒定O157H7與O55H7的非同源區(qū)域是否存在，技術(shù)人員可以快速地檢驗(yàn)來(lái)自病人、食物或者液體的樣品中是否含有強(qiáng)致病力的大腸桿菌菌株。另外，通過(guò)鑒定gnd位點(diǎn)是否存在其它多態(tài)現(xiàn)象，技術(shù)人員可以有效地區(qū)分特定的大腸桿菌菌株，使診斷和鑒定更加精確。
本發(fā)明的實(shí)施方案包括編碼gnd基因的分離的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列含有序列表中所公開的大腸桿菌序列之一。這些序列的含有至少9個(gè)連續(xù)堿基的片斷和表1中描述的多態(tài)性也是本發(fā)明的實(shí)施方案。其它實(shí)施方案還包括編碼一種與序列表中公開的大腸桿菌核苷酸序列相應(yīng)的多肽的分離的核苷酸；和至少含有9個(gè)堿基的核酸片斷，它能在如下條件下和序列表中的核苷酸序列雜交7％SDS，0.5M NaPO4(pH7.0)，1mM EDTA，50℃，并在42℃下用1％SDS洗。另外一個(gè)實(shí)施方案涉及一種檢測(cè)大腸桿菌O157H7是否存在的核酸探針，它包含一個(gè)至少長(zhǎng)7個(gè)核苷酸的分離的核酸分子，其中所述核酸分子可以和大腸桿菌O157H7的gnd基因序列雜交而不和非-H7大腸桿菌O157菌株的gnd基因雜交。本發(fā)明另一方面涉及可以用來(lái)檢測(cè)大腸桿菌O157H7是否存在的核酸引物，它包含一個(gè)至少含有7個(gè)核苷酸的分離的核酸分子，其中所述分離的核酸分子可以作為大腸桿菌O157H7的gnd基因的引物而不能作為非H7大腸桿菌O157菌株的gnd基因的引物。本發(fā)明中的核酸探針可以通過(guò)基質(zhì)或芯片中的微型點(diǎn)陣來(lái)提供。
含有序列表中的一段序列的重組構(gòu)建體和載體也是本發(fā)明的實(shí)施方案。此外，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案還包括攜有本發(fā)明的一個(gè)載體的培養(yǎng)細(xì)胞系。本發(fā)明中的蛋白質(zhì)包括一個(gè)包含序列表中的一段序列的分離的蛋白質(zhì)，以及一個(gè)含有序列表中一段序列的至少3個(gè)連續(xù)氨基酸的分離的多肽，其中所述多肽含有至少一個(gè)可從表1中推演出來(lái)的多態(tài)性位點(diǎn)。其他有關(guān)蛋白質(zhì)的實(shí)施方案還涉及一種能夠和含有序列表中一段序列的蛋白質(zhì)特異結(jié)合的分離的抗體，其中所述抗原決定簇與可從表1中推演出來(lái)的多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)應(yīng)。此外，還有一項(xiàng)實(shí)施方案包括一種能夠和含有序列表中至少9個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的一段序列的多肽結(jié)合的分離的抗體，其中的抗原決定簇對(duì)應(yīng)于至少一個(gè)可從表1中推演出來(lái)的多態(tài)性位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。
檢測(cè)多態(tài)性以及檢測(cè)或診斷是否存在強(qiáng)致病力的大腸桿菌的方法也是本發(fā)明的實(shí)施方案。在一個(gè)方法中，通過(guò)獲得含有多核苷酸的生物樣品并分析其中是否存在診斷性多核苷酸，該多核苷酸含有至少一個(gè)表1中描述的多態(tài)性，就可以檢測(cè)出編碼6-PGD的基因的多態(tài)性。有些情況下，我們還要分析是否存在C653T或者G653C的多態(tài)性和/或?qū)υ撋飿悠返姆治鲞M(jìn)一步包含DNA擴(kuò)增步驟。另一種方法涉及鑒定致病和非致病大腸桿菌。這種方法的實(shí)施是通過(guò)，獲得含有多核苷酸的生物樣品，然后分析該樣品中是否存在可用來(lái)診斷的多核苷酸，該多核苷酸含有至少一個(gè)表1中描述的多態(tài)性，并且在是否存在至少一個(gè)表1中描述的多態(tài)性的基礎(chǔ)上判斷該大腸桿菌是致病性還是非致病性菌株。在這種實(shí)施方案的某些情況中，需要分析是否存在C653T或G653C的多態(tài)性，和/或所述生物樣品的分析還包括DNA擴(kuò)增步驟。
本發(fā)明的其他方法包括，一種制備6-PGD蛋白的方法，它有下列步驟獲得含有序列表中的一個(gè)序列的cDNA；然后將該cDNA插入到一個(gè)表達(dá)載體中，從而使cDNA可操縱地與一個(gè)啟動(dòng)子連接；將該表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以便宿主細(xì)胞產(chǎn)生該cDNA所編碼的蛋白。這種方法可以和該蛋白的分離步驟聯(lián)合起來(lái)使用。另外一種方法涉及構(gòu)建能表達(dá)序列表中的一個(gè)序列的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。這種方法包括在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)入適合基因表達(dá)的重組DNA載體。另外，我們還提供了一種檢測(cè)樣品中是否存在大腸桿菌O157H7的方法，它包括如下步驟(a)在雜交條件下，使上述樣品和一種核酸探針進(jìn)行接觸以便形成雜交復(fù)合體，該探針能選擇性地和來(lái)自大腸桿菌O157H7的gnd的核酸序列雜交，而不和來(lái)自非H7的大腸桿菌O157菌株的gnd的核酸序列雜交，和(b)檢測(cè)上述雜交復(fù)合體是否產(chǎn)生，從而指示樣品中是否含有大腸桿菌O157H7。
附圖簡(jiǎn)述

圖1圖解顯示了存在于幾個(gè)大腸桿菌菌株的gnd基因位點(diǎn)中的多態(tài)性。橫條表示長(zhǎng)1407 bp的gnd等位基因，豎線表示通過(guò)與一段共有序列比較得出的多態(tài)性位點(diǎn)。
圖2顯示了大腸桿菌O55H7和大腸桿菌O157H7染色體在大腸桿菌O55H7的gnd 3′端下游3916個(gè)核苷酸和大腸桿菌O157H7的gnd基因3′端下游52個(gè)核苷酸之間的同源性。大腸桿菌O55H7的其余DNA中我們感興趣的元件包括一段與S.enterica Typhimurium的tnpA基因同源的片段，與大腸桿菌O157的rfb簇、wbdJ和wbdk的非編碼區(qū)有同源性的H-重復(fù)蛋白質(zhì)基因。開放閱讀框被注明是同源蛋白。位點(diǎn)按照染色體的情況定位。
圖3顯示一段帶有g(shù)nd位點(diǎn)及其旁側(cè)區(qū)域的染色體。
發(fā)明詳述本文中，發(fā)明人敘述了14個(gè)大腸桿菌菌株中g(shù)nd基因和相應(yīng)的6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-PGD)蛋白的發(fā)現(xiàn)過(guò)程。發(fā)明人還在這些基因和蛋白質(zhì)中找到了幾個(gè)可以用來(lái)確定存在某特定大腸桿菌菌株和/或?qū)⒁粋€(gè)大腸桿菌菌株與其他菌株相區(qū)別的遺傳差異或“多態(tài)性”。其中一個(gè)具體的多態(tài)性是第218位氨基酸由蘇氨酸替代異亮氨酸，該多態(tài)性用“T218I”或“Thr218Iso”表示。在某些情況下，這種形式的6-PGD或編碼這種6-PGD的多核苷酸(即218位為異亮氨酸或編碼218位異亮氨酸的多核苷酸)用“Thr218”表示。在其他的情況下，“Iso218”表示的是編碼6-PGD的一個(gè)片段的多核苷酸上的多態(tài)性(在這種情況下，多態(tài)性與編碼6-PGD片段的多核苷酸的第218位密碼子有關(guān))或表示6-PGD蛋白本身的一個(gè)片段(在此情況下，多態(tài)性與序列表提供的6-PGD多肽序列上第218位氨基酸有關(guān))。這種多態(tài)性也可以通過(guò)編碼Iso218多態(tài)性的核苷酸差異來(lái)表示。也就是說(shuō)，Thr218多態(tài)性來(lái)自于核苷酸位點(diǎn)653和654分別存在胞嘧啶和鳥嘌呤；然而，Iso218多態(tài)性在653和654位分別是胸腺嘧啶和胞嘧啶。這樣，其他表示第218號(hào)氨基酸殘基多態(tài)性的方法有，“第653位核苷酸的CT突變”和/或“第654位核苷酸的GC突變”或“C653T”和/或“G654C”。
在以下公開文本中，發(fā)明人描述了來(lái)自不同大腸桿菌菌株的14個(gè)gnd基因及其相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆、測(cè)序和鑒定。同時(shí)證明了在gnd-rfb區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)或多個(gè)可移動(dòng)的DNA元件，這些元件能在大腸桿菌中共轉(zhuǎn)移，引起抗原的變化，從而導(dǎo)致出現(xiàn)表達(dá)O55和O157抗原的致病大腸桿菌。生物學(xué)工具、診斷學(xué)和前述方法的使用也在以下部分闡述。這些實(shí)施方案對(duì)于快速鑒定是否存在特定的大腸桿菌菌株以及將一個(gè)菌株與其他菌株相區(qū)別，例如將強(qiáng)致病菌株O157H7與非致病的菌株區(qū)別開很有幫助。在以下部分，發(fā)明人描述了來(lái)自不同大腸桿菌菌株的14個(gè)gnd基因及其相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆、測(cè)序和鑒定。
來(lái)自不同大腸桿菌菌株的14個(gè)gnd基因及相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆、測(cè)序和鑒定最近，研究主要集中在利用大腸桿菌O157H7的rfb區(qū)(編碼產(chǎn)生大腸桿菌O157的O側(cè)鏈抗原所必需的酶的一簇基因)作為基于DNA的檢測(cè)系統(tǒng)的潛在目標(biāo)上，這種檢測(cè)系統(tǒng)用于食物、水源和人臨床樣品。(Desmarchelier等，臨床微生物學(xué)雜志，361801-1804(1996)；(Feng等，臨床微生物學(xué)雜志，362339-2341(1998)；(Paton和Paton，臨床微生物學(xué)雜志，36598-602(1998))。雖然O157抗原的表達(dá)和在這一區(qū)域編碼的rfb區(qū)的存在是致病性大腸桿菌O157的必要組分，但也存在不同的非產(chǎn)毒性的、表達(dá)H抗原3、16、43和45的大腸桿菌O157，它含有與大腸桿菌O157H7的rfb區(qū)同源的序列。(Bilge等，傳染與免疫，644795-4801(1996))。這些微生物會(huì)妨礙以檢測(cè)rfb區(qū)的基因差異為基礎(chǔ)的診斷策略的實(shí)行。(Wang等，傳染與免疫，663545-3551(1998))。
rbf基因簇在大腸桿菌染色體大約44分鐘(minutes)的位置。這些基因簇長(zhǎng)度通常為8-14kb，含有約8-12個(gè)產(chǎn)生O側(cè)鏈脂多糖的連續(xù)基因。(Reeves，New Compr Biochem，27281-314(1994)；Reeves等，微生物學(xué)進(jìn)展，4495-503(1996))。緊挨著rfb基因簇的是gnd等位基因，它編碼戊糖磷酸途徑的第3個(gè)酶——6-磷酸葡萄糖酸酶(6-PDG)(EC1.1.1.44)。盡管，gnd編碼一個(gè)與細(xì)菌的功能致關(guān)重要的“管家”基因，但與其他位于大腸桿菌染色體上的“管家”基因相比，這個(gè)等位基因卻是高度多態(tài)化的。(Whittam和Ake，“分子進(jìn)化機(jī)理”，Sinunir，Takahata和Clark編著，Sunderland，MA1993223-245)。一些人認(rèn)為gnd位點(diǎn)的多態(tài)性是由于與沙門氏菌的菌株間和種間的轉(zhuǎn)移及隨之的重組造成的。(Barcak和Wolf，微生物學(xué)雜志，170372-379(1988)；Beltran等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，857753-7757(1988)；Bisercic等，微生物學(xué)雜志，1733894-3900(1991)；Boyd等，普通微生物學(xué)雜志，1391125-1132(1993)；Oykhuizen和Green，微生物雜志，1737257-7288(1991)；以及Selander等，傳染與免疫，582262-2275(1990))。
在其中一種被稱為“搭乘假說(shuō)”的模型中，認(rèn)為大腸桿菌的rfb區(qū)是借助同源序列和低G＋C含量通過(guò)水平轉(zhuǎn)移從其他種獲得的。也就是說(shuō)gnd被認(rèn)為是與rfb共轉(zhuǎn)移的或與rfb“搭乘”的。(Nelson and Selander，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)9110227-10231(1994))。大腸桿菌O157H7的6-PGD和與之最接近的非O157H7大腸桿菌的6-PGD的相異電泳外觀支持這個(gè)假說(shuō)。據(jù)推測(cè)，在其他的進(jìn)化事件，包括獲得編碼噬菌體志賀毒素的基因、大腸桿菌O157H7的大質(zhì)粒和失去發(fā)酵山梨醇的能力等，大腸桿菌O55H7的rfb區(qū)域與大腸桿菌O157H7的rfb區(qū)域發(fā)生過(guò)交換。(Feng等，臨床微生物學(xué)雜志。362339-2341(1998))。
目前的范例將已觀察到的多態(tài)性gnd結(jié)構(gòu)解釋為對(duì)gnd本身的選擇壓力的結(jié)果，發(fā)明人則著手證明gnd基因的遺傳多樣性是由于gnd基因和rfb基因簇具有相似性及rfb基因編碼能成為免疫系統(tǒng)有效目標(biāo)的細(xì)菌表面分子引起的。發(fā)明人詳細(xì)論述gnd基因和其他位于rfb基因簇內(nèi)的基因一起與免疫系統(tǒng)共進(jìn)化，這樣，存在于這些基因中的多態(tài)性就能夠用來(lái)將大腸桿菌O157H7與其他大腸桿菌菌株(包括表達(dá)非致病形式抗原的O157)鑒定并分離開。因此，發(fā)明人對(duì)強(qiáng)致病性的大腸桿菌O157H7、大腸桿菌O55H7和表達(dá)O157抗原但并不象大腸桿菌O157H7那樣引起人類疾病的大腸桿菌的gnd基因進(jìn)行了克隆和測(cè)序，確定了存在于rfb基因簇，特別是gnd基因中的多態(tài)性和致病性之間的關(guān)系。
從純化的細(xì)菌DNA中克隆大腸桿菌O157H7和其他大腸桿菌菌株的gnd基因。為獲得基因組或質(zhì)粒DNA，細(xì)菌分別于37℃，在無(wú)抗生素或加入200mg/ml.氨芐西林的LB培養(yǎng)基(Maniatis等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratory，(1982))中培養(yǎng)過(guò)夜。為提取基因組DNA，取3ml細(xì)菌離心沉淀，用50毫摩爾(mM)Tris-HCl(pH8.0)和50mM乙二胺四乙酸(EDTA)懸浮。再向該混合物中加入10μl20％SDS，同時(shí)加入18μ1蛋白酶K(20mg/ml)。以上化學(xué)試劑得自Sigma公司(St.Louis，MO)。菌體在65℃保溫2-24小時(shí)，用苯-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)抽提一次或多次，再用氯仿-異戊醇(24∶1)反抽提。然后于室溫通過(guò)加入10M醋酸銨至終濃度為2.5M，再加入2.5倍體積的100％乙醇來(lái)沉淀所得水相中的DNA。將沉淀物離心，用100％乙醇洗一次，風(fēng)干，溶于含有1mM EDTA的10mM Tris-Hcl(pH8.0)中。按廠家說(shuō)明用Qiaprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)獲得并制備質(zhì)粒。
為了從表達(dá)O157抗原的大腸桿菌中擴(kuò)增gnd基因，發(fā)明人首先使用了引物對(duì)(1)5’CACGGATCCGATCACACCTGACAGGAGTA3’(SEQ.ID.No.1)(rfb端)和5’CCGGAATTCCGGGCAAAAAAAAGCCCGGTGCAA3’(SEQ.ID.No.2)(his端)。引物對(duì)(1)來(lái)自公開序列(Bisercic等，微生物學(xué)雜志，1733894-3900(1991))，并經(jīng)修改使之具有BamHl和EcoRI位點(diǎn)以便于克隆。但是，這些引物沒有能夠從大腸桿菌O55H7的DNA中得到擴(kuò)增子。因此，用引物對(duì)(2)----5’CGGAATTCCGCGCTCAACATCGANAGCCGTGG3’(SEQ-ID.No.3)和5’CGGAATTCCGCCTGGATCAGGTTAGCCGG3’(SEQ-ID.No.4)(來(lái)自計(jì)算機(jī)化的大腸桿菌gnd序列數(shù)據(jù)庫(kù)，并且具有5′EcoRI位點(diǎn))的共有多核苷酸作為引物從TB 182A菌株(一種大腸桿菌O55H7菌株)(Bokete等，J Infect Dis，1751382-1389(1997))中引導(dǎo)合成DNA。這些引物擴(kuò)增得到了長(zhǎng)度約為1.3kb的PCR產(chǎn)物，其中包含gnd基因內(nèi)的部分序列。對(duì)這些擴(kuò)增子進(jìn)行序列分析確定了下列引物對(duì)能分別從這個(gè)等位基因接近3’和5’端引導(dǎo)合成DNA(3)5’CGGGGTACCCCGTAAGGGACCAGTTTCTTACCTGGG3’(SEQ.ID.No.5)和5′GCCCTATCTAGATAAAGG3′(SEQ.ID.No.6)；(4)5′AGTTAAAGCCTTCCGCGG3′(SEQ.ID.No.7)和5TGCCCGCTACATCTCCTC3′(SEQ-ID.No.8)；(5)5′GTTGTACTCTTCAGACGC3′(SEQ ID.No.9)和5TCGTCGCTTATGCGGTACAGAGCG3′(SEQ.ID.No.10).
然后用SacII(購(gòu)自Promega.Madison，WI，按廠家說(shuō)明使用)消化大腸桿菌O55H7的全基因組DNA。通過(guò)加入連接酶和連接緩沖液(購(gòu)自New England Biolabs，按廠家說(shuō)明使用)使所得DNA片段環(huán)化。引物對(duì)(6)-5′CGGGGTACCCCGTAAGGGACCAGTITCTTACCTGGG3′(SEQ-ID.No.5)和5′GCCCTATCTAGATAAAGG3′(SEQ-ID.No.6)和引物對(duì)(7)-5′AGTTAAAGCCTTCCGCGG3′(SEQ-ID.No.7)和5TGCCCGCTACATCTCCTC3′(SEQ-ID.No.8)分別被用來(lái)擴(kuò)增大腸桿菌O55H7的gnd基因的5′和3′端外的序列。由此得到的序列數(shù)據(jù)促成了設(shè)計(jì)和利用引物對(duì)(8)-5′CCATCAGTAATAATGAAAAGGAATT3′(SEQ-ID.No.11)和5′ATCATTAGCTCCTCTTAAGATCGC3′(SEQ-ID.No.12)來(lái)擴(kuò)增大腸桿菌O55的gnd等位基因。引物對(duì)(9)-5’TCGTCGCTTATGCGGTACAGAGCG3′)(SEQ-ID.No.10)或5′GCGTTCTTAAAGAGTCCTGC3′(SEQ-ID.No.13)和5TGCCCGCTACATCTCCTC3′(SEQ.ID.No.8)擴(kuò)增跨越大腸桿菌O157H7、大腸桿菌O55H7和大腸桿菌O55H6菌株的gnd基因3’端的DNA(DEC譜系1和2)。
PCR過(guò)程使用ExpandTM長(zhǎng)模板PCR系統(tǒng)(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Indiana)(″擴(kuò)展系統(tǒng)″)或Taq DNA聚合酶(Promega，Madison，WI)。Taq DNA聚合酶(Promega)用于全gnd基因的擴(kuò)增的起始。對(duì)于使用擴(kuò)展系統(tǒng)的擴(kuò)增，反應(yīng)在廠家提供的50μl BMB緩沖液1中進(jìn)行。所用DNA聚合酶為Promega公司提供的Taq DNA聚合酶，貨號(hào)M1865(50U/μl)(A)或者Boehringer-Mannheim公司提供的Taq和Pwo DNA聚合酶(3.5U/μl)(B)。所用緩沖液是Promega無(wú)MgCl2的Taq DNA聚合酶10×反應(yīng)緩沖液(10×反應(yīng)緩沖液500mM KCl，100mM Tris-HCl，(25C下，pH9.0)，1.0％Triton X-100)(與聚合酶一起由廠家提供)；Promega公司的含MgCl2的Taq DNA多聚酶10×反應(yīng)緩沖液(廠家提供)(10×反應(yīng)緩沖液500mM KCl，15mM MgCl2，100mM Tris-HCl，(25C下，pH9.0)，1.0％Triton X-100)或者Boehringer-Mannheim Expand 10X緩沖液1(廠家提供)。熱循環(huán)條件94℃(1分鐘)，37℃(1分鐘)，和72℃(1分鐘)循環(huán)35次，再在72℃下溫育7分鐘；94℃(1分鐘)，37℃(1分鐘)和72℃(1分鐘)循環(huán)30次，再在72℃下溫育7分鐘；起始循環(huán)在95℃(3分鐘)，55℃(1分鐘)和74℃(1分鐘)條件下進(jìn)行，接著在95℃(1分鐘)，55℃(1分鐘)和72℃(1分鐘)條件下進(jìn)行35次循環(huán)，最后于72℃溫育5分鐘；或先在92℃下溫育2分鐘，接著在92℃(10秒)、52℃(30秒)和68℃(1分鐘)條件下循環(huán)10次，再于92℃(10秒)、52℃(30秒)和68℃(1分鐘，每次循環(huán)加10秒)循環(huán)10次。所有PCR反應(yīng)在PTCTM-100程控?zé)嵫h(huán)儀上進(jìn)行(MJ Research，Inc.，Watertown，MA)。所得擴(kuò)增產(chǎn)物在溴乙啶染色的瓊脂糖凝膠中顯示。
首先，將Taq酶合成的大腸桿菌O157的gnd等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物用BamHI和EcoRI消化后，克隆進(jìn)pSK+(stratagene)，大腸桿菌O157 gnd等位基因的基因內(nèi)部分的擴(kuò)增子克隆至pSK+的EcoRI位點(diǎn)。接著，用pGEM T Easy載體(Promega，Madison，WI)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序。在含氨芐西林(200mg/mL)的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的白色菌落說(shuō)明DNA已經(jīng)插入克隆載體，用Qiaprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)，按廠家說(shuō)明獲得并制備其質(zhì)粒。插入片段經(jīng)EcoRI消化和瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)。所克隆的插入片段用載體特異的(SP6和T7)和適當(dāng)?shù)拈g插引物，使用Perkins Elmer Applied Biosystems Dye Terminator CycleSequencing Ready反應(yīng)試劑盒(Part no 402079，Perkins Elmer，F(xiàn)oster City，CA)或Perkins Elmer Applied Systems BigDyeTMTerminator CycleSequencing Ready Reaction試劑盒(Part number 43031521.Perkins Elmer，F(xiàn)oster City，CA)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序在Fred Hutchinson癌癥研究中心用ABI373測(cè)序儀或在華盛頓大學(xué)生物化學(xué)系用ABI 377自動(dòng)測(cè)序儀(AppliedBiosystems)完成。
對(duì)于那些來(lái)源于利用沒有糾錯(cuò)系統(tǒng)的Taq聚合酶由gnd擴(kuò)增得到的被隆擴(kuò)增子的序列，得到了明確的雙向序列。給這些序列中的每一個(gè)，利用Expand System制備并克隆其亞序列擴(kuò)增子，并且通過(guò)序列分析對(duì)每個(gè)核苷酸至少確定一次。對(duì)于只利用Expand System獲得的擴(kuò)增子，得到了明確的雙向雙鏈序列。用GCG程序(University of Wisconsin)對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。利用NCBI Blast服務(wù)器進(jìn)行BLAST檢索(Gish和States，自然遺傳學(xué)3266-272(1993))。
以下給出了幾種產(chǎn)生毒素的O157大腸桿菌菌株的gnd及其相應(yīng)蛋白質(zhì)的序列(gnd SEQ ID No/6-PGD SEQ ID No)(1)157H7，菌株86-24(SEQ ID No.22和23)；(2)157H7，菌株2433(來(lái)自哥倫比亞，又稱為H8)(SEQ ID No.16和17)；(3)157H7，菌株ADLL 1541(來(lái)自澳大利亞的菌株)(SEQ ID No.18和19)；(4)157H7，菌株85-07(SEQ ID No.24和25)；(5)157H7，菌株87-16(SEQ ID No.26和27)；(6)157NM，菌株2755(來(lái)自德國(guó)的非運(yùn)動(dòng)型山梨醇發(fā)酵菌)(SEQ IDNo.20和21)；比較這些菌株的gnd序列時(shí)，菌株85-07和87-16中分別只有2個(gè)和3個(gè)核苷酸與來(lái)自大腸桿菌O517H7，菌株86-24的序列不同。此外，非運(yùn)動(dòng)型O157病原菌也具有與大腸桿菌O157H7的gnd幾乎相同的gnd，盡管它與大腸桿菌O157H7的進(jìn)化距離更遠(yuǎn)。這些發(fā)現(xiàn)確定了高度產(chǎn)毒素的大腸桿菌O157H7具有g(shù)nd，后者只發(fā)生了微小的基因漂移，并且提供了證據(jù)表明可以確定與致病性相關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定序列。
以下給出了幾個(gè)非志賀毒素產(chǎn)生性、非致病型大腸桿菌菌株的gnd及其相應(yīng)蛋白質(zhì)的序列(gnd SEQ ID No/6-PGD SEQ ID No)(1)55H7，菌株TB182A(SEQ ID No42和43)；(2)157H3，菌株3004-89(SEQ ID No28和29)；(3)157H12，菌株5933(SEQID No30和31)；(4)157H16，菌株13A80(SEQ ID No40和41)；(5)157H16，菌株13A81(SEQ ID No32和33)；(6)157H38，菌株3005-89(SEQ ID No36和37)；(7)157H43，菌株7E(SEQ ID No38和39)；以及(8)157H45，菌株13A83(SEQ ID No34和35)。
將毒性高的菌株與毒性低的菌株的序列進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)多態(tài)性可以用來(lái)鑒定高度產(chǎn)毒的大腸桿菌O157菌株。表1列出所發(fā)現(xiàn)的許多多態(tài)性，即大腸桿菌O157H7菌株86-24(參照菌株)的gnd與其他已經(jīng)測(cè)序的gnd基因不同的位點(diǎn)。圖1也圖示了這些多態(tài)性。值得注意的是，非致病型菌株的gnd與致病型大腸桿菌O157H7的gnd的不同位點(diǎn)發(fā)生在多個(gè)位點(diǎn)，這樣截然不同的樣式是可辨別的。例如，在菌株13A83和13A83(分別表達(dá)H抗原16和45的大腸桿菌O157分離物)；菌株13A80、7E、3005-89和G5933(分別表達(dá)H抗原16、43、38、3和12大腸桿菌O157)；以及所有非H7大腸桿菌O157菌株中都發(fā)現(xiàn)了單核苷酸多態(tài)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易想到，通過(guò)將核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與序列表中的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行匹配可以迅速地確定表1描述的多態(tài)性(即表達(dá)為氨基酸的多態(tài)性)所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。
令人驚訝的是，在病原性O(shè)157H7菌株和O55H7菌株TB182A中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特異的多態(tài)現(xiàn)象-T218I，而非致病性O(shè)157H7菌株中都沒有。序列數(shù)據(jù)揭示了除了O55H7的病原性菌株，在653和654位核苷酸上分別為胞嘧啶和鳥嘌呤；而病原性菌株在653和654位上分別為胸腺嘧啶和胞嘧啶。因此，一種區(qū)分病原性O(shè)157H7菌株和非病原性O(shè)157H7菌株的簡(jiǎn)便方法是鑒定gnd的653位核苷酸上的“CT”突變和/或654位核苷酸上的“GC”突變或者在218位氨基酸上是否存在異亮氨酸殘基。由于大腸桿菌O55H7的gnd與大腸桿菌O157H7(例如，菌株86-24)的gnd僅有約82％的同源性，這些菌株在幾個(gè)不同基因座可以容易地鑒別出來(lái)，如下面將要更詳細(xì)描述。表1
該發(fā)現(xiàn)的序列用GCG程序(Wisconsin大學(xué))和幾種Blast排列，用大腸桿菌O157H7，菌株86-24的核苷酸序列作為查詢序列在NCBIBlast服務(wù)器上進(jìn)行檢索。(Gish和States，Nat.Genet.，3266-272(1993))。來(lái)自應(yīng)用的大腸桿菌菌株的高分對(duì)在表2中列出。
表2高分片段對(duì) 分?jǐn)?shù)P(N) Ngb ｜U14423｜ECU14423 Escherichia coli A8190 6-phosphogl... 6675 0.0 1gb ｜M63829｜ECOR56 Escherichia coli 6-phosphogluconat... 6585 0.0 1gb ｜M63827｜ECOR25 Escherichia coli 6-phosphogluconat... 6549 0.0 1gb ｜M64331｜ECONDGN E. coli (strain ECOR65) 6-phosphogl... 6540 0.0 1gb ｜M63823｜ECOR18 Escherichia coli 6-phosphogluconat... 6513 0.0 1gb ｜M64328｜ECONDGK E. coli (strain ECOR69) 6-phosphogl... 6495 0.0 1gb ｜M64329｜ECONDGL E. coli (strain ECOR70) 6-phosphogl... 6468 0.0 1gb ｜M64330｜ECONDGM E. coli (strain ECOR68) 6.phosphogl... 6441 0.0 1gh ｜M63825｜ECOR21 Escherichia coli 6.phosphogluconat... 6432 0.0 1gb ｜M63824｜ECOR20 Escherichia coli 6-phosphogluconat... 6423 0.0 1gb ｜AEO00294｜ECAEO00294 Escherichia coli K-12 MG1655 secti... 6414 0.0 1dbj｜Dg0841｜D90841 E. coli genomic DNA， Kohara clone#... 6414 0.0 1gb ｜M63821｜ECOR1O Escherichia coli 6-phosphogluconat... 6405 0.0 1gb ｜K02072｜ECOGND E. coli gnd gene coding for 6-phosp... 6405 0.0 1gb ｜M63826｜ECOR23 Escherichia coli 6-phosphogluconat... 6369 0.0 1gb ｜M63822｜ECOR11 Escherichia coli 6-phosphogluconat... 6315 0.0 1gb ｜U14469｜SBU14469 Shigella boydii ATCC 8700 6-phosph... 6306 0.0 1gb ｜M63828｜ECOR47 Escherichia coli 6-phosphogluconat... 6297 0.0 1gb ｜U14456｜ECU14456 Escherichia coli EC63 6-phosphoglu... 6288 0.0 1emb｜X71970｜SFRFBAJ S.flexneri bB，galF，rfbA-J，rfbX，... 6270 0.0 1gb｜U14442｜ECU14442 Escherichia coli EC40 6-phosphoglu... 6270 0.0 1gb｜U14436｜ECU14436 Escherichia coli EC15 6-phosphoglu... 6261 0.0 1gb｜U14467｜SDU14467 Shigella dysenteriae ATCC 133136-... 6252 0.0 1gb｜U14445｜ECU14445 Escherichia coli EC43 6-phosphoglu... 6234 0.0 1gb｜U14433｜ECU14433 Escherichia coli E851819 6-phospho... 6225 0.0 1gb｜U14448｜ECU14448 Escherichia coli EC46 6-phosphoglu... 6216 0.0 1gb｜U14438｜ECU14438 Escherichia coli EC25 6-phosphoglu... 6216 0.0 1gb｜U14441｜ECU14441 Escherichia coli EC35 6-phosphoglu... 6189 0.0 1gb｜U14455｜ECU14455 Escherichia coli EC6 6-phosphogluc... 6180 0.0 1gb｜U14435｜ECU14435 Escherichia coli EC14 6-phosphoglu... 6180 0.0 1gb｜U14460｜ECU14460 Escherichia coli EC69 6-phosphoglu... 6153 0.0 1gb｜U14462｜EFU14462 Escherichia fergusonii ATCC 35469 ... 6148 0.0 1gb｜U14459｜ECU14459 Escherichia coil EC70 6-phosphoglu... 6144 0.0 1gb｜U14450｜ECU14450 Escherichia coli EC5 6-phosphogluc... 6135 0.0 1gb｜U14439｜ECU14439 Escherichia coli EC52 6-phosphoglu... 6126 0.0 1gb｜U14431｜ECU14431 Escherichia coli E2666-74 6-phosph... 6126 0.0 1gb｜U14458｜ECU14458 Escherichia coli EC68 6-phosphoglu... 6117 0.0 1gb｜U14440｜ECU14440 Escherichia coli EC32 6-phosphoglu... 6081 0.0 1gb｜U14434｜ECU14434 Escherichia coli EC10 6-phosphoglu... 6081 0.0 1gb｜U14470｜SSU14470 Shigella sonnei ATCC 29930 6-phosp.. 6027 0.01gb｜U14457｜ECU14457 Escherichia coli EC64 6-phosphoglu... 6000 0.0 1gb｜U14446｜ECU14446 Escherichia coli EC44 6-phosphoglu... 6000 0.0 1gb｜U14468｜SFU14468 Shigella flexneri ATCC 26903 6-pho... 5919 0.0 1gb｜U14451｜ECU14451 Escherichia coli EC50 6-phosphoglu... 5622 0.0 1gb｜U14449｜ECU14449 Escherichia coli EC49 6-phosphoglu... 5613 0.0 1gb｜M64324｜ECOGNDG E.coli (strain ECOR4) 6-phosphoglu... 5199 0.0 1emb｜X15651｜SEGNDB S. enterica gnd gene for 6-phospho... 5082 0.0 1gb｜M64332｜STYGNDA S.typhimurium (strain LT2) 6-phosp... 5082 0.0 1dbj｜D21242｜KPNCPS Klebsieila pneumoniae cps gene clu... 5001 0.0 1gb｜M64325｜ECONDGH E. coli(strain ECOR16) 6.phosphogl... 5001 0.0 1dbj｜ABO10150｜ABO10150 Escherichia coli 08 wb gene cluste... 4965 0.0 1gb｜U14424｜CDU14424 Citrobacter diversus CT19 6-phosph... 4938 0.0 1gb｜U14427｜CDU14427 Citrobacter diversus CT4 6-phospho... 4929 0.0 1gb｜U14425｜COU14425 Citrobacter diversus CT27 6-phosph... 4929 0.0 1gb｜U14428｜CDU14428 Citrobacter diversus CT42 6-phosph... 4920 0.0 1gb｜U14429｜ CDU14429 Citrobacter diversus CT45 6-phosph...4911 0.0 1gb｜U14432｜ CDU14432 Citrobacter diversus CT9 6-phospho...4893 0.0 1gb｜L27646｜ ECOGNDH E.coli phosphogluconate dehydroge... 4884 0.0 1gb｜U14353｜ SEU14353 Salmonella enterica V serovar Broo...4858 0.0 1gb｜U14495｜ SEU14495 Salmonella enterica Illa isolate S...4848 0.0 1gb｜U14481｜ SEU14481 Salmonella enterica V 6-phosphoglu...4839 0.0 1gb｜U14508｜ SEU14508 Salmonella enterica V isolate S304...4830 0.0 1gb｜U14466｜ CFU14466 Citrobacter freundii ATCC 8090 6-p...4829 0.0 1gb｜U14509｜ SEU14509 Salmonella enterica V isolate S304...4821 0.0 1gb｜U14360｜ SEU14360 Salmonella enterica I serovar Glos...4804 0.0 1gb｜U14500｜ SEU14500 Salmonella enterica II isolate S30...4803 0.0 1gb｜U14496｜ SEU14496 Salmonella enterica Illa isolate S...4803 0.0 1gb｜U14485｜ SEU14485 Salmonella enterica I ParatyphiB 6...4794 0.0 1gb｜U14476｜ SEU14476 Salmonella enterica I Saintpaul 6....4794 0.0 1gb｜U14368｜ SEU14368 Salmonella enterica I serovar Para...4786 0.0 1gb｜U14479｜ SEU14479 Salmonella enterica I Typhimurium ...4785 0.0 1gb｜U14346｜ SEU14346 Salmonella enterica Illa serovar A...4777 0.0 1gb｜U14340｜ SEU14340 Salmonella enterica II serovar Spr...4777 0.0 1gb｜U14498｜ SEU14498 Salmonella enterica II isolate S29...4776 0.0 1gb｜U14465｜ EVU14465 Escherichia vulneris ATCC 33821 6-...4776 0.0 1gb｜U14367｜ SEU14367 Salmonella enterica I serovar Senf...4768 0.0 1gb｜U14363｜ SEU14363 Salmonella enterica II serovar 1，9...4768 0.0 1gb｜U14361｜ SEU14361 Salmonella enterica II serovar Sof... 4768 0.0 1gb｜U14338｜ SEU14338 Salmonella enterica II serovar 9，1...4768 0.0 1gb｜U14497｜ SEU14497 Salmonella enterica II isolate S29... 4767 0.0 1gb｜U14493｜ SEU14493 Salmonella enterica IIIb isolate S... 4767 0.0 1gb｜U14480｜ SEU14480 Salmonella enterica Illb 6-phosph... 4767 0.0 1gb｜U14477｜ SEU14477 Salmonella enterica I Javiana 6-ph... 4767 0.0 1gb｜U14475｜ SEU14475 Salmonella enterica I Dublin 6-pho... 4767 0.0 1gb｜U14474｜ SEU14474 Salmonella enterica I Choleraesuis... 4767 0.0 1gb｜U14505｜ SEU14505 Salmonella enterica IV isolate S30... 4758 0.0 1gb｜U14491｜ SEU14491 Salmonella enterica I Enteritidis... 4758 0.0 1gb｜U14357｜ SEU14357 Salmonella enterica I serovar Cano... 4750 0.0 1gb｜U14351｜ SEU14351 Salmonella enterica IV serovar 43...4750 0.0 1gb｜U14349｜ SEU14349 Salmonella enterica IV serovar Ar ... 4750 0.0 1gb｜U14503｜SEU14503 Salmonella enterica VII isolate S3... 4749 0.01gb｜U14494｜SEU14494 Salmonella enterica Illb isolate S... 4749 0.01gb｜U14483｜SEU14483 Salmonella enterica VI iolate S30... 4749 0.0 1gb｜U14478｜SEU14478 Salmonella enterica I Derby 6-phos... 4749 0.01gb｜U14437｜ECU14437 Escherichia coli EC16 6-phosphonlu... 4749 0.01gb｜U14352｜SEU14352 Salmonella enterica V serovar Balb... 4741 0.01gb｜U14350｜SEU14350 Salmonella enterica IV serovar Hou... 4741 0.01gb｜U14490｜SEU14490 Salmonella enterica I ParatyphiA 6... 4740 0.01gb｜U14487｜SEU14487 Salmonella enterica I Typhi 6.phos... 4740 0.01gb｜U14484｜SEU14484 Salmonella enterica VI isolate S30... 4740 0.01gb｜U14484｜SEU14484 Salmonella enterica VI isolate S30... 4740 0.01在大腸桿菌O157中發(fā)現(xiàn)三個(gè)不同的等位基因組(參見表3)。這些等位基因彼此之間約5％核苷酸殘基不同。“gnd等位基因A”由產(chǎn)毒素大腸桿菌O157H7和大腸桿菌O157NM菌株的gnd組成。菌株85-07和87-16的gnd序列僅在它們的1407位核苷酸上與菌株86-24不同；其余三個(gè)相同?！癵nd等位基因B”在表達(dá)鞭毛抗原H3、H12、H16、和H38的大腸桿菌O157菌株和菌株DEC 7E(一種具有等同于大腸桿菌O157H43的MLEE模式的不可動(dòng)O157)中發(fā)現(xiàn)，其核苷酸中約4％與gnd等位基因A不同?！癵nd等位基因C”在大腸桿菌O157H45和O157H16菌株中發(fā)現(xiàn)，其1407個(gè)核苷酸中約6％與gnd等位基因A不同。
表3應(yīng)用的野生型大腸桿菌
NM-不可動(dòng)的*澳大利亞政府分析實(shí)驗(yàn)室**菌株3584-91是不可動(dòng)的，但具有等同于大腸桿菌O157H45的MLEE模式***菌株DEC 7E是不可動(dòng)的，但具有等同于大腸桿菌O157H43的MLEE模式雖然大腸桿菌O55H7與大腸桿菌O157H7密切相關(guān)，但它們的gnd序列顯著不同。大腸桿菌O157H7，菌株86-24的gnd序列與大腸桿菌O55H7，菌株TB182A的gnd序列僅具有約82％的同源性，看來(lái)這兩個(gè)等位基因之間無(wú)直接明顯的保守區(qū)。
經(jīng)分析大腸桿菌O55H7的gnd序列下游，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)在gnd-rfb基因簇中存在一種或多種可動(dòng)元件(圖2)。發(fā)現(xiàn)相對(duì)于大腸桿菌O55H7gnd的3’＋3915位之外(即從大腸桿菌O55H7 gnd的3’端之外的3916位核苷酸開始向his延伸的片段)的1934個(gè)核苷酸中大約96％與相對(duì)于大腸桿菌O157H7 gnd的3’＋52和3’＋1984位之間的核苷酸相同。大腸桿菌O55H7和大腸桿菌O157H7的共有區(qū)域包含編碼UDP葡萄糖-6-脫氫酶和O-抗原鏈長(zhǎng)決定蛋白的開放讀碼框(orf)。分別相對(duì)于大腸桿菌O55H7和大腸桿菌O157H7 gnd的3’＋1到3’＋51位和3’＋1到3’＋3915位之間的序列沒有發(fā)現(xiàn)同源性。
發(fā)現(xiàn)相對(duì)于大腸桿菌O55H7 gnd的3’＋52到3’＋3922位之間的DNA具有大量與DNA可動(dòng)性有關(guān)的特征。發(fā)現(xiàn)相對(duì)于大腸桿菌O55H7 gnd等位基因的3’＋2680到3’＋3809位之間的核苷酸中約97％與編碼大腸桿菌Rhs-相關(guān)H-重復(fù)(H-rpt)蛋白的DNA(Genbank號(hào)L02370)同源，包括3’＋3799和3’＋3809位之間的11個(gè)核苷酸(AGCTFGCCCTG)(SEQID NO14)與大腸桿菌中H-rpt單元(Genbank號(hào)L02370)旁側(cè)的11個(gè)反向重復(fù)核苷酸相同。(Zhao等，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)1752799-2808(1993))。該11-聚體的一個(gè)幾乎相同片段(CAGGGAAGAT)(SEQ ID NO15)還與所述H-rpt基因同源片段的相反末端，即3’＋2655到3’＋2665位之間的核苷酸相同。
另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在3’＋2817到3’＋3422位之間有一個(gè)編碼201個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的orf，該蛋白質(zhì)的氨基酸與由orf-H(Genbank號(hào)L02370)編碼的RhsB中的H-重復(fù)蛋白的氨基酸存在約98％的同源性。(Zhao等，細(xì)菌學(xué)雜志1752799-2808(1993))。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)相對(duì)于大腸桿菌O55H7 gnd的3’＋3809到3’＋3922位之間的114個(gè)核苷酸(包括與大腸桿菌O157H7序列相同的7個(gè)核苷酸)中約92％與編碼IS200轉(zhuǎn)座酶A的鼠傷寒沙門氏菌LT2的tnpA(GenBank號(hào)AF093749)的3’末端相鄰的核苷酸相同。還發(fā)現(xiàn)相對(duì)于大腸桿菌O55H7 gnd的3’＋478到3’＋1942位之間的DNA與大腸桿菌0111 wbdJ和wbdK(GenBank號(hào)U13629)約75％相同。相對(duì)于gnd的3’＋112到3’＋1035位，和3’＋1032到3’＋2198位之間核苷酸的兩個(gè)orf分別與wbdJ和wbdK 67％和80％相同。(Bastin和Reeves，Gene，16417-23(1995))。相對(duì)于大腸桿菌O55H7gnd等位基因的3’＋2788到3’＋3806位核苷酸之間的三個(gè)片段與大腸桿菌O157H7 rfb基因簇(GenBank號(hào)AF061251和AB008676)的非編碼區(qū)具有83-96％的同源性。
接下來(lái)，用引物5’GCGTFCTIAAAGAGTCCTGC3’(SEQ ID NO13)和5’TGCCCGCTACATCTCCTC3’(SEQ ID NO8)(它們對(duì)應(yīng)gnd的3’端和下游區(qū))進(jìn)行PCR，從而得到來(lái)源于11大腸桿菌O55菌株DNA的6.5kb復(fù)制子。當(dāng)用來(lái)源于大腸桿菌O157H7 DNA上的這些引物進(jìn)行PCR沒有得到該復(fù)制子。
而且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該復(fù)制子可以用作雜交探針，以有效地檢測(cè)來(lái)源于不同品系的大腸桿菌O55菌株的存在。應(yīng)用引物5’GCGTTCTTAAAGAGTCCTGC3’(SEQ.ID.No.13)和來(lái)源于5’TGCCCGCTACATCTCCTC3’(SEQ.ID.No.8)制備了來(lái)源于大腸桿菌HB101、大腸桿菌O157H7菌株86-24、大腸桿菌O55H7菌株TB156A、TB182A、和5 A-E、以及大腸桿菌O55H6菌株1A、1B、2A、和2B的基因組DNA或復(fù)制子。然后用Sacl消化這些DNA，并在1％瓊脂糖上在tris-硼酸鹽-EDTA中分離(Maniatis等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(ColdSpring Harbor Laboratory)(1982))，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Micron Separations)上。然后用通過(guò)引物5’GCGTTCTTAAAGAGTCCTGC3’(SEQ.ID.No.13)和5’TGCCCGCTACATCTCCTC3’(SEQ.ID.No.8)和應(yīng)用大腸桿菌O55H7模版DNA產(chǎn)生的克隆復(fù)制子作為探針檢測(cè)遷移的DNA。用Megaprime DNA系統(tǒng)(Amersham)和[-α32P]dATP(New England NuclearResearch Products)標(biāo)記復(fù)制子探針。該實(shí)驗(yàn)顯示在裝載來(lái)自O(shè)55菌株的DNA的泳道中出現(xiàn)強(qiáng)烈信號(hào)，而裝載來(lái)自O(shè)157菌株或HB101對(duì)照的DNA的泳道沒有信號(hào)。上述研究不僅提供明確證據(jù)證明大腸桿菌O55菌株中g(shù)nd的3’區(qū)含有一個(gè)具有涉及DNA可動(dòng)性的序列的保守元件，而且指示了一種區(qū)分大腸桿菌O55H7和O157H7的快速方法。
上述數(shù)據(jù)還清楚地顯示了大腸桿菌中g(shù)nd多樣性的來(lái)源，以及rfb區(qū)的可動(dòng)性。不同品系中大腸桿菌O55的gnd的相同結(jié)構(gòu)證明了gnd和O55 rfb基因簇在天然大腸桿菌菌株之間已經(jīng)轉(zhuǎn)化成一個(gè)完整單元。另外，忽視無(wú)性繁殖系的結(jié)構(gòu)，幾乎相同的大腸桿菌O55 gnd支持這樣的結(jié)果，即O55 gnd-rfb基因簇已經(jīng)散布到天然種群中。在大腸桿菌DEC5品系中表達(dá)O55和O157 LPS抗原的大腸桿菌的gnd之間存在的泛-等位基因不調(diào)和也與該大腸桿菌品系中完整gnd-rfb區(qū)的共轉(zhuǎn)移相一致。
序列分析證明大腸桿菌O55菌株中g(shù)nd-rfb區(qū)的重組利用了轉(zhuǎn)座作用?？梢澡b定插入染色體的一個(gè)短AT-富含區(qū)鄰近tnpA(IS200的)的3’殘跡，其利用AT-富含目標(biāo)整合區(qū)。然后一個(gè)具有完整orf的H-重復(fù)蛋白基因也是重要的。不是意圖將本發(fā)明的范圍限制到任何特定作用機(jī)制，僅為了解釋的目的而提供，本發(fā)明人相信H-rpt蛋白基因確實(shí)編碼一種轉(zhuǎn)座酶，該基因的完整性提供證據(jù)證明大腸桿菌O55 gnd-rfb基因簇也就在最近才在研究的三個(gè)不同品系中由大腸桿菌O55獲得。有趣的是，轉(zhuǎn)座作用看起來(lái)是V cholerae 0139 rfb區(qū)的插入機(jī)制(Stroeher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9210374-10378(1995)；Bik等，Embo J.，14209-216(1995)；Stroeher等，細(xì)菌學(xué)雜志，1792740-2747(1997)；Comstock等，分子微生物學(xué)，19815-826(1996))，推測(cè)H-rpt蛋白同源物在沙門氏菌和弧菌的rfb轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用(Xiang等，細(xì)菌學(xué)雜志，1764357-4365(1994)；Hill等，分子微生物學(xué)，12865-871(1994))。而且，兩個(gè)H-rpt同源物，殺鮭氣單胞菌的ISAS1元件(Gustafson等，分子生物學(xué)雜志，237452-463(1994))和IS1358構(gòu)建物(最初在V.cholerae 0139 rfb區(qū)中發(fā)現(xiàn))(Dumontier等細(xì)菌學(xué)雜志，1806101-6106(1998))已經(jīng)證明發(fā)生轉(zhuǎn)換。
還發(fā)現(xiàn)了已鑒定可動(dòng)元件的其它成分。大腸桿菌O55和0111 O-側(cè)鏈均含有可立糖(Keene等，碳水化合物研究(Carbohydr.Res.)，111289-296(1983))，一種已知細(xì)菌LPS糖中的不常見殘基。指定這兩個(gè)血清組的rfb區(qū)具有編碼WbdK和WbdJ同源物的基因，雖然在gnd不同側(cè)。WbdK與假結(jié)核耶爾森氏菌的RfbH同源，一種CDP-阿比可糖途徑中的CDB-4-酮-6-脫氧-D-葡萄糖-3-脫水酶。WbdK是合成0111抗原的相應(yīng)步驟上的一種推測(cè)的吡哆胺5-磷酸-依賴性脫水酶。(Bastin和Reeves，基因，16417-23(1995))。WbdJ與由大腸桿菌莢膜多糖基因簇編碼的Orf1.9同源，據(jù)信在大腸桿菌0111 LPS抗原的合成中行使相關(guān)功能。
這些結(jié)果有助于理解大腸桿菌染色體的這一區(qū)域的進(jìn)化。首先，在兩個(gè)不同十年間從四個(gè)大陸收集的大腸桿菌O157H7中g(shù)nd結(jié)構(gòu)的幾乎一致性與目前的結(jié)論即該病原體高突變且進(jìn)化迅速不一致。(LeClerc等，科學(xué)2741208-1211(1996))。其次，指定O157抗原的rfb基因僅與有限數(shù)目的不同gnd等位基因相關(guān)。第三，不同品系中完整gnd等位基因B、和C的存在提供證據(jù)證明非-H7大腸桿菌O157最近已經(jīng)獲得一種推測(cè)的O157可動(dòng)元件。在下面公開的內(nèi)容中，本發(fā)明人描述了幾個(gè)本發(fā)明涉及軟件和硬件的其它方面。軟件和硬件實(shí)施方式本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解含有g(shù)nd序列和/或SEQ ID Nos.16-43對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的計(jì)算機(jī)可讀媒體對(duì)于確定同源序列、探針和引物的設(shè)計(jì)、表位分析、結(jié)構(gòu)和功能域的闡述、以及用于合理藥物設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)模型的構(gòu)建是有用的。gnd序列和/或SEQ ID Nos.16-43對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)可以在能夠由計(jì)算機(jī)讀取和存儲(chǔ)的任何媒體上保存、記錄、和操作。
本文使用的詞匯“記錄”和“保存”指在計(jì)算機(jī)可讀媒體上保存信息的過(guò)程。技術(shù)人員可以容易地調(diào)整任何目前已知的在計(jì)算機(jī)可讀媒體上記錄信息的方法，以生產(chǎn)包括本發(fā)明該實(shí)施方式的核苷酸或多肽序列信息的產(chǎn)品。技術(shù)人員可以得到大量數(shù)據(jù)存貯結(jié)構(gòu)，用于創(chuàng)建一種具有記錄于其上的核苷酸或多肽序列的計(jì)算機(jī)可讀媒體。數(shù)據(jù)存儲(chǔ)結(jié)構(gòu)的選擇通常基于選擇用于讀取保存信息的成分。計(jì)算機(jī)可讀媒體包括磁性可讀媒體、光可讀媒體、或電子可讀媒體。例如，計(jì)算機(jī)可讀媒體可以是一個(gè)硬盤、軟盤、磁帶、CD-ROM、RAM、或ROM，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它類型的媒體。序列信息存儲(chǔ)于其上的計(jì)算機(jī)可讀媒體可以在個(gè)人電腦、網(wǎng)絡(luò)、服務(wù)器或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中。
本發(fā)明的實(shí)施方式包括系統(tǒng)，尤其是含有本發(fā)明描述的序列信息的基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)。本文使用的“基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)”指用于分析gnd序列和/或SEQ ID Nos.16-43對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)或它們片段的硬件、軟件、和數(shù)據(jù)庫(kù)?；谟?jì)算機(jī)的系統(tǒng)優(yōu)選包括上述儲(chǔ)存媒體，和用于存取和操作序列數(shù)據(jù)的處理器。該實(shí)施方式的基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)的硬件包括一個(gè)中央處理單元(CPU)和一個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)。有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員能夠容易地理解目前提供的任何一種基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)都是合適的。
在一個(gè)
具體實(shí)施例方式
中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)包括一個(gè)與總線連接的處理器，該總線連接于一個(gè)主存儲(chǔ)器(優(yōu)選作為RAM執(zhí)行)，和大量二級(jí)存儲(chǔ)設(shè)備，例如硬驅(qū)動(dòng)器和可移動(dòng)媒體存儲(chǔ)設(shè)備?？梢苿?dòng)媒體存儲(chǔ)設(shè)備可以是，例如，軟盤驅(qū)動(dòng)器、光盤驅(qū)動(dòng)器、磁帶驅(qū)動(dòng)器等。含有控制邏輯和/或記錄于其中的數(shù)據(jù)(例如，gnd序列和/或SEQ ID Nos.16-43對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì))的可移動(dòng)存儲(chǔ)媒體，例如軟盤、光盤、磁帶等可以插入可移動(dòng)存儲(chǔ)設(shè)備。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)包括合適的軟件，用于當(dāng)存儲(chǔ)媒體插入可移動(dòng)媒體存儲(chǔ)設(shè)備后，讀取控制邏輯和/或來(lái)自可移動(dòng)媒體存貯設(shè)備的數(shù)據(jù)。gnd序列和/或SEQ ID Nos.16-43對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)可以以公知方式保存于主存儲(chǔ)器，任何二級(jí)存儲(chǔ)設(shè)備，和/或可移動(dòng)存儲(chǔ)媒體。讀取和處理gnd序列和/或SEQ ID Nos.16-43對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的軟件(例如檢索工具、比較工具、和模擬工具等)在執(zhí)行中保留在主存儲(chǔ)器中。
本文使用的“數(shù)據(jù)庫(kù)”指能夠保存核苷酸或多肽序列信息、以及蛋白質(zhì)模型信息的存儲(chǔ)器。另外，“數(shù)據(jù)庫(kù)”指能夠存取含有記錄于其上的核苷酸或多肽序列信息，和/或蛋白質(zhì)模型信息的產(chǎn)品的存儲(chǔ)器存取成分。在另一個(gè)實(shí)施方式中，數(shù)據(jù)庫(kù)保存了一種含有核苷酸和/或多肽序列信息，和/或gnd基因和6-PGD蛋白上的蛋白質(zhì)模型信息及其多態(tài)性的“大腸桿菌病原體圖譜”。有利地是，大腸桿菌病原體圖譜在一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄或保存了大量與高病原性和/或低病原性大腸桿菌菌株有關(guān)的多態(tài)性，它將使研究者和臨床醫(yī)生能夠快速鑒定生物樣品或食品或水源或其它生物材料中特定大腸桿菌菌株的存在。理想的是，該多態(tài)性以有利于鑒定細(xì)菌菌株身份的方法的模式記錄，例如，病原體圖譜可以這樣保存，例如使對(duì)應(yīng)特定生物體中的序列完全可以通過(guò)序列、生物體、和/或限制性圖譜檢索，并可以確定查詢序列的同源性、相同性和匹配。一種優(yōu)選的數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)構(gòu)由NCBI提供，其允許BLAST-型檢索，蛋白質(zhì)模塊檢索、關(guān)鍵詞檢索、并提供Medline界面。本領(lǐng)域技術(shù)人員還知道一些其它類型的數(shù)據(jù)庫(kù)和結(jié)構(gòu)，下面將討論其中的一部分。
gnd序列和/或SEQ ID NO16-43對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)可以在很多數(shù)據(jù)處理程序中以多種格式保存和操作。例如，序列數(shù)據(jù)可以在字處理文件例如MicrosoftWORD或WORDPERFECT中作為文本保存，或者在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的多種數(shù)據(jù)庫(kù)程序例如DB2、SYBASE、或ORACLE中以ASCII文件保存。“檢索程序”指一種或多種用于在基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)上比較一種核酸或多肽序列與儲(chǔ)藏于數(shù)據(jù)庫(kù)中的其它核酸或多肽序列的程序。檢索程序還指一種或多種比較一種或多種蛋白質(zhì)模塊與數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的其它蛋白質(zhì)模塊的程序。檢索程序被用于，例如，比較gnd序列區(qū)和/或SEQ ID NO16-43對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)，在核酸和/或蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中比較序列從而鑒定同源性和結(jié)構(gòu)或功能基元。另外，檢索程序用于比較大腸桿菌病原體圖譜(profile)與查詢序列，從而鑒定查詢序列中是否存在一種或多種多態(tài)性，從而確定查詢序列來(lái)源的細(xì)菌菌株。
一種“補(bǔ)救程序”指一種或多種用于在基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)上執(zhí)行鑒定同源核酸序列、同源蛋白質(zhì)序列、或同源蛋白質(zhì)模塊的程序。而且，補(bǔ)救程序可以用于鑒定大腸桿菌病原體圖譜，其可比較查詢序列、關(guān)鍵詞、疾病特征、或限制圖譜。優(yōu)選地，補(bǔ)救程序以能夠被迅速區(qū)分開來(lái)的形式與提供大腸桿菌病原體圖譜數(shù)據(jù)的顯示模式分界。例如，圖1中顯示的“棒狀代碼”是一種能夠通過(guò)補(bǔ)救程序獲得的格式，其在多態(tài)性位置上提供信息，這可以用于鑒定或區(qū)別特殊大腸桿菌菌株。
在幾個(gè)實(shí)施方式中，SEQ ID NO16-43中公開的一種新序列與一種查詢序列比較，然后確定序列相同性百分?jǐn)?shù)。普遍使用的比較兩種多肽的相似性和氨基酸位置的標(biāo)準(zhǔn)方法可以用于進(jìn)行這種比較。應(yīng)用計(jì)算機(jī)程序，例如BLAST或FASTA，例如，可以排列兩種多肽，進(jìn)行各自氨基酸的最佳比對(duì)(可以沿著一種或兩種序列的全長(zhǎng)，或者沿著一種或兩種序列的預(yù)先確定的局部)。這種程序提供“缺陷”開放罰分和“缺陷”空位罰分，可以結(jié)合計(jì)算機(jī)程序使用一種打分矩陣?yán)鏟AM250(一種標(biāo)準(zhǔn)打分矩陣；參見Dayhoff等，Atlas of Protein Sequence and Structure，Vol.5，Supp.3(1978))。然后如下計(jì)算相同性百分?jǐn)?shù) 至少70％相同性的多肽通常具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入。通常，取代是保守的，從而很小或不影響蛋白質(zhì)的整體靜電荷、極性、或疏水性，但任選可以增加6-PGD的活性。
在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行了幾次Blast檢索(BlastP 2.0.10，參見Altschul等，核酸研究(Nucleic.Acids.Res.)253389(1997)，作為參考插入本文)，鑒定新的6-PGD分子、這些分子的片段、和gnd/rfb基因簇中的區(qū)域，尤其是6-PGD的3’區(qū)的特征。一些原始Blast檢索的結(jié)果在表2中顯示。廣泛檢索了T2171多態(tài)性附近的多肽片段。在該特殊檢索中，矩陣是BLOSUM62，開放空位罰分為11，空位拓展為1。其它檢索包括NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast 2(BlastP 2.0.9)檢索，應(yīng)用BLOSUM矩陣，開放罰分為11，空位拓展為1，x衰退(dropoff)為50。后面的這些檢索參數(shù)用于比較由O157H7，菌株86-24、H8、ADAL233、和2755編碼的6-PGD(1)由O157H7編碼的6-PGD，菌株87-16；(2)由O157H7編碼的6-PGD，菌株TB182A；(3)由O157H3編碼的6-PGD，菌株3004-89(一種“等位基因B”基因產(chǎn)物)；(4)由O157H12編碼的6-PGD，菌株G5933(一種“等位基因B”基因產(chǎn)物)；(5)由O157H16編碼的6-PGD，菌株13A81(一種“等位基因C”基因產(chǎn)物)；(6)由O157H45編碼的6-PGD，菌株3584-91(一種“等位基因C”基因產(chǎn)物)；(7)由O157H38編碼的6-PGD，菌株3005-89(一種“等位基因C”基因產(chǎn)物)；
(8)由O157H43編碼的6-PGD，菌株7E(一種“等位基因C”基因產(chǎn)物)；(9)由O157H45編碼的6-PGD，菌株3260-92(一種“等位基因C”基因產(chǎn)物)；(10)由O157H7編碼的6-PGD，菌株8507還將gnd序列編碼的ORF和/或SEQ.ID.No.16-43和gnd/rfb基因簇區(qū)對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)與Swissprot中發(fā)現(xiàn)的已知氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。本發(fā)明的實(shí)施方式可以應(yīng)用一些計(jì)算機(jī)程序和數(shù)據(jù)庫(kù)。下面列出的名單不在于限制本發(fā)明，而是為本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列實(shí)施方式可應(yīng)用的程序和數(shù)據(jù)庫(kù)提供指導(dǎo)?？梢詰?yīng)用的程序和數(shù)據(jù)庫(kù)包括但不限于MacPattern(EMBL)，DiscoveryBase(Molecular Applications Group)，GeneMine(Molecular Applications Group)，Look(Molecular Applications Group)，MacLook(Molecular Applications Group)，BLAST和BLAST2(NCBI)，BLASTN和BLASTX (Altschul等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol)215403(1990))，F(xiàn)ASTA(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852444(1988))，Catalyst(Molecular Simulations Inc.)，Catalyst/SHAPE(Molecular Simulations Inc.)，Cerius2.DBAccess(Molecular Simulations Inc.)，HypoGen(Molecular Simulations Inc.)，Insight II，(Molecular SimulationsInc.)，Discover(Molecular Simulations Inc.)，CHARMm(MolecularSimulations Inc.)，F(xiàn)elix(Molecular Simulations Inc.)，DelPhi，(MolecularSimulations Inc.)，QuanteMM，(Molecular Simulations Inc.)，Homology(Molecular Simulations Inc.)，Modeler(Molecular Simulations Inc.)，Modeller4(Sali和Blundell，分子生物學(xué)雜志234217-241(1997))，ISIS(MolecularSimulations Inc.)，Quanta/Protein Design(Molecular Simulations Inc.)，WebLab(Molecular Simulations Inc.)，WebLab Diversity Explorer(MolecularSimulations Inc.)，Gene Explorer(Molecular Simulations Inc.)，SeqFold(Molecular Simulations Inc.)，EMBL/Swissprotein數(shù)據(jù)庫(kù)，MDL提供的化學(xué)藥品目錄數(shù)據(jù)庫(kù)(MDL Available Chemicals Directory database)，MDL藥物數(shù)據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(MDL Drug Data Report database)，全面的藥物化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(Comprehensive Medicinal Chemistry database)，Derwents’s世界藥物索引數(shù)據(jù)庫(kù)(Derwents’s World Drug Index database)，和BioByteMasterFile數(shù)據(jù)庫(kù)。其它一些程序和數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于本發(fā)明涉及領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
另外，本發(fā)明的其它方面包括含gnd序列和/或SEQ.ID.No.16-43對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)和它們片段的重組載體、探針、和引物，尤其是那些含有一種表1描述的多態(tài)性的gnd序列或?qū)?yīng)蛋白質(zhì)部分。下面討論本發(fā)明的這些方面。核酸實(shí)施方式本發(fā)明的幾種實(shí)施方式包括含SEQ ID Nos.22，16，18，24，26，20，42，28，30，40，32，36，38，和34和其片段的gnd序列的重組載體、探針、和引物。除了SEQ.ID.Nos.22，16，18，24，26，20，42，28，30，40，32，36，38，和34描述的全長(zhǎng)gnd基因，優(yōu)選核酸實(shí)施方式包括具有一種表1描述的多態(tài)性的任何gnd基因片段。術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)”根據(jù)上下文既可指基因組gnd的全長(zhǎng)序列，也可指cDNA gnd的全長(zhǎng)序列。進(jìn)一步實(shí)施方式包括互補(bǔ)于SEQ.ID.Nos.22，16，18，24，26，20，42，28，30，40，32，36.38，和34描述的全長(zhǎng)gnd的核酸，和互補(bǔ)于具有至少一種表1描述的多態(tài)性的gnd片段的核酸。理想的實(shí)施方式包括具有g(shù)nd的至少9個(gè)連續(xù)堿基和至少一種表1描述的多態(tài)性或一種與它們互補(bǔ)的序列。在這點(diǎn)上，本發(fā)明的核酸實(shí)施方式可以具有SEQ.ID.Nos.22，16，18，24，26，20，42，28，30，40，32，36，38，和34的從9到約1406的連續(xù)核苷酸，或這些序列的實(shí)際上任何長(zhǎng)度的互補(bǔ)序列，只要這些核酸包括至少一種表1描述的多態(tài)性。本發(fā)明技術(shù)人員將容易理解本發(fā)明的gnd核酸可以整合入一種外源核酸，從而產(chǎn)生一種在本發(fā)明范圍內(nèi)的、實(shí)際上任意長(zhǎng)度的融合產(chǎn)物。因此，一種具有SEQ.ID.Nos.22，16，18，24，26，20，42，28，30，40，32，36，38，和34或這些序列的互補(bǔ)序列或本發(fā)明的全長(zhǎng)gnd(基因組或cDNA)的一部分(即約9到約1406的連續(xù)核苷酸)的核酸即為本發(fā)明的實(shí)施方式。也就是說(shuō)，本發(fā)明的實(shí)施方式包括一種具有至少一種表1描述的多態(tài)性和少于等于9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，40，41，42，43，44，45，46，47.48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69.70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，125，150.175，200，225，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，500，525，550，575，600，625，650，675，700，725.750，775，800，825，850，875，900，925，950，975，1000，1100，1200，1300，和1406個(gè)核苷酸的核酸。然而，核酸實(shí)施例優(yōu)選包括SEQ.ID.Nos.22，16，18，24，26，5 20，42，28，30，40，32，36，38，和34或這些序列的互補(bǔ)序列的至少12，13，14，15，16，17，18，或19個(gè)連續(xù)核苷酸，條件是只要所述片段具有至少一種表1描述的多態(tài)性。更優(yōu)選的是，核酸實(shí)施方式包括至少20-30個(gè)連續(xù)核苷酸。這些核酸低聚物具有生物技術(shù)和診斷用途，例如，在核苷酸雜交分析、Southern和Northern印跡分析等中，以及診斷大腸桿菌感染。一些實(shí)施方式包括具有SEQ.ID.Nos.22，10 16，18，24，26，20，42，28，30，40，32，36，38，和34或其互補(bǔ)序列公開的全部或部分gnd基因的重組構(gòu)建體。重組構(gòu)建體能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制?；蛘撸亟M構(gòu)建體可以被整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA中。這種重組多核苷酸包括通過(guò)人工操縱得到的半合成或合成來(lái)源的基因組多核苷酸或cDNA多核苷酸。因此，本發(fā)明的實(shí)施方式還提供包括不同于天然序列的重組核酸。
本發(fā)明的核酸實(shí)施方式還可以通過(guò)突變例如取代、添加、或刪除修飾，這些突變提供編碼功能等同分子的序列。由于核苷酸編碼序列的簡(jiǎn)并性，編碼與SEQ.ID.Nos.23，17，19，25，27，21，43，29，31，41，33，37，39，和35所述序列基本上相同的6-PGD氨基酸序列的其它DNA序列也可用于本發(fā)明的某些實(shí)施方式。這些包括但不限于，含SEQ.ID.Nos.22，16，18，24，26，20.42，28，30，40，32，36，38，和34或其互補(bǔ)序列描述的全部或部分gnd的核酸序列，這些序列已經(jīng)通過(guò)編碼序列中一種功能等同氨基酸殘基的不同密碼子取代而改變，由此產(chǎn)生一種沉默突變。
另外，可以對(duì)重組gnd-編碼核酸序列和它們的互補(bǔ)序列進(jìn)行人工操作，從而改變加工或表達(dá)。例如但不限于，SEQ.ID.Nos.22，16，18，24，26，20.42，28，30，40，32，36，38，和34描述的gnd基因可以與啟動(dòng)子序列和/或核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，或者可以在6-PGD-編碼序列的上游插入一種信號(hào)序列，使6-PGD能夠分泌，從而有利于收獲或生物利用。另外，一種特定gnd核酸可以在體外或體內(nèi)突變，以促進(jìn)和/或破壞翻譯、起始、和/或中止序列，或者在編碼區(qū)產(chǎn)生變異體和/或形成新的限制位點(diǎn)或破壞已經(jīng)存在的限制位點(diǎn)，或者促進(jìn)進(jìn)一步的體外修飾。可以使用本領(lǐng)域已知的任何誘變技術(shù)，包括但不限于，體外定點(diǎn)誘變。(Hutchinson等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2536551(1978))。編碼其它蛋白質(zhì)或其它蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核酸可以整合入編碼6-PGD的核酸，從而產(chǎn)生一種融合蛋白質(zhì)。得到的融合蛋白質(zhì)可以用作生物技術(shù)工具，來(lái)研究gnd/rfb基因簇區(qū)的活動(dòng)性，例如，研發(fā)株系特異性抗體。
核酸實(shí)施方式還可以用作分離程序和診斷分析的生物技術(shù)工具。應(yīng)用SEQ.ID.Nos.22，16，18，24，26，20，42，28，30，40，32，36，38，和34公開的gnd序列，可以通過(guò)寡核苷酸合成設(shè)計(jì)和生產(chǎn)互補(bǔ)于這些序列的探針。優(yōu)選的雜交探針包括至少一種表1描述的多態(tài)性。這些探針可以用于篩選cDNA或基因組文庫(kù)，從而分離本發(fā)明的核酸實(shí)施方式的天然資源，或者用于鑒定特定菌株或分類大腸桿菌菌株。另外，互補(bǔ)于SEQ.ID.Nos.22，16，18，24，26，20，42，28，30，40，32，36，38，和34中公開的gnd序列的核酸序列可以用于通過(guò)擴(kuò)增方法例如PCR中使用的常規(guī)寡核苷酸合成技術(shù)制備寡核苷酸引物。這些寡核苷酸引物可以用于，例如，通過(guò)應(yīng)用PCR或其它酶-介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA或生物樣品中的序列殘留物，而分離本發(fā)明的核酸實(shí)施方式。下面將更詳細(xì)地討論這種診斷技術(shù)和食品或水的篩選技術(shù)。
或者，應(yīng)用分子生物學(xué)的常規(guī)技術(shù)對(duì)編碼SEQ.ID.Nos.22，16，18，24，26，20，42，28，30，40，32，36，38，和34公開的gnd序列或其片段的核酸進(jìn)行操作，產(chǎn)生表達(dá)6-PGD或6-PGD片段的重組構(gòu)建體。下面的部分將描述這些表達(dá)構(gòu)建體和蛋白質(zhì)實(shí)施方式的一部分。
蛋白質(zhì)實(shí)施方式6-PGD多肽實(shí)施方式或其衍生物，包括但不限于，那些具有基本上如SEQ.ID.Nos.23，17，19，25，27，21，43，29，31，41，33，37，39，和35所述的全長(zhǎng)氨基酸序列和這些序列的至少三個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的片段作為一級(jí)氨基酸序列的分子，它們包括改變的序列，其中功能等同氨基酸殘基被取代為產(chǎn)生沉默突變的序列中的殘基。優(yōu)選片段包括至少一種可以由表1推斷出來(lái)的多態(tài)性，如前面的描述。應(yīng)當(dāng)理解，在這部分下面的討論中，針對(duì)6-PGD的參考文獻(xiàn)一般意義上來(lái)說(shuō)在于涵蓋SEQ.ID.Nos.23，17，19，25，27，21，43，29，31，41，33，37，39，和35描述的蛋白質(zhì)和其片段。
因此，SEQ.ID.Nos.23，17，19，25，27，21，43，29，31，41，33，37，39，和35的6-PGD多肽或其片段中的一種或多種氨基酸殘基可以取代為極性相似的另一種氨基酸，其作為一種功能等同物，產(chǎn)生沉默突變。對(duì)序列中的一種氨基酸的取代可以選自該氨基酸所屬類型中的其它成員。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和蛋氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺。正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸、和組氨酸。負(fù)電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。芳香氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸。
本發(fā)明的6-PGD片段可以少于或等于3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，125，150，175，200，225，250，275，300，325，350，375，400，425，450，和468個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。在本發(fā)明的其它方面，SEQ.ID.Nos.23，17，19，25，27，21，43，29，31，41，33，37，39，和35的6-PGD多肽或其片段或其衍生物在翻譯過(guò)程中或翻譯后進(jìn)行不同地修飾，例如，磷酸化，糖苷化，交聯(lián)，?；?，蛋白水解切割，與抗體分子、膜分子、或其它配體連接。(Ferguson等，生物化學(xué)年度綜述(Ann.Rev.Biochem.)57285-320(1988))。
在幾個(gè)實(shí)施方式中，SEQ.ID.Nos.23，17，19，25，27，21，43，29，31，41，33，37，39，和35的6-PGD多肽或其片段在細(xì)胞系中表達(dá)。這些包括本發(fā)明的序列、構(gòu)建體、載體、克隆、和其它材料可以方便地成為富集型或分離型。本發(fā)明使用的“富集”指材料的濃度至少約為其天然濃度的2，5，10，100，或1000倍，(例如)，方便地為0.01％重量、優(yōu)選至少約0.1％重量。重量約0.5％，1％，5％，10％，和20％的富集制品也是預(yù)期的。術(shù)語(yǔ)“分離”需要材料從其來(lái)源環(huán)境(例如如果是天然的即為天然環(huán)境)分離出來(lái)。例如，存在于活動(dòng)物體內(nèi)的天然多核苷酸或多肽是未分離的，但從天然系統(tǒng)中的部分或全部共存材料中分離出來(lái)的同樣多核苷酸或多肽是分離的。純化形式的序列也是有利的。術(shù)語(yǔ)“純化”不需要絕對(duì)純化；而是一個(gè)相對(duì)概念。起始材料或天然材料的純化至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，優(yōu)選兩到三個(gè)數(shù)量級(jí)，更優(yōu)選四到五個(gè)數(shù)量級(jí)是特別期望的。
為了表達(dá)gnd編碼的蛋白質(zhì)或其部分，得到含6-PGD或6-PGD片段的編碼序列的核酸，然后克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，從而使編碼區(qū)可操縱地連接于異源啟動(dòng)子。編碼待表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽的核酸用常規(guī)克隆技術(shù)可操縱地連接于表達(dá)載體中的啟動(dòng)子。表達(dá)載體可以是本領(lǐng)域已知的任何哺乳動(dòng)物、酵母、兩棲動(dòng)物、昆蟲、寄生蟲、或細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)。很多供應(yīng)商提供商業(yè)可得到的載體和表達(dá)系統(tǒng)，包括Genetics Institute(Cambridge，MA)，Stratagene(La Jolla，California)，Promega(Madison，Wisconsin)，和Invitrogen(San Diego，California)。為了增強(qiáng)表達(dá)和有助于適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊，如果需要，可以為表達(dá)載體導(dǎo)入的特定表達(dá)生物體優(yōu)化密碼子環(huán)境和序列的密碼子配對(duì)，如Hatfield等的US5082767中解釋的那樣，作為參考插入本文。而且，可以整合分泌性引導(dǎo)序列，從而有助于蛋白質(zhì)的純化。
下面提供了一個(gè)表達(dá)上述核酸編碼的蛋白質(zhì)的方法實(shí)施例。首先，鑒定基因的蛋氨酸起始密碼子和基因的poly A信號(hào)。如果編碼待表達(dá)多肽的核酸缺乏作為起始位點(diǎn)的蛋氨酸，可以用常規(guī)技術(shù)在核酸的第一密碼子旁邊導(dǎo)入一個(gè)起始蛋氨酸。同樣，如果核酸缺乏poly A信號(hào)，可以通過(guò)，例如，用Bgll和Sall限制性核酸內(nèi)切酶從pSG5(Stratagene)中切出poly A信號(hào)，然后將它整合到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pXT1(Stratagene)中。載體pXT1含有來(lái)自莫洛尼氏鼠白血病病毒的LTR和部分gag基因。構(gòu)建體中LTR的位置允許有效穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。載體包括單純皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子和可用于篩選的新霉素基因?？梢酝ㄟ^(guò)PCR從細(xì)菌載體得到編碼待表達(dá)多肽的核酸，應(yīng)用互補(bǔ)于所述核酸并包含適應(yīng)整合到5’引物中的PstI和相應(yīng)cDNA 3’引物的5’末斷的BgIII的限制性核酸內(nèi)切酶序列的寡核苷酸引物，注意確保所述核酸定位在具有poly A信號(hào)的讀碼框中。從發(fā)生的PCR反應(yīng)得到的純化片段用PstI消化，用核酸外切酶產(chǎn)生平端，用BgIII消化，純化并連接于pXT1，現(xiàn)在即包含了一個(gè)poly A信號(hào)，然后用BgIII消化。用Lipofectin(Life Technologies，Inc.，Grand Island，New York)，按照產(chǎn)品說(shuō)明書注明的條件，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染到一個(gè)適當(dāng)?shù)募?xì)胞系中，例如小鼠NIH3T3細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在600g/ml G418(Sigma，St.Louis，Missouri)中生長(zhǎng)后，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)染體。優(yōu)選地，表達(dá)蛋白質(zhì)釋放到培養(yǎng)基中，因此有助于純化。
另一個(gè)實(shí)施方式應(yīng)用“用于表達(dá)和純化的Xpress系統(tǒng)”(lnvitrogen，San Diego，CA)。Xpress系統(tǒng)被設(shè)計(jì)為從細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、和昆蟲細(xì)胞中高水平生產(chǎn)和純化重組蛋白質(zhì)。Xpress載體產(chǎn)生與一種短N(yùn)-末端引導(dǎo)肽融合的重組蛋白質(zhì)，所述引導(dǎo)肽對(duì)二價(jià)陽(yáng)離子具有高親和力。應(yīng)用鎳-螯合樹脂(lnvitrogen)，可以一步純化重組蛋白質(zhì)，然后用腸激酶酶切除去引導(dǎo)肽。
一種表達(dá)6-PGD和6-PGD片段的優(yōu)選載體是pBlueBacHis2 Xpress。pBlueBacHis2 Xpress載體是一種含有多個(gè)克隆位點(diǎn)、一個(gè)氨芐西林抗性基因、和一個(gè)lac z基因的桿狀病毒表達(dá)載體。按照一個(gè)研究，gnd核酸或其部分被克隆pBlueBacHis2 Xpress載體中，然后感染SF9細(xì)胞。然后按照生產(chǎn)商的說(shuō)明分離或純化表達(dá)出來(lái)的蛋白質(zhì)。其它幾種具有含gnd或其片段的重組構(gòu)建體或載體的培養(yǎng)細(xì)胞系也是本發(fā)明的實(shí)施方式，它們的生產(chǎn)在本發(fā)明中將是常規(guī)的。
還可以通過(guò)凝膠電泳分離培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)。然后用例如考馬斯或銀染色法，或者用抗蛋白質(zhì)的抗體檢測(cè)分離的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的考馬斯、銀染色、和免疫標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的技術(shù)。如果需要，還可以在電泳之前，根據(jù)蛋白質(zhì)的大小或電荷對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行硫酸銨沉淀或分離。
由gnd或其部分編碼的蛋白質(zhì)還可以用標(biāo)準(zhǔn)免疫色譜技術(shù)純化。在該程序中，將含蛋白質(zhì)的溶液，例如培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物應(yīng)用于具有附著于色譜基質(zhì)的抗蛋白質(zhì)抗體的柱子。使蛋白質(zhì)與免疫色譜柱結(jié)合。然后，沖洗柱子，除去非特異性結(jié)合蛋白。然后從柱子上釋放特異性結(jié)合蛋白，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)回收。
而且，gnd或其片段可以整合到設(shè)計(jì)用于嵌合多肽純化方案的表達(dá)載體中。在該方案中，gnd編碼序列或其片段被插入編碼另一半嵌合體的基因的讀碼框中。另一半嵌合體可以是-球蛋白或鎳結(jié)合多肽的編碼序列。然后用具有抗-球蛋白抗體或附著鎳的色譜基質(zhì)純化嵌合蛋白?？梢栽?球蛋白基因或鎳結(jié)合多肽與gnd cDNA之間人工插入蛋白酶例如腸激酶切割位點(diǎn)。因此，嵌合體的兩種肽可以通過(guò)蛋白酶消化彼此分開。
一種有用的產(chǎn)生-球蛋白嵌合體的表達(dá)載體是pSG5(Stratagene)，其編碼兔-球蛋白。兔-球蛋白基因的Intron II有助于表達(dá)的轉(zhuǎn)錄體的剪接，插入構(gòu)建體的多腺苷信號(hào)提高了表達(dá)水平。描述的這些技術(shù)對(duì)分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員是眾所周知的。一些方法教科書例如Davis等(分子生物學(xué)的基礎(chǔ)方法(Basic Methods in Molecular Biology)L.G.Davis，M.D.Dibner，和J.f.Battey，編，Elsevier Press，NY，1986)中公開了標(biāo)準(zhǔn)方法，Stratagene，Life Technologies，Inc.或Promega提供了一些方法。另外可以應(yīng)用體外翻譯系統(tǒng)，例如體外ExpressTM翻譯試劑盒(Stratagene)從構(gòu)建體生產(chǎn)多肽。
除了應(yīng)用重組DNA技術(shù)分離或純化6-PGD和6-PGD片段，還可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法例如Merrifield等，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)(J.Am.Chem.Soc.)852149(1964)，Houghten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，825132(1985)，和Stewart和Young，固相肽合成(solid phase peptide synthesis)，Pierce Chem Co.，Rockford，IL(1984)描述方法，通過(guò)化學(xué)合成法(例如固相肽合成)制備這些分子。合成的這些多肽的氨基末端可以有也可以沒有蛋氨酸?；瘜W(xué)合成的6-PGD和6-PGD片段可以用這些參考文獻(xiàn)中描述的方法氧化，以形成二硫鍵。6-PGD和6-PGD片段可以用作天然的、純化6-PGD和6-PGD片段的生物活性或免疫替代物。6-PGD和6-PGD片段的類似物包括模擬肽的小分子。這些小分子是也公知為肽模擬物(peptidomimetics)。肽模擬物是一種具有與肽同樣效果的分子，通常因?yàn)樗哂型瑯拥年P(guān)鍵“形狀”，但自身不是肽，因子不會(huì)被蛋白酶破壞，并且生產(chǎn)成本低。因此，可以制備結(jié)構(gòu)和/或功能類似6-PGD或6-PGD片段的肽模擬物，然后評(píng)價(jià)它們與6-PGD或6-PGD片段特征分析的相互作用能力(例如，抑制天然6-PGD或其片段的功能)或在受體中誘導(dǎo)一種免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域報(bào)道了幾種制備類似肽的肽模擬物的研究。例如US5288707；US5552534；US5811515；US5817626；US5817879；US5821231；和US5874529中公開了多種方法，其全文作為參考插入本發(fā)明。
合成或表達(dá)和分離或純化gnd或其部分編碼的蛋白質(zhì)后，分離或純化的蛋白質(zhì)可以用于生產(chǎn)抗體和與6-PGD或6-PGD片段相互作用的鑒定試劑的工具。識(shí)別6-PGD或6-PGD片段的抗體具有以下用途，包括但不限于，多克隆、單克隆、嵌合、單鏈、Fab片段和由Fab表達(dá)文庫(kù)生產(chǎn)的片段。
對(duì)于抗體的生產(chǎn)，各種宿主包括山羊、兔、大鼠、小鼠等可以用6-PGD或其保留免疫原性的任意部分、片段或小肽注射免疫。根據(jù)宿主的種類不同，可以應(yīng)用各種佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答。這些佐劑包括但不限于Freund’s、礦物膠例如氫氧化鋁、和表面活性劑例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、多聚陰離子、肽、油性乳劑、匙孔帽貝血藍(lán)蛋白、和二硝基酚。BCG(結(jié)核菌素)和小棒桿菌是潛在有用的佐劑。
用于誘導(dǎo)特異性抗體的肽可以具有至少由三個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，優(yōu)選包括可由表1推斷出的一種多態(tài)性的至少10或15個(gè)氨基酸。優(yōu)選的抗體，例如，包括與具有T2181多態(tài)性的多肽或具有C653T或G654C但無(wú)6-PGD或gnd的核酸(即其在核酸653位和654位分別具有Thr218或胸腺嘧啶或胞嘧啶多態(tài)性)特異性結(jié)合的抗體。也就是說(shuō)，優(yōu)選抗體識(shí)別專一鑒定Iso218多態(tài)性而非Thr218多態(tài)性的表位，或反之亦然，或者抗體識(shí)別專一鑒定核酸653位胞嘧啶和/或核酸654位鳥嘌呤或653位胸腺嘧啶和/或核酸654位胞嘧啶的表位。理想的是，編碼6-PGD片段的短氨基酸片段與另一種蛋白質(zhì)的氨基酸片段融合，例如匙孔帽貝血藍(lán)蛋白，產(chǎn)生抗這種嵌合分子的抗體。而能夠特異性識(shí)別6-PGD的抗體可以通過(guò)將相應(yīng)6-PGD蛋白質(zhì)序列的合成3-聚體、10-聚體、和15-聚體肽注射到小鼠中產(chǎn)生?？梢詰?yīng)用重組或純化6-PGD和6-PGD片段產(chǎn)生更多種抗體。
為了生產(chǎn)抗6-PGD和6-PGD片段的抗體，從轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離基本上純的6-PGD和6-PGD片段。對(duì)最后產(chǎn)品中多肽的濃度進(jìn)行調(diào)整，例如，利用Amicon過(guò)濾裝置濃縮，以達(dá)到幾個(gè)微生物/ml的水平。然后可以如下制備抗目標(biāo)多肽的單克隆或多克隆抗體可以用提供用于通過(guò)培養(yǎng)中的連續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的任何技術(shù)制備6-PGD和6-PGD片段的單克隆抗體。它們包括但不限于，最早由Koehler和Milstein(自然256495497(1975))描述的雜交瘤技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，今日免疫學(xué)(lmmunol Today)472(1983)；Cote等Proc Natl Acad Sci 802026-2030(1983))，和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，單克隆抗體和癌癥治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，AlanR.Liss Inc.New York N.Y，pp 77-96(1985))。另外，可以應(yīng)用研究用于制各“嵌合抗體”的技術(shù)，小鼠抗體基因與人抗體基因接合得到具有合適抗原特異性和生物活性的分子的技術(shù)。(Morrison等，Proc Natl Acad Sci816851.6855(1984)；Neuberger等，自然312604-608(1984)；Takeda等，自然314452-454(1985))?；蛘撸梢哉{(diào)整描述用于生產(chǎn)單鏈抗體的方法(US4946778)，生產(chǎn)6-PGD-特異性單鏈抗體。還可以在淋巴細(xì)胞群中誘導(dǎo)體內(nèi)生產(chǎn)或篩選重組免疫球蛋白文庫(kù)或高特異性結(jié)合試劑面板(如Orlandi等，Proc Natl Acad Sci 863833-3837(1989)，和Winter G.和Milstein C；自然，349293-299(1991)的報(bào)道)，來(lái)生產(chǎn)抗體。
還可以產(chǎn)生含6-PGD特異性結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。例如，這種片段包括但不限于，能夠通過(guò)胃蛋白酶消化抗體分子而產(chǎn)生的F(ab’)2片段，以及能夠通過(guò)減少F(ab’)2片段的二硫鍵而產(chǎn)生的Fab片段?；蛘?，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)，從而得以快速簡(jiǎn)便地鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段。(Huse W.D.等，科學(xué)2561275-1281(1989)。
在一個(gè)研究中，如下制備抗6-PGD或其片段的單克隆抗體。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用幾微克上述來(lái)源的選擇蛋白質(zhì)或多肽反復(fù)接種小鼠幾周時(shí)間。然后處死小鼠，分離脾的抗體生產(chǎn)細(xì)胞。在存在聚乙二醇條件下，將脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，將系統(tǒng)在含氨喋呤的選擇性培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)上生長(zhǎng)，以破壞過(guò)量的未融合細(xì)胞。稀釋成功融合的細(xì)胞，等分量的稀釋液置于微滴平板的孔中，在其中培養(yǎng)物繼續(xù)生長(zhǎng)。通過(guò)免疫分析程序例如ELISA(最早由Engvall，E.，酶學(xué)方法(Meth.Eazymo)70419(1980))和它的衍生方法檢測(cè)各孔上清液中的抗體，以鑒定抗體生產(chǎn)克隆。選擇出的陽(yáng)性克隆可以進(jìn)行擴(kuò)大，收獲它們的單克隆抗體產(chǎn)物以備應(yīng)用。生產(chǎn)單克隆抗體的詳細(xì)方法在Davis，L等的《分子生物學(xué)的基本方法》(Basic Methods in Molecular Biolooy，Elsevier，New York.Section 21-2)中描述。
可以用上述來(lái)源的表達(dá)的蛋白質(zhì)或肽(它們可以是未修飾的，也可以是為增強(qiáng)免疫原性而修飾的)免疫適當(dāng)?shù)膭?dòng)物，制備含抗一種蛋白質(zhì)異源表位的抗體的多克隆抗血清。通過(guò)調(diào)整一些與抗原和宿主種類有關(guān)的因素有效地進(jìn)行多克隆抗體的生產(chǎn)。例如，小分子比大分子傾向于產(chǎn)生較小的免疫原性，并可能需要應(yīng)用載體和佐劑。而且，宿主動(dòng)物隨接種部位和劑量而改變，抗原劑量不足或過(guò)量都會(huì)產(chǎn)生較低滴度的抗血清。小劑量抗原(ng水平)在多個(gè)真皮內(nèi)部位給藥看起來(lái)是最可靠的。在Vaitukaitis，J.等的《臨床內(nèi)分泌代謝雜志》((J.Clin.Endocrinol.Metab.)33988-991(1971))中描述了兔的有效免疫方案。
可以以有規(guī)律的間隔進(jìn)行增強(qiáng)注射，當(dāng)通過(guò)，例如在瓊脂中抗已知濃度抗原的雙免疫擴(kuò)散，半定量確定其抗體滴度開始下降時(shí)，收獲抗血清。參見，例如，Ouchterlony，O.等，實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)指南(Handbook ofExperimental Immunology)第19章，D.Wier(編)Blackwell(1973)?？贵w的高峰濃度通常在0.1-0.2mg/ml血清范圍內(nèi)(約12M)。通過(guò)制備競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合曲線(如，例如，F(xiàn)isher，D.，臨床免疫學(xué)手冊(cè)(Manual of ClinicalImmunology)第42章，第2版(Rose和Friedman，編)Amer.Soc.ForMicrobial.，Washington，D.C.(1980)所述)，確定抗血清對(duì)抗原的親和力。按照任一種方案制備的抗體制劑在確定微生物樣品中的抗原攜帶物質(zhì)的濃度的定量免疫分析中都是有用的；它們也用語(yǔ)半定量或定量(例如，在鑒定生物樣品中是否存在6-PGD的診斷實(shí)施方式中)。
診斷和篩選實(shí)施方式通常，可以按照實(shí)施方式是基于核酸還是基于蛋白質(zhì)的分析，對(duì)本發(fā)明的診斷和篩選方法進(jìn)行分類。這些分析優(yōu)選通過(guò)檢測(cè)gnd基因座中是否存在一種或多種多態(tài)性來(lái)鑒定和區(qū)分存在于生物樣品(例如，來(lái)自患者、食物源、或液體源的樣品)中的大腸桿菌的病原性菌株和程度。也就是說(shuō)，幾種診斷和篩選實(shí)施方式致力于檢測(cè)核酸或蛋白質(zhì)樣品中是否存在表1提供的或者可以從表1推斷出的一種或多種多態(tài)性。另外，組合了下面實(shí)施方式中描述的試劑和方法，從而允許快速檢測(cè)和鑒定高病原性O(shè)157H7大腸桿菌的試劑盒的生產(chǎn)也是預(yù)期的。診斷試劑盒可以包括一種核酸探針或一種抗體或它們的組合，它可以特異性地檢測(cè)表1描述的或可由表1推斷出的一種或多種多態(tài)性。這些試劑盒的檢測(cè)成分通常為一種或多種下面試劑的組合。通常提供能夠吸附或結(jié)合DNA、RNA、或蛋白質(zhì)的載體?？衫玫妮d體包括具有負(fù)載正電荷取代物陣列特征的硝酸纖維素膜、尼龍或衍生尼龍。這些試劑盒中可以提供一種或多種限制性酶，控制試劑、緩沖液、擴(kuò)增酶、和非人多核苷酸(例如小牛胸腺或鮭魚精子DNA)。
有用的基于核酸的診斷方法包括但不限于，直接DNA測(cè)序、Southern印跡分析、單鏈確認(rèn)分析(sing-stranded confirmation analysis，SSCA)、RNase保護(hù)分析、斑點(diǎn)印跡分析、核酸擴(kuò)增、和這些方法的組合。這些分析的出發(fā)點(diǎn)是分離或純化來(lái)自生物樣品的DNA。更簡(jiǎn)單地說(shuō)，從待測(cè)受試者得到糞便材料，或獲得食物或水樣?？梢耘囵B(yǎng)細(xì)菌以得到足量待測(cè)DNA，在某些實(shí)施方式中，從樣品中提取細(xì)菌DNA，通過(guò)DNA擴(kuò)增技術(shù)例如PCR，用對(duì)應(yīng)gnd基因座區(qū)和/或gnd/rfb基因簇區(qū)優(yōu)選具有一種表1所列多態(tài)性的區(qū)域的引物，擴(kuò)增細(xì)菌DNA。
可以用幾種方法檢測(cè)生物樣品中的多態(tài)性。直接DNA測(cè)序(人工測(cè)序或自動(dòng)熒光測(cè)序)可以檢測(cè)這種序列變異。另一種方法是單鏈確認(rèn)多態(tài)性分析(SSCA)(Orita等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1989)，作為參考并入本發(fā)明)。然而這種方法不能檢測(cè)所有的序列改變，尤其是如果DNA片段大小超過(guò)200個(gè)堿基對(duì)，但該方法能夠被優(yōu)化而檢測(cè)最多的DNA序列變異。檢測(cè)靈敏度的降低是不利的，但SSCA的提高檢測(cè)量的可能性使它成為一種對(duì)檢測(cè)突變的直接測(cè)序法的有吸引力的可行的替代方法。然后對(duì)在SSCA凝膠上遷移率改變的片段進(jìn)行測(cè)序，確定DNA序列變異的準(zhǔn)確性質(zhì)。其它基于檢測(cè)兩個(gè)互補(bǔ)DNA鏈之間錯(cuò)配的方法包括連鎖變性凝膠電泳(clamped denaturing gel electrophoresis，CDGE)(Sheffield等，美國(guó)人類遺傳學(xué)雜志(Am.J.Hum.Genet.)49699-706(1991))、異源雙鏈體分析(HA)(White等，基因組(Genomics)1230 1-306(1992))、和化學(xué)錯(cuò)配剪切(CMC)(Grompe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865855-5892(1989))。Grompe(天然遺傳學(xué)(Nature Genetics)5111-117(1993))提供了目前應(yīng)用的檢測(cè)DNA序列變異法的綜述。
可以通過(guò)觀察一系列用一種或多種限制性酶優(yōu)選用多種限制性酶進(jìn)行酶切的DNA的Souther印跡進(jìn)行一種檢測(cè)多態(tài)性和DNA序列的快速初步分析。每塊板都含有來(lái)自未感染個(gè)體的DNA和待測(cè)DNA的泳道。當(dāng)用對(duì)應(yīng)表1描述的一種或多種多態(tài)性的序列作為探針檢測(cè)，顯示為雜交片段的Southern印跡表明存在特定大腸桿菌菌株。可以用對(duì)應(yīng)表1描述的一種或多種多態(tài)性旁側(cè)區(qū)的引物，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法直接從樣品擴(kuò)增DNA，或者如下面將更詳細(xì)討論的擴(kuò)增子的測(cè)序，來(lái)檢測(cè)點(diǎn)突變。
下面提供了七種確定存在一種或多種表1描述的多態(tài)性的公知的基于核酸的方法。為實(shí)施例目的提供，不在于限制本發(fā)明的任何方面，這些方法包括(1)單鏈確認(rèn)分析(SSCA)(Orita等)；(2)變性梯度凝膠電泳(DGGE)(Wartell等，核酸研究(Nucl.AcidsRes.)182699-2705(1990)和Sheffield等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86232-236(1989)，均作為參考并入本發(fā)明)；(3)RNase保護(hù)分析(Finkelstein等，基因組7167-172(1990)和Kinszler等，科學(xué)2511366-1370(1991)，均作為參考并入本發(fā)明)；(4)識(shí)別核酸錯(cuò)配的蛋白質(zhì)的應(yīng)用，例如大腸桿菌mutS蛋白(Modrich，遺傳學(xué)年度綜述(Ann.Rev.Genet.)25229-253(1991)，作為參考并入本發(fā)明)；(5)等位基因特異性PCR(Rana和Kidd，核酸研究178392(1989)，作為參考并入本發(fā)明)，其中涉及應(yīng)用3’末端與一種多態(tài)性雜交的引物，如果該多態(tài)性不存在，即觀察不到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(6)擴(kuò)增難容突變系統(tǒng)(Ampification Refractory Mutation System，ARMS)，如EP 0332435和Newton等(核酸研究172503-2516(1989))的報(bào)道，均作為參考并入本發(fā)明；和(7)瞬時(shí)溫度梯度凝膠電泳(TTGE)，如Bio-Rad在U.S./E.G.公報(bào)2103中所述，作為參考并入本發(fā)明。
在SSCA，DGGE，TTGE，和RNase保護(hù)分析中，當(dāng)存在多態(tài)性時(shí)，出現(xiàn)新的電泳帶。SSCA和TTGE檢測(cè)遷移變化的色帶，因?yàn)樾蛄懈淖儗?dǎo)致單鏈、分子間堿基配對(duì)方面出現(xiàn)可由電泳檢測(cè)到的差異。RNase保護(hù)涉及突變多核苷酸剪切成兩種或多種小片段。DGGE用變性梯度凝膠檢測(cè)序列與病原性較低菌株的gnd序列之間遷移率的差異。在等位基因-特異性寡核苷酸分析(ASO)(Conner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80278-282(1983))中，設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)特定序列的寡核苷酸，通過(guò)檢測(cè)是否存在雜交信號(hào)進(jìn)行分析。在mutS分析中，蛋白質(zhì)僅結(jié)合由多態(tài)性序列和非多態(tài)性序列形成的異源雙鏈體中含一個(gè)核苷酸錯(cuò)配的序列。錯(cuò)配，該詞的意思指兩條鏈不是100％互補(bǔ)的雜交的核酸雙鏈體。由于從生物樣品，例如，已經(jīng)與非多態(tài)性鏈雜交的生物樣品中得到的擴(kuò)增子中存在一種或多種多態(tài)性，導(dǎo)致缺乏總體同源性。錯(cuò)配檢測(cè)可以用于檢測(cè)gnd基因或其mRNA產(chǎn)物中的點(diǎn)突變。而這些方法比測(cè)序靈敏度低，但它們?nèi)菀滋幚矶鄠€(gè)生物樣品，并且適應(yīng)陣列法。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸實(shí)施方式附著于有序陣列中的支持物上，其中多種核酸探針附著于支持物的不同區(qū)域，它們不會(huì)彼此重疊。優(yōu)選，這種有序陣列設(shè)計(jì)為“可設(shè)定地址的”，其中探針的各自位置被記錄下來(lái)，并可作為分析程序的一部分存取。在一些實(shí)施方式種，可設(shè)定地址的核酸陣列包括多種互補(bǔ)于表1列出的多種多態(tài)性的核酸探針。將這些探針加入不同已知位置中的支持物上。對(duì)各核酸探針的準(zhǔn)確位置的明晰時(shí)這些“可設(shè)定地址”的陣列在結(jié)合分析中特別有用。之后用常規(guī)方法(例如放射性或熒光)標(biāo)記來(lái)自幾種生物樣品制成品中的核酸，在雜交得以進(jìn)行的條件下將標(biāo)記的樣品加到陣列中。如果樣品中的核酸與陣列上的探針雜交，那么在對(duì)應(yīng)雜交體位置的支持物上將檢測(cè)到信號(hào)。因?yàn)楦鳂?biāo)記應(yīng)品的來(lái)源是已知的，標(biāo)記樣品加到的支持物區(qū)也是已知的，故可以迅速確定是否存在多態(tài)性變異體(即，大腸桿菌菌株)。還可以結(jié)合DNA擴(kuò)增的常規(guī)方法，如下面將要討論的，以便檢測(cè)少與10個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的存在。用本高通量診斷或檢測(cè)分析領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的方法可以容易地使這些方法自動(dòng)化。
另外，可以應(yīng)用與上述方法相反的方法。將生物樣品中存在的核酸置于支持物上，制備一種可設(shè)定地址的陣列。優(yōu)選地，將樣品置于不重疊的已知位置的支持物上。應(yīng)用互補(bǔ)于編碼多態(tài)性的核酸的標(biāo)記的核酸探針，然后檢測(cè)陣列上對(duì)應(yīng)生物樣品放置位置的信號(hào)的存在，確定各樣品中具有所需多態(tài)性的核酸的存在。因?yàn)樯飿悠返纳矸菀阎?，其在陣列上的位置已知，因此可以快速確定多型性變異體的身份。對(duì)于上述方法，可以組合常規(guī)DNA擴(kuò)增法，以便檢測(cè)極少量細(xì)菌細(xì)胞的存在。應(yīng)用高通量診斷分析領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法也可以容易地是這些方法自動(dòng)化。
任何本領(lǐng)域已知的可設(shè)定地址的陣列技術(shù)都可以用于本發(fā)明的這一方面。一種已知的多核苷酸陣列的具體實(shí)施方式
是GenechipsTM，US5143854；PCTS申請(qǐng)WO 90/15070和WO 92/10092中對(duì)其有一般性描述。這些陣列通常用機(jī)械合成法或光引導(dǎo)合成法制備，這些方法結(jié)合了照相平版印刷法和固相寡核苷酸合成的組合。(Fodor等，科學(xué)，251767-777，(1991))。隨著一般稱之為“極大規(guī)模固定的聚合物合成”(Very Large ScaleImmobilized Polymer Synthesis，VLSIPSTM)技術(shù)的進(jìn)展而使固體支持物上寡核苷酸陣列的固定化成為可能，在VLSIPS技術(shù)中，探針通過(guò)固定在芯片固體表面的高密度陣列中。US 5143854和US 5412087和PCT申請(qǐng)WO90/15070，WO 92/10092和WO 95/11995中提供了VLSIPSTM方法的實(shí)施例，它們描述了通過(guò)例如光-引導(dǎo)合成技術(shù)等方法制備寡核苷酸陣列的方法。在旨在于提供固定于固體支持物的核苷酸陣列的設(shè)計(jì)策略中，發(fā)展了進(jìn)一步介紹策略，即指定和顯示芯片上的寡核苷酸陣列，試圖使雜交模式和診斷信息最大化。這些介紹策略的實(shí)施例公開于PCT申請(qǐng)WO94/12305，WO 94/11530，WO 97/29212，和WO 97/31256。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種標(biāo)記和結(jié)合技術(shù)，它們可以用于各種核酸分析法。有幾種制備用于雜交或PCR的標(biāo)記核酸的方法，包括但不限于，低聚物標(biāo)記、缺口翻譯、末端標(biāo)記、或應(yīng)用標(biāo)記核苷酸的PCR擴(kuò)增?；蛘?，編碼6-PGD或其任何部分的核酸可以克隆到載體中，用于制備mRNA探針。這類載體是本領(lǐng)域已知的，可從商業(yè)得到，并可以通過(guò)加入一種合適的RNA聚合酶例如T7、T3SP6和標(biāo)記的核苷酸體外合成RNA探針。很多公司例如Pharmacia Biotech(Piscataway N.J.)，Promega(Madison Wis.)，和U.S.Biochemical Corp(Cleveland Ohio)提供用于這些程序的商業(yè)試劑盒和方案。適當(dāng)?shù)膱?bào)告分子或標(biāo)記物包括那些放射性核素、酶、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、或色原物質(zhì)，以及底物、輔因子、抑制物、磁性顆粒等。
適應(yīng)陣列技術(shù)的錯(cuò)配剪切技術(shù)的實(shí)施例是RNase保護(hù)法。實(shí)踐中，該方法涉及應(yīng)用互補(bǔ)于具有多態(tài)性(例如，使高病原性O(shè)157H7和O55H7與其它較低病原性的大腸桿菌菌株區(qū)分開來(lái)的C653T和G654C多態(tài)性)的gnd序列的標(biāo)記的核探針(riboprobe)。核探針與從生物樣品中分離并擴(kuò)增得到的mRNA或DNA退火(雜交)，隨后用酶RNase A消化，該酶能夠探測(cè)到雙鏈RNase結(jié)構(gòu)中的錯(cuò)配。如果RNase探測(cè)到錯(cuò)配，樣品中就不會(huì)存在多型性變異，酶在錯(cuò)配位點(diǎn)酶切，并破壞核探針。因此，當(dāng)在電泳凝膠基質(zhì)上分離退火的RNA時(shí)，如果已經(jīng)探測(cè)出錯(cuò)配并已由RNase A酶切，將看到比核探針和mRNA或DNA的全長(zhǎng)雙鏈RNA更小的RNA產(chǎn)物?；蛘?，可以將核探針的互補(bǔ)序列分散于陣列，然后與來(lái)自任何保留雜交體變性后的RNase A消化產(chǎn)物嚴(yán)緊雜交。在這種情況下，如果探測(cè)到錯(cuò)配，探針被RNase A破壞，那么陣列上的互補(bǔ)序列將不與降解的RNA在嚴(yán)緊條件下雜交。在這種方式中可以應(yīng)用多種核探針篩選多種多態(tài)性，只需留意探針和互補(bǔ)序列不發(fā)生交叉雜交。如上述具有這種篩選幾種基因座的陣列的面板對(duì)于研究大腸桿菌病原譜尤其有用。在一種類似模式中，可以用DNA探針探測(cè)錯(cuò)配，通過(guò)酶或化學(xué)剪切。參見，例如，Cotton，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854397(1988)；Shenk等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72989(1975)；和Novack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83586(1986)。
或者，可以通過(guò)錯(cuò)配雙鏈相對(duì)于匹配雙鏈電泳能力的移位，探測(cè)錯(cuò)配。(參見，例如，Cariello，人類遺傳學(xué)42726(1988)，作為參考并入本發(fā)明)。用核探針或DNA探針，可以在雜交之前通過(guò)PCR擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于含多態(tài)性的gnd區(qū)的細(xì)胞mRNA或DNA。然后可以應(yīng)用等位基因-特異性探針篩選從生物樣品中分離出來(lái)的經(jīng)PCR擴(kuò)增的DNA序列。這些探針是核酸低聚物，它們均含有一個(gè)包括表1所列的一種或多種多態(tài)性的區(qū)域。例如，一種低聚物長(zhǎng)度可以約為30個(gè)核苷酸，對(duì)應(yīng)C653T和G654C多態(tài)性。通過(guò)應(yīng)用一套這種等位基因-特異性探針，可以篩選PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以鑒定是否存在特定多態(tài)性。當(dāng)然，確定樣品中是否存在高病原性大腸桿菌的最權(quán)威性實(shí)驗(yàn)是直接比較從生物樣品中分離出來(lái)的核苷酸或蛋白質(zhì)序列與一種或多種表1列出的多態(tài)性。
大量PCR方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。對(duì)于PCR方法的綜述，參見基因工程的分子克隆(Molecular Cloning to Genetic Engineering)White，B.A.編《分子生物學(xué)方法(Methods in Molecular Biology)》67Humana Press，Totowa(1997)，參考其全文并入本發(fā)明，以及名稱為“PCR發(fā)法和應(yīng)用”的公開文獻(xiàn)(1991，Cold Spring Harbor Laboratory Press)，參考其全文并入本發(fā)明。對(duì)于mRNA的擴(kuò)增，逆轉(zhuǎn)錄mRNA成為cDNA，然后進(jìn)行PCR(RT-PCR)；或者應(yīng)用如US5322770(參考其全文并入本發(fā)明)所述兩個(gè)步驟使用一種酶；或者使用如Marshall R.L等(PCR方法和應(yīng)用480-84，1994，參考其全文并入本發(fā)明)所述的逆轉(zhuǎn)錄酶不對(duì)稱缺口連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcriptase Asymmetric Gap Ligase Chain Reaction，RT-AGLCR)，均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在每一個(gè)上述擴(kuò)增程序中，將待擴(kuò)增序列兩側(cè)的引物與dNTP和熱穩(wěn)定性聚合酶例如Taq聚合酶、Pfu聚合酶、或者Vent聚合酶一起加到適當(dāng)制備的核酸樣品中。使樣品中的核酸變性，引物特異性地與樣品中的互補(bǔ)核酸序列雜交。使雜交的引物延伸。之后，開始另一輪變性、雜交、和延伸。重復(fù)循環(huán)多次，以制備含引物區(qū)之間的核酸序列的擴(kuò)增片段。PCR還在幾個(gè)專利中有描述，包括US4683195、US4683202、和US4965188，通過(guò)參考其全文并入本發(fā)明。
選擇的引物基本上互補(bǔ)于gnd DNA或mRNA序列的一部分，以及基本上為互補(bǔ)于gnd DNA或mRNA序列的序列的一部分，因此允許引物之間的序列得以擴(kuò)增。應(yīng)用于本發(fā)明這一方面的引物的長(zhǎng)度等于前面提供的核酸實(shí)施方式的大多數(shù)長(zhǎng)度。即，引物長(zhǎng)度可以小于或等于9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，125，150，175，200，225，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，500，525，550，575，600，625，650，675，700，725，750，775，800，825，850，875，900，925，950，975，1000，1100，1200，1300，和1406個(gè)核苷酸。然而優(yōu)選引物長(zhǎng)度為16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29和30個(gè)核苷酸。較短引物傾向于對(duì)目標(biāo)核酸序列缺乏特異性，通常需要較低溫度以便與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。較長(zhǎng)引物制備昂貴，有時(shí)能夠自身-雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。穩(wěn)定雜交體的形成依賴于DNA的熔融溫度(Tm)。Tm依賴于引物長(zhǎng)度、溶液離子強(qiáng)度合G＋C含量。引物G＋C含量越高，熔融溫度越高，因?yàn)镚∶C對(duì)由三個(gè)H鍵結(jié)合，而A∶T對(duì)僅由兩個(gè)H鍵結(jié)合。本發(fā)明的擴(kuò)增引物的G＋C含量?jī)?yōu)選范圍在10-75％之間，更優(yōu)選在35-60％之間，最優(yōu)選在40-55％之間。在具體分析條件下引物的合適長(zhǎng)度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。
引物之間的間隔決定了待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。在本發(fā)明的情況下，攜帶編碼6-PGD片段的核酸序列的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度可以從至少越25bp到35kb。25-1407bp的擴(kuò)增片段是普遍的，50-1000bp的片段是優(yōu)選的，100-600bp的片段是高度優(yōu)選的。將理解用于本發(fā)明gnd基因的擴(kuò)增引物可以是允許SEQ.ID.Nos.22，16，18，24，26，20，42，28，30，40，32，36，38，和34中公開的gnd基因區(qū)特異性擴(kuò)增的任何序列，并能夠，例如，包括修飾例如有助于克隆的限制性位點(diǎn)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，通過(guò)應(yīng)用使用兩套引物的PCR擴(kuò)增鑒定了高病原性O(shè)157H7大腸桿菌，并使之與較低病原性的大腸桿菌區(qū)別開來(lái)。第一套引物被設(shè)計(jì)為產(chǎn)生一個(gè)至少含C653T和G654C多態(tài)性的擴(kuò)增子，其能將高病原性O(shè)157H7和O55H7大腸桿菌與低病原性菌株區(qū)分開來(lái)。第二套引物設(shè)計(jì)為產(chǎn)生一個(gè)O55H7寄生蟲獨(dú)特的擴(kuò)增子，例如，引物對(duì)5’GCGTTCTTAAAGAGTCCTGC3’(SEQ.ID.No.13)和5’TGCCCGCTACATCTCCTC3’(SEQ.ID.No.8)，其對(duì)應(yīng)于gnd的3’末端，下游區(qū)產(chǎn)生一個(gè)來(lái)自11大腸桿菌O55菌株而不是大腸桿菌O157H7DNA的6.5kb擴(kuò)增子。通過(guò)應(yīng)用SSCP或TTGE和簡(jiǎn)易凝膠電泳，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以快速鑒定C653T和G654C多態(tài)性的存在，并確定檢測(cè)到的多型性變異是O157H7還是O55H7。在類似模式中，可以應(yīng)用專屬地鑒定表1所述的其它多態(tài)性的引物和引物的組合，以鑒定和區(qū)分大腸桿菌菌株。
還可以應(yīng)用常規(guī)分析法檢測(cè)本發(fā)明的6-PGD蛋白的存在。例如，與特定6-PGD序列中發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性具有免疫反應(yīng)性的單克隆抗體可以用于篩選生物樣品是否存在特定大腸桿菌菌株，并可以用于使一種菌株從其它菌株中區(qū)分出來(lái)。由于T2181多態(tài)性可以使高病原性O(shè)157H7和O55H7與低病原性O(shè)157H7區(qū)分開來(lái)，因此包括涉及檢測(cè)是否存在T2181多態(tài)性的試劑和方法的診斷和篩選分析是優(yōu)選實(shí)施方式。這些診斷分析也可以包括特異性區(qū)分O55H7和O157H7寄生蟲的試劑，例如，針對(duì)來(lái)自O(shè)157H7寄生蟲的、與6-PGD蛋白非同源的、O55H7 6-PGD蛋白區(qū)中存在的表位的抗體。這些免疫分析可以在一些方便的模式下操作。
在一個(gè)實(shí)施方式中，用抗體從溶液中免疫沉淀本發(fā)明的6-PGD，在另一個(gè)實(shí)施方式中，用抗體與聚丙烯酰胺凝膠的Western或免疫印跡上的6-PGD反應(yīng)。檢測(cè)6-PGD的優(yōu)選實(shí)施方式包括酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，放射性免疫分析法(RIA)、免疫輻射測(cè)量法(IRMA)和免疫酶學(xué)分析法(IEMA)，包括應(yīng)用單克隆和/或多克隆抗體的夾層分析法。David等，在US 4376110和US4486530(作為參考并入本發(fā)明)中描述了舉例說(shuō)明的夾層分析法。其它實(shí)施方式應(yīng)用了多方面免疫色帶技術(shù)，如US 5290678；US 5604105；US 5710008；US 5744358；和US 5747274的公開，作為參考并入本發(fā)明，這些方法允許快速、可見地鑒定樣品中多種分析物的存在。這些方法可以方便地調(diào)整，從而得以快速檢測(cè)可由表1推測(cè)出的6-PGD多態(tài)性。
在優(yōu)選的基于蛋白質(zhì)的診斷和/或檢測(cè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體附著于有序陣列的支持物上，其中大量抗體附著于不會(huì)彼此重疊的支持物的不同區(qū)域。象基于核酸的陣列一樣，基于蛋白的陣列是被設(shè)計(jì)為“可設(shè)定地址”的有序陣列，從而可以記錄不同位置，并且它們可以被存取為分析程序的一部分。
在某些實(shí)施方式中，可設(shè)定地址的抗體陣列包括大量識(shí)別可由表1推斷出的6-PGD多態(tài)性的抗體。將這些探針加到不同已知位置的支持物上。各探針的精確位置的明晰使這些“可設(shè)定地址”的陣列在結(jié)合分析中特別有用。例如，一種可設(shè)定地址的陣列可以包括一種支持物，其具有加入了多個(gè)識(shí)別可由表1推斷出的6-PGD多態(tài)性的抗體探針的若干區(qū)域。從生物樣品得到的蛋白質(zhì)用常規(guī)方法標(biāo)記(例如，放射性、比色法、或熒光法)，在允許結(jié)合的條件下將標(biāo)記樣品加到陣列中。如果樣品中的蛋白質(zhì)結(jié)合陣列上的抗體探針，那么將在對(duì)應(yīng)抗體-蛋白質(zhì)復(fù)合物位置的支持物位置上檢測(cè)到信號(hào)。因?yàn)楦鳂?biāo)記樣品的身份是已知的，標(biāo)記樣品加到的支持物區(qū)域是已知的，因此可迅速確定存在、濃度、和/或表達(dá)水平。也就是說(shuō)，通過(guò)應(yīng)用已知濃度6-PGD的標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品，研究者可以準(zhǔn)確地確定樣品中的6-PGD蛋白質(zhì)濃度，并能夠從該信息評(píng)價(jià)6-PGD的表達(dá)水平。測(cè)量密度的常規(guī)方法也能夠用于更準(zhǔn)確地確定6-PGD的濃度或表達(dá)水平。應(yīng)用高通量診斷分析領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)可以容易地使這些方法自動(dòng)化。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以應(yīng)用于前面提供方法相反的方法?？梢詫⑸飿悠分写嬖诘牡鞍踪|(zhì)置于支持物上，以形成一種可設(shè)定地址的陣列。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)樣品置于不重疊的已知位置的支持物上。應(yīng)用識(shí)別對(duì)應(yīng)可由表1推斷出的多態(tài)性的6-PGD表位的標(biāo)記抗體探針，并檢測(cè)對(duì)應(yīng)生物樣品放置位置的陣列上位置的信號(hào)，即可確定各樣品中編碼特定6-PGD形式的蛋白質(zhì)的存在。由于生物樣品的身份是已知的，其在陣列中的位置是已知的，因此可以迅速確定特定6-PGD的存在、濃度、和/或表達(dá)水平。也就是說(shuō)，通過(guò)應(yīng)用已知濃度6-PGD的標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品，研究者可以準(zhǔn)確地確定樣品中的6-PGD蛋白質(zhì)濃度，并能夠從該信息評(píng)價(jià)6-PGD的表達(dá)水平。測(cè)量密度的常規(guī)方法也能夠用于更準(zhǔn)確地確定6-PGD的濃度或表達(dá)水平。應(yīng)用高通量診斷分析領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)可以容易地使這些方法自動(dòng)化。如前面詳細(xì)討論的，本領(lǐng)域已知的任何可設(shè)定地址的陣列技術(shù)都可以應(yīng)用于本發(fā)明的這一方面，在芯片展示的蛋白質(zhì)陣列試圖使抗體結(jié)合模式和診斷信息最大化。
如前面所討論的，6-PGD中存在或檢測(cè)到一種或多種多態(tài)性可以診斷受試者疾病或顯示食物或水源污染。其它實(shí)施方式包括制備診斷試劑盒，其中包括檢測(cè)成分例如特異于一種或多種6-PGD多態(tài)性的抗體。提供的檢測(cè)成分通常將與一種或多種下列試劑組合。通常將提供能夠吸附或結(jié)合RNA或蛋白質(zhì)的支持物。可用于這一目的的支持物包括但不限于，硝酸纖維素膜、具有能夠負(fù)載正電荷取代物陣列功能的尼龍或衍生化尼龍，和GenechipsTM或它們的等價(jià)物。試劑盒中可以裝入一種或多種酶，例如逆轉(zhuǎn)錄酶和/或Taq聚合酶，也可以裝入dNTP、緩沖液、或非人多核苷酸例如小牛胸腺或鮭魚精子DNA。試劑盒分析出的結(jié)果可以由衛(wèi)生保健人員或診斷實(shí)驗(yàn)室分析。或者，生產(chǎn)診斷試劑盒，然后出售給私人個(gè)體用于自我診斷。
下文實(shí)施例1描述了一種方法，該方法可用于鑒定rfb/gnd基因簇中具有多態(tài)性的其它區(qū)域，這些多態(tài)性可用于鑒別和區(qū)分大腸桿菌菌株。
實(shí)施例1參考圖3，應(yīng)用限制圖譜和PCR克隆技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)gnd基因座旁側(cè)的判別序列。如圖3所示，限制性位點(diǎn)“A”在“B-G”片段中(即“A1、A2、和A3”)，定義如下?！癇”對(duì)應(yīng)病原性或抗原性島的左手邊界，“G”對(duì)應(yīng)該該元件的右手邊界。“A1”是A位點(diǎn)到B左側(cè)的第一個(gè)限制性位點(diǎn)，“A2”是A位點(diǎn)到G右側(cè)的第一個(gè)限制性位點(diǎn)。如果B-G片段的序列是已知的，例如gnd，該序列旁側(cè)的BG島可以應(yīng)用反向PCR確定。引物“C”、“D”、“E”、和“F”來(lái)源于獨(dú)特的病原性/抗原性島的序列。實(shí)際序列來(lái)源于原始數(shù)據(jù)，按照5’到3’方向描述，如圖3中下劃線部分所示。引物是同向的(引物D、引物F)或者反向的(引物C和引物E)。
接下來(lái)，用酶A徹底消化大腸桿菌DNA。然后加入連接酶，使得到的片段重新環(huán)化。在含有熱穩(wěn)定聚合酶和PCR的不同試管中加入引物，進(jìn)行PCR得到擴(kuò)增子?？寺『蜏y(cè)序擴(kuò)增子。該方法鑒定了已知病原性/抗原性島的5’和3’端之外的序列，用來(lái)源于這些序列的引物擴(kuò)增各種病原體和非-病原體的該區(qū)，如對(duì)gnd等位基因進(jìn)行的操作那樣。然后對(duì)得到的擴(kuò)增子測(cè)序，以鑒定分化的多態(tài)性。
雖然參考實(shí)施方式和實(shí)施例描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解在不偏離本發(fā)明實(shí)質(zhì)的情況下可以進(jìn)行各種修改。因此，本發(fā)明僅通過(guò)所附的權(quán)利要求來(lái)限定。本發(fā)明引證的所有參考文獻(xiàn)作為參考特別地插入。
權(quán)利要求
1.一種編碼gnd的分離的多核苷酸，其中該多核苷酸包括SEQ IDNos22、16、18、24、26、20、42、28、30、40、32、36、38、和34之一的序列。
2.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中該多核苷酸包括SEQ ID Nos22、16、18、24、26、20、42、28、30、40、32、36、38、和34之一序列的至少9個(gè)連續(xù)堿基，并含有一種表1中描述的多態(tài)性。
3.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中多核苷酸編碼一種由SEQ IDNos22、16、18、24、26、20、42、28、30、40、32、36、38、和34之一序列推斷出的多肽。
4.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中該多核苷酸包括與SEQ IDNos22、16、18、24、26、20、42、28、30、40、32、36、38、和34之一序列或它們的一個(gè)互補(bǔ)序列的核苷酸序列在下列條件下雜交的至少9個(gè)堿基，雜交條件為7％十二烷基磺酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4pH7.0，0.1mM EDTA，50℃；并用1％SDS在42℃清洗。
5.一種重組構(gòu)建體，它含有可操縱地連接于一種異源啟動(dòng)子的SEQID Nos22、16、18、24、26、20、42、28、30、40、32、36、38、和34之一的序列。
6.一種含有權(quán)利要求1的分離的DNA的載體。
7.一種含有權(quán)利要求2的分離的DNA的載體。
8.一種檢測(cè)編碼6-PGD的基因中的多態(tài)性的方法，包括取得含多核苷酸的生物樣品；和分析該生物樣品是否存在具有至少一種表1描述的多態(tài)性的診斷性多核苷酸。
9.權(quán)利要求8的方法，其中該多態(tài)性是C653T或G653C。
10.權(quán)利要求8的方法，其中對(duì)生物樣品的分析進(jìn)一步包括DNA擴(kuò)增步驟。
11.一種鑒定病原性或非-病原性大腸桿菌的方法，包括取得含多核苷酸的生物樣品；分析該生物樣品是否存在具有至少一種表1描述的多態(tài)性的診斷性多核苷酸；和基于至少一種表1描述的多態(tài)性是否存在，鑒定大腸桿菌為病原性或非-病原性菌株。
12.權(quán)利要求11的方法，其中多態(tài)性是C653T或G653C。
13.權(quán)利要求11的方法，其中對(duì)生物樣品的分析進(jìn)一步包括DNA擴(kuò)增步驟。
14.一種分離的蛋白質(zhì)，包括SEQ ID Nos23、17、19、25、27、21、43、29、31、41、33、37、39、和35的序列。
15.一種分離的多肽，包括SEQID Nos23、17、19、25、27、21、43、29、31、41、33、37、39、和35之一序列的至少3個(gè)連續(xù)的氨基酸，其中所述多肽含有至少一種可由表1推斷出的多態(tài)性。
16.一種制各6-PGD蛋白的方法，包括獲得含有SEQ ID Nos22、16、18、24、26、20、42、28、30、40、32、36、38、和34之一序列的cDNA；將所述cDNA插入表達(dá)載體，使cDNA可操縱地連接于啟動(dòng)子；和將所述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，由此宿主細(xì)胞產(chǎn)生由所述cDNA編碼的蛋白質(zhì)。
17.權(quán)利要求16的方法，進(jìn)一步包括分離蛋白質(zhì)。
18.一種構(gòu)建轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的方法，該宿主細(xì)胞表達(dá)SEQ IDNos23、17、19、25、27、21、43、29、31、41、33、37、39、和35之一的序列，包括用適合基因表達(dá)的重組DNA載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
19.一種含有權(quán)利要求6的載體的培養(yǎng)細(xì)胞系。
20.一種含有權(quán)利要求7的載體的培養(yǎng)細(xì)胞系。
21.一種分離的抗體，它能夠特異性結(jié)合具有SEQ ID Nos23、17、19、25、27、21、43、29、31、41、33、37、39、和35之一序列的蛋白質(zhì)，其中表位對(duì)應(yīng)于至少一種可由表1推斷出的多態(tài)性。
22.一種分離的抗體，它能夠結(jié)合包括SEQ ID Nos23、17、19、25、27、21、43、29、31、41、33、37、39、和35序列的至少9個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽，其中表位對(duì)應(yīng)于至少一種可由表1推斷出的多態(tài)性。
23.權(quán)利要求21或22的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
24.一種用于檢測(cè)是否存在大腸桿菌O157H7的核酸探針，其由一種長(zhǎng)度至少7個(gè)核苷酸的分離的核酸分子構(gòu)成，所述分離的核酸分子與大腸桿菌O157H7的gnd的DNA雜交，而不與非H7大腸桿菌O157菌株的gnd的DNA雜交。
25.一種用于檢測(cè)是否存在大腸桿菌O157H7的核酸引物，其由一種長(zhǎng)度至少7個(gè)核苷酸的分離的核酸分子構(gòu)成，所述分離的核酸分子引導(dǎo)大腸桿菌O157H7的gnd的DNA，但不引導(dǎo)非H7大腸桿菌O157菌株的gnd的DNA。
26.一種檢測(cè)樣品中是否存在大腸桿菌O157H7的方法，包括以下步驟(a)在雜交條件下，用可選擇性地與來(lái)自大腸桿菌O157H7的gnd的核酸序列雜交，而不與來(lái)自非H7大腸桿菌O157菌株的gnd的核酸序列雜交的核酸探針，接觸所述樣品，形成雜交復(fù)合物；和(b)檢測(cè)形成的所述雜交復(fù)合物，作為樣品中是否存在大腸桿菌O157H7的指示。
27.在一種基質(zhì)上的多個(gè)權(quán)利要求24的核酸探針。
28.在一種芯片的微陣列中的多個(gè)權(quán)利要求24的核酸探針。
全文摘要
本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)涉及微生物學(xué)和食品科學(xué)領(lǐng)域。具體地說(shuō),發(fā)明人從14個(gè)大腸桿菌(Escherichia Coli)菌株及其多態(tài)性序列中發(fā)現(xiàn)了gnd基因和相應(yīng)的6－磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6－PGD)蛋白,并發(fā)明了一套新的生物技術(shù)工具、診斷方法和食物檢測(cè)技術(shù)。
文檔編號(hào)C12N1/15GK1333831SQ9981568
公開日2002年1月30日 申請(qǐng)日期1999年12月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月8日
發(fā)明者菲利普·I·塔爾 申請(qǐng)人:兒童醫(yī)院及地區(qū)醫(yī)療中心