專利名稱：利用腸桿菌科的菌株生產(chǎn)L－氨基酸的方法,該菌株過表達(dá)編碼半乳糖質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運蛋白 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種利用過表達(dá)galP基因的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的菌株生產(chǎn)L-氨基酸，尤其是L-蘇氨酸，的方法。
背景技術(shù)：
L-氨基酸，尤其是L-蘇氨酸，用于人類醫(yī)學(xué)，和用于制藥工業(yè)、食品工業(yè)和特別是動物營養(yǎng)。
已知可以通過發(fā)酵腸桿菌科的菌株，尤其是大腸桿菌(E.coli)和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)，來制備L-氨基酸。由于其極為重要，因此不斷地努力改進(jìn)生產(chǎn)方法。方法的改進(jìn)可能涉及比如攪拌和供氧這樣的發(fā)酵工程措施，或涉及比如發(fā)酵過程中的糖濃度這樣的營養(yǎng)培養(yǎng)基組成，或涉及通過例如離子交換層析來逐步形成產(chǎn)物形式，或涉及微生物自身的內(nèi)在生產(chǎn)性能。
利用誘變、選擇和突變體選擇的方法來改進(jìn)這些微生物的生產(chǎn)性能。用這種方法，獲得了對于比如蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥基戊酸(AHV)這樣的抗代謝物有抗性，或者是對重要的調(diào)控代謝物為營養(yǎng)缺陷型，且能生產(chǎn)比如L-蘇氨酸這樣的L-氨基酸的菌株。
一段時間以來，通過擴增單個氨基酸生物合成基因并測試其對生產(chǎn)的效應(yīng)，已經(jīng)將重組DNA遺傳工程方法用于對生產(chǎn)L-氨基酸的腸桿菌科的菌株進(jìn)行菌株改良?？梢栽贜eidhardt(編者)Escherichiacoli and Salmonella，Cellular and Molecular Biology，第二版，ASM Press，Washington，D.C.，USA，(1996)中找到涉及大腸桿菌和沙門氏菌屬(Salmonella)細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的信息的概述。
發(fā)明目的本發(fā)明人設(shè)立的目的是提供用于改進(jìn)的L-氨基酸，尤其是L-蘇氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)的新措施。
發(fā)明概述本發(fā)明提供，利用來自腸桿菌科的微生物，尤其是那些已能生產(chǎn)L-氨基酸且其中編碼galP基因的核苷酸序列過表達(dá)的微生物，來發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸尤其是L-蘇氨酸的方法。
發(fā)明詳述galP基因編碼的基因產(chǎn)物在現(xiàn)有技術(shù)中已知為，尤其是“半乳糖質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運蛋白”或“半乳糖通透酶”。
通常，將由核苷酸序列，即基因或等位基因所編碼的蛋白質(zhì)，或所編碼的核糖核酸稱作基因產(chǎn)物。
等位基因通常理解為給定的基因的替代形式。這些形式的特征在于核苷酸序列中的差異。
以下提到L-氨基酸或氨基酸的任何地方，都意指選自如下的一或多種氨基酸，包括它們的鹽L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸和L-精氨酸。特別優(yōu)選L-蘇氨酸。
本文中，用語“過表達(dá)”描述，通過例如將基因的拷貝數(shù)提高至少一個(1)拷貝或使用強啟動子以及可選地將這些方法相結(jié)合，導(dǎo)致微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶或蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)活性或濃度的提高。
調(diào)節(jié)過表達(dá)這一方法通常使相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度相對于野生型蛋白質(zhì)或起始微生物中的蛋白質(zhì)活性或濃度提高至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，最多提高至1000％或2000％。起始微生物或親本菌株理解為將對其實施本發(fā)明方法的微生物。
本發(fā)明提供通過發(fā)酵來自腸桿菌科的重組微生物來生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其特征在于a)在使培養(yǎng)基或細(xì)胞中富集所希望的L-氨基酸的條件下，于培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生所希望的L-氨基酸的微生物，該微生物中g(shù)alP基因或編碼其的核苷酸序列是過表達(dá)的，和b)分離所希望的L-氨基酸，其中所有或部分(≥0至100％)發(fā)酵液體培養(yǎng)基組分和/或生物質(zhì)可選地保留在所分離的產(chǎn)物中或者被完全除去。
這些同樣由本發(fā)明提供的(尤其是重組的)微生物，能夠從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜，可選地從淀粉，可選地從纖維素或從甘油和乙醇生產(chǎn)L-氨基酸。它們是選自埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)和沙雷氏菌屬(Serratia)的腸桿菌科的代表。埃希氏菌屬和沙雷氏菌屬是優(yōu)選的。對于埃希氏菌屬，特別提到大腸桿菌，對于沙雷氏菌屬，特別提到粘質(zhì)沙雷氏菌。
通常通過利用含有所希望的基因的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或結(jié)合來制備重組微生物。
埃希氏菌屬中的適宜菌株，尤其是那些生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株，特別是大腸桿菌的菌株，例如是-大腸桿菌H4581 (EP-A 0 301 572)-大腸桿菌KY10935 (Bioscience Biotechnologyand Biochemistry 61(11)1877-1882(1997)-大腸桿菌VNIIgenetika MG442 (US-A-4278,765)-大腸桿菌VNIIgenetika M1 (US-A-4,321,325)-大腸桿菌VNIIgenetika 472T23 (US-A-5,631,157)-大腸桿菌BKIIM B-3996(US-A-5,175,107)-大腸桿菌kat 13 (WO98/04715)-大腸桿菌KCCM-10132 (WO00/09660)沙雷氏菌屬中的適宜菌株，尤其是那些生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株，特別是粘質(zhì)沙雷氏菌的菌株，例如是-粘質(zhì)沙雷氏菌HNr21 (Applied and EnvironmentalMicrobiology38(6)1045-1051(1979))-粘質(zhì)沙雷氏菌TLr156 (Gene57(2-3)151-158(1987))-粘質(zhì)沙雷氏菌T-2000 (Applied Biochemistry andBiotechnology 37(3)255-265(1992))來自腸桿菌科的生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株優(yōu)選具有，尤其是一種或多種選自以下的遺傳或表型特征α-氨基-β-羥基戊酸抗性，硫代賴氨酸抗性，乙硫氨酸抗性，α-甲基絲氨酸抗性，二氨基琥珀酸抗性，α-氨基丁酸抗性，疏螺旋體素抗性，環(huán)戊烷甲酸抗性，利福平抗性，對于例如纈氨酸異羥肟酸鹽(Valinehydroxamate)這樣的纈氨酸類似物的抗性，對于例如6-二甲基-氨基嘌呤這樣的嘌呤類似物的抗性，需要L-甲硫氨酸，可選地部分且可補償?shù)匦枰狶-異亮氨酸，需要中二氨基庚二酸，對含有蘇氨酸的二肽為營養(yǎng)缺陷，L-蘇氨酸抗性，蘇氨酸精煉物抗性，L-高絲氨酸抗性，L-賴氨酸抗性，L-甲硫氨酸抗性，L-谷氨酸抗性，L-天冬氨酸抗性，L-亮氨酸抗性，L-苯丙氨酸抗性，L-絲氨酸抗性，L-半胱氨酸抗性，L-纈氨酸抗性，對氟代丙酮酸的敏感性，缺陷的蘇氨酸脫氫酶，可選地能夠利用蔗糖，蘇氨酸操縱子過表達(dá)，高絲氨酸脫氫酶I-天冬氨酸激酶I過表達(dá)(優(yōu)選為反饋抗性形式)，高絲氨酸激酶過表達(dá)，蘇氨酸合酶過表達(dá)，天冬氨酸激酶過表達(dá)(可選地為反饋抗性形式)，天冬氨酸半醛脫氫酶過表達(dá)，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶過表達(dá)(可選地為反饋抗性形式)，磷酸烯醇丙酮酸合酶過表達(dá)，轉(zhuǎn)氫酶過表達(dá)，RhtB基因產(chǎn)物過表達(dá)，RhtC基因產(chǎn)物過表達(dá)，YfiK基因產(chǎn)物過表達(dá)，丙酮酸羧化酶過表達(dá)，乙酸形成減少。
人們發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)galP基因后，腸桿菌科的微生物以改良的方式生產(chǎn)L-氨基酸，尤其是L-蘇氨酸。
來自大腸桿菌的該基因的核苷酸序列是現(xiàn)有技術(shù)的部分，且可以從由Blattner等人公開的大腸桿菌基因組序列獲得(Science 2771453-1462(1997))。
尤其是利用以下信息來描述galP基因名稱糖類轉(zhuǎn)運蛋白，半乳糖質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運蛋白功能作為膜整合蛋白，將2-脫氧-D-半乳糖和質(zhì)子和一個質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運進(jìn)細(xì)胞參考文獻(xiàn)Macpherson等人；The Journal of BiologicalChemistry258(7)4390-4396(1983)，Venter等人；The Biochemical Journal 363(Pt2)243-252(2002)登錄號 AE000377鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)中的半乳糖通透酶尤其描述于以下參考文獻(xiàn)中Postma PW；Journal of Bacteriology 129(2)630-639(1977)；Nagelkerke和Postma；Journal of Bacteriology 133(2)607-613(1978)。
核酸序列可以從國家醫(yī)學(xué)圖書館(Bethesda，MD，USA)的國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫、歐洲分子生物學(xué)實驗室(EMBL，Heidelberg，Germany和Cambridge，UK)的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫或日本的DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ，Mishima，Japan)獲得。
為更加清楚的描述，大腸桿菌galP基因的核苷酸序列示為SEQ IDNO3，由該基因編碼的半乳糖質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列示為SEQ ID NO4。
根據(jù)本發(fā)明可以使用在所引用的參考文獻(xiàn)中描述的基因。此外，可以使用通過遺傳密碼簡并或功能中性有義突變制得的這些基因的等位基因。優(yōu)選使用內(nèi)源基因。
“內(nèi)源基因”或“內(nèi)源核苷酸序列”理解為存在于某一物種群體中的基因或等位基因或核苷酸序列。
含有功能中性有義突變的等位基因包括那些在由其編碼的蛋白質(zhì)中導(dǎo)致至少一個保守氨基酸交換的等位基因。
對于芳香族氨基酸，保守交換是指苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸相互取代。對于疏水氨基酸，保守交換是指亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸相互取代。對于極性氨基酸，保守交換是指谷氨酰胺和天冬酰胺相互取代。對于堿性氨基酸，保守交換是指精氨酸、賴氨酸和組氨酸相互取代。對于酸性氨基酸，保守交換是指天冬氨酸和谷氨酸相互取代。對于含羥基的氨基酸，保守交換是指絲氨酸和蘇氨酸相互取代。
同樣，可以使用那些編碼所提及的蛋白質(zhì)的變體的核苷酸序列，這些蛋白質(zhì)變體在N-或C-末端另外加長或縮短了至少一個(1)氨基酸。這一延長或縮短不超過50、40、30、20、10、5、3或2個氨基酸或氨基酸基團(tuán)。
為了產(chǎn)生過表達(dá)，例如可以提高相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或者可以使位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子和調(diào)控區(qū)域或核糖體結(jié)合位點發(fā)生突變。整合在結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒以同樣的方式起作用?？梢允褂玫膯幼佑绕浒ㄒ阎麨閘ac和trp啟動子的大腸桿菌乳糖和色氨酸操縱子的啟動子。包含在lac啟動子的-10區(qū)域和trp啟動子的-35區(qū)域內(nèi)的雜合啟動子是tac啟動子(DeBoer等人；Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America8021-25(1983))。其它可以使用的啟動子是λ噬菌體的左向PL啟動子和T7噬菌體啟動子，它們與已經(jīng)提到的lac、trp和tac啟動子起作用的方式一樣與阻遏蛋白相互作用，其中轉(zhuǎn)錄克隆的基因可以被特異性地開啟或關(guān)閉。通過利用可誘導(dǎo)啟動子，還有可能提高L-蘇氨酸發(fā)酵生產(chǎn)過程中的表達(dá)。還可以通過采用延長m-RNA壽命的措施來提高表達(dá)。此外，還通過防止酶蛋白質(zhì)的降解來提高酶活性?；蚧蚧驑?gòu)建體可以以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或在染色體中整合并擴增。此外，作為選擇，可以通過改變培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)管理來實現(xiàn)相關(guān)基因的過表達(dá)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員，尤其可以在Chang和Cohen(Journal ofBacteriology 1341141-1156(1978))、Hartley和Gregori(Gene13347-353(1981))、Amann和Brosius(Gene40183-190(1985))、de Broer等人(Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 8021-25(1983))、LaVallie等人(BIO/TECHNOLOGY 11187-193(1993))、WO98/04715、Llosa等人(Plasmid26222-224(1991))、Quandt和Klipp(Gene 80161-169(1989))、Hamilton等人(Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))、Jensen和Hammer(Biotechnology andBioengineering 58191-195(1998))以及熟知的有關(guān)遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的教科書中找到與此有關(guān)的指導(dǎo)。
可以使用可在腸桿菌科細(xì)菌中復(fù)制的質(zhì)粒載體，比如源自pACYC184的克隆載體(Bartolomé等人；Gene10275-78(1991))、pTrc99A(Amann等人；Gene69301-315(1988))或pSC101-衍生物(Vocke和Bastia；Proceedings of the National Academy ofSciences USA 80(21)6557-6561(1983))。在本發(fā)明的方法中，可以使用用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化了的菌株，其中質(zhì)粒載體包含至少一個編碼galP基因的核苷酸序列。
表達(dá)轉(zhuǎn)化理解為宿主(微生物)接受一種分離的核酸。
還有可能通過序列交換(Hamilton等人；Journal ofBacteriology 1714617-4622(1989))、結(jié)合或轉(zhuǎn)導(dǎo)來轉(zhuǎn)換不同菌株中影響特定基因表達(dá)的突變。
對遺傳學(xué)和分子生物學(xué)中所使用的這些概念的更詳細(xì)的說明可以在熟知的遺傳性和分子生物學(xué)教科書中獲得，比如Birge的教科書(Bacterial and Bacteriophage Genetics，第4版，Springer Verlag，New York(USA)，2000)，或Berg、Tymoczko和Stryer的教科書(Biochemistry，第五版，F(xiàn)reeman and Company，New York(USA)，2002)，或Sambrook等人的手冊(Molecular Cloning，ALaboratoryManual，(3卷套)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor(USA)，2001)。
此外，利用這樣的腸桿菌科的菌株，即該菌株除了過表達(dá)galP基因之外還過表達(dá)一種或多種在熟知的蘇氨酸生物合成途徑中的酶或anoplerotic代謝中的酶，或產(chǎn)生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶，或糖酵解中的酶，或PTS酶，或硫代謝中的酶，對于生產(chǎn)L-氨基酸，尤其是L-蘇氨酸，可能是有利的。通常優(yōu)選利用內(nèi)源基因。
因此，可以同時過表達(dá)，例如一或多種選自以下的基因·編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶(US-A-4,278,765)的thrABC操縱子，·來自谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)的、編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(WO99/18228)，·編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(Molecular andGeneral Genetics 231(2)332-336(1992))，·編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(Gene31279-283(1984))，·編碼轉(zhuǎn)氫酶的pntA和pntB基因(European Journal ofBiochemistry 158647-653(1986))，·賦予高絲氨酸抗性的rhtB基因(EP-A-0 994 190)，·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(WO02/06459)，·賦予蘇氨酸抗性的rhtC基因(EP-A-1 013 765)，·來自谷氨酸棒桿菌的、編碼蘇氨酸輸出蛋白的thrE基因(WO01/92545)，·編碼谷氨酸脫氫酶的gdhA基因(Nucleic Acids Research115257-5266(1983)；Gene 23199-209(1983))，·編碼葡糖激酶的glk基因(Journal of Bacteriology 1791298-1306(1997)，·編碼DNA結(jié)合蛋白HLP-II的hns基因(WO03/004671)，·編碼葡糖磷酸變位酶的pgm基因(WO03/004598)，·編碼果糖二磷酸醛縮酶的fba基因(WO03/004664)，·來自ptsHIcrr操縱子的、編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)PTS中的磷酸組氨酸蛋白己醣磷酸轉(zhuǎn)移酶的ptsH基因(WO03/004674)，
·來自ptsHIcrr操縱子的、編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)PTS中的酶I的ptsI基因(WO03/004674)，·來自ptsHIcrr操縱子的、編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)PTS中的葡萄糖-特異性IIA組分的crr基因(WO03/004674)，·編碼葡萄糖-特異性IIBC組分的ptsG基因(WO03/004670)，·編碼亮氨酸調(diào)節(jié)子中的調(diào)控蛋白的lrp基因(WO03/004665)，·編碼全局調(diào)控蛋白Csr的csrA基因(Journal ofBacteriology 1754744-4755(1993)，·編碼fad調(diào)節(jié)子中的調(diào)控蛋白的fadR基因(Nucleic AcidsResearch 167995-8009(1988))，·編碼中央中間代謝中的調(diào)控蛋白的iclR基因(Journal ofBacteriology 1722642-2649(1990))，·編碼10KDa陪伴蛋白的mopB基因(WO03/004669)，已知其名稱還為groES，·來自ahpCF操縱子的、編碼烷基氫過氧化物還原酶的小亞基的ahpC基因(WO03/004663)，·來自ahpCF操縱子的、編碼烷基氫過氧化物還原酶的大亞基的ahpF基因(WO03/004663)，·編碼半胱氨酸合酶A的cysK基因(WO03/006666)，·編碼cys調(diào)節(jié)子中的調(diào)控蛋白的cysB基因(WO03/006666)，·來自cysJIH操縱子的、編碼NADPH亞硫酸鹽還原酶中的黃素蛋白的cysJ基因(WO03/006666)，·來自cysJIH操縱子的、編碼NADPH亞硫酸鹽還原酶中的血蛋白的cysI基因(WO03/006666)，·來自cysJIH操縱子的、編碼腺苷酰硫酸還原酶的cysH基因(WO03/006666)，·來自phoBR操縱子的、編碼pho調(diào)節(jié)子中的正調(diào)控蛋白PhoB的phoB基因(WO03/008606)，·來自phoBR操縱子的、編碼pho調(diào)節(jié)子中的傳感蛋白的phoR基因(WO03/008606)，·編碼細(xì)胞外膜中的E蛋白的phoE基因(WO03/008608)，·編碼受果糖刺激的丙酮酸激酶I的pykF基因(WO03/008609)，·編碼6-磷酸果糖激酶II的pfkB基因(WO03/008610)，·編碼麥芽糖轉(zhuǎn)運中的周質(zhì)結(jié)合蛋白的malE基因(WO03/008605)，·編碼超氧化物歧化酶的sodA基因(WO03/008613)，·來自rseABC操縱子的、編碼具有抗-σE活性的膜蛋白的rseA基因(WO03/008612)，·來自rseABC操縱子的、編碼σE因子中的全局調(diào)控蛋白的rseC基因(WO03/008612)，·來自sucABCD操縱子的、編碼2-酮戊二酸脫氫酶的脫羧酶亞基的sucA基因(WO03/008614)，·來自sucABCD操縱子的、編碼2-酮戊二酸脫氫酶的二氫硫辛酸轉(zhuǎn)琥珀酸酶E2亞基的sucB基因(WO03/008614)，·來自sucABCD操縱子的、編碼琥珀酰-CoA合成酶的β-亞基的sucC基因(WO03/008615)，·來自sucABCD操縱子的、編碼琥珀酰-CoA合成酶的α-亞基的sucD基因(WO03/008615)，·編碼腺苷酸激酶的adk基因(Nucleic Acids Research13(19)7139-7151(1985))，·編碼具有類似陪伴蛋白功能的周質(zhì)蛋白的hdeA基因(Journal of Bacteriology175(23)7747-7748(1993))，·編碼具有類似陪伴蛋白功能的周質(zhì)蛋白的hdeB基因(Journal of Bacteriology 175(23)7747-7748(1993))，·編碼異檸檬酸脫氫酶的icd基因(Journal of BiologicalChemistry 262(22)10422-10425(1987))，·編碼周質(zhì)、結(jié)合半乳糖的轉(zhuǎn)運蛋白的mglB基因(Molecularand General Genetics 229(3)453-459(1991))，·編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶的lpd基因(European Journal ofBiochemistry 135(3)519-527(1983))，·編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E1組分的aceE基因(EuropeanJournal of Biochemistry133(1)155-162(1983))，·編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E2組分的aceF基因(EuropeanJournal of Biochemistry133(3)481-489(1983))，·編碼氨肽酶B的pepB基因(Journal of Fermentation andBioengineering 82392-397(1996))，·編碼醛脫氫酶(E.C.1.2.1.3)的aldH基因(Gene99(1)15-23(1991))，·編碼鐵貯藏同型蛋白(細(xì)菌鐵蛋白)的bfr基因(Journal ofBacteriology 171(7)3940-3947(1989))，·編碼尿苷磷酸化酶的udp基因(Nucleic Acids Research 17(16)6741(1989))，和·編碼具有σE因子活性的調(diào)控蛋白的rseB基因(MolecularMicrobiology 24(2)355-371(1997))。
此外，除過表達(dá)galP基因外，衰減尤其是關(guān)閉或減少一個或多個選自下列的基因的表達(dá)，對于生產(chǎn)L-氨基酸，尤其是L-蘇氨酸，可能是有利的·編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因(Journal of Bacteriology1694716-4721(1987))，·編碼蘋果酸脫氫酶(E.C.1.1.1.37)的mdh基因(Archivesin Microbiology 14936-42(1987))，·開放閱讀框(ORF)yjfA的基因產(chǎn)物(國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的登錄號AAC77180，WO02/29080)，·開放閱讀框(ORF)ytfP的基因產(chǎn)物(國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的登錄號AAC77179，WO02/29080)，·編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA基因(WO02/29080)，
·編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(WO02/36797)，·編碼異檸檬酸裂合酶的aceA基因(WO02/081722)，·編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的DgsA調(diào)控蛋白的dgsA基因(WO02/081721)，已知其名稱也為mlc基因，·編碼果糖阻遏蛋白的fruR基因(WO02/081698)，已知其名稱也為cra基因，·編碼38-因子的rpoS基因(WO01/05939)，已知其名稱也為katF基因，·編碼天冬氨酸銨裂合酶的aspA基因(WO03/008603)，和·編碼蘋果酸合酶A的aceB基因(WO03/008603)。
本文中的表達(dá)“衰減”描述了，通過例如利用弱啟動子或編碼具有較低活性的相應(yīng)酶或蛋白質(zhì)的基因或等位基因，或者使相應(yīng)酶或蛋白質(zhì)或基因失活，以及可選地結(jié)合這些方法，微生物中一或多種由相應(yīng)DNA編碼的酶或蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)活性或濃度的減少或關(guān)閉。
由于衰減措施，使相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度通常降低至起始微生物中的野生型蛋白質(zhì)活性或濃度的0至75％、0至50％、0至25％、0至10％或0至5％。
此外，除了過表達(dá)galP基因之外，還關(guān)閉不希望的副反應(yīng)對于生產(chǎn)L-氨基酸，尤其是L-蘇氨酸，可能是有利的。(Nakayama“Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms”，inOverproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編者)，Academic Press，London，UK，1982)根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的微生物可以用分批法、補料分批法或重復(fù)補料分批法培養(yǎng)。Chmiel的教科書(Bioprozesstechnik1.Einführung indie Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas的教科書(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))中給出了已知培養(yǎng)方法的概述。
所欲使用的培養(yǎng)基必須以適宜方式滿足特定菌株的需要。美國細(xì)菌學(xué)協(xié)會的手冊“Manual of Methods for General Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)中給出了有關(guān)不同微生物培養(yǎng)基的說明。
可以使用的適宜碳源有糖類和碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉以及任選的纖維素，油和脂肪例如大豆油、葵花油、花生油和椰子脂，脂肪酸例如棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸，醇類例如甘油和乙醇這樣的，和有機酸例如乙酸這樣的。這些物質(zhì)可以分別或作為混合物使用。
可以使用的氮源有，有機含氮化合物例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麥芽提取物、玉米漿、大豆粉和尿素，無機化合物例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。氮源可以分別或作為混合物使用。
可以使用的磷源有，磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應(yīng)的含鈉鹽。培養(yǎng)基還可以包含比如硫酸鎂或硫酸鐵這樣的生長所需的金屬鹽。最后，除上述提到的物質(zhì)外，還可以使用比如氨基酸和維生素這樣的基本生長物質(zhì)。培養(yǎng)基中還可以添加適宜的前體。上述提到的原料可以以單個混合物的形式添加到培養(yǎng)物中或者可以在培養(yǎng)過程中以適宜的方式給料。
通常在pH5.5至9.0，尤其是6.0至8.0下完成發(fā)酵。以適宜的方式使用比如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水這樣的堿性化合物或比如磷酸或硫酸這樣的酸性化合物來控制pH?？梢允褂帽热缰舅峋垡叶减ミ@樣的抗泡沫劑來控制泡沫形成?？梢韵蚺囵B(yǎng)基中添加以選擇性方式起作用的物質(zhì)例如抗生素，以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。為保持通氣條件，向培養(yǎng)基中導(dǎo)入氧氣或含氧氣體例如空氣。培養(yǎng)溫度通常為25℃至45℃，優(yōu)選為30℃至40℃。連續(xù)培養(yǎng)至已經(jīng)產(chǎn)生了最大量的L-氨基酸或L-蘇氨酸。這一目標(biāo)通常在10小時至160小時內(nèi)實現(xiàn)。
可以按照Spackman等人(Analytical Chemistry301190-1206(1958))所述通過在陰離子交換層析后進(jìn)行茚三酮衍生來完成L-氨基酸的分析，或者可以按照Lindroth等人(Analytical Chemistry 511167-1174(1979))所述通過反相HPLC來完成。
根據(jù)本發(fā)明的方法用于發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，例如L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-高絲氨酸和L-賴氨酸，尤其是L-蘇氨酸。
利用工作實施例，本發(fā)明在下文中得到了更為詳細(xì)的說明。
J.H.Miller(A short course in bacterial genetics(1992)，Cold Spring Harbor Laboratory Press)描述了大腸桿菌的基本培養(yǎng)基(M9)和完全培養(yǎng)基(LB)。根據(jù)Sambrook等人(Molecular Cloning-A Laboratory Manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)所描述的完成從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA以及所有涉及限制性、連接、Klenow和堿性磷酸酶處理的技術(shù)。除非另外描述，根據(jù)Chung等人所述(Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 862172-2175(1989))完成大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。
制備菌株和轉(zhuǎn)化體期間的培養(yǎng)溫度是37℃。
實施例1構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pTrc99AgalP利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和合成的寡核苷酸來擴增來自大腸桿菌K12的galP基因。從大腸桿菌K12 MG1655中的galP基因核苷酸序列開始(登錄號AE000377，Blattner等人(Science 2771453-1474(1997))，合成PCR引物。(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)。引物序列經(jīng)過修飾從而產(chǎn)生限制酶的識別位點。選擇XbaI的識別序列用于galP1引物，選擇HindIII的識別位點用于galP2引物，它們在以下所示核苷酸序列中用下劃線表示galP15′-CACAATCTAGATAAACCATATTGGAGGGCATC-3′(SEQ ID No.1)galP25′-GGGAGGAAGCTTGGGGAGATTAATC-3′(SEQ ID No.2)根據(jù)生產(chǎn)商的說明，利用“Qiagen Genomic-tips100/G”(QIAGEN，Hilden，Germany)分離用于PCR的染色體大腸桿菌K12MG1655 DNA。用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs GmbH，F(xiàn)rankfurt，Germany)，在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件(Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press)下利用特異引物可以擴增出大約1450bp大小的DNA片段(SEQ ID No.3)。
用酶XbaI和HindIII切割所擴增的galP片段，并與已經(jīng)用酶XbaI和HindIII消化過的載體pTrc99A(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)連接。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株TOP 10 One Shot(TOPOTA Cloning Kit，Invitrogen，Groningen，荷蘭)，在已經(jīng)用50μg/ml氨芐青霉素處理過的LB瓊脂上選擇含有質(zhì)粒的細(xì)胞。在質(zhì)粒DNA分離后，經(jīng)酶XbaI、HindIII和EcoRV的測試切割可以檢測到成功的克隆。該質(zhì)粒稱作pTrc99AgalP(附

圖1)。
實施例2用菌株MG442/pTrc99AgalP生產(chǎn)L-蘇氨酸生產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌菌株MG442描述于專利說明書US-A-4,278,765中，并保藏在俄羅斯國家工業(yè)微生物保藏所(VKPM，Moscow，Russia)，保藏號為CMIMB-1628。
用實施例1中描述的質(zhì)粒pTrc99AgalP和用載體pTrc99A轉(zhuǎn)化菌株MG442，在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇含有質(zhì)粒的細(xì)胞。在質(zhì)粒DNA分離后，經(jīng)酶HincII、BamHI和KpnI的測試切割可以檢測到成功的轉(zhuǎn)化。用這種方式制備菌株MG442/pTrc99AgalP和MG442/pTrc99A。然后，在具有以下組成的基本培養(yǎng)基上再次擴增所選擇出的單個克隆3.5g/l Na2HPO4*2H2O、1.5g/l KH2PO4、1g/l NH4Cl、0.1g/l MgSO4*7H2O、2g/l葡萄糖、20g/l瓊脂、50mg/l氨芐青霉素。在置于100ml錐形瓶中的10ml分批培養(yǎng)物中檢查L-蘇氨酸的生產(chǎn)。向其中添加具有以下組成的10ml預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基2g/l酵母提取物、10g/l(NH4)2SO4、1g/l KH2PO4、0.5g/l MgSO4*7H2O、15g/lCaCO3、20g/l葡萄糖、50mg/l氨芐青霉素，接種，并于37℃在KühnerAG(Birsfelden，瑞士)的ESR培養(yǎng)器上以180rpm培養(yǎng)16小時。然后將這些預(yù)培養(yǎng)物各250μl接種到10ml生產(chǎn)培養(yǎng)基(25g/l(NH4)2SO4、2g/l KH2PO4、1g/l MgSO4*7H2O、0.03g/l FeSO4*7H2O、0.018g/l MnSO4*1H2O、30g/l CaCO3、20g/l葡萄糖、50mg/l氨芐青霉素)中，于37℃培養(yǎng)48小時。以同樣的方式檢查起始菌株MG442的L-蘇氨酸生產(chǎn)，然而其中在培養(yǎng)基內(nèi)不添加氨芐青霉素。培養(yǎng)后，用Dr.Lange Co.(Düsseldorf，德國)的LP2W光度計在660nm的測量波長下測定培養(yǎng)物懸浮液的光密度(OD)。
最后，用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)的氨基酸分析儀，通過離子交換層析和采用茚三酮檢測的柱后反應(yīng)來測定在無菌過濾的培養(yǎng)物上清液中產(chǎn)生的L-蘇氨酸濃度。
表1給出了實驗結(jié)果。
表1
附圖簡述附圖1含有g(shù)alP基因的質(zhì)粒pTrc99AgalP圖譜涉及長度的數(shù)據(jù)視為近似數(shù)據(jù)。所使用的縮寫和名稱定義如下·Amp氨芐青霉素抗性基因·lacItrc啟動子中阻遏蛋白的基因·Ptrctrc啟動子區(qū)域，IPTG可誘導(dǎo)·galPgalP基因的編碼區(qū)域·5S5SrRNA區(qū)域·rrnBTrRNA終止子區(qū)域限制酶縮寫定義如下·BamHI來自解淀粉芽孢桿菌H(Bacillusamyloliquefaciens H)的限制性內(nèi)切酶·EcoRV來自大腸桿菌B946的限制性內(nèi)切酶·HincII來自流感嗜血桿菌(Haemophilus influence)RC的限制性內(nèi)切酶·HindIII來自流感嗜血桿菌的限制性內(nèi)切酶·KpnI來自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的限制性內(nèi)切酶·XbaI來自巴氏黃單胞菌(Xanthomonas badrii)(ATTC11672)的限制性內(nèi)切酶序列表<110>Degussa AG<120>利用腸桿菌科的菌株生產(chǎn)L-氨基酸的方法<130>020481 BT<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>32<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(32)<223>galP1<400>1cacaatctag ataaaccata ttggagggca tc 32<210>2<211>25<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(25)<223>galP2<400>2gggaggaagc ttggggagat taatc 25<210>3<211>1446<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>DNA片斷<222>(1)..(1446)<223>PCR產(chǎn)物<220>
<221>CDS<222>(33)..(1427)<223>galP編碼區(qū)
<400>3cacaatctag ataaaccata ttggagggca tc atg cct gac gct aaa aaa cag53Met Pro Asp Ala Lys Lys Gln1 5ggg cgg tca aac aag gca atg acg ttt ttc gtc tgc ttc ctt gcc gct101Gly Arg Ser Asn Lys Ala Met Thr Phe Phe Val Cys Phe Leu Ala Ala10 15 20ctg gcg gga tta ctc ttt ggc ctg gat atc ggt gta att gct ggc gca149Leu Ala Gly Leu Leu Phe Gly Leu Asp Ile Gly Val Ile Ala Gly Ala25 30 35ctg ccg ttt att gca gat gaa ttc cag att act tcg cac acg caa gaa197Leu Pro Phe Ile Ala Asp Glu Phe Gln Ile Thr Ser His Thr Gln Glu40 45 50 55tgg gtc gta agc tcc atg atg ttc ggt gcg gca gtc ggt gcg gtg ggc245Trp Val Val Ser Ser Met Met Phe Gly Ala Ala Val Gly Ala Val Gly60 65 70agc ggc tgg ctc tcc ttt aaa ctc ggg cgc aaa aag agc ctg atg atc293Ser Gly Trp Leu Ser Phe Lys Leu Gly Arg Lys Lys Ser Leu Met Ile75 80 85ggc gca att ttg ttt gtt gcc ggt tcg ctg ttc tct gcg gct gcg cca341Gly Ala Ile Leu Phe Val Ala Gly Ser Leu Phe Ser Ala Ala Ala Pro90 95 100aac gtt gaa gta ctg att ctt tcc cgc gtt cta ctg ggg ctg gcg gtg389Asn Val Glu Val Leu Ile Leu Ser Arg Val Leu Leu Gly Leu Ala Val105 110 115ggt gtg gcc tct tat acc gca ccg ctg tac ctc tct gaa att gcg ccg437Gly Val Ala Ser Tyr Thr Ala Pro Leu Tyr Leu Ser Glu Ile Ala Pro120 125 130 135gaa aaa att cgt ggc agt atg atc tcg atg tat cag ttg atg atc act485Glu Lys Ile Arg Gly Ser Met Ile Ser Met Tyr Gln Leu Met Ile Thr140 145 150atc ggg atc ctc ggt gct tat ctt tct gat acc gcc ttc agc tac acc533Ile Gly Ile Leu Gly Ala Tyr Leu Ser Asp Thr Ala Phe Ser Tyr Thr155 160 165
ggt gca tgg cgc tgg atg ctg ggt gtg att atc atc ccg gca att ttg581Gly Ala Trp Arg Trp Met Leu Gly Val Ile Ile Ile Pro Ala Ile Leu170 175 180ctg ctg att ggt gtc ttc ttc ctg cca gac agc cca cgt tgg ttt gcc629Leu Leu Ile Gly Val Phe Phe Leu Pro Asp Ser Pro Arg Trp Phe Ala185 190 195gcc aaa cgc cgt ttt gtt gat gcc gaa cgc gtg ctg cta cgc ctg cgt677Ala Lys Arg Arg Phe Val Asp Ala Glu Arg Val Leu Leu Arg Leu Arg200 205 210 215gac acc agc gcg gaa gcg aaa cgc gaa ctg gat gaa atc cgt gaa agt725Asp Thr Ser Ala Glu Ala Lys Arg Glu Leu Asp Glu Ile Arg Glu Ser220 225 230ttg cag gtt aaa cag agt ggc tgg gcg ctg ttt aaa gag aac agc aac773Leu Gln Val Lys Gln Ser Gly Trp Ala Leu Phe Lys Glu Asn Ser Asn235 240 245ttc cgc cgc gcg gtg ttc ctt ggc gta ctg ttg cag gta atg cag caa821Phe Arg Arg Ala Val Phe Leu Gly Val Leu Leu Gln Val Met Gln Gln250 255 260ttc acc ggg atg aac gtc atc atg tat tac gcg ccg aaa atc ttc gaa869Phe Thr Gly Met Asn Val Ile Met Tyr Tyr Ala Pro Lys Ile Phe Glu265 270 275ctg gcg ggt tat acc aac act acc gag caa atg tgg ggg acc gtg att917Leu Ala Gly Tyr Thr Asn Thr Thr Glu Gln Met Trp Gly Thr Val Ile280 285 290 295gtc ggc ctg acc aac gta ctt gcc acc ttt atc gca atc ggc ctt gtt965Val Gly Leu Thr Asn Val Leu Ala Thr Phe Ile Ala Ile Gly Leu Val300 305 310gac cgc tgg gga cgt aaa cca acg cta acg ctg ggc ttc ctg gtg atg1013Asp Arg Trp Gly Arg Lys Pro Thr Leu Thr Leu Gly Phe Leu Val Met315 320 325gct gct ggc atg ggc gta ctc ggt aca atg atg cat atc ggt att cac1061Ala Ala Gly Met Gly Val Leu Gly Thr Met Met His Ile Gly Ile His
330 335 340tct ccg tcg gcg cag tat ttc gcc atc gcc atg ctg ctg atg ttt att1109Ser Pro Ser Ala Gln Tyr Phe Ala Ile Ala Met Leu Leu Met Phe Ile345 350 355gtc ggt ttt gcc atg agt gcc ggt ccg ctg att tgg gta ctg tgc tcc1157Val Gly Phe Ala Met Ser Ala Gly Pro Leu Ile Trp Val Leu Cys Ser360 365 370 375gaa att cag ccg ctg aaa ggc cgc gat ttt ggc atc acc tgc tcc act1205Glu Ile Gln Pro Leu Lys Gly Arg Asp Phe Gly Ile Thr Cys Ser Thr380 385 390gcc acc aac tgg att gcc aac atg atc gtt ggc gca acg ttc ctg acc1253Ala Thr Asn Trp Ile Ala Asn Met Ile Val Gly Ala Thr Phe Leu Thr395 400 405atg ctc aac acg ctg ggt aac gcc aac acc ttc tgg gtg tat gcg gct1301Met Leu Asn Thr Leu Gly Asn Ala Asn Thr Phe Trp Val Tyr Ala Ala410 415 420ctg aac gta ctg ttt atc ctg ctg aca ttg tgg ctg gta ccg gaa acc1349Leu Asn Val Leu Phe Ile Leu Leu Thr Leu Trp Leu Val Pro Glu Thr425 430 435aaa cac gtt tcg ctg gaa cat att gaa cgt aat ctg atg aaa ggt cgt1397Lys His Val Ser Leu Glu His Ile Glu Arg Asn Leu Met Lys Gly Arg440 445 450 455aaa ctg cgc gaa ata ggc gct cac gat taa tctccccaag cttcctccc 1446Lys Leu Arg Glu Ile Gly Ala His Asp460<210>4<211>464<212>PRT<213>大腸桿菌<400>4Met Pro Asp Ala Lys Lys Gln Gly Arg Ser Asn Lys Ala Met Thr Phe1 5 10 15
Phe Val Cys Phe Leu Ala Ala Leu Ala Gly Leu Leu Phe Gly Leu Asp20 25 30Ile Gly Val Ile Ala Gly Ala Leu Pro Phe Ile Ala Asp Glu Phe Gln35 40 45Ile Thr Ser His Thr Gln Glu Trp Val Val Ser Ser Met Met Phe Gly50 55 60Ala Ala Val Gly Ala Val Gly Ser Gly Trp Leu Ser Phe Lys Leu Gly65 70 75 80Arg Lys Lys Ser Leu Met Ile Gly Ala Ile Leu Phe Val Ala Gly Ser85 90 95Leu Phe Ser Ala Ala Ala Pro Asn Val Glu Val Leu Ile Leu Ser Arg100 105 110Val Leu Leu Gly Leu Ala Val Gly Val Ala Ser Tyr Thr Ala Pro Leu115 120 125Tyr Leu Ser Glu Ile Ala Pro Glu Lys Ile Arg Gly Ser Met Ile Ser130 135 140Met Tyr Gln Leu Met Ile Thr Ile Gly Ile Leu Gly Ala Tyr Leu Ser145 150 155 160Asp Thr Ala Phe Ser Tyr Thr Gly Ala Trp Arg Trp Met Leu Gly Val165 170 175Ile Ile Ile Pro Ala Ile Leu Leu Leu Ile Gly Val Phe Phe Leu Pro180 185 190
Asp Ser Pro Arg Trp Phe Ala Ala Lys Arg Arg Phe Val Asp Ala Glu195 200 205Arg Val Leu Leu Arg Leu Arg Asp Thr Ser Ala Glu Ala Lys Arg Glu210 215 220Leu Asp Glu Ile Arg Glu Ser Leu Gln Val Lys Gln Ser Gly Trp Ala225 230 235 240Leu Phe Lys Glu Asn Ser Asn Phe Arg Arg Ala Val Phe Leu Gly Val245 250 255Leu Leu Gln Val Met Gln Gln Phe Thr Gly Met Asn Val Ile Met Tyr260 265 270Tyr Ala Pro Lys Ile Phe Glu Leu Ala Gly Tyr Thr Asn Thr Thr Glu275 280 285Gln Met Trp Gly Thr Val Ile Val Gly Leu Thr Asn Val Leu Ala Thr290 295 300Phe Ile Ala Ile Gly Leu Val Asp Arg Trp Gly Arg Lys Pro Thr Leu305 310 315 320Thr Leu Gly Phe Leu Val Met Ala Ala Gly Met Gly Val Leu Gly Thr325 330 335Met Met His Ile Gly Ile His Ser Pro Ser Ala Gln Tyr Phe Ala Ile340 345 350Ala Met Leu Leu Met Phe Ile Val Gly Phe Ala Met Ser Ala Gly Pro355 360 365
Leu Ile Trp Val Leu Cys Ser Glu Ile Gln Pro Leu Lys Gly Arg Asp370 375 380Phe Gly Ile Thr Cys Ser Thr Ala Thr Asn Trp Ile Ala Asn Met Ile385 390 395 400Val Gly Ala Thr Phe Leu Thr Met Leu Asn Thr Leu Gly Asn Ala Asn405 410 415Thr Phe Trp Val Tyr Ala Ala Leu Asn Val Leu Phe Ile Leu Leu Thr420 425 430Leu Trp Leu Val Pro Glu Thr Lys His Val Ser Leu Glu His Ile Glu435 440 445Arg Asn Leu Met Lys Gly Arg Lys Leu Arg Glu Ile Gly Ala His Asp450 455 460
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)L-氨基酸尤其是L-蘇氨酸的方法，它通過以下步驟完成a)發(fā)酵腸桿菌科的微生物，該微生物中的galP基因或編碼其的核苷酸序列是過表達(dá)的，且該微生物生產(chǎn)所希望的L-氨基酸，b)在培養(yǎng)基或微生物細(xì)胞中富集所希望的L-氨基酸，和c)分離所希望的L-氨基酸，其中一些或全部(≥0至100％)發(fā)酵液體培養(yǎng)基組分和/或生物質(zhì)可選地保留在產(chǎn)物中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中另外還使用過表達(dá)在所希望的L-氨基酸合成途徑中的其它基因的微生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中使用至少一些代謝途徑被關(guān)閉的微生物，所述代謝途徑減少所希望的L-氨基酸的生產(chǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過提高拷貝數(shù)來提高編碼galP基因的多核苷酸的過表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過改變啟動子來提高編碼galP基因的多核苷酸的過表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中發(fā)酵另外還同時過表達(dá)選自下列的一或多種基因的腸桿菌科微生物來生產(chǎn)L-氨基酸6.1編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶的thrABC操縱子，6.2編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，6.3編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因，6.4編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因，6.5編碼轉(zhuǎn)氫酶的pntA和pntB基因，6.6賦予高絲氨酸抗性的rhtB基因，6.7編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因，6.8賦予蘇氨酸抗性的rhtC基因，6.9編碼蘇氨酸輸出蛋白的thrE基因，6.10編碼谷氨酸脫氫酶的gdhA基因，6.11編碼葡糖激酶的glk基因，6.12編碼DNA結(jié)合蛋白HLP-II的hns基因，6.13編碼葡糖磷酸變位酶的pgm基因，6.14編碼果糖二磷酸醛縮酶的fba基因，6.15編碼磷酸組氨酸蛋白己醣磷酸轉(zhuǎn)移酶的ptsH基因，6.16編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的酶I的ptsI基因，6.17編碼葡萄糖-特異性IIA組分的crr基因，6.18編碼葡萄糖-特異性IIBC組分的ptsG基因，6.19編碼亮氨酸調(diào)節(jié)子中的調(diào)控蛋白的lrp基因，6.20編碼全局調(diào)控蛋白Csr的csrA基因，6.21編碼fad調(diào)節(jié)子中的調(diào)控蛋白的fadR基因，6.22編碼中央中間代謝中的調(diào)控蛋白的iclR基因，6.23編碼10KDa陪伴蛋白的mopB基因，6.24編碼烷基氫過氧化物還原酶的小亞基的ahpC基因，6.25編碼烷基氫過氧化物還原酶的大亞基的ahpF基因，6.26編碼半胱氨酸合酶A的cysK基因，6.27編碼cys調(diào)節(jié)子中的調(diào)控蛋白的cysB基因，6.28編碼NADPH亞硫酸鹽還原酶中的黃素蛋白的cysJ基因，6.29編碼NADPH亞硫酸鹽還原酶中的血蛋白的cysI基因，6.30編碼腺苷酰硫酸還原酶的cysH基因，6.31編碼pho調(diào)節(jié)子中的正調(diào)控蛋白PhoB的phoB基因，6.32編碼pho調(diào)節(jié)子中的傳感蛋白的phoR基因，6.33編碼細(xì)胞外膜中的E蛋白的phoE基因，6.34編碼受果糖刺激的丙酮酸激酶I的pykF基因，6.35編碼6-磷酸果糖激酶II的pfkB基因，6.36編碼麥芽糖轉(zhuǎn)運中的周質(zhì)結(jié)合蛋白的malE基因，6.37編碼超氧化物歧化酶的sodA基因，6.38編碼具有抗-σE活性的膜蛋白的rseA基因，6.39編碼σE因子中的全局調(diào)控蛋白的rseC基因，6.40編碼2-酮戊二酸脫氫酶的脫羧酶亞基的sucA基因，6.41編碼2-酮戊二酸脫氫酶的二氫硫辛酸轉(zhuǎn)琥珀酸酶E2亞單位的sucB基因，6.42編碼琥珀酰-CoA合成酶的β-亞基的sucC基因，6.43編碼琥珀酰-CoA合成酶的α-亞基的sucD基因，6.44編碼腺苷酸激酶的adk基因，6.45編碼具有類似陪伴蛋白功能的周質(zhì)蛋白的hdeA基因，6.46編碼具有類似陪伴蛋白功能的周質(zhì)蛋白的hdeB基因，6.47編碼異檸檬酸脫氫酶的icd基因，6.48編碼周質(zhì)、結(jié)合半乳糖的轉(zhuǎn)運蛋白的mglB基因，6.49編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶的lpd基因，6.50編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E1組分的aceE基因，6.51編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E2組分的aceF基因，6.52編碼氨肽酶B的pepB基因6.53編碼醛脫氫酶的aldH基因，6.54編碼鐵貯藏同型蛋白的bfr基因，6.55編碼尿苷磷酸化酶的udp基因，和6.56編碼具有σE因子活性的調(diào)控蛋白的rseB基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中為生產(chǎn)L-氨基酸發(fā)酵腸桿菌科的微生物，這些微生物中另外還衰減尤其是關(guān)閉了一個或多個選自下列的基因，或降低了它們的表達(dá)7.1編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因，7.2編碼蘋果酸脫氫酶的mdh基因，7.3開放閱讀框(ORF)yjfA的基因產(chǎn)物，7.4開放閱讀框(ORF)ytfP的基因產(chǎn)物，7.5編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA基因，7.6編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因，7.7編碼異檸檬酸裂合酶的aceA基因，7.8編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的DgsA調(diào)控蛋白的dgsA基因，7.9編碼果糖阻遏蛋白的fruR基因，7.10編碼σ38-因子的rpoS基因，7.11編碼天冬氨酸銨裂合酶的aspA基因，和7.12編碼蘋果酸合酶A的aceB基因。
8.來自腸桿菌科，尤其是來自埃希氏屬的微生物，其galP基因或編碼該基因的核苷酸序列過表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的微生物，其中這些微生物產(chǎn)生L-蘇氨酸。
全文摘要
本發(fā)明提供生產(chǎn)L－氨基酸尤其是L－蘇氨酸的方法，它通過以下步驟完成a)發(fā)酵腸桿菌科的微生物，該微生物中的galP基因或編碼其的核苷酸序列是過表達(dá)的，且該微生物生產(chǎn)所希望的L－氨基酸，b)在培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中富集所希望的L－氨基酸，和c)分離所希望的L－氨基酸。
文檔編號C12N15/63GK1768147SQ200480008435
公開日2006年5月3日 申請日期2004年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月1日
發(fā)明者M·里平戈 申請人:底古薩股份公司