專利名稱：一種吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶的熱穩(wěn)定性突變體及其高通量篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的可溶性吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶熱穩(wěn)定性提高的突變體以及篩選熱穩(wěn)定性突變體的高通量篩選方法，屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血糖濃度測(cè)定在糖尿病的臨床診斷和管理中極為重要。目前，我國(guó)約有成年糖尿病患者9700萬(wàn)人，還有1. 48億糖尿病前期患者，已經(jīng)超越西方發(fā)達(dá)國(guó)家，成為全球糖尿病人最多的國(guó)家，糖尿病將是未來(lái)我國(guó)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，而血糖監(jiān)測(cè)越來(lái)越受到重視。血糖檢測(cè)在自我診斷檢測(cè)市場(chǎng)中占據(jù)了近16%的市場(chǎng)份額，資料顯示，目前全球糖尿病患者已達(dá)3. 66億人，全世界血糖檢測(cè)市場(chǎng)容量為50億美元，90%歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家的糖尿病患者通過(guò)血糖儀進(jìn)行自我監(jiān)測(cè)。可溶性吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶(EC 1.1. 5. 2，簡(jiǎn)稱s-GDH)，是一種可以將葡萄糖氧化為葡萄糖酸的氧化還原酶，因此該類型酶可用于檢測(cè)血糖。吡咯喹啉醌(PQQ)是繼黃素核苷酸(FMN、FAD)和煙酰胺核苷酸(NAD、NADP)后的第三種新型輔酶。后來(lái)又相繼發(fā)現(xiàn)一些與PQQ結(jié)構(gòu)類似的輔酶topaquinone (TPQ) Uysine tymsylqllinone (LTQ)、tryptophantryptophylquinone (TTQ)，這四種輔酶并稱為醌式輔酶，以PQQ、TPQ、LTQ、TTQ為輔酶的氧化還原酶統(tǒng)稱為醌蛋白酶或醌酶。吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶是一類主要的以PQQ為輔酶的醌蛋白，因其獨(dú)特的性質(zhì)而備受關(guān)注。醌蛋白廣泛存在于革蘭陰性菌的胞外周質(zhì)中，部分溶于胞外周質(zhì)，部分與細(xì)胞膜的外表面相連，組成了一個(gè)與細(xì)胞膜上呼吸鏈相偶聯(lián)的胞外周質(zhì)氧化還原系統(tǒng)，傳遞電子到細(xì)胞膜上的電子受體。這種胞外周質(zhì)氧化還原系統(tǒng)的特征是縮短了電子傳遞的路徑，減少了底物氧化和產(chǎn)物釋放所需的能量。吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶因其存在的部位不同，又分為膜結(jié)合型即m-GDH 和水溶型即s-GDH。m-GDH存在于多種革蘭陰性菌中，如不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬和醋酸菌屬的細(xì)菌，位于這些細(xì)菌的細(xì)胞膜外表面，可直接氧化D-葡萄糖生成脂類或葡萄糖酸。該酶是單亞基組成的醌蛋白，只由一條87kD的肽鏈構(gòu)成，有5個(gè)穿膜結(jié)構(gòu)，為高度疏水。其底物專一性較高，除了葡萄糖可以氧化己糖、戊糖等單糖，但不會(huì)氧化二糖。s-GDH是來(lái)源于醋酸鈣不動(dòng)桿菌的可溶性醌蛋白，發(fā)現(xiàn)于醋酸鈣不動(dòng)桿菌的周質(zhì)空間內(nèi)，目前只在不動(dòng)桿菌屬中有發(fā)現(xiàn)。s-GDH被證明是區(qū)別于m-GDH的第二種PQQ依賴的葡萄糖脫氫酶，且二者同源性很低。該酶是同型二聚體，每個(gè)亞基的相對(duì)分子質(zhì)量為50，000，N端是一個(gè)由對(duì)個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，在分泌到胞外周質(zhì)中后被切除。該酶不參與醋酸鈣不動(dòng)桿菌中的呼吸鏈，生理學(xué)功能未知。該酶可以催化各種單糖和二糖氧化成相應(yīng)的酮，酮再進(jìn)一步水解成醛糖酸，并且s-GDH可以將電子提供給PMS (吩嗪硫酸甲酯)、DCIP (2，6- 二氯靛酚)、 WB(ffurster氏藍(lán))短鏈泛酸如泛醌Ql和泛醌Q2以及某些人工電子受體如N-甲基二甲基苯基吡唑酮硫酸甲酯和導(dǎo)電聚合物等。
s-GDH與其他的葡萄糖脫氫酶和葡萄糖氧化酶相比，具有極高的反應(yīng)活性，反應(yīng)靈敏；而且輔酶與蛋白結(jié)合緊密不需反應(yīng)中額外添加輔酶(如NAD)；此外，反應(yīng)過(guò)程中氧氣不會(huì)作為電子的受體而不受氧分壓干擾及廣泛的人工電子受體特異性。這些優(yōu)點(diǎn)使s-GDH在血糖檢測(cè)以及微體積、快速響應(yīng)的葡萄糖傳感器等方面有著重要作用和應(yīng)用。盡管使用s-GDH有上述討論的優(yōu)點(diǎn)，但是其熱穩(wěn)定性較差，在使用過(guò)程中如果遇到較高溫度的環(huán)境很容易失活。近來(lái)，針對(duì)熱穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，Sode等在用PCR方法進(jìn)行了一系列的定點(diǎn)突變，選擇多肽鏈側(cè)鏈基團(tuán)表面231位的絲氨酸殘基分別代之以半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、天門冬氨酸、谷氨酰胺、組氨酸和賴氨酸，都使酶的穩(wěn)定性得到了一定程度的提高，其中以Ser231LyS在保持高活力的前提下穩(wěn)定性增加最明顯，與野生型相比，55°C半衰期提高了 8倍，但仍然保持其原有酶活力。根據(jù)通過(guò)增加兩個(gè)亞基之間的結(jié)合力而提高穩(wěn)定性的原理，采用的其他方法有①采用戊二醛將兩個(gè)亞基的C、N端進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，55°C半衰期達(dá)到63min ；②利用基因工程的方法，在兩個(gè)亞基的中間添加了一段連結(jié)肽 Glu-Leu-Gly-Thr-Arg-Gly-Ser-Ser-Arg-Val-Asp-Leu-Gln,半衰期 16min ；③在兩個(gè)亞基的接觸表面進(jìn)行突變，Asn340Phe/Tyr418Ile和Thr416Val/Thr417Val，增加亞基間的疏水作用力，半衰期16min。選擇sPQQGDH多肽鏈側(cè)鏈基團(tuán)表面415位的絲氨酸殘基代之以半胱氨酸，突變后的sPQQGDH與野生型相比，在保持其原有的催化活力的前提下，55°C熱穩(wěn)定性增加了 30倍，70°C孵育IOmin后，Ser415Cys仍然保持著90%的活力。定向進(jìn)化屬于非理性設(shè)計(jì)，已經(jīng)成為體外改造酶分子的一種策略，不用事先了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、保守位點(diǎn)、催化機(jī)制等因素，而是人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，在體外模擬達(dá)爾文進(jìn)化過(guò)程，通過(guò)建立隨機(jī)突變文庫(kù)或重組基因庫(kù)，再經(jīng)過(guò)合適的篩選，獲得具有性質(zhì)明顯提高的蛋白質(zhì)。酶定向進(jìn)化技術(shù)在一定程度上彌補(bǔ)了定點(diǎn)突變技術(shù)的不足，具有很大的應(yīng)用價(jià)值?？扇苄云咸烟敲摎涿傅膬?yōu)良性質(zhì)使其在血糖檢測(cè)和葡萄糖傳感器等方面的應(yīng)用有著極大的潛能，但是較差的熱穩(wěn)定性則限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用，因此通過(guò)生物技術(shù)手段提高它的熱穩(wěn)定性成為s-GDH研究中的一個(gè)重要方向，得到高熱穩(wěn)定性的可溶性吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶具有重要的意義，不僅可拓寬酶的工業(yè)應(yīng)用范圍，而且可研究酶結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性的關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)市場(chǎng)上可溶性葡萄糖脫氫酶熱穩(wěn)定性差的問(wèn)題，發(fā)明的任務(wù)是通過(guò)定向進(jìn)化技術(shù)與高通量的篩選方法提供與野生型酶相比熱穩(wěn)定性得到顯著提升的新型s-GDH突變體或變異體。本發(fā)明的技術(shù)方案一種熱穩(wěn)定性提高的S-GDH突變體，其特征在于野生型S-GDH 位于111，263，270，331，347，416位中的氨基酸中有一個(gè)或多個(gè)被取代，其中這些位置對(duì)應(yīng)于由醋酸鈣不動(dòng)桿菌Acinetobactercalcoaceticus L. M. D. 79. 41的s-GDH野生型序列 (SEQ ID NO 2)已知的氨基酸位置。s-GDH突變體的高通量篩選方法，通過(guò)易錯(cuò)PCR構(gòu)建 s-GDH的高容量突變文庫(kù)，利用浸有有色底物的濾紙?jiān)诰淦桨迳线M(jìn)行原位篩選，并結(jié)合菌落直接轉(zhuǎn)化法獲得s-GDH克隆子，得到s-GDH熱穩(wěn)定性提高的突變體。與野生型S-GDH相比，所述的S-GDH突變體的熱穩(wěn)定性獲得了顯著提高。得到高熱穩(wěn)定性的可溶性吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶為進(jìn)一步擴(kuò)大葡萄糖脫氫酶的應(yīng)用范圍奠定了基礎(chǔ)。編碼本發(fā)明的s-GDH突變蛋白的多核苷酸序列以及含這種多核苷酸序列的表達(dá)載體和含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞也是本發(fā)明的方案。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的突變體在葡萄糖檢測(cè)方法中的用途，尤其是在通過(guò)測(cè)試條裝置或用生物傳感器進(jìn)行的葡萄糖檢測(cè)方法。


圖1 含有野生型或s-GDH突變體的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)2 易錯(cuò)PCR的瓊脂糖凝膠電泳3 定向進(jìn)化篩選示意4 野生型及s-GDH突變體在55 °C的熱穩(wěn)定性分析
具體實(shí)施例方式具有葡萄糖脫氫酶活性(膜結(jié)合型和可溶型)的兩種完全不同的醌蛋白酶類型同被分組在EC 1. 1. 5. 2下，但這兩種類型的酶并不相關(guān)。對(duì)于本發(fā)明而言，只有可溶型葡萄糖脫氫酶s-GDH是有關(guān)的，下文討論其改良變體。本領(lǐng)域知道，s-GDH的野生型DNA序列可從不動(dòng)桿菌屬(AcinetcAacter)的菌株中分離出來(lái)。最優(yōu)先的是從醋酸鈣不動(dòng)桿菌菌株LMD79. 41中分離出來(lái)。該野生型s-GDH的 DNA序列及多肽序列分別在SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中給出。本發(fā)明的重組載體是表達(dá)載體，可以根據(jù)表達(dá)及純化的需要等目的使用適當(dāng)?shù)妮d體，例如pET系列、pQE系列、pMAL系列、pGEX系列等適于大腸桿菌的表達(dá)載體或分別適于枯草菌等其他原核細(xì)胞、酵母、霉菌等絲狀菌的表達(dá)載體。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，例如在制備s-GDH時(shí)，可以使用大腸桿菌、枯草菌等其他原核細(xì)胞、酵母、霉菌等絲狀菌等。上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以通過(guò)采用電穿孔法、氯化鈣法等公知的方法將重組載體導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行制備。作為重組載體及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的具體例中，可以舉出下述實(shí)施例中給出的重組載體pET28-gdh和由此載體得到的轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)。隨著創(chuàng)建基因文庫(kù)方法的不斷建立和完善，建立一個(gè)突變庫(kù)已變得很常規(guī)，而建立一個(gè)合適的高通量篩選方法卻變得非常關(guān)鍵，建立一個(gè)通用的高通量篩選方法目前仍是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。在過(guò)去幾年，出現(xiàn)了許多有應(yīng)用價(jià)值的篩選方法。催化活性的選擇往往是通過(guò)表型或在固相和微孔中進(jìn)行篩選。選擇壓力的使用往往導(dǎo)致突變體中出現(xiàn)不影響催化活性的突變。本發(fā)明目的篩選熱穩(wěn)定性提高的突變體，因此選擇熱處理作為選擇壓力。s-GDH為胞內(nèi)酶，若要通過(guò)平板直接篩選則需要以細(xì)胞為單位進(jìn)行酶活反應(yīng)，預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3) /pET28-gdh也表現(xiàn)出與s_GDH相同的酶反應(yīng)活性，可以使反應(yīng)底物溶液的顏色褪去。除此之外，由于pET28a載體會(huì)有少量的泄露表達(dá)，當(dāng)用可以使表達(dá)的s-GDH形成有活性的全酶的篩選平板培養(yǎng)時(shí)，平板上的菌落表達(dá)出一定的酶活性。以上兩點(diǎn)決定了可以通過(guò)底物顏色變化進(jìn)行原位篩選。
由于熱處理過(guò)程中菌體大部分已死亡，正常接種無(wú)法生長(zhǎng)，為了獲得陽(yáng)性突變子， 可以采用平板影印，原位PCR或菌落直接轉(zhuǎn)化等方法，本發(fā)明采用菌落直接轉(zhuǎn)化法。對(duì)于本發(fā)明而言，采用菌落直接轉(zhuǎn)化法獲得陽(yáng)性突變子的克隆。熱處理使得部分菌體裂解，所含質(zhì)粒釋放，通過(guò)直接將熱處理失活菌落轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，使陽(yáng)性突變子的質(zhì)粒得到轉(zhuǎn)化，從而得到其克隆子。使野生型或s-GDH突變體在宿主細(xì)胞中表達(dá)后，為了從培養(yǎng)物中分離純化得到目的蛋白，可以組合公知的分離操作進(jìn)行分離。例如可以舉出用超聲波處理、酶消化、鹽析或溶劑沉淀法、透析、離心、超濾、凝膠過(guò)濾、SDS-PAGE、離子交換色譜法、親和色譜法等。本實(shí)驗(yàn)的具體方案是利用野生型或s-GDH突變體C端融合表達(dá)的His標(biāo)簽進(jìn)行親和純化。由于大腸桿菌沒(méi)有合成PQQ的能力，只能得到sPQQGDH的重組酶蛋白，因此測(cè)定酶活之前需要添加相應(yīng)的輔酶輔基以形成有功能活性的全酶。向純酶或粗酶的酶液加入一定濃度的PQQ以及Ca2+，使輔酶與酶蛋白完全的結(jié)合即形成有活性的全酶溶液，可用酶活測(cè)定反應(yīng)。如上所述，s-GDH可以利用多種電子受體，如PMS (吩嗪硫酸甲酯)、DCIP 0，6-二氯靛酚)、WB (ffurster氏藍(lán))短鏈泛酸如泛醌Ql和泛醌Q2以及某些人工電子受體如N-甲基二甲基苯基吡唑酮硫酸甲酯和導(dǎo)電聚合物。通過(guò)這些電子受體對(duì)s-GDH氧化葡萄糖的活性進(jìn)行間接測(cè)定。本發(fā)明采用PMS和DCIP對(duì)s_GDH活性進(jìn)行測(cè)定。s-GDH氧化葡萄糖的酶活測(cè)定原理如下D-Glucose+ox-PMS — D-glucono- δ-lactone+re-PMSre-PMS+ox-DCIP — ox-PMS+re-DCIP氧化態(tài)的DCIP溶液為藍(lán)色，在600nm下有吸光值，而還原態(tài)的DCIP溶液為無(wú)色， 因此當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，藍(lán)色為慢慢褪去，相應(yīng)的0D_值會(huì)逐漸減少，通過(guò)0D_值的變化對(duì)酶活進(jìn)行測(cè)定計(jì)算。一個(gè)酶活單位(U)為25 °C條件下，在Imin內(nèi)能夠使Iymol的葡萄糖氧化(或 Iumol DCIP還原)的酶量。單位體積酶溶液中酶活單位的計(jì)算公式如下Enzyme activity (U/ml) = (( Δ ODtest- Δ ODblank) X df X Vt) / (tminX kX Vs)tmin:反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)度Omin)Vt 總的反應(yīng)體積Oml)Vs 加入的酶液體積(0. Olml)k =DCIP 在 600nm 下的吸光系數(shù)(1/ μ Μ)df 酶液稀釋倍數(shù)本領(lǐng)域知道，穩(wěn)定性可涉及不同方面，分別例如儲(chǔ)存溫度或儲(chǔ)存時(shí)間。短期溫度應(yīng)力模型常用于評(píng)價(jià)穩(wěn)定性。本發(fā)明的穩(wěn)定性以此短期溫度應(yīng)力模型評(píng)價(jià)，因此稱為熱穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定性通過(guò)檢測(cè)樣品的無(wú)應(yīng)力和有應(yīng)力的s-GDH酶活性來(lái)測(cè)定。通過(guò)將無(wú)應(yīng)力樣品活性設(shè)定為100%，應(yīng)力處理后的剩余活性可以百分率計(jì)算。對(duì)于具體的野生型或s-GDH突變體，選擇65°C處理30分鐘或是測(cè)定55°C下的半衰期。使用這些條件，65°C處理30分鐘下野生型s-GDH剩下其原始活性在15%以下，而s-GDH突變體在實(shí)施此短期應(yīng)力模型后剩下初始酶活的大大高于15%。本發(fā)明最后得到的突變s-GDH熱穩(wěn)定性顯著提升。由于新型s-GDH的提升的熱穩(wěn)定性，所以有可能使各種應(yīng)用領(lǐng)域中的葡萄糖測(cè)定取得顯著技術(shù)進(jìn)步。本發(fā)明的改良型s-GDH突變體可以巨大優(yōu)勢(shì)用于生物樣品中葡萄糖的檢測(cè)，尤其是通過(guò)測(cè)試條裝置或通過(guò)生物傳感器進(jìn)行的檢測(cè)。本發(fā)明的改良s-GDH變異體的主要應(yīng)用之一是用于測(cè)試條，以監(jiān)測(cè)糖尿病患者的血糖水平。如上所述，s-GDH對(duì)氧的不敏感性是超越葡萄糖氧化酶的巨大優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)在具有提高的熱穩(wěn)定性的新型s-GDH變異體，可更好的儲(chǔ)存和應(yīng)用。本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的s-GDH突變體檢測(cè)、測(cè)定或測(cè)量樣品中葡萄糖的方法。尤其優(yōu)選的是，用于檢測(cè)樣品中葡萄糖的改進(jìn)方法的特征在于，使用傳感器或測(cè)試條裝置進(jìn)行葡萄糖的所述檢測(cè)、測(cè)定或測(cè)量。用于檢測(cè)或測(cè)量樣品中葡萄糖的裝置也發(fā)球本發(fā)明范圍，所述裝置包含符合本發(fā)明的s-GDH突變體以及所述測(cè)量所需要的其他試劑。熱穩(wěn)定性提高的本發(fā)明s-GDH突變體還可以非常有利地用于生物傳感器中，以在線監(jiān)測(cè)樣品中或反應(yīng)器中的葡萄糖。對(duì)于此目的，所述s-GDH突變體例如可用于包被具有鋨絡(luò)合物的氧不敏感玻璃電極，以更加準(zhǔn)確地測(cè)定葡萄糖濃度。通過(guò)以下步驟進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，步驟1易錯(cuò)PCR本發(fā)明采用GeneMorph II易錯(cuò)PCR試劑盒進(jìn)行突變，按說(shuō)明書所述，突變率與所采用的模板加入的量及PCR循環(huán)數(shù)有關(guān)，模板量越多，循環(huán)數(shù)越少，突變率越低，反之則突變率越高。以含野生型s-GDH基因(SEQ ID NO 2)的重組載體pET28_gdh (如圖1)為模板，以 F(5~-GCCCATGGAAAACATTTATTGGCT-3~)( = SEQ ID NO 5)和 R(5，-GGAAGCTTATACATAGCCTTATAGG-3") ( = SEQ ID NO 6)為引物進(jìn)行易錯(cuò)PCR，采用50 μ L反應(yīng)體系如下，60ng/ μ L pET28_gdh 5 μ L ；250ng/ yL 引物 F 0. 5 μ L ；250ng/ μ L 引物 R 0. 5 μ L ；IOXMutazyme II 緩沖液 5 μ L ；40mM dNTP 1 μ L ；Mutazyme II DNA 聚合酶 1 μ L ；ddH20 37 yL。PCR條件為95°C預(yù)變性:3min ；32個(gè)循環(huán)_95°C變性40s，56°C退火40s，72°C延伸1. 5min ；72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物通過(guò)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2。 步驟2構(gòu)建高容量突變文庫(kù) 將易錯(cuò)PCR產(chǎn)物電泳后利用DNA膠回收試劑盒(Axyft^p DNA Gel ExtractionKit)進(jìn)行切膠回收并與載體pED8分別進(jìn)行Ncol/Hindlll的雙酶切反應(yīng)。酶切后回收的片段通過(guò)260nm處吸光度值進(jìn)行濃度測(cè)定。將目的片段與載體片段按照物質(zhì)的量比為10 1的比例混合，利用T4連接酶在12°C條件下連接10h。將連接產(chǎn)物利用PCR回收試劑盒(Axyft^p PCR cleanup Kit)進(jìn)行除鹽回收，最后以10 μ L去離子水溶解，以防止連接過(guò)程中緩沖液的離子對(duì)電轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響。然后將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化高效感受態(tài)細(xì)胞Ε. coliBL21 (DE3)，電擊條件200 Ω ,25 μ F, 2. 5kV。將復(fù)原細(xì)胞均勻的涂布于篩選平板上，37°C培養(yǎng)12 16h，待菌落長(zhǎng)出。篩選平板0. 5%酵母粉(Yeast Extract)，1 %胰蛋白胨(Tryptone)，1 %氯化鈉，IOmM氯化鈣，1. 5%瓊脂粉，混勻在121°C滅菌20min，冷卻至55 °C左右，加入終濃度30 μ g/ml卡那霉素以及ImM經(jīng)過(guò)濾滅菌的PQQ，倒平板。步驟3高通量篩選熱穩(wěn)定性突變體利用平板對(duì)S-GDH熱穩(wěn)定性突變文庫(kù)進(jìn)行高通量的篩選，具體方法如下1)將新開(kāi)封的濾紙?jiān)跓o(wú)菌操凈臺(tái)內(nèi)按平板大小的直徑進(jìn)行裁剪備用；2)配制酶反應(yīng)底液，IOmM MOPS (pH 7. 0)，20mM葡萄糖，0. 6mM PMS, 0. 3mM DCIP,混合均勻；3)將突變文庫(kù)置于60°C的烘箱內(nèi)熱處理30分鐘，然后冷卻至室溫；4)將剪裁過(guò)的濾紙完全浸潤(rùn)反應(yīng)液，然后將其小心鋪于突變文庫(kù)的平板上^后拿起。濾紙上與菌體接觸的部分會(huì)發(fā)生酶反應(yīng)，就會(huì)出現(xiàn)褪色出現(xiàn)白色的斑點(diǎn)；若由于熱處理導(dǎo)致酶已失活，則菌落會(huì)被染至深藍(lán)色，而其對(duì)應(yīng)的濾紙部分不會(huì)發(fā)生顏色變化，因此根據(jù)這一顏色變化，仍可使濾紙褪色的菌落則有可能是具有高熱穩(wěn)定性的突變位點(diǎn)；5)由于熱處理過(guò)程中菌體大部分已死亡，正常接種無(wú)法生長(zhǎng)，因此將挑出的可能的突變子直接加入到BL21(DE3)的感受態(tài)中，利用熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，(即采用落直接轉(zhuǎn)化法獲得s-GDH克隆子)；6)將二次轉(zhuǎn)化后長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行熱穩(wěn)定性驗(yàn)證復(fù)篩7)將復(fù)篩得到的穩(wěn)定性有提高的突變菌株進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，由生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下，
權(quán)利要求
1.一種熱穩(wěn)定性提高的S-GDH突變體，其特征在于野生型S-GDH位于111，沈3，270， 331，347，416位中的氨基酸中有一個(gè)或多個(gè)被取代，其中這些位置對(duì)應(yīng)于由醋酸鈣不動(dòng)桿菌Acinetobactercalcoaceticus L. M. D. 79. 41的s-GDH野生型序列已知的氨基酸位置。
2.如權(quán)利要求1所述的s-GDH突變體，其特征在于野生型s-GDH中位于111位的天冬氨酸被谷氨酸取代，位于263位的甘氨酸被半胱氨酸取代，位于270位的谷氨酰胺被組氨酸取代，位于331位的蘇氨酸被甲硫氨酸取代，位于347位的絲氨酸被脯氨酸取代，位于416 位的蘇氨酸被異亮氨酸取代。
3.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼權(quán)利要求2的s-GDH突變體。
4.一種重組載體，其特征在于載有權(quán)利要求3所述的分離的多核苷酸。
5.一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于由權(quán)利要求4所述的重組載體轉(zhuǎn)化而制成。
6.一種應(yīng)用權(quán)利要求3的s-GDH突變體檢測(cè)、測(cè)定或測(cè)量樣品中葡萄糖的方法，所述方法包括使所述樣品與所述突變體接觸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征還在于使用傳感器或試紙條裝置來(lái)進(jìn)行葡萄糖的所述檢測(cè)、測(cè)定或測(cè)量。
8.一種用于檢測(cè)或測(cè)量樣品中的葡萄糖的裝置，所述裝置包括權(quán)利要求2中的s-GDH 突變體。
9.一種高通量篩選如權(quán)利要求1所述的s-GDH突變體的方法，其特征在于利用浸有有色底物的濾紙?jiān)诰淦桨迳线M(jìn)行原位篩選。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的高通量篩選s-GDH突變體的方法，篩選得到的陽(yáng)性突變子通過(guò)菌落直接轉(zhuǎn)化法得到其克隆子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種定向改造可溶性吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶(s-GDH)的分子結(jié)構(gòu)，并采用高通量技術(shù)篩選熱穩(wěn)定性突變體的方法。其特征在于通過(guò)易錯(cuò)PCR構(gòu)建s-GDH的高容量突變文庫(kù)，利用浸有有色底物的濾紙?jiān)诰淦桨迳线M(jìn)行原位篩選，并結(jié)合菌落直接轉(zhuǎn)化法，獲得s-GDH熱穩(wěn)定性提高的突變體。與野生型s-GDH相比，所述的s-GDH突變體的熱穩(wěn)定性獲得了顯著提高。得到高熱穩(wěn)定性的可溶性吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶為進(jìn)一步擴(kuò)大葡萄糖脫氫酶的應(yīng)用范圍奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/54GK102559624SQ20121005498
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月5日
發(fā)明者于怡, 徐志南, 朱建忠, 楊葉東, 黃磊 申請(qǐng)人:浙江德清匯寧生物科技有限公司