一種共表達(dá)羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌系統(tǒng)的構(gòu)建的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種共表達(dá)羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的重組菌E.coil BL21(pETDuet-Sygdh-Sys1)，并且公開了其構(gòu)建方法。其SyS1酶活力為3.7U/g，SyGDH酶活力為44.1U/g。它避免了添加昂貴的純酶和輔酶NADPH，只需添加低成本的輔酶NADP+就可以使得輔酶NADPH高效再生，大大降低了生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種共表達(dá)羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌系統(tǒng)的 構(gòu)建

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種共表達(dá)羰基還原酶基因（Sysl)和葡萄糖脫氫酶基因（Sygdh)的 重組大腸桿菌系統(tǒng)的構(gòu)建，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 手性醇即含有手性醇羥基的一類化合物，在手性藥物、香料、農(nóng)藥等物質(zhì)的合成方 面有著重要的作用，如（R)-2_氯-1-(3-氯苯基）乙醇（(R)-CCE)是一種重要的手性化合 物，是合成多種β3-腎上腺素能受體（AR)激動劑（SR-58611A、TAK-677)的重要手性中間 體。近年來有關(guān)（R)-CCE的合成一直是國內(nèi)外的熱點，該類化合物的制備方法主要包括化 學(xué)法和生物法，而每種方法又有拆分法和合成法。拆分法的缺點是最大收率不超過50% ; 化學(xué)合成法的收率在70?90%，對映體過量（e. e.)值50?80%，但其所用催化劑價格昂 貴，產(chǎn)物的光學(xué)純度不高，后期金屬離子的去除不理想，且藥物中對于金屬離子的嚴(yán)格要求 都限制著化學(xué)合成。生物催化法具有高效性，高立體選擇性，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點，近年來 受到廣大研究者的青睞。利用羰基還原酶不對稱還原3-氯苯甲酰甲基氯（m-CPC)，將潛手 性的底物111-〇?(：轉(zhuǎn)化成具有手性的〇〇-(1^，有產(chǎn)率高和 6.6.值大等優(yōu)勢。但是生物催化 羰基的不對稱還原反應(yīng)除了在氧化還原酶作用下進行，還需輔酶NAD(P)H參與。輔酶可以 通過底物偶聯(lián)或酶偶聯(lián)的方法再生。底物偶聯(lián)法是在反應(yīng)過程中添加輔助底物，在相同酶 的作用下實現(xiàn)目標(biāo)底物和輔助底物的同時轉(zhuǎn)化，但兩者的方向相反。酶偶聯(lián)法是利用兩個 獨立的氧化還原體系進行反應(yīng)。
[0003] 最近報道了一種木蘭假絲酵母（Candida magnoliae)的羰基還原酶基因（si), 其編碼的羰基還原酶（SI)被發(fā)現(xiàn)可催化溴代苯乙酮衍生物生成相應(yīng)鹵代醇，但沒有關(guān) 于利用羰基還原酶Sl還原m-CPC的相關(guān)研究和報道。本專利的工作是將其羰基還原 酶基因（si)根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛性進行密碼子優(yōu)化并人工合成其基因，命名為 Sysl。為解決輔酶再生問題，利用合成基因 Sysl相同的方法將嗜酸熱源體（Thermoplasma acidophilum)中的葡萄糖脫氫酶基因（gdh)進行優(yōu)化和合成并命名為Sygdh。將二者 構(gòu)建在含有雙啟動子的質(zhì)粒pETDuet-Ι中，并在大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)，即E. coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)是一種單菌共表達(dá)雙酶偶聯(lián)的體系，可解決生物催化中輔酶的 再生問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種共表達(dá)羰基還原酶基因和葡萄糖脫氫酶基因的重組大 腸桿菌。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案：
[0006] -種新型的共表達(dá)羰基還原酶基因和葡萄糖脫氫酶基因的大腸桿菌工程菌是指 導(dǎo)入了密碼子優(yōu)化后的木蘭假絲酵母（Candida magnoliae)的羰基還原酶基因（si)和嗜 酸熱源體（Thermoplasma acidophilum)的葡萄糖脫氫酶基因（gdh)的重組大腸桿菌。 [0007] 所述的木蘭假絲酵母（Candida magnoliae)的羰基還原酶基因（si)含有852bp 堿基，其在GeneBank登錄號為AB036927,對其進行密碼子優(yōu)化并命名為Sysl。優(yōu)化后的基 因序列Sysl含有852bp堿基且已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KJ522844,其基因序如 SEQ ID NO: 1所示。由該基因編碼的羰基還原酶包含283個氨基酸，其GenBank登錄號為 AHZ34231，其氨基酸序如 SEQ ID N0:2。
[0008] 所述的嗜酸熱源體（Thermoplasma acidophilum)的葡萄糖脫氫酶基因（gdh) 含有1086bp堿基，其在GeneBank登錄號為CAC12026,對其進行密碼子優(yōu)化并命名為 Sygdh。優(yōu)化后的基因序列Sygdh含有1086bp堿基且已提交至GeneBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為 KF739810,其基因序列入SEQ ID N0:3所示。由該基因編碼的葡萄糖脫氫酶包含361個氨 基酸，其GeneBank登錄號為AHF81466,其氨基酸序如SEQ ID NO:4。
[0009] 所述重組大腸桿菌的構(gòu)建方法（見圖1)為：人工合成羰基還原酶基因 Sysl和葡 萄糖脫氫酶基因 Sygdh，構(gòu)建雙酶耦合表達(dá)載體，并在大腸桿菌中實現(xiàn)共表達(dá)，重組蛋白用 SDS-PAGE分析（見圖2)。
[0010] 所述的羰基還原酶（SySl)和葡萄糖脫氫酶（SyGDH)的活性測定方法：
[0011] 羰基還原酶（SySl)活性測定：反應(yīng)體系為200 μ L 0. lmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0) ，0.2禮隱0?!1，5111111^^(：，加入5(^14且酶液。加入酶液后立即開始掃描反應(yīng)體系在 340nm處吸光度的變化。酶活定義：每分鐘內(nèi)氧化lymol NADPH所需要的酶量為一個酶活 單位（U)。
[0012] 葡萄糖脫氫酶（Sy⑶H)活性測定：反應(yīng)為200 μ L 0. lmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0) 中，0.2mMNADP+，0.1M底物葡萄糖，加入50μL粗酶液。加入酶液后立即開始掃描反 應(yīng)體系在340nm處吸光度的變化。酶活定義：每分鐘內(nèi)還原lymol NADP+所需要的酶量為 一個酶活單位（U)。
[0013] 所述的（R)-CCE的檢測方法：反應(yīng)結(jié)束后，12000rpm，離心5min，取600μ L上清， 加入ImL乙酸乙酯，劇烈振蕩5min放置分離有機層和水層。吸取上層乙酸乙酯相，加入適 量無水硫酸鎂除去殘余水分，所得有機相過濾膜后氣相檢測。采用CP-Chirasil-DEX CB手 性色譜柱（25mX0. 25nmX0. 25μπι)，檢測器FID。分析條件：進樣口和檢測器溫度分別為 220°C和250°C。柱溫145°C維持2min，以5°C /min升溫至200°C維持5min，載氣為氮氣，流 量為3mL/min，分流比1:50。
[0014] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明構(gòu)建了羰基還原酶（SySl)基因和葡萄糖脫氫酶 (Sy⑶H)基因共表達(dá)的重組菌E. coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)。它避免了添加昂貴的 純酶和輔酶NADPH，只需添加低成本的輔酶NADP+就可以使得輔酶NADPH高效再生，大大降 低了生產(chǎn)成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖 1 :重組菌 E. coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)質(zhì)粒圖
[0016] 圖2 :重組蛋白的SDS-PAGE分析圖

【具體實施方式】
[0017] 以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳 細(xì)說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0018] 實施例I Sysl基因和Sygdh基因的密碼子優(yōu)化及合成
[0019] 參照大腸桿菌偏愛性密碼子表對Sl中的稀有密碼子進行優(yōu)化，并在該基因 N端引 入6個編碼組氨酸的標(biāo)簽序列，在兩端分別添加 Nde I和Xho I限制性酶切位點。優(yōu)化后 基因命名為Sysl，由上海Sangon公司合成并與pUCm-T連接，獲得重組質(zhì)粒pUCm-T-Sysl。 同樣的方法對gdh進行密碼子優(yōu)化，在兩端分別添加 Nco I和Hind III限制性酶切位 點。優(yōu)化后基因命名為Sygdh，由上海合Sangon公司成并與pUCm-T連接，獲得重組質(zhì)粒 pUCm-T-Sygdh。
[0020] 實施例2表達(dá)載體pETDuet-Sygdh-Sysl的構(gòu)建
[0021] 用限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I分別對載體pETDuet-Ι和重組質(zhì)粒pUCm-T-Sysl 進行雙酶切，將獲得的Sysl基因和線性化載體片段連接，獲得的陽性克隆質(zhì)粒 pETDuet-Sysl。再使用 Nco I 和 Hind III 分別對 pUCm-T-Sygdh 和 pETDuet-Sysl 進行雙 酶切，將Sygdh基因插入到pETDuet-Sysl中，構(gòu)建的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受 態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐霉素抗性篩選，獲得陽性重組菌E. coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)，并送 至上海Sangon公司測序，測序正確后命名該重組表達(dá)質(zhì)粒為pETDuet-Sygdh-Sysl。
[0022] 實施例 3 重組菌 Ε· coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)的發(fā)酵
[0023] 接種重組菌 Ε· coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)于 2mT,含有 100 μ g/mL 氨節(jié)青 霉素的LB液體培養(yǎng)基，于37°C、220r/min振蕩培養(yǎng)12h。取300 μ L培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于30mL含 有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37°C、220r/min振蕩培養(yǎng)至OD6c?為0. 6? 〇. 8時，向培養(yǎng)物中加至終濃度為I. Ommol/L的IPTG，于26°C，220r/min振蕩培養(yǎng)10h，4°C 離心收集菌體。菌體用磷酸鉀緩沖液（100mm〇l/L、pH 6. 5)懸浮，超聲破碎（200w，超聲3s， 間歇8s)，4°C離心，測定上清中的酶活，其中SySl酶活力為3. 7U/g(濕菌體），Sy⑶H酶活 力為44. lU/g(濕菌體）。SDS-PAGE分析顯示在30. OkDa和41. OkDa有明顯條帶，表明SySl 和Sy⑶H都成功表達(dá)。
[0024] 實施例4輔酶NADPH再生驗證
[0025] 在ImL磷酸鉀緩沖液（100mmol/L、pH 6. 5)中，力卩入50mg重組菌 E. coliBL21(pETDuet-Sygdh_Sysl)濕菌體，含有終濃度 50mmol/L 葡萄糖、lmmol/L NADPH 或 lmmol/L NADP+、2mmol/L m-CPC;在 37°C、220r/min 條件下反應(yīng) 12h;同樣條件下，在不 加葡萄糖的情況下做為陰性對照，計算產(chǎn)物（R)-CCE的得率，結(jié)果（表1)表明，由反應(yīng)體系 1、2、3、可知葡萄糖脫氫酶參與輔酶的循環(huán)，且葡萄糖參與的體系3的產(chǎn)率是體系2的兩倍。 體系 3、4、5 可知 NADP+ 和 NADPH 作用相當(dāng)，說明重組菌 E. Co I i BL21 (pETDuet-Sygdh-Sy s 1) 能夠?qū)崿F(xiàn)輔酶的再生。
[0026] 表1 :不同反應(yīng)體系分析輔酶再生
[0027] Table I. Analysis of cofactor regeneration with difference reaction systems
[0028]

【權(quán)利要求】
1. 一種共表達(dá)羰基還原酶基因和葡萄糖脫氫酶基因的重組大腸桿菌，導(dǎo)入了密碼 子優(yōu)化后的木蘭假絲酵母（Candida magnoliae)的羰基還原酶基因（si)和嗜酸熱源 體（Thermoplasma acidophilum)的葡萄糖脫氫酶基因（gdh)并實現(xiàn)了在重組大腸桿菌 BL21(pETDuet-Sygdh_Sysl)中的共表達(dá)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的密碼子優(yōu)化后的木蘭假絲酵母（Candida magnoliae)的羰 基還原酶基因（Sysl)含有852bp堿基，登錄號為KJ522844,其基因序如SEQ ID N0:1所示。 由該基因編碼的羰基還原酶包含283個氨基酸，其GeneBank登錄號為AHZ34231，其氨基酸 序如 SEQ ID N0:2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的密碼子優(yōu)化后的嗜酸熱源體（Thermoplasma acidophilum) 的葡萄糖脫氫酶基因（Sygdh)含有1086bp堿基，登錄號為KF739810,其基因序列入SEQ ID N0:3所示。由該基因編碼的羰基還原酶包含361個氨基酸，其GeneBank登錄號為 AHF81466,其氨基酸序如 SEQ ID N0:4。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法為：克隆羰基還原酶基因Sysl和 葡萄糖脫氫酶基因Sygdh，構(gòu)建雙酶耦合表達(dá)載體，并在大腸桿菌中實現(xiàn)共表達(dá)。SDS-PAGE 分析顯示在30. OkDa和41. OkDa有明顯條帶，表明SySl和Sy⑶H都成功表達(dá)。
【文檔編號】C12N1/21GK104388373SQ201410758942
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】鄔敏辰, 朱利娟, 吳芹, 李劍芳, 張鵬, 何瑤 申請人:江南大學(xué)