專利名稱：一種控制水稻籽粒粒寬和粒重基因OsAGSW1的克隆及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種控制水稻籽粒粒寬和粒重的基因 OsAGSffl的克隆及應(yīng)用高。
背景技術(shù)：
水稻產(chǎn)量受三大因素影響，包括單位面積有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重，而千粒重與水稻籽粒的粒型呈顯著正相關(guān)(Murata Y. Nogyo Gi jutsu, 1965, 20 :451-456 ；Evans LT. Rice Res. Inst，1972，499_511)水稻粒形是與水稻產(chǎn)量性狀直接相關(guān)，與品質(zhì)性狀存在著密切關(guān)系的數(shù)量性狀，其評價指標主要是粒長、粒寬、粒厚、長寬比和長厚比(高志強， 遺傳，2011，33 (4):314-321)。稻谷籽粒性狀不僅是影響水稻產(chǎn)量的重要指標之一，也是影響稻米的外觀品質(zhì)、商品品質(zhì)、和加工品質(zhì)的重要因素。在美國、法國及歐洲的消費者喜歡細長粒形的稻米；在亞洲，印度喜歡長粒米，東南亞則喜愛中等或偏長粒形的米粒，而在溫帶地區(qū)卻是短粒米較受歡迎(Gravois KA. Crop Science, 1993, 33:83-86)。在我國的國家優(yōu)質(zhì)稻谷標準中還對稻米粒長與粒寬的比值作了具體規(guī)定，認為優(yōu)質(zhì)的秈稻品種的稻米長寬比不低于2. 8。因此，闡明谷粒大小的分子機理有利于同時改良水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。此外，谷粒大小在作物的進化研究中具有重要意義。一般認為野生親緣種具有小而圓的谷粒粒形以適應(yīng)自然選擇，經(jīng)過人類的長期馴化和選擇，谷粒粒形已經(jīng)發(fā)生了明顯的改變。因此揭示谷粒大小的遺傳基礎(chǔ)可以為作物的分子育種提供理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的可用于控制水稻籽粒粒寬粒重的基因OsAGSWI 及其應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)
在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的水稻粒寬粒重OsAGSWI蛋白，該蛋白選自下組 Ca)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；或
(b)將SEQ ID NO:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有控制作物粒寬或粒重共的由(a)衍生的多肽。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的蛋白來源于水稻。本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，該多核苷酸選自下組
(i)編碼所述的水稻大粒蛋白的多核苷酸；或
(ii)與(i)中的多核苷酸互補的多核苷酸。本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，該多核苷酸編碼具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，該多核苷酸選自SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，該多核苷酸選自SEQ ID NO: I中693-1189位所示的核苷酸序列，如SEQ ID NO:3或其互補序列SEQ ID NO:4。
本發(fā)明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。本發(fā)明的第四方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有所述的載體；或它的基因組中整合有所述的多核苷酸。在本發(fā)明的第五方面，提供所述的水稻大粒蛋白或其編碼基因的用途，用于控制作物籽粒的粒寬或粒重(更優(yōu)選的，為增加作物籽粒的粒寬或粒重，從而增加作物產(chǎn)量)；條件細胞過程；或作為鑒定作物大粒品種和小粒品種的分子標記。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的細胞過程包括但不限于細胞分裂、信號轉(zhuǎn)導、 細胞伸長。在本發(fā)明的第六方面，提供一種改良作物(更優(yōu)選的，為增加作物籽粒的粒寬或粒重)的方法，該方法包括(A)降低所述作物中水稻大?；虻谋磉_；或化)將功能降低或功能缺失的水稻大?；蚧虻鞍讓胱魑镏?。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，將功能降低或功能缺失的水稻大?；蚧虻鞍讓胄×Ｆ贩N的作物中，從而可促進作物籽粒變大。更優(yōu)選的，將功能缺失的水稻大粒基因或蛋白導入作物中。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，用分子標記選擇技術(shù)將從大粒品種的作物中獲得的 OsAGSffl基因片段導入小粒品種的作物中。在本方面的第七方面，提供一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述的方法包括步驟將所述的多核苷酸導入植物細胞中，培養(yǎng)所述的植物細胞，再生產(chǎn)植物。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟
(Si)提供攜帶表達載體的農(nóng)桿菌，所述的表達載體含有所述的蛋白的編碼基因；
(s2 )將植物細胞或組織或器官與步驟(sI)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；
(s3)選擇出轉(zhuǎn)入所述的蛋白編碼基因的植物細胞或組織或器官；以及 (s4)將步驟(s3)中的植物細胞或組織或器官再生成植物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
(I)首次分離得到一種新的水稻粒寬粒重基因，增加該基因的表達可使得作物(如水稻)的籽粒變大，從而可增加作物的產(chǎn)量。(2)本發(fā)明的水稻粒寬粒重基因OsAGSWI可以作為控制作物籽粒大小，提高產(chǎn)量和品質(zhì)的一個基因，應(yīng)用于作物品種的改良。并且，可將OsAGSWI基因的分子標記技術(shù)用于農(nóng)作物大粒高產(chǎn)育種。


圖I顯示了水稻OsAGSWI過量表達與RNAi敲減株系表達量檢測；
圖2顯示了水稻OsAGSWI過量表達轉(zhuǎn)基因株系(UBI: :OsAGSWI#3和UBI: :OsAGSWI#5) 和RNAi敲減轉(zhuǎn)基因株系(OsAGSWl RNAi#4和OsAGSWl RNAi#14)的谷粒與受體品種“中花 11 (ZHlI)”的谷粒的比較;
圖3顯示了水稻OsAGSWI過量表達轉(zhuǎn)基因株系(UBI: :OsAGSWI#3和UBI: :OsAGSWI#5) 和RNAi敲減轉(zhuǎn)基因株系(OsAGSWl RNAi#4和OsAGSWl RNAi#14)的谷粒與受體品種“中花 11 (ZHlI)”的谷粒粒寬粒重統(tǒng)計;圖4顯示了水稻OsAGSWI的未開花前過量表達UBI: :OsAGSWI#3和RNAi敲減轉(zhuǎn)基因株系OsAGSWl RMiM穎殼形態(tài)，穎殼橫切面細胞生物學觀察，穎殼外圍薄壁細胞長度和細胞數(shù)目的統(tǒng)計分析。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首先發(fā)現(xiàn)了一種控制作物籽粒粒寬和/或粒重的新基因，該基因的功能的過量表達可產(chǎn)生大粒的表型，而敲減可產(chǎn)生小粒的表型，本發(fā)明人將之命名為水稻粒寬粒重基因(OsAGSWl)。試驗證實，OsAGSWl基因的過量表達的轉(zhuǎn)基因植株的粒型變大、粒重增加，OsAGSWl基因的敲減表達的轉(zhuǎn)基因植株的粒型變小、粒重減少， 可見OsAGSWl基因?qū)⒃谵r(nóng)作物高產(chǎn)育種中起重要作用，具有廣泛的應(yīng)用前景。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。如本文所用，所述的“作物”包括但不限于禾本科植物。更優(yōu)選的，所述的禾本科植物包括但不限于小麥、大麥、玉米、高粱等。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即為天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的OsAGSWl蛋白或多肽”是指所述的OsAGSWl蛋白基本上不包含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標準的蛋白純化技術(shù)純化OsAGSWl蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人,分子克隆實驗室指南(New York: cold spring harbor laboratory press, 1989)中所述的條件，或按照以下文獻中公布的方法Carl ff. Diffenbach &Gabriela S. Devksler eds. PCR Primer: A Laboatory manual. Cold spring harbor laboratory press, 1995?；虬凑罩圃鞆S商所建議的條件。實施例I OsAGSWl基因RNAi表達載體和過表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得
I.水稻的培養(yǎng)
水稻種子放在2ml離心管中，先用75%酒精消毒I 2 min，再用1%的次氯酸鈉消毒 3 5 min，無菌水沖洗5次后，無菌紙晾干后播在滅菌的MS固體培養(yǎng)基(I. 5%蔗糖，0. 8% 瓊脂，pH 5.8)上，溫度221/ 180C (日/夜)，16h / 8h光周期，白熾燈光照培養(yǎng)。2.采用本領(lǐng)域常規(guī)的Trizol法提取水稻RNA。3. RT-PCR 檢測
3.I逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(cDNA合成)
用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考相關(guān)試劑盒說明即可。
3. 2目的基因的RT-PCR擴增
根據(jù)OsAGSWl的CDS以及酶切信息，分別選取合適的酶切位點將目的片段克隆到相應(yīng)的載體上，其中所用到引物如表I所示。 表I構(gòu)建OsAGSWl的RNAi表達載體和過表達載體引物序列
用逢引著!名稱序列(5'-3*)■ ,t jIfiIIXJGOT7-pYL-N畔tccCTC4ACAATATG\€CTTCC (SEQNO:5)BamHIIl的引物JGSIT7-pYL-CiagcttG ATC AGCATGAAAGTAACC < SBQ ID NO:6)HindinIf增反義Mu-FcaccetgtcgcsiggttittenctRttsaSt C SBO ID NO;7)Mul鍵_物Pst-RACXAGAACTGCAGCCITAGAlCTACCATCMSirG (SEQ ID NO J)PstI過表&引pHQ-jGsrriNgaatic ATGGCGGCCACCGCCGOCGC <SEQlDNOf)EcoR I物序列pHQ-JGSff7CRaillcCTAAGGAGATCCTGGAGCAG (SEQtDXOilO)EcoRI
PCR 反應(yīng)體系ddH20 15. 4 u LUOXTaq Buffer 2 u LUOmM dNTP mix 0.5 u L, PrimerN (10 u mol/L) 0. 4 u L、PrimerC (10 u mol/L) 0. 4 uL、DNA 模板 I u L 和 Taq 酶(5U/ii L) 0. 3 ii L。PCR 反應(yīng)程序94°C變性 2 min，然后按 94°C 30s、55°C 30s、72°C I min 進行 30 個循環(huán)，最后在72°C下延伸10 min。4.構(gòu)建OsAGSWl的RNAi表達載體和過表達載體
為了研究OsAGSWl的功能，我們通過RNAi技術(shù)構(gòu)建了 OsAGSWl基因敲減載體。方法是用帶BamH I和HindIII酶切位點的引物(A 5F7-pYL-N，AGSWl擴增正義鏈(SEQ ID NO. 3)，產(chǎn)物回收后用BamH I和HindIII雙酶切，再回收酶切產(chǎn)物；產(chǎn)物與pMD_18T 4°C 連接過夜，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，篩選出陽性克隆并測序；用同樣酶切處理 PYLRNAi. 5質(zhì)粒載體，將產(chǎn)物酶切回收片段與載體酶切回收片段通過T4 DNA連接酶連接， 用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌疋coli T0P10，篩選出陽性克?。灰詷?gòu)建正確的正向載體為模板，以載體通用引物(Mlu-F Pst-R)擴增反義鏈(SEQ ID NO. 4)，并回收反向片段；反向片段與正向載體經(jīng)Mlu I和Pst I酶切后回收產(chǎn)物，并經(jīng)T4 DNA連接酶連接，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌萬.
DH5 a，篩選出陽性克隆。得到OsAGSWl基因敲減載體pYLRNAi-AGSWl，用陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌A tumefaciens EHA105，在含有卡納霉素和利福平的培養(yǎng)基上挑單克隆，并用PCR 鑒定陽性克隆。用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化野生型中花11愈傷，經(jīng)過預培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有抗性的愈傷、分化、生根、煉苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系主要應(yīng)用 Hiei 等人報道的方法(參見 Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed, 2008, Nature protocol, doi: 10. 1038 / nprot. 2008 . 46)基礎(chǔ)上進行。本發(fā)明的遺傳轉(zhuǎn)化的主要步驟如下所述
(I)、將成熟的種子去殼，(挑選飽滿的種子)用75%的酒精消毒SOflmin (量少30s/量多Imin),用2%NaC10溶液，加一滴Tween-20,然后120rpm搖45分鐘。無菌水漂洗3 5 次，風干，接種于NBO增養(yǎng)基上，26°C暗培養(yǎng)4周，15天繼代一次。(2)、將農(nóng)桿菌在AB培養(yǎng)基上劃線涂板，28°C暗培養(yǎng)3天。(3)、將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌刮下(濃度要適中)放入AAI+AS (促進侵染)培養(yǎng)液中， 280CHf搖2 5小時。(4)、選擇致密的愈傷組織顆粒(直徑3 5 mm )用于轉(zhuǎn)化。將待轉(zhuǎn)化的愈傷組織顆粒在準備好的AAM+AS菌液中浸染5min，放在無菌濾紙上除去過多的菌液后，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基26°C暗培養(yǎng)3天。(5)、共培養(yǎng)后,用無菌水+吐溫洗滌3次，然后在含500 m g / L頭孢霉素的無菌水中洗IOmin (—定要清洗干凈)，吹干愈傷組織I小時左右，然后將愈傷轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基+抗生素上進行篩選I個月。(6)、篩選后的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基+抗生素上在光照條件下26°C繼續(xù)培養(yǎng)至分化出綠苗。把小苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基+抗生素中培養(yǎng)，將其從生根培養(yǎng)基中移出， 洗凈殘留培養(yǎng)基，在清水中煉苗。當白色的新根長出時，將其移栽到溫室或大田。經(jīng)篩選的陽性植株移至土壤生長，待成熟收集種子即得TO代，經(jīng)過HPT(潮霉素)篩選及半定量RT-PCR分析，我們篩選到兩個較為理想的轉(zhuǎn)基因株系RMiM 和6MG5F7 RNAi#14。該兩株系中6MG5F7基因表達水平較之野生型均明顯下降，且株系 OsAGSWl RNAi#4下降程度更為顯著(圖I )，為后續(xù)實驗提供了較為理想的研究材料。同時，我們將擴增的正義鏈轉(zhuǎn)化pCAMBIA1390載體，構(gòu)建了 UBI:: OsAGSWl過表達載體，并轉(zhuǎn)化野生型中花11愈傷獲得了轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)潮霉素篩選及半定量RT-PCR 鑒定，選取其中兩個OsAGSWl表達水平明顯上調(diào)的轉(zhuǎn)基因株系UBI: : OsAGSWl #3和 mi: :0sAGS￥l#5 (圖I)作為備選研究對象。上述植物表達載體RNAi載體pYLRNAi5、過表達載體pCAMBIA1390、PCanG、大腸桿菌萬.coli DH5A、T0P10和農(nóng)桿菌A tumefaciens EHA105均為本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的實驗材料。上述操作中的載體連接、大腸桿菌細胞的轉(zhuǎn)化以及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化均為本領(lǐng)域的常規(guī)操作。實施例2基因的功能鑒定
I轉(zhuǎn)OsAGSWl基因水稻株系粒形的表型分析
成熟過量表達種子粒寬和粒重增加，敲減植株粒寬變窄，粒重減少(圖2 3)。 由于OsAGSWl過表達籽粒變大，為進一步了解其在植株生長過程中的表型變化，我們對其抽穗期植株高度、劍葉寬度和長度進行統(tǒng)計分析，與中花11野生型植株相比發(fā)現(xiàn)過量表達植株株高增加、劍葉長度和寬度均增加，而敲減植株劍葉長度變短、株高和劍葉長度變化不大。(表2)表2轉(zhuǎn)OsAGSWl基因水稻株高和劍葉數(shù)據(jù)統(tǒng)計
權(quán)利要求
1.一種水稻OsAGSWI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。
2.權(quán)利要求I所述水稻OsAGSWI基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQID NO:2所
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水稻OsAGSWI基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸的取代、缺失或添加，并具有控制作物粒寬或粒重功能的由權(quán)利要求2衍生的多肽。
4.如權(quán)利要求I所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸選自下組1)SEQ ID NO: I 所示的核苷酸序列；或其互補的多核苷酸；2) SEQ ID NO: I中693-1189位所示的核苷酸序列SEQ ID NO: 3或其互補序列 SEQ ID NO:4。
5.—種表達載體,其特征在于所述表達載體含有權(quán)利要求4所述的多核苷酸。
6.一種重組工程菌，其特征在于所述重組工程菌含有權(quán)利要求5所述的表達載體。
7.—種轉(zhuǎn)基因細胞系，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因細胞系含有權(quán)利要求I所述的水稻 OsAGSWI 基因。
8.權(quán)利要求I所述的蛋白或其編碼基因的用途，其特征在于，用于控制控制作物籽粒的粒寬或粒重；調(diào)節(jié)細胞過程；光合作用同化物運輸；增加植物產(chǎn)量或增加植物株高、劍葉寬度；作為鑒定作物大粒品種和小粒品種的分子標記。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的細胞過程包括細胞分裂、信號轉(zhuǎn)導、或細胞伸長。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述水稻基因的應(yīng)用，其特征在于所述植物為水稻；并作為遺傳標記，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的產(chǎn)品鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種控制水稻谷粒粒寬和粒重性狀的OsAGSW1基因的克隆和應(yīng)用。本發(fā)明水稻OsAGSW1基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，序列全長2181bp，編碼726個氨基酸。利用轉(zhuǎn)基因獲得了轉(zhuǎn)OsAGSW1基因的過量表達水稻植株，轉(zhuǎn)基因植株都表現(xiàn)出株高顯著變高，粒寬和粒重增加，RNAi法沉默后轉(zhuǎn)化到植物中，植物出現(xiàn)植株高度變矮，粒寬變窄。OsAGSW1基因可用于控制作物籽粒的大小、提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)、調(diào)節(jié)作物光合產(chǎn)物運輸。
文檔編號C12N5/10GK102533782SQ20121000180
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者李濤, 陽成偉 申請人:華南師范大學