專利名稱：禽白血病病毒的多重pcr檢測引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物疾病檢測方法，具體地，涉及禽白血病病毒的多重PCR檢測引物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
禽白血病是由禽白血病病毒(avian lekosis virus，ALV)引起的以造血細(xì)胞惡性增生為主的一類傳染病。包括淋巴細(xì)胞性白血病、成紅細(xì)胞性白血病、成髓細(xì)胞白血病和髓細(xì)胞樣白血病。禽白血病主要通過垂直和水平傳播引起臨床和亞臨床感染，產(chǎn)生非腫瘤綜合征，表現(xiàn)為生產(chǎn)指標(biāo)發(fā)生變化，如性成熟推遲、母雞產(chǎn)蛋率下降、蛋重下降、受精率下降和孵化率下降，由此嚴(yán)重影響雞的生產(chǎn)性能，最終產(chǎn)生腫瘤，導(dǎo)致雞的死亡。并且該病能夠通過垂直傳播危害子代雞，嚴(yán)重影響雛雞的質(zhì)量，造成較大的經(jīng)濟損失。此外，禽白血病一但感染后，可引起雞群的免疫抑制，會繼發(fā)諸如馬立克氏病、傳染性法氏囊、雞傳貧等免疫抑制病，從而造成更嚴(yán)重的損失。自1908年首次報道并分離到ALV以來，禽白血病已分布于世界各地，我國也有該病的流行和發(fā)生。近年來，湖北、山東等地雞白血病疑似病例頻發(fā)，重慶、廣西等省份也有相關(guān)報道，雞群ALV的感染率高達(dá)60%，病死率高達(dá)50%以上。而我國西北地區(qū)尚未見禽白血病流行報告，據(jù)此本實驗擬通過建立禽白血病的PCR診斷方法，對甘肅省各雞場進(jìn)行禽白血病的分子流行病學(xué)調(diào)查，準(zhǔn)確而詳細(xì)的掌握該病對本地養(yǎng)禽業(yè)的危害情況，為制定有效的疾病防制措施提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，并采取相應(yīng)的措施淘汰帶毒病雞，通過不斷地凈化達(dá)到純化雞群的目的。禽白血病在世界范圍內(nèi)幾乎所有雞群均有發(fā)生，嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)的可持續(xù)發(fā)展， 因此具有重要的經(jīng)濟意義。我國對于禽白血病的綜合防控體系還不夠完善，仍需加強對該病毒的分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)研究，加快建立更加快速、敏感及準(zhǔn)確的檢測方法，并應(yīng)用于實踐，以便對該病更好地進(jìn)行監(jiān)控。目前，該病尚無切實可行的防治措施。既無療效好的抗病毒藥物，又無有效的疫苗可使用。預(yù)防本病的主要方法是培育具有遺傳性抵抗力的新品種，淘汰陽性雞，凈化種群，經(jīng)過兒代選育凈化出無白血病雞群。要建立一個無白血病雞群必須從孵化、飼養(yǎng)到維持都必須使雞群處在無先天性感染的隔離狀態(tài)。目前國內(nèi)外相繼建立了多種檢測ALV的方法，主要包括傳統(tǒng)的病毒分離與鑒定、血清學(xué)檢測方法和分子生物學(xué)檢測方法。自1868年，國外學(xué)者報道禽白血病以來，研究工作者就對其進(jìn)行了許多的研究， 并在病毒的分離、鑒定、檢測和診斷方面取得了許多進(jìn)展。國內(nèi)外已經(jīng)建立了一些禽白血病檢測診斷方法，如瓊脂擴散試驗、病毒中和試驗、補體結(jié)合試驗、ELISA、放射免疫、免疫熒光技術(shù)等。而這些方法大多是用于實驗室研究，很少能進(jìn)入臨床應(yīng)用。國外的ELISA檢測方法建立比較早，1979年以來，美、英、澳、日等國家相繼報道應(yīng)用ELISA方法檢測禽白血病， 如1983年P(guān)yane L. N等應(yīng)用ELISA方法對雞群進(jìn)行檢測，隨后(198 美國制成ELISA試劑盒井于市場出售。Smith E J.等建立了 PCR法檢測ALV-J前病毒DNA，寡核苷酸序列設(shè)計基于前病毒E元件序列和3’末端TLR。這種方法具有很高的特異性和敏感性，可代替常規(guī)的病毒分離。Smith L Μ.等所建立的PCR方法，是從pol基因片段選取一段作為下游寡核苷酸序列，這種方法可避免內(nèi)源性EAV序列發(fā)生非特異性反應(yīng)。Arshda等應(yīng)用原位雜交技術(shù)，以DIG標(biāo)記的特異性核酸探針檢測感染ALV-J (HPRS 一 103)病雞組織中的RNA復(fù)制， 也取得了成功。有人利用感染的CEF的ALV-J的囊膜糖蛋白作為抗原進(jìn)行了 ELISA試驗。 Venugopal應(yīng)用重組gp85基因產(chǎn)物作為抗原進(jìn)行的新型ELISA獲得了良好的效果。在我國，八十年代中期哈爾濱獸醫(yī)研究所首先建立了簡便易行，適用于現(xiàn)場大面積應(yīng)用的從羽髓中檢測禽白血病病毒群特異性抗原的瓊脂擴散試驗，隨后國內(nèi)多家單位相繼研制出該方法。但瓊擴試驗的敏感性較差，并有一定的假陽性出現(xiàn)，因此，人們將目光轉(zhuǎn)向更加敏感、特異、操作方便的ELISA檢測方法。國內(nèi)1991年起哈爾濱獸醫(yī)研究所開展了從蛋清、泄殖腔拭子等樣品中檢測禽白血病的雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(DAS-ELISA)技術(shù)及其在生產(chǎn)實踐中應(yīng)用的研究工作，并取得了階段性的進(jìn)展。國內(nèi)其他單位也在ELISA方法上作了初步的嘗試。任德林等(199 建立了抗p27、pl9蛋白的雜交瘤細(xì)胞株。黃進(jìn)等(1994)以雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗為基本原理，研制出禽白血病抗原ELISA試劑盒，秦愛建等國應(yīng)用特異性ALV-J單克隆抗體JE9建立了免疫熒光檢測ALV-J抗原和抗體的方法也具有很高的特異性。上述各種診斷方法都存在各自的不足之處，如操作復(fù)雜、檢測成本高、敏感性差等。因此在實際生產(chǎn)實踐中迫切需要一種快速、準(zhǔn)確、廉價的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的缺陷，提供了一種禽白血病病毒的多重 PCR檢測引物，該引物用于檢測禽白血病病毒的3個亞群，本發(fā)明所提出的檢測方法具有快速、準(zhǔn)確、廉價的優(yōu)點。本發(fā)明具有以下有益效果
傳統(tǒng)的各種診斷方法都存在各自的不足之處，如病毒的分離鑒定法很難確保雞體內(nèi)不存在潛伏感染的病毒，更不能排除雞發(fā)生再感染的可能；瓊脂雙向擴散試驗法對大型集約化祖代雞場來講，要實現(xiàn)全群凈化，實際操作非常困難；熒光抗體實驗需要熒光顯微鏡，所以有一定的局限性；現(xiàn)有的PCR方法成本較高、操作較復(fù)雜耗時、對人員素質(zhì)要求較高，這些都限制其在生產(chǎn)中的實際應(yīng)用等等，相比之下，本發(fā)明所提出的禽白血病病毒的多重PCR 檢測引物實現(xiàn)了在一次實驗中快速檢測出三個禽白血病病毒亞群的目的，相當(dāng)于傳統(tǒng)的三次PCR反應(yīng)，另外，傳統(tǒng)方法需要借助大型儀器來完成，這些儀器往往耗資巨大，增加了實驗成本，因此，本發(fā)明的成本相比之下非常低廉，效率也相當(dāng)高；在靈敏度方面，本方法靈敏度和特異性都非常高，能夠檢出的模板最小拷貝數(shù)是lOOObp。


附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中
圖1是實施例2中多重PCR擴增結(jié)果示意圖； 圖2是實施例2中多重PCR敏感性實驗結(jié)果示意圖； 圖3是實施例4中多重PCR特異性實驗結(jié)果示意圖。
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結(jié)合附圖，給出以下附圖標(biāo)記
圖 1 中M =DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 :ALV-A ；2 =ALV-B ；3 :ALV-. J ；4 :ALV_A/B ；5 :ALV_A/J ； 6 ALV-B/J ；7 :ALV-A/B/J ；
圖 2 中M :DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；Γ10 質(zhì)粒拷貝數(shù)(1010，109，108，107，106，105，104， 103，102，101)；
圖 3 中M =DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 :ALV-A/B/J ；2 8 對照毒株(MDV，HVT，NDV，IBDV， I LTV, IBV, DF-D0
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例1(產(chǎn)品實施例)
本發(fā)明所提出的一種禽白血病病毒的多重PCR檢測引物，包括以下禽白血病病毒3個亞群A、B、J的3對核苷酸序列 禽白血病病毒亞群A檢測引物 上游引物 A3 5' -GGTTGGTCTAGACAGGAAGC-3' 下游引物 A4 5' -CATTGCCACAGCGGTAC-3， 禽白血病病毒亞群B檢測引物 上游引物 B3 5' -CATACGATAGTCCGGCTG-3， 下游引物 B4 5，-CCCCACACATCCTGACA-3' 禽白血病病毒亞群J檢測引物 上游引物 J3 5，-GGAGTTCATCTATTGCAACAACC-3' 下游引物 J4 5，-GCGCCTGCTACGGTGGT-3，。其中，禽白血病病毒亞群A (ALV-A)檢測引物是在env基因的上游596飛15位點， 下游775 791位點上設(shè)計的，該基因在Genbank中的登錄號為M19113 ；
禽白血病病毒亞群B( ALV-B )檢測引物是在erw基因的上游569飛86位點，下游 805 821位點上設(shè)計的，該基因在Genbank中的登錄號為M14902 ；
禽白血病病毒亞群J (ALV-J)檢測引物是在erw基因的上游175 197位點，下游 1082 1098位點上設(shè)計的，該基因在Genbank中的登錄號為Z46390。實施例2 (應(yīng)用實施例)
本發(fā)明所提出的禽白血病病毒的多重PCR檢測引物在禽白血病病毒檢測中的應(yīng)用，包括以下步驟
(1)提取雞血全基因組DNA，作為多重PCR的模板；
(2)以禽白血病病毒亞群A檢測引物、禽白血病病毒亞群B檢測引物和禽白血病病毒亞群J檢測引物為3對檢測引物，進(jìn)行多重PCR ；所述多重PCR的反應(yīng)條件如表1和表2 :
權(quán)利要求
1.一種禽白血病病毒的多重PCR檢測引物，包括針對禽白血病病毒A、B、J亞群的3對特異性寡核苷酸引物序列禽白血病病毒亞群A檢測引物 上游引物 A3 5' -GGTTGGTCTAGACAGGAAGC-3' 下游引物 A4 5' -CATTGCCACAGCGGTAC-3， 禽白血病病毒亞群B檢測引物 上游引物 B3 5' -CATACGATAGTCCGGCTG-3， 下游引物 B4 5，-CCCCACACATCCTGACA-3' 禽白血病病毒亞群J檢測引物 上游引物 J3 5，-GGAGTTCATCTATTGCAACAACC-3' 下游引物 J4 5，-GCGCCTGCTACGGTGGT-3，。
2.權(quán)利要求1所述的禽白血病病毒的多重PCR檢測引物在禽白血病病毒檢測中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，包括以下步驟(1)提取家禽全基因組DNA，作為多重PCR的模板；(2)以禽白血病病毒亞群A檢測引物、禽白血病病毒亞群B檢測引物和禽白血病病毒亞群J檢測引物為3對檢測引物，進(jìn)行多重PCR ；所述多重PCR的反應(yīng)條件為反應(yīng)體系為25μ L 三個亞群A、B、J的上下游每條引物IyL;模板3μ L ；預(yù)混酶 12. 5μ L ；水補足至25μ L ； 預(yù)變性95°C 5 min ； 變性94°C 45s ； 退火58°C 45s ； 延伸72°C Imin ； 循環(huán)數(shù)35 ；循環(huán)末延伸72°C 10 min ；(3)取步驟(2)反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種禽白血病病毒的多重PCR檢測引物，包括檢測禽白血病病毒A亞群、B亞群和J亞群的檢測引物，同時，公開了多重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。本發(fā)明所提出的檢測方法具有快速、準(zhǔn)確、廉價的優(yōu)點。
文檔編號C12N15/11GK102433397SQ20111045094
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者萬學(xué)瑞, 何軼群, 刁小龍, 劉磊, 吳潤, 張小麗, 管宏偉, 羅鵬, 賈曉蕊 申請人:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)