專利名稱：結(jié)核桿菌的lamp檢測(cè)方法及其專用引物與試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中細(xì)菌的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，特別是涉及結(jié)核桿菌的 LAMP檢測(cè)方法及其專用引物與試劑盒。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病。結(jié)核菌可能侵入人體全身各種器官，但主要侵犯肺臟，稱為肺結(jié)核病。結(jié)核病又稱為癆病和“白色瘟疫”，是一種古老的傳染病，自有人類以來(lái)就有結(jié)核病。迄今為止，結(jié)核病仍為嚴(yán)重的傳染病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界人口中 1/3感染有結(jié)核分枝桿菌。據(jù)WHO報(bào)道，每年約有800萬(wàn)新病例發(fā)生，至少有300萬(wàn)人死于該病。我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，約三分之一的人口已感染了結(jié)核桿菌， 受感染人數(shù)超過(guò)4億。我國(guó)現(xiàn)有肺結(jié)核病人約500萬(wàn)，主要集中在25歲及以上人群，其中涂陽(yáng)肺結(jié)核病人150萬(wàn)，每年約有13萬(wàn)人死于結(jié)核病，死亡平均年齡為55. 2歲。據(jù)研究， 受結(jié)核菌感染的人群中，10%的人會(huì)發(fā)展為結(jié)核病。如果不采取有效的控制措施，在未來(lái)的 10年，我國(guó)可能有近5000萬(wàn)的結(jié)核病感染者。結(jié)核病是青年人容易感染的一種慢性和緩發(fā)的傳染病，一年四季都可以發(fā)病，15 歲到35歲的青少年是結(jié)核病的高發(fā)峰年齡；結(jié)核病的潛伏期4-8周；80%的結(jié)核病感染發(fā)生在肺部，其它部位(頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼)也可繼發(fā)感染；人與人之間呼吸道傳播是該病傳染的主要方式；傳染源為接觸排菌的肺結(jié)核患者。環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)是由Τ· Notomi (Notomi Τ, Okayama H, MasubuchiH, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 2000；28(12) :63.)發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)依賴4條特異設(shè)計(jì)的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可以高效、快速、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列。 近年來(lái)，國(guó)外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)。Masaki Imai等人(Imai M, Ninomiya A, Minekawa H, et al. Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method. J Virol Methods. 2007 ； 141 (2) :173-80.)禾Ij M LAMP建立了禽流感病毒的實(shí)驗(yàn)室確診體系；Nobuyuki Hayashi等人(Hayashi N, Arai R, Tada S, Taguchi H, Ogawa Y.Detection and identification of Brettanomyces/ Dekkera sp. yeasts with a loop-mediated isothermal amplification method. Food Microbiol. 2007 ；24(7-8) :778-85.)針對(duì)四種香酒酵母的ITS序列設(shè)計(jì)了 LAMP特異性引物，建立了高效的LAMP檢測(cè)體系。LAMP還可以檢測(cè)其它與人類相關(guān)的病毒，如病毒性出血性敗血病(VHS)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)^I 彩病毒、人類瘡疹病毒8型、造血組織壞死病毒(IHHNV)、番茄斑萎病毒和番茄黃化曲葉病毒等。但是迄今為止，市場(chǎng)上還未見(jiàn)用于檢測(cè)結(jié)核桿菌的LAMP專用引物與試劑盒問(wèn)世
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異性和靈敏度較高的用于檢測(cè)結(jié)核桿菌的LAMP檢測(cè)專用引物。本發(fā)明所提供的用于對(duì)結(jié)核桿菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)的專用引物，是根據(jù)如序列表中序列1所示的結(jié)核桿菌的特異性保守靶序列IS6110設(shè)計(jì)的，用以定性檢測(cè)待測(cè)樣品中的結(jié)核桿菌。具體來(lái)講，所述用于對(duì)結(jié)核桿菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)的專用引物命名為JH164引物組合，由以下三組引物對(duì)混合得到，第一組引物對(duì)引物1(F3)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，引物2 (B3)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；第二組引物對(duì)引物3 (FIP)， 其核苷酸序列如序列表中序列4所示，引物4 (BIP)，其核苷酸序列如序列表中序列5所示； 第三組引物對(duì)引物5(LF)，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，引物6 (LB)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。所述JH164引物組合中各引物對(duì)(FIP和BIP) (LF和LB) (F3和B3)的摩爾比為 40 20 5。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種結(jié)核桿菌的LAMP檢測(cè)方法。本發(fā)明所提供的結(jié)核桿菌的LAMP檢測(cè)方法，可包括以下步驟1)以待測(cè)物的基因組DNA為模板，在上述專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；2)反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行結(jié)果判定在反應(yīng)液中添加鈣黃綠素指示劑，根據(jù)反應(yīng)液的顏色變化判斷結(jié)果，綠色表示待測(cè)樣品中存在結(jié)核桿菌，橙色表示待測(cè)樣品中不存在結(jié)核桿菌；或者不添加鈣黃綠素指示劑直接用濁度儀檢測(cè)反應(yīng)前后反應(yīng)液的濁度變化來(lái)判斷結(jié)果，濁度上升表示待測(cè)樣品中存在結(jié)核桿菌，濁度無(wú)變化表示待測(cè)樣品中不存在結(jié)核桿菌。在上述結(jié)核桿菌的LAMP檢測(cè)方法中，所述步驟1)中的待測(cè)樣品包括純菌、 痰液和腦脊液等；所述25 μ 1 LAMP反應(yīng)體系可包括待測(cè)物的基因組DNA 2μ l,20mM Tris ‘ HCKpH 8. 8), IOmM KCl，IOmM (NH4) 2S04，0. Tween20，0. 8M 甜菜堿(betaine), 8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，引物加入量為40pmol 序列表中序列 2 (FIP)和序列3 (BIP)所示引物，20 11101序列表中序列4(1^)和序列5 (LB)所示引物，5pmol 序列表中序列6 (F3)和序列7(B3)所示引物。所述步驟1)中的LAMP擴(kuò)增條件可為置60-65°C恒溫40-60min (優(yōu)選為50min)。所述步驟2)中鈣黃綠素指示劑的添加量可為1 μ 1(終反應(yīng)體系為1)，包含有 0. 5mM鈣黃綠素和IOmM氯化錳。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種結(jié)核桿菌的LAMP檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明所提供的結(jié)核桿菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，包含有上述結(jié)核桿菌的LAMP檢測(cè)的專用引物。所述試劑盒中還包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照為結(jié)核桿菌的基因組DNA，所述陰性對(duì)照為不含DNA的LAMP擴(kuò)增體系，如雙蒸水。具體的，所述結(jié)核桿菌的LAMP檢測(cè)試劑盒包括20mM Tris · HCl (pH 8. 8)，IOmM KCl，IOmM (NH4) 2S04，0. Tween20，0. 8M 甜菜堿(betaine)，8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each, JH164 引物組合40pmol FIP 和 BIP，20pmol LF 和 LB，5pmol F3 和 B3 ;Bst DNA 聚合酶、雙蒸水、鈣黃綠素指示劑和結(jié)核桿菌的基因組DNA (25 μ 1 LAMP反應(yīng)體系中使用2 μ 1)。采用以上設(shè)計(jì)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1)高特異性6條引物對(duì)結(jié)核桿菌靶序列的8個(gè)特異區(qū)域的識(shí)別保證了 LAMP擴(kuò)增的高度特異性，即LAMP能從相差僅一個(gè)核苷酸的基因標(biāo)本中找出相應(yīng)的靶序列進(jìn)行擴(kuò)增；2)高靈敏度靈敏度比普通PCR高10倍；3)結(jié)果鑒定簡(jiǎn)便可通過(guò)肉眼觀察結(jié)果(鈣黃綠素顯色)，也可以直接用濁度儀判斷結(jié)果；4)操作簡(jiǎn)單只要將檢測(cè)樣品(靶核酸)和檢測(cè)試劑一起放入60_65°C恒溫水浴鍋中50分鐘后就可以判斷結(jié)果；5)快速、高效擴(kuò)增整個(gè)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)一小時(shí)內(nèi)即可完成，且產(chǎn)率可達(dá)到0. 5mg/
mLo綜上所述，本發(fā)明可以在等溫條件下快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測(cè)到結(jié)核桿菌，不需要復(fù)雜儀器，為結(jié)核桿菌的檢測(cè)提供了一個(gè)新的技術(shù)平臺(tái)，可用于畜牧業(yè)生產(chǎn)單位、基層醫(yī)療衛(wèi)生單位和各疾病預(yù)防控制中心篩查和檢測(cè)結(jié)核桿菌，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益，適于大范圍推廣應(yīng)用。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為5套引物的LAMP擴(kuò)增曲線圖2為本發(fā)明結(jié)核桿菌LAMP檢測(cè)方法特異性的濁度儀檢測(cè)結(jié)果圖3為本發(fā)明結(jié)核桿菌LAMP檢測(cè)方法特異性的鈣黃綠素指示劑染色檢測(cè)結(jié)果圖4為本發(fā)明結(jié)核桿菌LAMP檢測(cè)方法靈敏度的濁度儀檢測(cè)結(jié)果圖5為本發(fā)明結(jié)核桿菌LAMP檢測(cè)方法靈敏度的鈣黃綠素指示劑染色檢測(cè)結(jié)果圖6為結(jié)核桿菌的PCR檢測(cè)結(jié)果
具體實(shí)施例方式實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、用于對(duì)結(jié)核桿菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)的引物設(shè)計(jì)從美國(guó)基因數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得結(jié)核桿菌序列(GenBank號(hào)CP0(^992. 1)，通過(guò)BLAST 軟件進(jìn)行同源性分析，獲得結(jié)核桿菌的特異性保守靶序列IS6110(序列表中序列1)，再根據(jù)該保守靶DNA序列，用軟件I^rimer design V4設(shè)計(jì)用于對(duì)結(jié)核桿菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)的引物，設(shè)計(jì)出5套引物(JH164、JH118、JH99、JH75、JHM)，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比(參見(jiàn)實(shí)施例2)，最終選取了由6條引物組成的引物組合JH164(6條引物可以任意比例組配，實(shí)施例2反應(yīng)體系中給出了一種具體優(yōu)化組配作為示例)，其引物序列如表1所示。表1用于對(duì)結(jié)核桿菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)的引物JH16權(quán)利要求
1.用于對(duì)結(jié)核桿菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)的專用引物，是根據(jù)如序列表中序列1所示的結(jié)核桿菌的特異性保守靶序列IS6110設(shè)計(jì)的，用以定性檢測(cè)待測(cè)樣品中的結(jié)核桿菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的專用引物，其特征在于所述用于對(duì)結(jié)核桿菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)的專用引物命名為JH164引物組合，由以下三組引物對(duì)混合得到，第一組引物對(duì)引物 1 (F3)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，引物2 (B3)，其核苷酸序列如序列表中序列3 所示；第二組引物對(duì)引物3(FIP)，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，引物4(BIP)，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；第三組引物對(duì)引物5 (LF)，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，引物6 (LB)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的專用引物，其特征在于所述JH164引物組合中各引物對(duì) (FIP 和 BIP) (LF 和 LB) (F3 禾口 B3)的摩爾比為 40 20 5。
4.一種結(jié)核桿菌的LAMP檢測(cè)方法，包括以下步驟1)以待測(cè)樣品的基因組DNA為模板，在權(quán)利要求1或2或3所述專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；所述待測(cè)樣品為純菌液、痰液或腦脊液等；2)反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行結(jié)果判定在反應(yīng)液中添加鈣黃綠素指示劑，根據(jù)反應(yīng)液的顏色變化判斷結(jié)果，綠色表示待測(cè)樣品中存在結(jié)核桿菌，橙色表示待測(cè)樣品中不存在結(jié)核桿菌；或者不添加鈣黃綠素指示劑直接用濁度儀檢測(cè)反應(yīng)前后反應(yīng)液的濁度變化來(lái)判斷結(jié)果，濁度上升表示待測(cè)樣品中存在結(jié)核桿菌，濁度無(wú)變化表示待測(cè)樣品中不存在結(jié)核桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟1)中的25μ 1 LAMP反應(yīng)體系可包括待測(cè)物的基因組 DNA 2 μ l,20mM Tris · HCl (pH 8. 8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4, 0.1 % Tween20，0. 8M 甜菜堿(betaine)，8mM MgSO4,1. 4mMdNTP each，8U Bst DNA polymerase，引物加入量為40pmol序列表中序列2(FIP)和序列3(BIP)所示引物，20pmol 序列表中序列4 (LF)和序列5 (LB)所示引物，5pmol序列表中序列6 (F3)和序列7 (B3)所示引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟1)中的LAMP擴(kuò)增條件為置60-65°C恒溫40-60min，優(yōu)選為50min，。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟2)中鈣黃綠素指示劑的添加量為1 μ 1，包含有0. 5mM鈣黃綠素和IOmM氯化錳。
8.一種結(jié)核桿菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，包含有權(quán)利要求1或2或3所述的結(jié)核桿菌的 LAMP檢測(cè)的專用引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述結(jié)核桿菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照為結(jié)核桿菌的基因組DNA，所述陰性對(duì)照為不含DNA 的LAMP擴(kuò)增體系，如雙蒸水。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述結(jié)核桿菌的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括20mM Tris ‘ HCKpH 8. 8), IOmM KCl，IOmM (NH4) 2S04，0. Tween20，0. 8M 甜菜堿(betaine), 8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each, JH164 引物組合40pmol FIP 和 BIP，20pmol LF 禾口 LB，5pmol F3 和B3 ；Bst DNA聚合酶、雙蒸水、鈣黃綠素指示劑和結(jié)核桿菌的基因組DNA。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了結(jié)核桿菌的LAMP檢測(cè)方法及其專用引物與試劑盒。該專用引物包含由FIP、BIP、LF、LB、F3和B3共6條引物組成的引物組合，本發(fā)明LAMP檢測(cè)方法可以在等溫條件下快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測(cè)到結(jié)核桿菌，不需要復(fù)雜儀器，可針對(duì)純菌試樣以及臨床痰液、腦脊液樣本等進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明為結(jié)核桿菌的檢測(cè)提供了一個(gè)新的技術(shù)平臺(tái)，可用于基層醫(yī)療衛(wèi)生單位和各疾病預(yù)防控制中心篩查和檢測(cè)結(jié)核桿菌。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102399901SQ20111043251
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者劉威, 尹志濤, 熊鴻燕, 袁靜, 鄒大陽(yáng), 黃留玉 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制所