一種用于快速特異檢測結(jié)核桿菌感染的試劑盒及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于快速特異檢測結(jié)核桿菌感染的試劑盒，包括三對(duì)分別用于結(jié)核桿菌游離小RNA的特異性引物。本發(fā)明通過設(shè)計(jì)針對(duì)結(jié)核桿菌游離小RNA的特異性引物，從人外周血中提取和檢測結(jié)核桿菌游離小RNA，合成cDNA后，建立了含梯度稀釋的cDNA實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增體系，從而建立快速特異的結(jié)核菌感染檢測的試劑盒及方法，最終解決了結(jié)核患者實(shí)驗(yàn)室診斷耗時(shí)長、敏感性低和操作復(fù)雜等問題。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的試劑盒可用于臨床實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)核桿菌感染，還可用于臨床治療效果的評(píng)價(jià)。使用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行結(jié)核桿菌的檢測具有敏感性高、特異性好、成本低、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足臨床及實(shí)驗(yàn)室快速診斷的需要。
【專利說明】-種用于快速特異檢測結(jié)核桿菌感染的試劑盒及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測結(jié)核桿菌感染的試劑盒，特別涉及一種能夠快速而且特 異地從人外周血中檢測結(jié)核菌感染的試劑盒，本發(fā)明屬于結(jié)核桿菌的臨床診斷領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核分枝桿菌（M. tuberculosis)，俗稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌?？汕址?全身各器官，但以肺結(jié)核為最多見。結(jié)核病至今仍為重要的傳染病。估計(jì)世界人口中1/3 感染結(jié)核分枝桿菌。據(jù)WHO報(bào)道，每年約有800萬新病例發(fā)生，至少有300萬人死于該病。 我國建國前死亡率達(dá)200-300人/10萬,居各種疾病死亡原因之首,建國后人民生活水平提 高，衛(wèi)生狀態(tài)改善，特別是開展了群防群治，兒童普遍接種卡介苗，結(jié)核病的發(fā)病率和死亡 率大為降低。但應(yīng)注意，世界上有些地區(qū)因艾滋病、吸毒、免疫抑制劑的應(yīng)用、酗酒和貧困等 原因，發(fā)病率又有上升趨勢。
[0003] 20世紀(jì)80年代后，由于艾滋病和結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)、免疫抑制劑的應(yīng) 用、吸毒、貧困及人口流動(dòng)等因素，全球范圍內(nèi)結(jié)核病的疫情驟然惡化。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全世界 約每3個(gè)人中就有1個(gè)人感染了結(jié)核分枝桿菌，在某些發(fā)展中國家成人中結(jié)核分枝桿菌攜 帶率高達(dá)80%，其中約5%?10%攜帶者可發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病。近二十年由于艾滋病的 流行，感染了 HIV的結(jié)核分枝桿菌攜帶者，由于病毒破壞了機(jī)體的免疫功能，發(fā)展為活動(dòng)性 結(jié)核病的可能性比未感染HIV者高30?50倍，且結(jié)核的病程發(fā)展更快。此外，在HIV感染 的發(fā)展進(jìn)程中，結(jié)核是最早發(fā)生的一種機(jī)會(huì)性感染，結(jié)核病加重了 HIV感染者或艾滋病人 的疾病負(fù)擔(dān)，使其更易死亡。目前全球每年約出現(xiàn)800萬結(jié)核新病例，并導(dǎo)致約300萬萬人 死亡。中國每年死于結(jié)核病的人約25萬之多，是各類傳染病死亡人數(shù)總和的兩倍多。因 此，結(jié)核病又成為了威脅人類健康的全球性衛(wèi)生問題，并成為某些發(fā)展中國家和地區(qū)，特別 是艾滋病高發(fā)區(qū)人群的首要死因。
[0004] 在本發(fā)明的前期工作中已經(jīng)明確了人結(jié)核桿菌H37RV株染色體為4,411，532bp， 通過分析細(xì)菌中提取的小分子RNA，或者用基于生物信息學(xué)的方法，目前在該株細(xì)菌中共 確認(rèn)和驗(yàn)證了 100余種小RNA(sRNA)，它們不僅調(diào)控結(jié)核菌的基因表達(dá)，而且參與細(xì)菌的應(yīng) 激調(diào)節(jié)，同時(shí)也可能參與感染和致病。本發(fā)明的前期試驗(yàn)表明，這些小RNA還可以釋放到菌 體外，在人體循環(huán)中發(fā)揮作用。在外周血中，小RNA與microRNA -樣有很好的抗RNA酶降 解的作用。提示它們可用于結(jié)核桿菌感染的外周血檢測診斷中。
[0005] 在本發(fā)明的前期試驗(yàn)中，發(fā)明人選取了已明確存在結(jié)核桿菌中的若干種sRNA用 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法在人外周血中進(jìn)行了檢測。通過對(duì)結(jié)核患者外周血樣本離心分離 的血漿進(jìn)行結(jié)核菌sRNA的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者外周血漿中存在結(jié)核菌sRNA。提示結(jié)核菌 sRNA可能具有分泌功能。
[0006] 細(xì)菌sRNA具有復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)PCR反應(yīng)體系及條件要求高，易出現(xiàn)非特異反 應(yīng)，即假陽性，給實(shí)驗(yàn)室診斷帶來一定困難。所以建立一個(gè)敏感度高、特異性好的實(shí)驗(yàn)室診 斷方法在結(jié)核桿菌快速診斷中是至關(guān)重要的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有結(jié)核桿菌感染檢測技術(shù)中耗時(shí)長、陽性率低和操作復(fù) 雜等缺點(diǎn)，提供了一種方便的、高敏感性和特異性、可廣泛應(yīng)用的sRNA檢測的試劑盒。利用 本發(fā)明的試劑盒可以實(shí)現(xiàn)快速，高效，準(zhǔn)確地從人外周血中檢測結(jié)核菌感染的目的。
[0008] 為了達(dá)到上述目的本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：
[0009] 1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，自主設(shè)計(jì)了三對(duì)分別用于人外周血中結(jié)核桿菌游離 小RNA的檢測引物，并建立檢測和疾病診斷的具體應(yīng)用方法；
[0010] 2.基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制原理，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR樣本體系中 加入濃度倍比稀釋的模板，進(jìn)一步通過反應(yīng)中測得的CT值是否成線性關(guān)系來確定SRNA在 外周血中的有無。
[0011] 具體的，本發(fā)明的一種用于快速特異檢測結(jié)核桿菌感染的試劑盒，其特征在于包 括三對(duì)分別用于結(jié)核桿菌游離小RNA的特異性引物，第一對(duì)引物的核苷酸序列分別為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，第二對(duì)引物的核苷酸序列分別為SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4 所示，以及第三對(duì)引物的核苷酸序列分別為SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示。
[0012] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的試劑盒為熒光定量PCR檢測試劑盒。
[0013] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的試劑盒中還包括SYBR Green染料。
[0014] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的試劑盒用于快速特異檢測結(jié)核桿菌感染，按照以下步 驟進(jìn)行：
[0015] (1)從患者的外周血中分離血楽,并提取其中的總RNA ;
[0016] ⑵利用隨機(jī)引物將提取得到的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ;
[0017] (3)分別應(yīng)用權(quán)利要求1中的三對(duì)特異性引物對(duì)上述cDNA進(jìn)行體外核酸擴(kuò)增；
[0018] (4)根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷是否感染。
[0019] 其中，優(yōu)選的，所述的體外核酸擴(kuò)增是指采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。
[0020] 其中，優(yōu)選的，以原液、4倍稀釋、16倍稀釋的模板分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò) 增，通過熒光檢測分別得到模板原液CT值、4倍稀釋的CT值及16倍稀釋的CT值，如果稀釋 倍數(shù)與CT值成線性關(guān)系則說明血液樣本中存在結(jié)核菌sRNA，即感染了結(jié)核桿菌。
[0021] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的試劑盒在制備快速特異檢測結(jié)核桿菌感染的試 劑中的應(yīng)用。
[0022] 相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：
[0023] 1、本發(fā)明所涉及檢測的結(jié)核桿菌小RNA為游離存在于患者外周血中，標(biāo)本容易獲 得。
[0024] 2、本發(fā)明所涉及的結(jié)核桿菌小RNA可以抵抗RNA酶的降解作用，在外周血中穩(wěn)定 存在。
[0025] 3、本發(fā)明所涉及的核酸擴(kuò)增方法可以高靈敏度的檢測血中低水平的結(jié)合小RNA， 且本發(fā)明的三對(duì)引物只在結(jié)核桿菌（BCG)中呈特異性擴(kuò)增反應(yīng)，而對(duì)于常見的感染性細(xì)菌 大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌無擴(kuò)增，說明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物具有良好的特異性。
[0026] 4、本發(fā)明涉及到的倍比稀釋基于實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，具有強(qiáng)大的理論 基礎(chǔ)。
[0027] 5、本發(fā)明所涉及的檢測方法無需結(jié)核菌培養(yǎng)，因此使用更安全、更快速。
[0028] 6、本發(fā)明所涉及的引物根據(jù)細(xì)菌小RNA特點(diǎn)設(shè)計(jì)，序列更加優(yōu)化。
[0029] 7、結(jié)核菌感染率高，是當(dāng)今感染的局勢和特點(diǎn)，本發(fā)明所涉及的檢測方法便于大 規(guī)模篩查檢測，能夠滿足當(dāng)前對(duì)于結(jié)核菌感染檢測的需要。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1為正常人與患者血清中SRNA熒光定量PCR檢測的CT值結(jié)果；
[0031] 其中患者CT值相對(duì)正常人小且具有線性關(guān)系，正常人CT值較高且無線性關(guān)系；
[0032] 圖2為患者cDNA梯度稀釋后定量PCR熒光累積曲線；
[0033] 圖3為正常人cDNA梯度稀釋后定量PCR熒光累積曲線；
[0034] 圖4為qPCR的反應(yīng)條件設(shè)定；
[0035] 圖5為使用發(fā)明的引物的特異性PCR檢測結(jié)果；
[0036] 圖5A為第一對(duì)引物的特異性PCR檢測結(jié)果，圖5B為第二對(duì)引物的特異性PCR檢 測結(jié)果，圖5C為第三對(duì)引物的特異性PCR檢測結(jié)果；
[0037] 圖6為不同拷貝數(shù)小RNA用對(duì)應(yīng)引物對(duì)（第一對(duì)引物）做定量PCR的熒光圖及CT 檢測結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著 描述而更為清楚"但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制"本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0039] 實(shí)施例1引物的設(shè)計(jì)與合成
[0040] 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，自主設(shè)計(jì)并合成了三對(duì)分別用于結(jié)核桿菌游離小RNA 的特異性引物，第一對(duì)引物的核苷酸序列分別為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，第二對(duì) 引物的核苷酸序列分別為SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示，以及第三對(duì)引物的核苷酸序 列分別為SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示（表1)。
[0041] 表1多重PCR檢測引物組
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于快速特異檢測結(jié)核桿菌感染的試劑盒，其特征在于包括三對(duì)分別用于結(jié) 核桿菌游離小RNA的特異性引物，第一對(duì)引物的核苷酸序列分別為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，第二對(duì)引物的核苷酸序列分別為SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示，以及第三對(duì) 引物的核苷酸序列分別為SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒為熒光定量PCR檢測試劑盒。
3. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于還包括SYBR Green染料。
4. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于用于快速特異檢測結(jié)核桿菌感染，按照以 下步驟進(jìn)行： (1) 從患者的外周血中分離血漿，并提取其中的總RNA ; (2) 利用隨機(jī)引物將提取得到的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ; (3) 分別應(yīng)用權(quán)利要求1中的三對(duì)特異性引物對(duì)上述cDNA進(jìn)行體外核酸擴(kuò)增； (4) 根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷是否感染。
5. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的體外核酸擴(kuò)增是指采用實(shí)時(shí)熒光定 量PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。
6. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于以原液、4倍稀釋、16倍稀釋的模板分別進(jìn) 行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，通過熒光檢測分別得到模板原液CT值、4倍稀釋的CT值及16倍 稀釋的CT值，如果稀釋倍數(shù)與CT值成線性關(guān)系則說明血液樣本中存在結(jié)核菌sRNA，即感染 了結(jié)核桿菌。
7. 權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的試劑盒在制備快速特異檢測結(jié)核桿菌感染的試劑中的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104313127SQ201410443043
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月2日
【發(fā)明者】張鳳民, 李文靜, 付英梅, 宋武琦, 張智瑋 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)