專利名稱：活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物氫譜多肽的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，特別是涉及一種活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物(ActiveTuberculosis Mark-ATM)′H(氫譜)多肽的檢測(cè)方法。
國(guó)內(nèi)外有關(guān)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)種類較多，早期建立現(xiàn)在仍廣泛使用的常規(guī)檢測(cè)方法有痰涂片、菌型鑒定、分離培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)及OT皮試等。近十年來(lái)發(fā)展較快的方法有，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、酶聯(lián)免疫電泳技術(shù)(ELIEP)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及核酸探針(DNA Pribe)等。以上各種方法進(jìn)行結(jié)核病診斷時(shí)，均是以抗體、抗原及免疫復(fù)合物作檢測(cè)指標(biāo)。
本發(fā)明的目的在于提供一種利用活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物′H多肽對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病患者的體液進(jìn)行檢測(cè)的活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物的檢測(cè)方法。
本發(fā)明活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物′H多肽檢測(cè)方法中的活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物′H多肽經(jīng)氫譜象位分析，確定不屬于抗體范疇，而是一種僅存在于活動(dòng)性結(jié)核病患者體內(nèi)的一種蛋白質(zhì)成分，并從對(duì)11個(gè)國(guó)家和地區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)菌株中，經(jīng)反復(fù)技術(shù)分析和實(shí)驗(yàn)篩選，確立了CD-1331顆粒性抗原，其特點(diǎn)是與′H多肽結(jié)合穩(wěn)定，特異，且無(wú)毒無(wú)污染，在特定的試驗(yàn)條件下，通過(guò)反應(yīng)，CD1331可與′H多肽形成疏松的吸附環(huán)。經(jīng)染色后，通過(guò)觀察吸附環(huán)的顏色對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病進(jìn)行診斷。
本發(fā)明活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物′H多肽的檢測(cè)方法是這樣進(jìn)行的，在反應(yīng)原CD1331中加入活化劑，如多肽、內(nèi)纖酶等常用活化劑，充分混合，活化反應(yīng)原后備用；在瓊脂糖介質(zhì)中加入緩沖液，如巴比妥緩沖液、薩姆緩沖液等常用緩沖液，加熱熔化，控制PH＝8.5～8.6，離子強(qiáng)度u＝0.03，介質(zhì)含水量大于99％，并于40～46℃溫度下，向瓊脂糖介質(zhì)緩沖液中加入反應(yīng)原CD1331，其加入比例為，瓊脂糖介質(zhì)緩沖液∶反應(yīng)原＝10∶1，制備反應(yīng)原凝膠板。采用常規(guī)的U型制板框制備，控制反應(yīng)原凝膠板的厚度為2mm，其長(zhǎng)度和寬度可根據(jù)條件設(shè)定；然后利用孔位模板對(duì)反應(yīng)原凝膠板打孔，控制孔徑為3mm，孔間距為12～15mm，打孔時(shí)注意挑出孔中凝膠塊，每孔中加入待測(cè)樣品，待測(cè)樣品為體液，如血清、血漿、胸腹水、腦脊液、尿液及膿汁等。樣品高體放置時(shí)間不超過(guò)10小時(shí)，放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果；再將加樣后的凝膠板于37～42℃的溫度下擴(kuò)散30分鐘～16小時(shí)，即反應(yīng)30分鐘～16小時(shí)，擴(kuò)散時(shí)間的長(zhǎng)短與樣品離體放置時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)，放置時(shí)間越長(zhǎng)，擴(kuò)散時(shí)間亦越長(zhǎng)，此時(shí)，′H多肽與反應(yīng)原形成疏松的吸附環(huán)。樣品加入量以10μl為宜。恒溫?cái)U(kuò)散可在水箱或培養(yǎng)箱等恒溫箱中進(jìn)行；最后將擴(kuò)散后的凝膠板置于生理鹽水中浸泡8～24小時(shí)，其間更換生理鹽水2～3次，徹底洗凈各種未結(jié)合的雜蛋白，干燥后，用染色液染色，脫色，吸附環(huán)即成一中心深染，隨面積擴(kuò)大色澤逐漸變淡，直至消失的著色環(huán)，晾干后觀察著色環(huán)顏色，判定檢測(cè)結(jié)果。所用染色液可以是麗春紅、氨基黑等常用染色液。觀察時(shí)如著色環(huán)為無(wú)色，則為陰性，而根據(jù)不同染色液呈現(xiàn)不同顏色時(shí)，則為陽(yáng)性。
本發(fā)明活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物的檢測(cè)方法與OT皮試、酶聯(lián)免疫ELISA、DNA探針、PCR基因擴(kuò)增技術(shù)及典型病例組患者進(jìn)行X線計(jì)算機(jī)斷層攝影(CT)、磁共振成像(MRI)等進(jìn)行多組對(duì)比試驗(yàn)，試驗(yàn)及臨床研究證明，′H多肽檢測(cè)的總敏感度為86.87％，特異度96.15％，準(zhǔn)確度95.20％，診斷效率為83.53％，批內(nèi)CV1.2％，批間CV2.0％，P＜0.005，X2檢驗(yàn)＝443.19，相關(guān)系數(shù)＝0.93。
本發(fā)明活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物的檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)在于其準(zhǔn)確性高和實(shí)用性廣，1)由于檢測(cè)對(duì)象不是抗原，故解決了肺外結(jié)核，如骨結(jié)核、肝結(jié)核、子宮內(nèi)膜結(jié)核等深部病變部位取材的困難，使肺部結(jié)核不排菌時(shí)，痰培養(yǎng)及抗酸染色出現(xiàn)的假陰性結(jié)果得以糾正。2)由于檢測(cè)對(duì)象不是抗體，故不受曾否預(yù)防接種和曾否罹患結(jié)核病的影響，使結(jié)果具確診的價(jià)值。3)檢測(cè)程序合理，設(shè)計(jì)科學(xué)，干擾因素少，在體外檢查機(jī)體感染結(jié)核菌情況，完全避免了皮膚實(shí)驗(yàn)造成的醫(yī)源性損傷。4)與疾病的輕重呈正相關(guān)，與療效的好差成負(fù)相關(guān)，因半衰期很短，有助于臨床調(diào)整藥物、觀察療效、及時(shí)判斷采取相應(yīng)措施。5)方法簡(jiǎn)捷，費(fèi)用低廉，既可用于臨床，又可用于大批量人群普查和流行病學(xué)調(diào)查。
下面結(jié)合附圖
詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例實(shí)施例1一、試劑1、反應(yīng)原CD-1331(顆粒性反原)2、活化劑多肽3、緩沖液巴比妥緩沖液(PH＝8.6，u＝0.03)4、介質(zhì)瓊脂糖(日本進(jìn)口)5、染色液麗春紅二、操作取反應(yīng)原CD1331(安瓶、10U)1支，加入多肽4.0ml，充分混勻備用。取瓊脂糖0.9g于三角燒瓶中，加入巴比妥緩沖液100ml，置于沸水浴加熱溶化，準(zhǔn)確吸取瓊脂糖介質(zhì)緩沖液10ml于燒杯中，待41℃溫度時(shí)加反應(yīng)原液1,0ml，充分混勻，乘熱倒入制板框中，靜置冷卻后移去文具夾、蓋片及U型框，制成2mm×70mm×130mm的反應(yīng)原凝膠板。將孔位模板襯在抗原凝膠板下，用打孔器對(duì)準(zhǔn)孔位打孔(孔徑3mm，孔間距15mm)，并挑出孔中凝膠塊，每孔加入待測(cè)樣品血清10μl(離體放置1小時(shí))，避免氣泡外溢。將加樣后的凝膠板水平放置于培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃下擴(kuò)散30分鐘。取出凝膠板，放入生理鹽水中浸泡8小時(shí)，其間更換2次生理鹽水，于燥后用麗春紅染色液染色，脫色，晾干后觀察吸附環(huán)里紅色，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。
實(shí)施例2一、試劑1、反應(yīng)原CD-1331(顆粒性反應(yīng)原)2、活化劑內(nèi)纖酶3、緩沖液薩姆緩沖液(PH＝8.5，υ＝0.03)4、介質(zhì)瓊脂糖(國(guó)產(chǎn))5、染色液氨基黑二、操作取反應(yīng)原CD1331(安瓶、10U)1支，加入內(nèi)纖酶1.0ml，充分混勻備用。取瓊脂糖0.9g于三角燒瓶中，加入薩姆緩沖液100ml，置于沸水浴加熱溶化，準(zhǔn)確吸取瓊脂糖介質(zhì)緩沖液10ml于燒杯中，待溫度45℃時(shí)加反應(yīng)原液1.0ml，充分混勻，乘熱倒入制板框中，靜置冷卻后移去文具夾、蓋片及U型框，制成2mm×70mm×130mm的反應(yīng)原凝膠板。將孔位模板襯在抗原凝膠板下，用打孔器對(duì)準(zhǔn)孔位打孔(孔徑3mm，孔間距12mm)，并挑出孔中凝膠塊，每孔加入待測(cè)樣品血槳10μl(離體放置8小時(shí))，避免氣泡外溢。將加樣后的凝膠板水平放置于水浴箱內(nèi)，在37℃下擴(kuò)散15小時(shí)。取出凝膠板，放入生理鹽水中浸泡24小時(shí)，其間更換3次生理鹽水，干燥后用氨基黑染色液染色，脫色，晾于后觀察吸附環(huán)呈蘭色，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。
權(quán)利要求
1.一種活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物′H多肽的檢測(cè)方法，其特征在于1)在反應(yīng)原CD1331中加入活化劑，充分混合備用；2)在瓊脂糖介質(zhì)中加入緩沖液，加熱熔化，并控制PH＝8.5～8.6，離子強(qiáng)度u＝0.03，于40～46℃溫度下加入反應(yīng)原CD1331，制備反應(yīng)原凝膠板；3)利用孔位模板對(duì)反應(yīng)原凝膠板進(jìn)行打孔，然后向孔內(nèi)加入待測(cè)樣品；4)將加樣后的反應(yīng)原凝膠板于37～42℃的溫度下擴(kuò)散30分鐘～16小時(shí)；5)將擴(kuò)散后的反應(yīng)原凝膠板置于生理鹽水中浸泡8～24小時(shí)，其間更換生理鹽水2～3次，干燥后用染色液染色，脫色，晾干后觀察吸環(huán)顏色。
2.如權(quán)利要求1所述的活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物′H多肽的檢測(cè)方法，其特征在于瓊脂糖介質(zhì)緩沖液的含水量大于99％。
3.如權(quán)利要求1所述的活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物′H多肽的檢測(cè)方法，其特征在于瓊脂糖介質(zhì)緩沖液與反應(yīng)原的混合比例為10∶1。
4.如權(quán)利要求1所述的活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物′H多肽的檢測(cè)方法，其特征在于反應(yīng)原凝膠板的厚度為2mm。
5.如權(quán)利要求1所述的活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物′H多肽的檢測(cè)方法，其特征在于凝膠板打孔用孔位模板的孔徑為3mm，孔間距為12～15mm。
6.如權(quán)利要求1所述的活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物′H多肽的檢測(cè)方法，其特征在于待測(cè)樣品是離體放置時(shí)間不超過(guò)10小時(shí)的體液。
7.如權(quán)利要求1所述的活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物′H多肽的檢測(cè)方法，其特征在于反應(yīng)原CD1331是顆粒性反應(yīng)原。
全文摘要
本發(fā)明提供一種活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)志物′H多肽的檢測(cè)方法,首先在反應(yīng)原CD1331中加入活化劑備用;在瓊脂糖介質(zhì)中加入緩沖液,加熱熔化,并控制pH=8.5～8.6,離子強(qiáng)度u=0.03,于40～46℃溫度下加入反應(yīng)原CD1331,制備反應(yīng)原凝膠板;對(duì)反應(yīng)原凝膠板打孔,然后向孔內(nèi)加入待測(cè)樣品;于37～42℃擴(kuò)散30分鐘～16小時(shí),用生理鹽水浸泡,干燥,染色,脫色,觀察吸附環(huán)顏色。本法適合于活動(dòng)期結(jié)核病患者體液檢查,敏感度86.87%,特異度96.15%,準(zhǔn)確度95.20%。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1186242SQ9611784
公開(kāi)日1998年7月1日 申請(qǐng)日期1996年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月23日
發(fā)明者胡娟 申請(qǐng)人:成都軍區(qū)生物醫(yī)學(xué)研究所