專利名稱：表達(dá)尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種表達(dá)尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株及其制備方法和應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明提供表達(dá)尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株rLa_NiVF (其保藏號(hào)為CGMCC No. 5401)及其在制備用于預(yù)防尼帕病腦炎的疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
尼帕病腦炎是一種高度烈性人畜共患傳染病，其病原尼帕病毒屬于副粘病毒科， 亨尼帕病毒屬，同屬的只有亨德拉病毒[1]。尼帕病毒宿主范圍非常廣泛，其中豬是重要的易感動(dòng)物。尼帕病毒的自然宿主為果蝠[2]。該病于1998年9月下旬至1999年6月中旬于馬來(lái)西亞首次爆發(fā)，發(fā)病例數(shù)高達(dá)265例，死亡105例，死亡率為38.5%。為了控制疾病的蔓延，馬來(lái)西亞政府屠殺了一百多萬(wàn)頭豬，占該國(guó)養(yǎng)豬量40%。此后，該病又在印度、孟加拉等國(guó)陸續(xù)發(fā)生，而本病的致死率也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(67% -92% ) [3]。尼帕病毒給這些國(guó)家的畜牧業(yè)發(fā)展和人民健康造成了嚴(yán)重危害。我國(guó)目前雖然沒(méi)有該病爆發(fā)，但其已經(jīng)對(duì)我國(guó)構(gòu)成了巨大威脅。果蝠在東南亞地區(qū)廣泛分布，在我國(guó)南方地區(qū)分布較多，國(guó)內(nèi)已有學(xué)者從我國(guó)南方地區(qū)的蝙蝠當(dāng)中檢測(cè)到了尼帕病毒抗體的存在W]。由于我國(guó)周邊多個(gè)國(guó)家爆發(fā)該病，伴隨著貿(mào)易往來(lái)的不斷加深該病傳入我國(guó)的壓力也不斷增大。且我國(guó)養(yǎng)豬數(shù)量極大，養(yǎng)豬業(yè)已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)的重要支柱性產(chǎn)業(yè)之一，因此該病一旦爆發(fā)勢(shì)必會(huì)對(duì)我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)及人民群眾的正常生活和生命安全造成嚴(yán)重危害，防控形勢(shì)不容樂(lè)觀。因此，儲(chǔ)備可以有效防控尼帕病毒的疫苗具有非常重要的戰(zhàn)略意義。尼帕病毒的融合蛋白(F蛋白)是位于病毒粒子表面的I型跨膜糖蛋白，其主要功能是介導(dǎo)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合，從而使病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞。F蛋白是尼帕病毒的主要免疫保護(hù)性抗原，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生CTL(殺傷性T細(xì)胞)免疫反應(yīng)的主要結(jié)構(gòu)蛋白。 F蛋白也能使免疫動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體[5，6]。本研究利用新城疫病毒LaSota疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)成功構(gòu)建了表達(dá)尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒活載體疫苗-rLa-NiVF，并在小鼠和豬體內(nèi)對(duì)rLa-NiVF的免疫效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，證明此疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，是防控尼帕腦炎病毒的優(yōu)秀的候選疫苗，在我國(guó)應(yīng)對(duì)尼帕病毒的潛在威脅中顯示了良好的應(yīng)用前景，因而具有重要的戰(zhàn)略意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種表達(dá)尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株及其制備方法和應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明提供表達(dá)尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株rLa-NiVF (其保藏號(hào)為CGMCC No. 5401)及其在制備用于預(yù)防尼帕病腦炎的疫苗中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明成功構(gòu)建了表達(dá)尼帕病毒(Nipah virus，NiV)F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF (該疫苗株于2011年10月沈日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，中國(guó)北京，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)，并在小鼠和斷奶仔豬上系統(tǒng)評(píng)價(jià)了所述重組病毒產(chǎn)生的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。本發(fā)明采用新城疫病毒LaSota弱毒株反向遺傳操作系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)尼帕病毒F 蛋白的重組新城疫病毒rLa-NiVF。用間接免疫熒光和特異性細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)證實(shí)尼帕病毒 F蛋白的表達(dá)；將所述重組病毒免疫小鼠，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和水泡性口炎病毒囊膜嵌合尼帕腦炎病毒G/F蛋白偽型病毒粒子做中和試驗(yàn)(VNA)以檢測(cè)重組病毒誘導(dǎo)的體液免疫水平；用流式細(xì)胞術(shù)(FACQ評(píng)價(jià)重組病毒產(chǎn)生的特異性細(xì)胞免疫。以rLa-NiVF免疫斷奶仔豬并檢測(cè)中和抗體水平。結(jié)果顯示，rLa-NiVF能夠正確表達(dá)尼帕病毒F蛋白。將重組病毒免疫Balb/c小鼠，ELISA表明免疫組小鼠可產(chǎn)生特異性IgG，病毒中和試驗(yàn)顯示免疫小鼠可以產(chǎn)生針對(duì)尼帕病毒的中和抗體；流式細(xì)胞術(shù)表明免疫組小鼠能夠產(chǎn)生高水平的 F蛋白特異性CD8細(xì)胞免疫反應(yīng)。豬免疫試驗(yàn)表明，rLa-NiVF可以誘導(dǎo)豬產(chǎn)生較高水平的中和抗體。本發(fā)明的成果目前國(guó)內(nèi)外均無(wú)報(bào)道，具有很強(qiáng)的創(chuàng)新性。rLa-NiVF作為一種具有前瞻性，創(chuàng)新性，并且高效安全的防控尼帕病毒的候選疫苗，對(duì)我國(guó)應(yīng)對(duì)尼帕病毒潛在威脅具有重要的戰(zhàn)略意義。本發(fā)明提供制備表達(dá)尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株的方法，所述方法包括下述步驟(1)構(gòu)建重組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括其中插入尼帕病毒F基因的所述新城疫 LaSota疫苗株的基因組cDNA序列，將所述重組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒命名為pBRN_NiVF ；(2)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒系統(tǒng)，該輔助質(zhì)粒系統(tǒng)包括編碼所述新城疫LaSota疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列的輔助質(zhì)粒pBSNP、編碼所述新城疫LaSota疫苗株的磷酸蛋白 (P)的cDNA序列的輔助質(zhì)粒pBSP、和編碼所述新城疫LaSota疫苗株的大聚合酶蛋白(L) 的cDNA序列的輔助質(zhì)粒pBSL ；(3)將步驟(1)的所述重組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒PBRN-NiVF和步驟⑵的轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒 pBSNP.pBSP.pBSL共轉(zhuǎn)染所述新城疫LaSota疫苗株復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；和(4)收獲上清液，過(guò)濾后接種雞胚尿囊腔拯救重組病毒株。更具體地，制備表達(dá)尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株的方法描述如下以人工合成的尼帕病毒F基因cDNA (SEQ ID No. 1，其編碼的F蛋白氨基酸序列為SEQ ID No. 2)為模板，利用PCR方法分別在F基因兩端插入新城疫病毒特異性基因起始和終止序列以及Riie I限制性酶切位點(diǎn)，測(cè)序鑒定無(wú)誤，將F基因插入到LaSota全長(zhǎng)基因組質(zhì)粒 (該質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，構(gòu)建方法可參見已獲得授權(quán)的專利申請(qǐng)?zhí)?00510097997. 8， 發(fā)明名稱為“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用”，發(fā)明人步志高，陳化蘭， 申請(qǐng)時(shí)間2005年9月2日)的P(磷蛋白)和M(基質(zhì)蛋白)基因之間的Riie I位點(diǎn)，構(gòu)建成全長(zhǎng)重組質(zhì)粒pBRN-NiVF，利用質(zhì)粒提取試劑盒大量制備此重組質(zhì)粒，同時(shí)以輔助質(zhì)粒 pBSNP、pBSP、pBSL(所述輔助質(zhì)粒的構(gòu)建參見參考文獻(xiàn)[7])共同轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞(預(yù)先感染表達(dá)T7聚合酶的重組痘病毒)，72小時(shí)后以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清接種10日齡SPF雞胚尿囊腔，接種72小時(shí)后取接種雞胚的尿囊液做血凝試驗(yàn)HA和新城疫血凝抑制試驗(yàn)HI均呈陽(yáng)性，初步表明病毒拯救成功。以拯救得到的重組病毒rLa-NiVF感染BHK-21細(xì)胞，并同時(shí)轉(zhuǎn)
4染表達(dá)尼帕病毒G蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒PCAGG-NiVG，24小時(shí)后可以觀察到尼帕病毒F和G 蛋白共同表達(dá)介導(dǎo)的特異性細(xì)胞融合；另用鼠抗MV F蛋白單克隆抗體作一抗用間接免疫熒光檢測(cè)尼帕F蛋白在rLa-NiVF感染的BHK-21細(xì)胞中的表達(dá)，在熒光顯微鏡下可以觀察到特異性的強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。細(xì)胞融合試驗(yàn)與間接免疫熒光均證明重組病毒rLa-NiVF能夠正確表達(dá)尼帕病毒F蛋白。本發(fā)明所用的新城疫LaSota疫苗株為AV1615(中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，CVCC)，也由本實(shí)驗(yàn)室制備，制備方法參見已獲得授權(quán)的專利申請(qǐng)?zhí)?200510097997. 8，發(fā)明名稱為“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用”，發(fā)明人步志高，陳化蘭，申請(qǐng)時(shí)間2005年9月2日。本發(fā)明還提供所述表達(dá)尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株用于制備預(yù)防尼帕病腦炎的疫苗的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述表達(dá)尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株為rLa-NiVF。所述應(yīng)用還包括所述表達(dá)尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株與表達(dá)尼帕病毒G蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株進(jìn)行聯(lián)合免疫。本發(fā)明還提供用于預(yù)防尼帕病腦炎的疫苗，所述疫苗包含有效量的本發(fā)明所述的表達(dá)尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株。優(yōu)選地，所述疫苗包含有效量的重組新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF。另外，所述疫苗還可以包含藥用的佐劑或賦形劑等。本發(fā)明的用于預(yù)防尼帕病腦炎的疫苗可以用于預(yù)防哺乳動(dòng)物中的尼帕病腦炎，所述哺乳動(dòng)物包括，但不限于，豬、小鼠、犬，貓及馬等。本發(fā)明還提供用于預(yù)防哺乳動(dòng)物中的尼帕病腦炎的方法，所述方法包括給所述哺乳動(dòng)物施用有效量的包含本發(fā)明所述的表達(dá)尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株的疫苗，優(yōu)選為rLa-NiVF。附圖簡(jiǎn)述參考下述附圖，進(jìn)一步描述本發(fā)明，在所述附圖中

圖1. rLa-NiVF的構(gòu)建示意圖；圖2. rLa-NiVF感染細(xì)胞的間接免疫熒光；圖3.尼帕病毒G、F蛋白共表達(dá)形成的合胞體；圖4.重組病毒的雞胚生長(zhǎng)曲線；圖5.最大劑量重組病毒免疫后小鼠體重變化；圖6A. rLa-NiVF免疫小鼠血清中特異性IgG水平(ng/ml)，圖6B. rLa-NiVF免疫小鼠中和抗體水平，縱坐標(biāo)表示血清稀釋的倍數(shù)；圖7.重組病毒免疫小鼠的特異性⑶8細(xì)胞免疫反應(yīng)；圖8.重組病毒誘導(dǎo)豬產(chǎn)生抗尼帕病毒中和抗體。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實(shí)施例只是舉例說(shuō)明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。需要說(shuō)明的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，下述實(shí)施例中所用的試劑、酶類等除特別說(shuō)明外，均為可從試劑公司商購(gòu)的分析純級(jí)別的試劑或酶類。1材料和方法
1. 1 材料1. 1. 1:毒株與質(zhì)粒新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株(GenBank登錄號(hào) AY845400. 2，由本實(shí)驗(yàn)室制備，制備方法參見已獲得授權(quán)的專利申請(qǐng)?zhí)?00510097997. 8， 發(fā)明名稱為“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用”，發(fā)明人步志高，陳化蘭， 申請(qǐng)時(shí)間2005年9月2日)，表達(dá)尼帕病毒F蛋白的重組桿狀病毒rBac-NiVF[8]由本實(shí)驗(yàn)室保存(其詳細(xì)的構(gòu)建方法參見參考文獻(xiàn)8)。表達(dá)T7聚合酶的重組痘病毒VTF7-3由美國(guó)NIH的Bernard Moss博士提供，其制備與滴定過(guò)程均按文獻(xiàn)[9]進(jìn)行，滴定后的病毒于_70°C保存?zhèn)溆?。LaSota全長(zhǎng)基因組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pBRN_FL以及輔助質(zhì)粒pBSNP、pBSP、pBSL 由本實(shí)驗(yàn)室制備保存[7](參考文獻(xiàn)7詳細(xì)說(shuō)明了上述質(zhì)粒的制備方法)。另外LaSota疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)參見已獲得授權(quán)的專利申請(qǐng)?zhí)?00510097997. 8，發(fā)明名稱為“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用”，發(fā)明人步志高，陳化蘭，申請(qǐng)時(shí)間2005 年9月2日。表達(dá)尼帕病毒G和F蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGG-NiVG和pCAGG_NiVF均由本實(shí)驗(yàn)室保存[10](參考文獻(xiàn)10詳細(xì)說(shuō)明了上述質(zhì)粒的制備方法)。用于制備囊膜嵌合尼帕病毒G和F蛋白的表達(dá)綠色熒光蛋白的重組水泡性口炎假病毒粒子(VSV Δ G^GFP-NiVG/ F)的重組VSV基因組cDNA克隆質(zhì)粒pVSV Δ G*GFP及輔助表達(dá)質(zhì)粒pBS-G、pBS-L、pBS_N和 PBS-P由美國(guó)田納西大學(xué)Michael Whitt博士提供[11](參考文獻(xiàn)11詳細(xì)說(shuō)明了上述質(zhì)粒的制備方法)。1. 1.2 細(xì)胞和血清細(xì)胞系BHK-21，Sf9昆蟲細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC)并在本實(shí)驗(yàn)室使用和保存。BHK-21細(xì)胞生長(zhǎng)及維持液為含5%胎牛血清 (FBS)的DMEM(購(gòu)自Gibco) ；SF9昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液為SF900II (購(gòu)自Gibco)無(wú)血清培養(yǎng)液。1. 1.3單克隆抗體和多肽表位尼帕病毒F蛋白特異性單克隆抗體F2G1由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存，詳細(xì)制備方法參見文獻(xiàn)[12]；尼帕病毒F蛋白小鼠CD8細(xì)胞表位多肽F280 (VYFPILTEI, H2Kd) (VYFPILTEI是多肽的氨基酸序列，H2Kd是指小鼠的MHC I (I型主要組織相容性復(fù)合體)單倍體基因型)，人免疫缺陷病毒Gag蛋白小鼠CD8表位多肽 (AMQMLKETI, H2Kd)由北京中科亞光公司合成并由本實(shí)驗(yàn)室保存。1. 1. 4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。四周齡斷奶仔豬購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地并由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地繁殖并飼養(yǎng)。1. 2 表達(dá)NiV F基因的病毒基因組cDNA克隆的構(gòu)建以PCAGG-NiVF為模板，通過(guò)PCR引物(見表1)在尼帕病毒F基因(其基因序列為SEQ ID No. 1，所編碼的蛋白序列為SEQ ID No. 2)開放閱讀框5'端引入Riie I限制性酶切位點(diǎn)識(shí)別序列(GTTTAAAC)和NDV自身聚合酶L識(shí)別的轉(zhuǎn)錄終止序列GE(TTAAGAAAAAA) 及轉(zhuǎn)錄起始序列GS (ACGGGTAGAA)，在3 ‘端引入Riie I限制性酶切位點(diǎn)；PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，末端用Rne I酶切后插入pBRN-FL-Pmel (即，經(jīng)過(guò)Rne I酶切的pBRN_FL質(zhì)粒)，構(gòu)建成的重組全長(zhǎng)基因組cDNA克隆命名為pBRN-FL-NiVF。表1擴(kuò)增NiV F插入LaSota全長(zhǎng)基因組的PCR引物
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組新城疫病毒LaSota疫苗株，其中尼帕腦炎病毒F蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No. 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組新城疫病毒LaSota疫苗株，其中尼帕腦炎病毒F蛋白的基因序列為SEQ ID No. 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組新城疫病毒LaSota疫苗株，其中所述用于表達(dá)F蛋白的新城疫LaSota疫苗株是AV1615。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組新城疫病毒LaSota疫苗株，其命名為rLa_NiVF，保藏號(hào)為 CGMCC No. 5401。
6.一種用于預(yù)防尼帕病腦炎的疫苗，其包含有效量的權(quán)利要求1所述的表達(dá)尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其包含有效量的權(quán)利要求5所述的重組新城疫病毒 LaSota 疫苗株 rLa_MVF。
8.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的表達(dá)尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota 疫苗株用于制備預(yù)防尼帕病腦炎的疫苗的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其還包括所述表達(dá)尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株與表達(dá)尼帕病毒G蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株進(jìn)行聯(lián)合免疫。
10.構(gòu)建表達(dá)尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株的方法，所述方法包括下述步驟(1)構(gòu)建重組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括其中插入尼帕病毒F基因的所述新城疫 LaSota疫苗株的基因組cDNA序列，將所述重組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒命名為pBRN_NiVF ；(2)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒系統(tǒng)，該輔助質(zhì)粒系統(tǒng)包括編碼所述新城疫LaSota疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列的輔助質(zhì)粒pBSNP、編碼所述新城疫LaSota疫苗株的磷蛋白(P)的 cDNA序列的輔助質(zhì)粒pBSP、和編碼所述新城疫LaSota疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA 序列的輔助質(zhì)粒PBSL;(3)將步驟(1)的所述重組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pBRN-NiVF和步驟的轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒pBSNP、 pBSP、pBSL共轉(zhuǎn)染所述新城疫LaSota疫苗株復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；和(4)收獲上清液，過(guò)濾后接種雞胚尿囊腔拯救重組病毒株。
全文摘要
本發(fā)明提供一種表達(dá)尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株及其制備方法和應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明提供表達(dá)尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF(其保藏號(hào)為CGMCC No.5401)及其在制備用于預(yù)防尼帕病腦炎的疫苗中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102533675SQ20111043189
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者步志高, 溫志遠(yuǎn), 葛金英 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所