納米粒的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種負載新城疫DNA疫苗納米粒的制備方法。
【背景技術】
[0002] 作為一種急性高度接觸性的家禽傳染性疾病--新城疫（ND)，它是由新城疫病毒 (NDV)引起的，在世界養(yǎng)殖業(yè)范圍內造成了巨大的經(jīng)濟危害，同時對于行業(yè)發(fā)展也有著巨大 的潛在威脅。由此可見，新城疫疫苗研制及有效防控對養(yǎng)禽業(yè)具有重大的現(xiàn)實意義和較高 的經(jīng)濟效益。相對于常規(guī)疫苗，DNA疫苗有著獨特的優(yōu)點，具體表現(xiàn)為在根本上解決了返祖 問題與基因突變問題，并且無毒力回復、工藝易實現(xiàn)、免疫持續(xù)時間長、成本價格低、質量風 險較小，同時能夠激發(fā)機體體液免疫和細胞免疫反應、便于儲存和運輸?shù)葍?yōu)點，具有一定的 應用實踐和深遠的研宄前景。但目前DNA疫苗存在著一些不足，如生物利用度低、未達到細 胞前就被降解、免疫應答弱等缺點，另外，其給藥方式多數(shù)是以肌肉注射形式，對于新城疫 這類的由于呼吸道或消化道引起的黏膜傳染病，肌注給藥后，難以通過擴散方式透過細胞 膜，難以到達吞噬細胞、樹突狀細胞等抗原提呈細胞（APCs)中，因此導致了表達出的抗原 量低，免疫效果不好。因此，黏膜免疫在新城疫防治中具有舉足輕重的作用。
[0003] 基因遞送載體的選擇直接影響著基因治療的效果。目前在基因治療與基因疫苗的 研宄中，應用最廣泛的基因遞送載體是病毒載體。但杰西?哥爾辛格事件使得人們對于病 毒基因載體的安全性產生了懷疑。納米材料作為基因遞送載體具有非病毒載體的安全性， 又具有其獨特的優(yōu)勢。殼-核結構的納米材料可以將兩種納米材料合二為一，從而發(fā)揮各 自材料的特點，并且作為基因遞送載體具有非病毒載體的安全性，又可以保護DNA不被核 酸酶降解，增強其穩(wěn)定性，延長抗原表達時間，提高轉染效率等。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明是要解決現(xiàn)有DNA疫苗抗原肌注給藥易被胃腸道內的代謝酶和酸性環(huán)境 降解，需多次免疫，不能夠實現(xiàn)緩釋和黏膜免疫，質粒DNA免疫原性較弱，需用較強的免疫 佐劑或合適的基因遞送系統(tǒng)才能有效誘導免疫應答的問題，提供一種負載新城疫病毒F基 因質粒DNA的LDHOSiO 2納米粒的制備方法。
[0005] 本發(fā)明的技術方案是通過溶膠凝膠方法制備SiO2納米粒，接著使用3-氨基丙基 三乙氧基硅烷（APTES)修飾SiO 2，使其表面修飾成氨基（APTES-SiO2),帶正電；將模型藥物 pVAXl-optiF 與 APTES-SiO2 連接，制備 PFDNA-SiO2-NPsJlj用共沉淀法在 pFDNA-SiO 2-即3表 面沉淀層狀雙氫氧化物（LDH)，合成pFDNA-LDH@Si0 2-NPs。
[0006] 本發(fā)明負載新城疫病毒F基因質粒DNA的LDHOSiO2納米粒的制備方法，按以下步 驟進行：
[0007] -、采用溶膠凝膠法合成Si02m米粒；
[0008] 二、pVAXl_optiF/Si02納米粒（PFDNA-SiO2-NPs)的合成
[0009] A、SiO2氨基化：
[0010] 配制體積百分濃度為I %~I. 5%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES)的乙醇溶 液，稱取1~I. 5mg Si02m米粒置于上述溶液中，室溫下磁力攪拌10~12h，離心收集沉淀， 用無水乙醇洗滌沉淀三次，將沉淀室溫下干燥，即得氨基化的SiO2納米粒（APTES-SiO2);
[0011] B、稱取氨基化的SiO2納米粒分散于PBS (pH7. 4)緩沖溶液中，配制成lmg/mL的納 米粒懸液，向納米粒懸液加入質粒DNA pVAXl-optiF，用移液槍緩慢吸打混勻，室溫下孵育 15min，4°C、10000~I lOOOr/min離心10min收集沉淀，用PBS洗滌三次，沉淀用PBS緩沖液 重懸，即得 PFDNA-SiO2-NPs ;
[0012] 三、載新城疫F基因質粒DNALDHOSiO2納米粒（pFDNA-LDHOSiO 2-NPs)的合成：
[0013] a、稱取6. 3g NaOH和9. Ig NaNO3溶解于72mL煮沸后的去離子水中，得溶液A，將 16g Mg(NO3)2 ? 6H20和11. 7g Al (NO3)3 ? 9H20溶解于63mL煮沸后的去離子水中，得溶液B ;
[0014] b、向溶液A中加入0. 8g PFDNA-SiO2-NPs,在N2保護及攪拌條件下，將溶液B以 3mL/min的速度緩慢滴加到上述混合液中，滴加完畢后繼續(xù)在室溫下攪拌1~I. 5h ;離心 收集沉淀，用煮沸后的去離子水洗滌沉淀至上清液為中性，室溫真空干燥即得pFDNA-LDHO SiO2-NPs 0
[0015] 本發(fā)明步驟二中質粒DNA pVAXl-optiF已在申請日以前于《密碼子優(yōu)化增強新城 疫病毒DNA疫苗的表達水平和免疫效果》（中國動物傳染病學報，2009, 17 (2) :8-16)中公 開發(fā)表，可由文章作者獲得。
[0016] 本發(fā)明制備的納米粒子可以保護質粒DNA不被DNA酶降解，粒徑可控。
[0017] 本發(fā)明制備的pFDNA-LDH@Si02-NPs平均粒徑為470. lnm，多分散系數(shù)為0? 005， Zeta電位為+16. 82mV，納米粒子的包封率在90%以上，載藥量在45%以上。
[0018] 本發(fā)明的技術方案是采用溶液凝膠法合成不同粒徑的介孔SiO2，再用共沉淀法在 介孔310 2表面包覆LDH，形成LDHOSiO 2，借助核結構完成對新城疫病毒F基因質粒DNA的搭 載，建立新城疫DNA疫苗納米化的安全級黏膜免疫遞送系統(tǒng)（pDNA-LDH@Si0 2-NPs)。本發(fā)明 合成的LDHOSiO2既具有LDH體內分散性好、對pH敏感、Zeta電位高，又具有能延長抗原滯 留、利于DC識別、促進DC成熟和向淋巴結趨化的優(yōu)勢，解決了單純LDH作為DNA疫苗所面 臨的問題；同時，LDMSiO 2具有SiO 2介孔結構特點，突破了 LDH搭載質粒DNA有限的瓶頸。
[0019] 本發(fā)明制備的pFDNA-LDH@Si02-NPs克服了抗原質粒DNA易被降解、免疫持續(xù)時間 短、免疫次數(shù)多等缺點，且制備方法簡單易行，條件溫和，生產成本較低、易于規(guī)模化生產。
【附圖說明】
[0020] 圖1為實施例1制備的二氧化硅的透射電子顯微鏡圖；
[0021] 圖2為實施例1制備的PFDNA-SiO2-NPs的透射電子顯微鏡圖；
[0022] 圖3為實施例1制備的PFDNA-SiO2-NPs抗DNA酶降解的瓊脂糖凝膠電泳圖
[0023] 圖4為實施例1制備的pFDNA-LDH@Si02-NPs的紅外光譜圖；
[0024] 圖5為實施例1制備的pFDNA-LDH@Si02-NPs的XRD圖；
[0025] 圖6為實施例1制備的pFDNA-LDH@Si02-NPs的體外釋放圖；
[0026] 圖7為實施例1制備的pFDNA-LDH@Si02-NPs的透射電鏡圖；
[0027] 圖8為實施例1制備的pFDNA-LDH@Si02-NPs的粒徑分布圖。
【具體實施方式】
[0028] 本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
【具體實施方式】 [0029] 一：本實施方式負載新城疫病毒F基因質粒DNA的LDHOSiO2納米粒 的制備方法，按以下步驟進行：
[0030] 一、采用溶膠凝膠法合成Si02m米粒；
[0031]二、pVAXl_optiF/Si02納米粒（PFDNA-SiO2-NPs)的合成
[0032] A、SiO2氨基化：
[0033] 配制體積百分濃度為1 %~1. 5%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES)的乙醇溶 液，稱取1~I. 5mg Si02m米粒置于上述溶液中，室溫下磁力攪拌10~12h，離心收集沉淀， 用無水乙醇洗滌沉淀三次，將沉淀室溫下干燥，即得氨基化的SiO 2納米粒（APTES-SiO2);
[0034] B、稱取氨基化的SiO2納米粒分散于PBS (pH7. 4)緩沖溶液中，配制成lmg/mL的納 米粒懸液，向納米粒懸液加入質粒DNA pVAXl-optiF，用移液槍緩慢吸打混勻，室溫下孵育 15min，4°C、10000~I lOOOr/min離心10min收集沉淀，用PBS洗滌三次，沉淀用PBS緩沖液 重懸，即得 PFDNA-SiO2-NPs ;
[0035] 三、載新城疫F基因質粒DNALDHOSiO2納米粒（pFDNA-LDHOSiO 2-NPs)的合成：
[0036] a、稱取6. 3g NaOH和9. Ig NaNO3溶解于72mL煮沸后的去離子水中，得溶液A，將 16g Mg(NO3)2 ? 6H20和11. 7g Al (NO3)3 ? 9H20溶解于63mL煮沸后的去離子水中，得溶液B ;
[0037] b、向溶液A中加入0? 8g pFDNA-Si02-NPs，在N2保護及攪拌條件下，將溶液B以 3mL/min的速度緩慢滴加到上述混合液中，滴加完畢后繼續(xù)在室溫下攪拌1~I. 5h ;離心 收集沉淀，用煮沸后的去離子水洗滌沉淀至上清液為中性，室溫真空干燥即得pFDNA-LDHO SiO2-NPs 0
[0038] 本實施方式步驟一中采用溶膠凝膠法合成SiO2納米粒的具體步驟為：
[0039] 依次向潔凈的燒杯中加入90mL無水乙醇、12. 5mL去離子水、2mL濃氨水（見13含量 為28% )，并在室溫下200r/min磁力攪拌使其混合均勾；之后，在磁力攪拌下，一次性快速 向其中加入IOmL TE0S，加入TEOS后溶液逐漸變成乳白色，繼續(xù)在室溫下磁力攪拌2h ;反應 停止后，4°C、lOOOOr/min離心收集SiO2納米粒，無水乙醇反復洗滌沉淀三次后將沉淀置于 空氣中干燥，即獲得Si0 2m米粒。
[0040] 本實施方式所使用的正硅酸乙酯，濃氨水都是普通的化學試劑，生產成本低，適宜 大規(guī)模生產。本發(fā)明制備的310 2表面光滑、形態(tài)規(guī)則、呈球形、粒徑大小均一、分散性好，無 明顯黏連、塌陷等現(xiàn)象
[0041] 新型納米材料的出現(xiàn)，為獲得高品質的DNA疫苗載體提供了可能。層狀雙金屬氫 氧化物（LDHs)是一類由帶正電荷的金屬氫氧化物層和層間填充可交換陰離子所構成的層 柱狀化合物。LDH作為基因遞送載體具有很多優(yōu)點：1)DNA類生物大分子能穩(wěn)定存在于LDH 納米復合材料中；2)體內分散性好，在pH 3-5環(huán)境中，釋藥速率快；3)生物相容性和緩釋 效應好，且有較