專利名稱：一種鑒別牛分枝桿菌的pcr引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)鑒別技術(shù)，具體地說(shuō)涉及對(duì)牛分枝桿菌進(jìn)行PCR鑒別用引物及使用該引物的PCR鑒別方法。
背景技術(shù)：
牛結(jié)核病主要是由牛結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性消耗性傳染病，該病可通過(guò)病畜或其產(chǎn)品傳染給人類或其他動(dòng)物。感染牛結(jié)核分枝桿菌的大多數(shù)牛不呈顯性感染或僅到晚期才出現(xiàn)臨床癥狀，故早期臨床診斷不易獲得準(zhǔn)確結(jié)果。病原學(xué)檢查是最確實(shí)的方法之一，病理學(xué)檢查可以根據(jù)特征病變確診，但必須在動(dòng)物死亡或宰殺后進(jìn)行且所需確診周期長(zhǎng)，需3-8周，所以常常不被實(shí)際工作所采用。由于牛奶、牛肉等食品與人類生活息息相關(guān)， 結(jié)核桿菌可侵犯人和動(dòng)物的全身各器官，以肺結(jié)核最常見(jiàn)。因此及時(shí)確定病原菌，合理進(jìn)行牛結(jié)核病的防控有利于保障公共衛(wèi)生安全。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)包括結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌I型和II型、牛分枝桿菌、卡介苗、田鼠分枝桿菌、caprae分枝桿菌以及canettii分枝桿菌。目前臨床上鑒別牛結(jié)核桿菌的方法最廣泛的是變態(tài)反應(yīng)診斷，但該法存在著極強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，即在相當(dāng)數(shù)量的結(jié)核變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性牛中，既找不出特征病變，又不能分離出結(jié)核桿菌，或僅僅分離出非典型的分枝桿菌，而且妊娠母牛仍然檢出率低，在重復(fù)檢疫時(shí)陽(yáng)性率下降，因此在實(shí)際工作中用于診斷牛結(jié)核病并不十分理想。近年來(lái)，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和實(shí)時(shí)熒光PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)在結(jié)核或副結(jié)核病原菌快速檢測(cè)鑒別方面發(fā)展較快，但均為針對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌單獨(dú)菌種的方法，也有直接通過(guò)基因分型方法直接鑒別出分枝桿菌各種型的，然而這些方法有的只給出了鑒別單獨(dú)菌株的引物，有的給出了很多信息，卻沒(méi)有進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，這對(duì)于臨床運(yùn)用是不夠完善的，有的不夠經(jīng)濟(jì)，成本較高，如熒光定量PCR。 例如2002年Richard C. Huard等建立了鑒別分枝桿菌復(fù)合群中各菌株的PCR方法，能特異性的鑒別出MTBC中的各種菌；2007年張鷺等根據(jù)牛分枝桿菌MPB70的特異性基因序列進(jìn) PCR擴(kuò)增，檢測(cè)牛奶中的MTBC，陽(yáng)性率達(dá)到40. 9%，靈敏度達(dá)到40ng/L ；2007年孟祥紅等人建立了多重PCR技術(shù)可以快速鑒別結(jié)核分枝桿菌和非分結(jié)核分枝桿菌，應(yīng)用多重PCR法與 BACTEC培養(yǎng)的結(jié)果有很高的一致性，為臨床結(jié)核病和分枝桿菌病的鑒別診斷提供了有效的手段；2010年賈廣樂(lè)等根據(jù)IS1081序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物及探針，建立了牛結(jié)核病 TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法。上述方法，都只是單獨(dú)的給出了鑒別某一種菌的PCR相關(guān)方法，有的采用探針雜交，熒光定量等經(jīng)濟(jì)成本較高的方法，這些都不利于臨床檢測(cè)樣品， 目前還沒(méi)有系統(tǒng)地使用整套引物對(duì)分枝桿菌屬類的主要細(xì)菌進(jìn)行鑒別的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鑒別牛分枝桿菌的PCR用引物及PCR鑒別方法。本發(fā)明用于PCR鑒別牛分枝桿菌的特異性引物組合，用于鑒別分枝桿菌屬、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、結(jié)核桿菌、牛分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG株。其分別能對(duì)分枝桿菌的16SrRNA保守區(qū)、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)Rv0577基因，結(jié)核分枝桿菌RD7區(qū)域的 Rvl970,牛分枝桿菌pncA基因和RDl區(qū)基因進(jìn)行擴(kuò)增，生成特異性擴(kuò)增片段。本發(fā)明提供的牛分枝桿菌PCR鑒別用引物組合，包括1 16SrRNA-F 5’ -ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3，；16SrRNA-R 5’ -TCTGCGATTAGCGACTAAGACTTCA-3’ ；2MTBC-F 5’ -ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAGGCAA-3’ ；MTBC-R 5’ -CTATTGCTGCGGTGCGGGCTTCAA-3’ ；3MT-F 5’ -GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC-3’ ；MT-R 5’ -CGCCGGCAGCCTCACGAAATG-3 ‘；4PncA-F 5， -CTCAGCTGGTCATGTTCCCGAT-3，；PncA-R 5’ -CGGTGTGCCGGAGAAGCCG-3’ ；5RD1-F 5’ -AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3’ ；RDl-R 5’ -GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3，。本發(fā)明提供一種牛分枝桿菌PCR鑒別方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用上述引物組合分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。本發(fā)明提供一種鑒別牛分枝桿菌的PCR方法，還包括當(dāng)待測(cè)菌為未知菌時(shí)，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述的第1 5對(duì)引物組合，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；或當(dāng)待測(cè)菌為分枝桿菌屬細(xì)菌時(shí)，以樣品總DNA為模板，利用上述第2 5對(duì)引物組合，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；或當(dāng)待測(cè)菌為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群細(xì)菌時(shí)，以樣品總DNA為模板，利用上述第3 5 對(duì)引物組合，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；或當(dāng)待測(cè)菌為結(jié)核分枝桿菌時(shí)，以樣品總DNA為模板，利用上述第4 5對(duì)引物組合，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；或當(dāng)待測(cè)菌為牛分枝桿菌細(xì)菌時(shí)，以樣品總DNA為模板，利用上述第5對(duì)引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增；反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。含有16SrRNA、MTBC, PncA引物對(duì)的PCR的反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94°C、5min，再經(jīng) 94°〇變性4()8，601退火40s，72°C延伸40s，31個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；或含有MT引物對(duì)的PCR的反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94°C、5min，再經(jīng)94°C變性40s，61°C 退火40s，72°C延伸40s，31個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；或含有RDl引物對(duì)的PCR的反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94°C、5min，再經(jīng)94°C變性40s，62°C 退火40s，72°C延伸40s，31個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。上述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，其中20 μ 1反應(yīng)液的具體配置為上游引物下游引物 Taq Mix ddH20
250ηΜ 0.5μ1 250ηΜ 0.5μ1 10μ1 8 μ
5ng 0.5μ1
DNA模板可以將本發(fā)明引物以及相關(guān)試劑組裝成試劑盒，以方便使用。本發(fā)明的試劑盒可以是由多個(gè)隔斷所形成，以容納固定一個(gè)或多個(gè)如管或小瓶的容器。這些容器之一或者多個(gè)可以裝有本發(fā)明的引物，根據(jù)需要該引物可以是凍干形式或溶于緩沖液中的狀態(tài)。另外， 本發(fā)明的試劑盒中還可以包括用于PCR反應(yīng)的一種或多種酶/試劑，以及實(shí)施本發(fā)明所需要的其它成分及用具。使用本發(fā)明的引物以及方法進(jìn)行鑒別的樣品來(lái)源包括分離的菌種資源或動(dòng)物組織，但并不局限于此。本發(fā)明提供了上述5對(duì)引物在制備用于檢測(cè)及鑒別牛分枝桿菌的試劑中的用途。應(yīng)用本發(fā)明的PCR鑒別方法能鑒別出減毒的牛結(jié)核分枝桿菌，如BCG，而減毒牛結(jié)核分枝桿菌常常作為制備預(yù)防結(jié)核病的疫苗的種子來(lái)源，因此本發(fā)明還提供了上述5種引物或本發(fā)明的PCR鑒別分枝桿菌的方法在制備預(yù)防結(jié)核病疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的5對(duì)引物是經(jīng)過(guò)篩選優(yōu)化獲得的，可以逐步縮小待檢分枝桿菌所屬范圍，獲得準(zhǔn)確的相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，一旦在整套反應(yīng)方向上某對(duì)引物出現(xiàn)陰性結(jié)果，就立即可以確定待檢分枝桿菌所屬范圍，這是與分枝桿菌屬、種群分類復(fù)雜性相關(guān)的。分枝桿菌屬、 結(jié)核桿菌復(fù)合群MTBC、結(jié)核桿菌、牛分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG株關(guān)系圖見(jiàn)圖17。通過(guò)使用本發(fā)明的5對(duì)引物，分別對(duì)所測(cè)菌種的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，生成特異擴(kuò)增片段，從而能夠簡(jiǎn)單且精確地對(duì)分枝桿菌進(jìn)行鑒別。并且，本發(fā)明的引物僅針對(duì)目的片段特異擴(kuò)增，不會(huì)擴(kuò)增其它區(qū)域，并且，本研究建立了牛分枝桿菌的檢測(cè)方法，可以將臨床未知樣品從分枝桿菌屬開(kāi)始進(jìn)行鑒別，逐步鑒別出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，結(jié)核桿菌，牛分枝桿菌以及牛分枝桿菌經(jīng)過(guò)傳代獲得的減毒株BCG株，形成一套鑒別牛分枝桿菌的完整的PCR方法。該方法簡(jiǎn)便，操作簡(jiǎn)單，一臺(tái)PCR儀就可以完成，實(shí)現(xiàn)快速、大通量診斷和檢測(cè)。比采用一對(duì)引物鑒別出單獨(dú)菌株的方法更可靠，降低了鑒別時(shí)易造成假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果的概率，也可以對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的菌株進(jìn)行監(jiān)測(cè)，確保菌株保存過(guò)程中沒(méi)有被別的雜菌污染。研究表明本研究建立的這一套PCR方法體系，特異性達(dá)到100%，靈敏度達(dá)到pg級(jí)。圖1為瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)16S rRNA引物PCR產(chǎn)物結(jié)果，產(chǎn)物條帶大小為 543bp ；M 分子量標(biāo)準(zhǔn)為I plus DNA marker, 1 結(jié)核分枝桿菌參考株C68503 ；2 牛分枝桿菌參考株C68001 ；3 =BCG ；4 恥垢分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株cm2155 ；5 禽分枝桿菌參考株C68201 ；6 葡萄球菌(CAU0411) ；7 大腸桿菌(CAU0439) ；8 空白對(duì)照；圖2為1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)MTBC引物PCR產(chǎn)物結(jié)果，產(chǎn)物條帶大小為786bp， Μ:分子量標(biāo)準(zhǔn)為I plus DNA marker, 1 結(jié)核分枝桿菌參考株C68503 ；2 牛分枝桿菌參考


株C68001 ；3 =BCG ；4 恥垢分枝桿菌；5 禽分枝桿菌參考株C68201 ；6 空白對(duì)照；圖3為瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)MT引物PCR產(chǎn)物結(jié)果，產(chǎn)物條帶大小分別為 1116bp, M 分子量標(biāo)準(zhǔn)為I plus DNA marker, 1 結(jié)核分枝桿菌參考株C68503 ；2 牛分枝桿菌參考株C68001 ；3 =BCG ；4 空白對(duì)照；圖4為1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pncA引物PCR產(chǎn)物結(jié)果，產(chǎn)物條帶大小為^4bp， M 分子量標(biāo)準(zhǔn)為2( plus DNA marker, 1 牛分枝桿菌參考株C68001 ；2 =BCG ；3 結(jié)核分枝桿菌參考株C68503 ；4 空白對(duì)照；圖5為瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RDl引物PCR產(chǎn)物結(jié)果，產(chǎn)物條帶大小分別為 200bp, M 分子量標(biāo)準(zhǔn)為2K plus DNA marker, 1 :BCG ；2 牛分枝桿菌參考株C68001 ；3 空白對(duì)照；圖6 為 16S rRNA 引物敏感性檢測(cè) 1 :4ng，2 :400pg，3 :40pg，4 :4pg，5 陰性對(duì)照， M 分子量標(biāo)準(zhǔn)為2K plus DNAmarker ；圖7MTBC 引物敏感性檢測(cè) 1 :4ng，2 :400pg，3 :40pg，4 :4pg，5 :400fg，6 陰性對(duì)照 M 分子量標(biāo)準(zhǔn)為2K plus DNA marker ；圖8MT 引物敏感性檢測(cè) 1 :12ng,2 1. 2ng,3 :240pg，4 :48pg，5 :9. 6pg，6 :1.92pg， 7 陰性對(duì)照M :分子量標(biāo)準(zhǔn)為2K plus DNAmarker ；圖9pncA 引物敏感性檢測(cè) 1 :4ng，2 :400pg，3 :40pg，4 :4pg，5 :400fg，6 陰性對(duì)照 M 分子量標(biāo)準(zhǔn)為2K plus DNA marker ；圖10RD1 引物敏感性檢測(cè) 1 :25ng，2 :4. 7ng，3 :470pg，4 :47pg，5 :4. 7pg，6 :470fg, 7 陰性對(duì)照M :分子量標(biāo)準(zhǔn)為2K plus DNAmarker ；圖1116S rRNA引物鑒別結(jié)果1 7 編號(hào)分別為1，2，3，4，5，6，7，的保存菌株；M 分子量標(biāo)準(zhǔn)為2K plus DNA marker ；圖12MTBC引物鑒別結(jié)果1 7 編號(hào)分別為1，2，3，4，5，6，7，的保存菌株；M 分子量標(biāo)準(zhǔn)為 2K plus DNA marker ；圖13MT引物鑒別結(jié)果1 7 編號(hào)分別為1，2，3，4，5，6，7，的保存菌株；M 分子量標(biāo)準(zhǔn)為2K plus DNA marker ；+ 陽(yáng)性對(duì)照；-陰性對(duì)照；圖14pncA引物鑒別結(jié)果1 7 編號(hào)分別為1，2，3，4，5，6，7，的保存菌株；M 分子量標(biāo)準(zhǔn)為2K plus DNA marker ；+ 陽(yáng)性對(duì)照；-陰性對(duì)照；圖15RD1引物鑒別結(jié)果1 5 編號(hào)分別為1,2,4,6,7,的保存菌株；M 分子量標(biāo)準(zhǔn)為2K plus DNA marker ；+ 陽(yáng)性對(duì)照；-陰性對(duì)照。圖16臨床上對(duì)疑似結(jié)核桿菌感染的貓皮膚結(jié)節(jié)組織液PCR鑒別；M 分子量標(biāo)準(zhǔn)為 2K plus DNA marker, 1 16SrRNA引物PCR結(jié)果；2 :MTBC弓丨物PCR 結(jié)果；3 =MT引物PCR結(jié)果；4 =PncA引物PCR結(jié)果；5 =RDl引物PCR結(jié)果；圖17本PCR鑒別方法可檢測(cè)的分枝桿菌屬、結(jié)核桿菌復(fù)合群MTBC、結(jié)核桿菌、牛分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG株關(guān)系示意圖
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
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若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明所用菌株為牛分枝桿菌參考株C68001，結(jié)核分枝桿菌參考株C68503，牛分枝桿菌BCG參考株C68017，禽分枝桿菌參考株C68201購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；恥垢分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株cm2155以及非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株C68203，由本實(shí)驗(yàn)保存；葡萄球菌、 大腸桿菌，本實(shí)驗(yàn)室保存，編號(hào)為CAU0411，CAU0439)。實(shí)施例IPCR特異性引物的設(shè)計(jì)16SrRNA所對(duì)應(yīng)的16S rDNA基因在細(xì)菌基因組中具有高度保守性，可以鑒別屬的細(xì)菌的原理，首先根據(jù)分枝桿菌屬16Sr RNA保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，目的片段大小為M3bp序列， 利用軟件和I^imer 3設(shè)計(jì)引物，引物序列為16SrRNA-F 5’ -ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3，；16SrRNA-R 5’ -TCTGCGATTAGCGACTAAGACTTCA-3’ ；Rv0577為MTBC限定基因，根據(jù)這段基因設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增的目的片段大小為 786bp。引物序列為MTBC-F 5’ -ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAGGCAA-3’ ；MTBC-R 5’ -CTATTGCTGCGGTGCGGGCTTCAA-3’ ；由于缺失區(qū)7 (deleted region7，RD7)不存在于其他MTBC菌種中，只有結(jié)核分枝桿菌具有這個(gè)基因區(qū)，根據(jù)這段區(qū)域中的RV1970(lprM)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增的目的片段大小為1116bp。引物序列為MT-F 5’ -GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC-3，；MT-R 5' -CGCCGGCAGCCTCACGAAATG-3‘；試驗(yàn)證明，人結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌在吡喹酰胺編碼基因pncA上存在SNP現(xiàn)象，利用基因點(diǎn)突變的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物，可以特異性的鑒別出牛分枝桿菌(包括BCG株)，牛分枝桿菌(以及BCG株)能特異性的擴(kuò)增出^Sbp的條帶，而結(jié)核分枝桿菌沒(méi)有條帶。。引物序列為PncA-F 5’ -CTCAGCTGGTCATGTTCCCGAT-3，；PncA-R 5’ -CGGTGTGCCGGAGAAGCCG-3’ ；NCBI基因分析結(jié)果表示，RDl區(qū)僅僅存在于致病性的分枝桿菌中，RDl區(qū)基因全長(zhǎng) 9. 51Λ，共9個(gè)開(kāi)放閱讀框(Rv3871-3879)，因此我們可以以此來(lái)區(qū)分牛分枝桿菌與BCG，BCG 株缺少基因RDl區(qū)，根據(jù)這段基因設(shè)計(jì)引物，對(duì)牛分枝桿菌而言，不能有效的擴(kuò)增出全長(zhǎng)為 9. 5kb的RDl序列，而B(niǎo)CG只能擴(kuò)增出200bp的產(chǎn)物，故可以特異性的鑒別出這兩者。引物序列為RDl-F 5’ -AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3’ ；RDl-R 5 ’ -GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3 ’。實(shí)施例2PCR擴(kuò)增方法的建立1、PCR反應(yīng)體系以細(xì)菌總DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，20 μ L反應(yīng)體系為上游引物250ηΜ 0.5μ1下游引物250ηΜ 0.5μ1Taq Mix10μ1ddH208 μ DNA模板5ng 0.5μ1。2、PCR反應(yīng)條件含有16SrRNA、MTBC, PncA引物對(duì)的PCR的反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94°C、5min，再經(jīng) 94°〇變性4()8，601退火40s，72°C延伸40s，31個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；含有MT引物對(duì)的PCR的反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94°C、5min，再經(jīng)94°C變性40s，61°C 退火40s，72°C延伸40s，31個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；含有RDl引物對(duì)的PCR的反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94°C、5min，再經(jīng)94°C變性40s，62°C 退火40s，72°C延伸40s，31個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。反應(yīng)結(jié)束后擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。實(shí)施例3PCR方法的特異性檢驗(yàn)分別以結(jié)核分枝桿菌C68503、牛分枝桿菌C68001、牛分枝桿菌BCGC68017、恥垢分枝桿菌cm2155、禽分枝桿菌C68201、葡萄球菌CAU0411、大腸桿菌CAU0439的DNA為模板，以水為空白對(duì)照，分別用本發(fā)明的5對(duì)引物，通過(guò)本發(fā)明建立的PCR方法進(jìn)行檢驗(yàn)，PCR反應(yīng)結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳的特異性擴(kuò)增條帶判定結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果IBSrRNA引物的PCR結(jié)果分枝桿菌屬的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，而其它菌株和空白對(duì)照均沒(méi)有目的擴(kuò)增片段出現(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。MTBC引物的PCR結(jié)果結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和BCG出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，恥垢分枝桿菌、禽分枝桿菌和空白對(duì)照沒(méi)有目的擴(kuò)增片段出現(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。MT引物的PCR結(jié)果結(jié)核分枝桿菌出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，牛分枝桿菌、BCG和空白對(duì)照沒(méi)有目的擴(kuò)增片段出現(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。pncA引物的PCR結(jié)果牛分枝桿菌和BCG出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，結(jié)核分枝桿菌和空白對(duì)照沒(méi)有目的擴(kuò)增片段出現(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。RDl引物的PCR結(jié)果BCG出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，牛分枝桿菌和空白對(duì)照沒(méi)有目的擴(kuò)增片段出現(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，膠回收后，與pGEM-T easy載體連接，轉(zhuǎn)化DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞；再用OMEGA的質(zhì)粒提取試劑盒純化重組質(zhì)粒，送測(cè)序公司測(cè)序。結(jié)果表明本發(fā)明設(shè)計(jì)的5對(duì)引物具有很好的特異性，能特異性的鑒別出分枝桿菌屬，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，結(jié)核分枝桿菌，牛分枝桿菌及BCG。實(shí)施例4PCR方法的靈敏度檢驗(yàn)以牛分枝桿菌參考株，人結(jié)核分枝桿菌參考菌株，牛分枝桿菌BCG參考株為模板， 分別檢測(cè)其DNA濃度為^g/ μ 1，12ng/ μ 1和47ng/ μ 1，并進(jìn)行梯度稀釋，最后牛分枝桿菌參考株每個(gè)稀釋度含400fg、4pg、40pg、400pg、4ng的DNA ；人結(jié)核分枝桿菌參考菌株每個(gè)稀釋度含1. 2pg、9. 6pg、48pg、240pg、l. 2ngU2ng的DNA ；牛分枝桿菌BCG參考株每個(gè)稀釋度含470fg、4. 7pg、47pg、470pg、4. 7ng、25ng的DNA ；按照上述PCR體系和條件分別進(jìn)行擴(kuò)增， 檢驗(yàn)其敏感性。PCR產(chǎn)物在的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(見(jiàn)圖6，7，8，9，10)。結(jié)果表明， 16S rRNA引物、MTBC引物、pncA引物靈敏度可以檢測(cè)到40pg的DNA ；MT引物靈敏度可以檢測(cè)到9. 6pg的DNA ；ET引物靈敏度可以檢測(cè)到470fg的DNA，說(shuō)明本發(fā)明PCR方法具有很好的靈敏度。 實(shí)施例5PCR方法的應(yīng)用使用所建立的PCR方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的7株分枝桿菌進(jìn)行鑒別。這7株分枝桿菌分別是1 :C68021，牛分枝桿菌，來(lái)自英國(guó)中央獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室，AN5 ；2 :C68004，牛分枝桿菌，來(lái)自哈爾濱獸研所，北京系；3 :C68501，結(jié)核分枝桿菌，保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室；4 :C68006，牛分枝桿菌，分離于結(jié)核病牛，北京，1953，保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室；5 :C68203，鳥(niǎo)分枝桿菌，分離于結(jié)核病雞，保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家動(dòng)物海綿狀腦
病實(shí)驗(yàn)室；6 :C68017，來(lái)自衛(wèi)生部檢定所的BCG ；7 :3003-13，來(lái)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心的BCG。首先將7株分枝桿菌進(jìn)行增菌培養(yǎng)，提取細(xì)菌DNA，以該DNA為模板，分別用上述5 對(duì)引物以及PCR體系和條件，對(duì)7株分枝桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(見(jiàn)圖11，12，13，14，15)。結(jié)果如表1所示。表1實(shí)驗(yàn)室保存菌株鑒別結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于PCR鑒別牛分枝桿菌的特異性引物組合，其特征在于，其分別能對(duì)分枝桿菌屬細(xì)菌的16SrRNA保守區(qū)、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群MTBC的Rv0577基因，結(jié)核分枝桿菌RD7 區(qū)域的Rvl970，牛分枝桿菌pncA基因和RDl區(qū)基因進(jìn)行擴(kuò)增，生成特異性擴(kuò)增片段。
2.如權(quán)利要求1所述的PCR鑒別用引物組合，包括 116SrRNA-F 5' -ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGT T TC-3'； 16SrRNA-R 5' -TCTGCGATTAGCGACTAAGACTTCA-3‘； 2MTBC-F 5' -ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAGGCAA-3‘； MTBC-R 5’ -CTATTGCTGCGGTGCGGGCTTCAA-3‘； 3MT-F 5’ -GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC-3，；MT-R 5' -CGCCGGCAGCCTCACGAAATG-3‘； 4PncA-F 5’ -CTCAGCTGGTCATGTTCCCGAT-3’ ； PncA-R 5' -CGGTGTGCCGGAGAAGCCG-3‘； 5RD1-F 5' -AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3‘； RDl-R 5' -GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3’。
3.一種鑒別牛分枝桿菌的PCR方法，其特征在于，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求 1或2所述的引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，還包括當(dāng)待測(cè)菌為未知菌時(shí)，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述的第1 5對(duì)引物組合，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；或當(dāng)待測(cè)菌為分枝桿菌屬細(xì)菌時(shí)，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述的第2 5 對(duì)引物組合，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；或當(dāng)待測(cè)菌為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群細(xì)菌時(shí)，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述的第3 5對(duì)引物組合，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；或當(dāng)待測(cè)菌為結(jié)核分枝桿菌時(shí)，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述的第4 5對(duì)引物組合，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；或當(dāng)待測(cè)菌為牛分枝桿菌細(xì)菌時(shí)，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述的第5對(duì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。
5.如權(quán)利要求3或4所述的PCR方法，其特征在于，含有16SrRNA、MTBC, PncA引物對(duì)的PCR的反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94°C、5min，再經(jīng)94°C 變性40s，60°C退火40s，72°C延伸40s，31個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；或含有MT引物對(duì)的PCR的反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94°C、5min，再經(jīng)94°C變性40s，61°C退火 40s，72°C延伸40s，31個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；或含有RDl引物對(duì)的PCR的反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94°C、5min，再經(jīng)94°C變性40s，62°C退火40s，72°C延伸40s，31個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。
6.如權(quán)利要求5所述的PCR方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，其中20μ1反應(yīng)液的具體配置為上游引物下游引物 Taq Mix ddH20250nM 0.5 μ 250ηΜ 0.5 μ 10μ1 8 μ 5ng 0.5μ1。DNA模板
7.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，樣品總DNA來(lái)自分離的菌種資源或動(dòng)物組織。
8.一種鑒別牛分枝桿菌的試劑盒，其包括，權(quán)利要求1或2所述的引物組合。
9.權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)在制備用于檢測(cè)及鑒別牛分枝桿菌試劑中的用途。
10.權(quán)利要求1 2所述的引物或權(quán)利要求3 4所述的方法在制備預(yù)防結(jié)核病疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了牛分枝桿菌PCR鑒別用5對(duì)引物及鑒別方法，5對(duì)引物分別針對(duì)分枝桿菌屬細(xì)菌的16SrRNA保守區(qū)、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)Rv0577基因，結(jié)核分枝桿菌RD7區(qū)域的Rv1970，牛分枝桿菌pncA基因和RD1區(qū)基因進(jìn)行擴(kuò)增，生成特異擴(kuò)增片段，核苷酸序列如SEQ ID No.1～5所示。本發(fā)明的鑒別方法是以樣品總DNA為模板，利用上述5對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增條帶的大小判定結(jié)果。本發(fā)明引物能特異性地鑒別出分枝桿菌屬，MTBC，結(jié)核分枝桿菌，牛分枝桿菌及牛分枝桿菌BCG，檢測(cè)方法靈敏度好，方法簡(jiǎn)便，操作簡(jiǎn)單，能實(shí)現(xiàn)牛分枝桿菌快速、大通量的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102409102SQ20111039192
公開(kāi)日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者周向梅, 尹曉敏, 李華, 楊利峰, 楊春華, 林敬鈞, 趙德明 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)