專利名稱：用于下調(diào)免疫系統(tǒng)th2活性的母牛分枝桿菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是關于對以免疫系統(tǒng)活性從Th1活性向Th2活性轉移為特征的疾病的治療。在驚人的發(fā)現(xiàn)中觀察到，母牛分枝桿菌(Mycobacteriumvaccae)制劑能夠引起非特異性的全身性Th1偏移，特別是通過下調(diào)Th2活性但不伴隨上調(diào)Th1活性而起作用?？蓱帽景l(fā)明治療的疾病包括慢性疲勞綜合征，海灣戰(zhàn)爭綜合征和總體過敏反應綜合征(TotalAllergy Syndrome)。
慢性疲勞綜合征(CFS)(Turnberg et al)病人可能具有較高的變態(tài)反應性征侯發(fā)病率，二倍數(shù)量的皮膚過敏性反應，以及NK細胞活性降低，IFNγ和IL-2減少(Streus，1996)。某些病人具有對EB病毒的高抗體水平，這也是Th1活性降低的病人的特征。他們還具有情緒改變和抑郁癥。這些特征都與細胞因子分布狀態(tài)中Th1向Th2的轉換相一致。這種偏移可能是由于現(xiàn)代生活方式的結果，這種生活方式使人們不能暴露于足夠的Th1-誘導性刺激，而傾向于較多地暴露于Th2誘導性免疫接種和過敏原。
本發(fā)明者相信，海灣戰(zhàn)爭綜合征代表一種特殊情況下的CFS，其中可發(fā)現(xiàn)Th2-誘導性刺激，因為海灣戰(zhàn)爭人員都接受了多種Th2-誘導性疫苗接種。疫苗接種或感染可發(fā)揮全身性作用，非特異性地增強或減弱對其它無關抗原反應的Th1/Th2細胞因子平衡(Shaheen et al.，1996，Shirakawa et al.，1996)，并可影響(積極地或消極地)不相關疾病的存活率(Aaby，1996，Aaby et al.，1995)。根據(jù)這種免疫接種方案的如下四個特點，可證實本發(fā)明者關于用于海灣的這些免疫接種誘導了全身性Th2轉換的觀點(i)對在海灣的英國軍隊使用了百日咳桿菌(Pertussis)作佐劑，它的佐劑性具有很強的Th2作用(Mu & Sewell，1993，Ramiya et al.，1996，Smit et al.，1996)。
(ii)對海灣戰(zhàn)爭軍隊給予了抗鼠疫、炭疽、傷寒、破傷風和霍亂的Th2-誘導性免疫原。而且，這樣大量的抗原負荷有可能誘發(fā)對Th2的反應(Aaby，1995，Bretscher et al.，1992，Hernandez-Pando & Rook，1994)。
(iii)是在軍隊在海灣地區(qū)部署之后，或者剛剛被運輸?shù)竭@里之前給予這些疫苗接種，這時人體應激水平已經(jīng)提高了。在有高水平糖皮質激素(即皮質醇)存在下的免疫接種，可誘發(fā)對Th2的反應(Bernton et al.，1995，Brinkmann & Kristofic，1995，Ramirez et al.，1996)。
(iv)軍隊還曾暴露于氨基甲酸酯和有機磷殺蟲劑的環(huán)境中，這些殺蟲劑可抑制對于正常Th1功能所必需的IL-2誘導的征侯(Casale etal.，1993)。對于這種因素的重要性尚不確切。但是已有傳聞，這些殺蟲劑常常是從海灣當?shù)氐膩碓传@得的，因此對其純度不了解，甚至有可能存在較毒性的污染物。
因此，在這種環(huán)境下給予的多種疫苗接種，可能已經(jīng)引起了全身性長時間持續(xù)的細胞因子不平衡。由于疫苗接種或其它Th2-誘發(fā)性環(huán)境刺激和感染，在一般人群中也偶爾發(fā)生相同的作用，這可以解釋慢性疲勞綜合征廣泛發(fā)病的原因。
下面將對這些觀點作更詳細的說明。
本發(fā)明者已作出了驚人的發(fā)現(xiàn)(被殺死的)母牛分枝桿菌制劑能夠以非特異性方式，強有力地糾正全身性Th1＞Th2偏移。這種作用是以某種方式使免疫系統(tǒng)活性偏移遠離Th2，這種方式包括對在所注射的母牛分枝桿菌制劑中不存在的抗原的免疫反應。
已通過動物模型和人體實驗證明了這點。代表性實驗將在下面的詳述中描述。特別是它們驚奇地顯示出Th2活性的下調(diào)，而且可以不伴隨Th1活性的上調(diào)。
簡單地說，對于實驗動物給予母牛分枝桿菌時，可觀察到遠離Th2活性的全身性非特異偏移，表現(xiàn)為在預先免疫以便建立Th2反應的小鼠對卵清蛋白(一種與母牛分枝桿菌本身無關的過敏原)的IL-4(Th2)依賴性抗體應答的滴度下降。單次注射母牛分枝桿菌就能引起這種作用，進一步注射可使之加強。此作用是非特異性的，因為不需要在所注射的制劑中存在任何卵清蛋白成分。
對于人(癌癥病人)，通過如下方式證明了這種作用以佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯和鈣離子載體刺激后，在外周血中出現(xiàn)能自動分泌IL-2(一種特征性Th1細胞因子)的淋巴細胞，以及分泌IL-4(一種特征性Th2細胞因子)的T細胞減少了。在每次連續(xù)注射母牛分枝桿菌之后，顯示這種激活Th1表型的淋巴細胞百分數(shù)逐漸增加，在許多病人3-5次注射109個細菌后(0天，15天，30天，然后每月一次)達到高峰值。
此外，下面還有報告表明，對患有慢性疲勞綜合征的病人給予母牛分枝桿菌制劑，獲得了有益的效果。
本發(fā)明者以前曾公開過將母牛分枝桿菌用于治療結核病(GB-A-2156673)，癌癥(ZA 95/2644)，HIV感染(WO 94/06466)，以及慢性炎癥(GB-B-2252044)。WO 92/08488(也是出自本發(fā)明者)公開了它作為佐劑用于同所需抗原一起給藥的用途，顯示出對此抗原反應的T-細胞成分從Th2型式轉變成Th1型式。在WO 92/08488中并未提示母牛分枝桿菌可引起免疫系統(tǒng)活性的非特異性Th2/Th1轉移，這是一種不同于，在針對母牛分枝桿菌所給予的抗原的特異性反應中的轉移。而且在WO 92/08488中和在別處，都沒有提示它能下調(diào)Th2活性，而不伴隨上調(diào)Th1活性。
關于母牛分枝桿菌作為Th1佐劑的綜述包括Abou-Zeid et al(1997)，Skinner et al(1997a)，和Skinner et al(1997b)。也可參閱Mosmann and Sad(1996)，此文述評了Th1細胞因子的下調(diào)對Th2細胞增殖有抑制作用。
概括地說，本發(fā)明是關于對病人下調(diào)免疫系統(tǒng)Th2活性，而不上調(diào)Th1活性，特別是在治療以免疫系統(tǒng)活性從Th1向Th2轉移為特征的疾病中，在此下調(diào)Th2活性而不伴隨上調(diào)Th1活性，對治療特別有益。
本發(fā)明的一個方面是提供了一種治療病人的方法，此方法包括對病人給予母牛分枝桿菌的抗原物質和/或免疫調(diào)節(jié)物質。
本發(fā)明進一步提供了將母牛分枝桿菌的抗原物質和/或免疫調(diào)節(jié)物質，用于制備對病人治療的藥物中的用途。
本發(fā)明的另一方面提供了一種用于治療病人的物質或組合物，此物質或組合物包括母牛分枝桿菌的抗原物質和/或免疫調(diào)節(jié)物質。
優(yōu)選的是，所提供的母牛分枝桿菌制劑不含有任何額外的(“外來的”)抗原，免疫原，或過敏原。
可被治療疾病的特征是，病人免疫系統(tǒng)存在從Th1活性向Th2活性的總體非特異性偏移?？筛鶕?jù)病人IL-2生成減少或者TL-4或IL-5生成增加，或者通過檢測作為Th2代表性細胞因子的IL-13，和作為Th1代表性細胞因子的γ-干擾素(IFNγ)，對此疾病進行評價或診斷。還可以考慮其它Th1/Th2細胞因子。認為免疫系統(tǒng)從Th1活性向Th2活性的非特異性轉移，可能不是由于或者起因于病人暴露于特殊的抗原，或被特殊病原體感染。被治療的病人可能不患有結核病或其它分枝桿菌感染?？砂凑毡景l(fā)明治療的特殊疾病包括慢性疲勞綜合征，海灣戰(zhàn)爭綜合征和總體性過敏綜合征(Straus，1996)?？砂凑毡景l(fā)明治療的其它疾病是下調(diào)Th2活性而不上調(diào)Th1活性對其治療有益的疾病。
對慢性疲勞綜合征的可操作性定義，可采用例如所謂的1994 CDC標準(Fukuda et al.)，或者所謂的牛津標準(Sharpe et al.)。關于慢性疲勞綜合征的現(xiàn)有知識在Turnberg et al的論文中(1996年10月發(fā)表)有綜述和討論。
母牛分枝桿菌物質可以是，或者包含母牛分枝桿菌的死細胞。這種細胞可以用輻射法，化學法或其它任何方法殺死，例如用鈷60以2.5兆拉德的劑量照射，但優(yōu)選的方法是高壓滅菌，例如在69kPa壓力，115℃-125℃下處理10分鐘。高壓滅菌可產(chǎn)生比輻射法更有效的制劑。
在殺死母牛分枝桿菌細胞之前，可在適當?shù)墓腆w培養(yǎng)基上對其細胞進行培養(yǎng)。優(yōu)選的可以是改良的Sauton′s液體培養(yǎng)基(Boyden et al.)，以最好是1.3％的瓊脂固化。一般在32℃好氧培養(yǎng)10天之后收獲此微生物，然后稱重，在稀釋劑中作成懸液，準備用于給藥。如果需要，使用前可貯存于4℃。
稀釋劑可以是無熱原的未緩沖生理鹽水。優(yōu)選的稀釋劑是硼酸緩沖的，并最好含有表面活性劑如Tween 80。適合的硼酸緩沖液是Na2B4O7·10H2O-3.63g，H3BO3-5.25g，NaCl-6.19g，Tween800.0005％，用蒸餾水稀釋至1升。這種稀釋劑是可藥用的。
通過給予母牛分枝桿菌的GMP制劑SRL 172，獲得了上述對人的治療結果，此制劑經(jīng)過食品藥品管理局(FDA)IND的和英國藥品管理署(Medicines Control Agency)CTX的幾次審查，獲準可對人使用。由Huntingdon Research完成了GLP急性毒理學試驗。已在美國獲得第一期和第二期安全評價資料，并已提交給FDA。在第三期試驗中SRL 172是用于結核病免疫治療。SRL 172被優(yōu)選地用于本發(fā)明。
SRL 172是從稱為R877R的菌株得到的母牛分枝桿菌制劑，根據(jù)布達佩斯條約，此菌株于1984年2月13日保藏于聯(lián)合王國ColmdaleAvenue，London NW 9 5HT的公共衛(wèi)生中心實驗室，國立典型培養(yǎng)物保藏中心(NCTC)，保藏號為NCTC 11659。R877R最初是從烏干達中部Lango區(qū)的泥土樣品中被分離出(Stanford and Paul)。
可使用其它的母牛分枝桿菌菌株代替SRL 172。借助于生物化學和抗原的判斷標準，可鑒別屬于母牛分枝桿菌的微生物(Bonicke et al.)。
對于本發(fā)明優(yōu)選的是，用于給藥的母牛分枝桿菌物質不含有，或者基本不含有非母牛分枝桿菌抗原物質或免疫調(diào)節(jié)物質。換句話說，用于給藥的這種藥劑或組合物包含，或者基本上由母牛分枝桿菌抗原物質和/或免疫調(diào)節(jié)物質組成，例如死亡的細胞，其提取物或衍生物，以及可藥用的稀釋劑。
優(yōu)選地是以“治療有效劑量”給藥，這是足以對病人顯出療效的劑量。這種療效是至少使其中一種癥狀有改善。實際給藥劑量，給藥的頻率和時間進程將取次于被治療疾病的特點和嚴重程度。治療的處方，如確定劑量等等，應該是一般專業(yè)人員和其它醫(yī)生的責任。
單一劑量給藥(給予死細胞)通常含有107-1010個殺死的母牛分枝桿菌菌體。可以對病人一次給予108-109個殺死的母牛分枝桿菌，雖然需要時可重復給藥，例如間隔2周至6個月。
此組合物可以單獨給藥，或者同其它治療劑聯(lián)合給藥，同時給予或順序給予，取決于所治療的狀況。
本發(fā)明的藥物組合物，為了用于本發(fā)明，除了活性成分之外，還可能包括本領域技術人員熟知的可藥用的賦形劑，載體，緩沖劑，穩(wěn)定劑或其它物質。這些物質應該是沒有毒性的，并應該不會干擾活性成分的效果。載體或其它物質的確切性質將取決于給藥的途徑，優(yōu)選地是通過注射途徑，如皮膚、皮下或皮內(nèi)注射。
用于注射，可使活性成分形成注射給藥可接受的水溶液形式，不含熱原物質；并且有適當?shù)膒H，等滲性和穩(wěn)定性。對于可藥用的優(yōu)選的適當稀釋劑，上面已有論述。
也可采用口服給藥，這種情況下，該藥物組合物可以是片劑，膠囊劑，粉末劑或液體劑形式。片劑可包含固體載體如明膠，或一種佐劑。液體藥物組合物一般包含液體載體如水，石油，動物油或植物油，礦物油或者合成油。還可能含有生理鹽水液，葡萄糖或其它糖類溶液，或者二元醇溶液如乙二醇，丙二醇或聚乙二醇。
還可以通過氣霧劑將母牛分枝桿菌對呼吸道給藥，采用適當?shù)膭┬?，例如包括其大小能通過呼吸道適當部分的顆粒劑。這種劑型可能是干粉末而不是水懸液。
可使用來自母牛分枝桿菌的物質代替殺死的細胞，特別是具有必要活性的提取物或合成分子。
如前面已簡單地論述過的，對于海灣戰(zhàn)爭退伍軍人，多種疫苗接種，應激狀態(tài)和其它一些因素，可能已經(jīng)引起了長時間持續(xù)的全身性細胞因子不平衡。由于疫苗接種或其它Th2誘導性環(huán)境刺激，以及感染，同樣的作用可能散在地發(fā)生在一般群體中，這可以解釋慢性疲勞綜合征廣泛發(fā)病率的原因。
強有力的免疫原對無關抗原免疫反應的性質，可以具有全身性長時間持續(xù)的非特異性作用。例如麻疹感染可減少特異反應性發(fā)病率和對室內(nèi)粉塵螨過敏性反應的發(fā)病率(Shaheen et al，1996)。類似的情況是，結核菌素皮膚試驗陽性的日本兒童與結核菌素陰性的兒童相比較，前者很可能較少具有特異反應性，并且他們的循環(huán)Th1/Th2細胞因子比率也較高。而且，重復注射BCG之后，對于出現(xiàn)結核菌素轉變的兒童，他們的特異反應性癥狀消失的機率增加了(Shirakawa et al，1996)。
麻疹疫苗接種是另一個例子。這種疫苗當以標準劑量使用時，與未接種疫苗的人群相比較，相當多地降低了死亡率，可用麻疹的發(fā)病率下降來解釋。白喉，破傷風和百日咳疫苗(Th2-誘導性的)不表現(xiàn)出這種非特異性保護作用(Aaby et al，1995)。但是，當使用高滴度麻疹疫苗時，死亡率增加了，雖然對麻疹本身的保護作用仍然存在(Aaby，1995，Aaby et al，1995)。有證據(jù)表明，這種死亡率增加伴有向Th2的轉換，并且對于其它幾種免疫原已明確地證實，具有劑量相關的增加對Th2成分的誘導作用(Bretscher et al，1992，Hernander-Pando& Rook，1994)。用于海灣的疫苗是Th2-誘導性的(鼠疫，炭疽，傷寒，破傷風，霍亂)，并累積性地構成了一個大的抗原負荷，又進一步促進了Th2。而且，通過使用百日咳疫苗作佐劑，這種趨勢將會增加，因為它是一種強有力的Th2誘導劑(Mu & Swell，1993，Ramiye etal，1996，Smit et al，1996)。百日咳疫苗的這種特性，目前已導致人們探討如下的可能性它對兒童的使用可能會促進同時增加特異性反應性的發(fā)生(Nilsson et al，1996，Odent et al，1994)。
通過對應激狀態(tài)繼發(fā)性的內(nèi)分泌因素，這些疫苗驅動全身性Th2反應的內(nèi)在趨勢將會大大增強，海灣戰(zhàn)爭的人員在疫苗接種時就暴露于這種應激狀態(tài)。
幾種類固醇激素能調(diào)節(jié)T細胞的反應。脫氫表雄甾酮(DHEA)或者其未知的代謝產(chǎn)物，傾向于促進Th1模式。這種DHEA能恢復年老小鼠的免疫功能，并且在年老動物觀察到，它能糾正調(diào)節(jié)異常的細胞因子釋放(Daynes et al，1993，Garg & Bondade，1993)。對老年人也檢測到類似的特點(Moreles et al，1994)。它能促進產(chǎn)生Th1細胞因子如IL-2和IFNγ(Daynes & Araneo，1989，Daynes et al.，1990，Daynes et al.，1995，Daynes et al.，1991)。DHEA還能促進人外周血T細胞分泌IL-2(Suzuki et al，1991)。
DHEA的這些作用與糖皮質激素如皮質醇的作用相反，皮質醇提高Th2活性，并與Th2細胞因子有協(xié)同作用(Fischer & Konig，1991，Guida et al，1994，Padgett et al.，1995，Wu et al.，1991)。如果存在非特異性刺激時(Brinkmann & Kristofic，1995)“幼稚”T淋巴細胞的增殖被驅動，或者被抗原驅動(如疫苗接種法)那么將形成具有Th2細胞因子模式的T淋巴細胞。已用來自“清潔的”實驗室嚙齒動物的脾細胞相當清楚地顯示了這點，這種動物在正常環(huán)境下幾乎沒有記憶細胞(Ramirez et al.，1996)。
總的“深層線索”(“bottom line”)是，皮質醇有助于從幼稚的細胞發(fā)展Th2細胞因子模式(Brinkmann & Kristofic，1995)。這點必須與如下事實區(qū)分開已確立的Th2細胞分泌細胞因子的活性易受皮質醇抑制。因此，以皮質醇類似物用于常規(guī)治療Th2-介導的疾病如濕疹，哮喘和枯草熱，可能是通過抗炎癥作用，并且通過減少Th2細胞產(chǎn)生細胞因子而發(fā)揮功能(Corrigan et al，1995)，可是，當使用皮質醇時，通過驅動新補充的T細胞向Th2偏移，又將促使根本問題依然存在。
心理的和物理的應激狀態(tài)可激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，因而導致包括增加皮質醇分泌在內(nèi)的多種改變。過度的運動和缺乏飲食和睡眠導致降低了DHEA對皮質醇的比率(DHEA/皮質醇之比)。這與遲發(fā)型過敏反應性降低(一種Th1的標志)直接相關，并且同時出現(xiàn)血清IgE水平升高。IgE完全依賴于Th2細胞因子的產(chǎn)生(Bernton et al，1995)。根據(jù)上面簡述的DHEA和皮質醇的已知作用可預料到這點。
應激狀態(tài)對Th1-＞Th2轉換作用的另一個例子是，以應激方式對考試顯示反應的學生，對EB病毒的抗體增加了。這種病毒通常是由Th1反應和胞毒T細胞控制，失去控制將導致病毒復制和抗體增加(Zwilling，1992)。類似的情況是，考試期間的醫(yī)學院學生，外周血白細胞顯示出較低的IFNγ，一種Th1細胞因子的mRNA水平(Glaseret al，1993)。
以對動物更多控制的方式可證明類似的觀點。由于擁擠或限制活動而引起的應激反應可促進小鼠結核性結節(jié)中分枝桿菌的生長(Brown etal，1993，Tobach & Bloch，1956)。這是一種對甚至存在少量Th2成分都極度靈敏的動物模型(Rook & Hernandez-Pando，1996)。還論述了其它一些例子(Moynihan，1994)。
有相當多的證據(jù)表明，抑郁癥與腦中過度的皮質醇介導性作用有關(在Raven et al.，1996中有述評)，應激狀態(tài)可導致抑郁癥。因此，抑郁癥(如在CFS和GWS病人所見到的)傾向于與Th2介導的疾病如哮喘，濕疹同時存在，并且某些內(nèi)分泌改變是Th2病癥和抑郁癥共有的(Holsboer et al.，1984，Rupprecht et al.，1995)。
在結核病病人，存在全身性Th2偏移(Rook & Hernandez-Pando，1996)，并有異常形式的腎上腺類固醇代謝產(chǎn)物排泄于尿中(Rook et al.，1996)。因此相對于可的松的代謝產(chǎn)物，皮質醇的代謝產(chǎn)物增加了。對疾病的治療可恢復Th1的優(yōu)勢，并可糾正類固醇代謝產(chǎn)物的類型，使相對于皮質醇的代謝產(chǎn)物，可的松的代謝產(chǎn)物增加了(Rook et al，1996)。用藥物美替拉酮治療抑郁癥，對類固醇的代謝產(chǎn)物引起了同樣的改變(例如相對于皮質醇的代謝產(chǎn)物，17-羥-11脫氫皮質甾酮的代謝產(chǎn)物增加了)(Raven et al，1995)。母牛分枝桿菌制劑SRL 172對結核病的免疫治療是有效的。
如前面所述，疫苗接種可誘導全身Th1/Th2平衡的非特異性改變，以及通常所尋求的抗原特異性免疫作用。為了恢復正常健康個體特征性的Th1高于Th2的優(yōu)勢，對CFS的治療可能需要誘導全身非特異性Th1偏移。這同海灣人員所接受的疫苗接種可能已誘導的偏移正好相反。
現(xiàn)在在此提供的實驗證據(jù)驚人地表明，母牛分枝桿菌制劑可以使這種可能見于海灣戰(zhàn)爭退伍軍人的有害的Th1向Th2偏移減弱。
現(xiàn)在將非限制性地根據(jù)實驗實施例和如下附圖對本發(fā)明進行說明

圖1顯示小鼠首次以卵清蛋白免疫接種后，在不同天血清總IgE(ng/ml±SD)的改變，被計算成相對于第46天的值。小園圈代表接受母牛分枝桿菌的小鼠，小方塊代表鹽水對照動物。為方便起見，標明了以卵清蛋白免疫接種和給予母牛分枝桿菌或生理鹽水的時間(天)。
圖2顯示對IL-5(pg/ml±SD)的測定結果，此IL-5是從取自卵清蛋白刺激小鼠的脾細胞在體外釋放的。所采用測定方法的最小檢測濃度為15.6pg/ml。
圖3顯示預先用OVA(卵清蛋白)免疫的BALB/c小鼠，以皮下注射生理鹽水(●)治療同注射107母牛分枝桿菌制劑(○)治療相比較，對血清總IgE(ng/ml)的影響。(圖3A)107未修飾的母牛分枝桿菌(Mv)，(圖3B)OVA偶聯(lián)的母牛分枝桿菌(Mv-OVA)，或(圖3C)NaCl洗和過碘酸處理的對照母牛分枝桿菌(NaCl-Mv)。數(shù)據(jù)表示為相對于第46天取樣所得到讀數(shù)的改變值±SD。圖上標明了免疫接種和治療的程序。(OVA以在IFA中的50mg OVA免疫接種)。
圖4顯示預先用OVA免疫的BALB/c小鼠，以皮下注射生理鹽水(●)治療同注射107個母牛分枝桿菌制劑(○)治療相比較，對OVA-特異性IgE的影響。(圖4A)未修飾的母牛分枝桿菌(Mv)(O.D.405nm)，(圖4B)OVA結合的母牛分枝桿菌(Mv-OVA)(O.D.405nm)，或(圖4C)NaCl洗和過碘酸處理的對照母牛分枝桿菌(NaCl-Mv)(ng/ml)。數(shù)據(jù)表示為相對于第46天取樣所得到讀數(shù)的改變值±SD。圖上標明了免疫接種和治療的程序。
圖5顯示與OVA共同培養(yǎng)的脾細胞IL-2的產(chǎn)生。脾是從經(jīng)如下處理的小鼠在第109天獲得在0天和24天用OVA先免疫小鼠，在53天和81天以生理鹽水，107未修飾的母牛分枝桿菌(Mv)，OVA偶聯(lián)的母牛分枝桿菌(Mv-OVA)，或者相應的對照，NaCl洗和過碘酸處理的對照母牛分枝桿菌(NaCl-Mv)治療小鼠。培養(yǎng)24小時之后，收集培養(yǎng)上清液測定IL-2。數(shù)據(jù)表示為此細胞因子的平均水平±SD(pg/ml)。
圖6顯示與OVA共同培養(yǎng)的脾細胞IL-5的產(chǎn)生。脾是從經(jīng)如下處理的小鼠在109天獲得在0天和24天先用OVA免疫小鼠，在53天和81天以生理鹽水，107未修飾的母牛分枝桿菌(Mv)，OVA偶聯(lián)的母牛分枝桿菌(Mv-OVA)，或者相應的對照NaCl洗和過碘酸處理的母牛分枝桿菌(NaCl-Mv)治療小鼠。培養(yǎng)48小時之后收集培養(yǎng)上清液測定IL-5。數(shù)據(jù)表示為IL-5的平均水平±SD(pg/ml)。
圖7顯示預先用OVA免疫的BALB/c小鼠，以皮下單次注射不同劑量母牛分枝桿菌治療同注射生理鹽水相比較，對血清IgE水平的影響。血清IgE表示為相對于在32天，以母牛分枝桿菌或生理鹽水治療之前取樣所得到讀數(shù)的改變值(平均值±SE)。在第52天和70天采集治療后的血清樣品(即在第42天以生理鹽水或母牛分枝桿菌治療后10天和28天)。在實驗方法中標明了免疫接種和治療的程序。通過Mann-WhitneyU-檢驗進行不同組間的統(tǒng)計學比較。
圖8顯示與OVA共同培養(yǎng)的脾細胞IL-2(圖8A)和IL-4(圖8B)的產(chǎn)生。先對BALB/c小鼠給予二次OVA，然后給予不同劑量的母牛分枝桿菌107，108，或109(pg/ml)。在第82天獲得脾細胞并與OVA共同培養(yǎng)。實驗方法中標明了免疫接種和治療的程序。培養(yǎng)48小時后收集培養(yǎng)上清液測定IL-4，培養(yǎng)24小時后收集上清液測定IL-2。數(shù)據(jù)表示為細胞因子的平均水平±SD。通過Student′s t檢驗進行不同組間的統(tǒng)計學比較。(生理鹽水組在用生理鹽水治療之前，用OVA免疫接種2次，10^7Mv組在用107母牛分枝桿菌治療之前，用OVA免疫接種2次)。
圖9顯示以皮下注射2次(第53天和81天)107母牛分枝桿菌(○)治療同注射生理鹽水(●)相比較，對血清總IgE(圖9A)和OVA-特異性IgE(圖9B)的影響。圖上標明了免疫接種和治療的程序。血清IgE表示為相對于第46天取樣所得到讀數(shù)的改變值±SD(ng/ml)。通過Mann-Whitney U-檢驗進行不同組間的統(tǒng)計學比較。(OVA卵清蛋白免疫接種，Mv母牛分枝桿菌免疫接種)。
圖10顯示與OVA共同培養(yǎng)的脾細胞IL-5(圖10A)，IL-2(圖10B)和IFN-γ(圖10C)的產(chǎn)生(pg/ml)。在第109天獲得脾細胞，并與OVA共同培養(yǎng)。免疫接種和治療的程序標明在圖9上。培養(yǎng)48小時后收集培養(yǎng)上清液測定IL-5，培養(yǎng)24小時后收集上清液測定IFN-γ和IL-2。數(shù)據(jù)表示為細胞因子的平均水平±SD。通過Student′s t-檢驗進行不同組間的統(tǒng)計學比較。(生理鹽水先以OVA免疫接種2次，然后生理鹽水治療2次；107Mv先以OVA免疫接種2次，然后107母牛分枝桿菌治療2次)。
在此所提到的所有文獻均被引入作為參考。實施例1對實驗動物給予母牛分枝桿菌，引起免疫系統(tǒng)Th2活性非特異性降低的證據(jù)在0天和第24天以在油中(不完全弗氏佐劑，IFA)乳化的卵清蛋白50μg，免疫6-8周齡的Balb/c小鼠。已知這樣可引發(fā)很強的Th2模式反應，伴隨IgE的產(chǎn)生，并觸發(fā)二個Th2細胞因子IL-4和IL-5的釋放。
然后在第53天和81天給予動物生理鹽水或高壓滅菌的107母牛分枝桿菌(皮下注射)。
先在第46天(即以生理鹽水或母牛分枝桿菌治療之前)，然后在67天，91天和109天采集血清樣品。
然后收集脾細胞，用于在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中以卵清蛋白刺激。48小時之后收集培養(yǎng)上清液，借助于ELISA測定細胞因子。
以從Pharmingen獲得的抗體對，采用捕獲測定法進行檢測。
IL-5#18051D捕獲抗體#18062D(生物素化的)檢測抗體。檢測抗體的結合以鏈霉親和素-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物(DakoP0397)顯示，生色原是ABTS(Sigma A-1888)。
IgE#02111D捕獲抗體；#02122D(生物素化的)檢測抗體。以親和素-堿性磷酸酶偶聯(lián)物(Sigma E-2636)顯示檢測抗體的結合，生色原是pNPP(Sigma N-2770)。
以同第46天的血清濃度(處理前的最后值)相比較的改變值ng/ml表示IgE水平的結果。因此，從以后每個血樣的數(shù)值中扣除了第46天的數(shù)值。結果注射母牛分枝桿菌降低了以卵清蛋白免疫接種引起的IgE水平上升。以母牛分枝桿菌治療引起的降低，在所有被測定的時間點都是顯著的。結果顯示在圖1中。
類似的情況是，如果供體動物已用母牛分枝桿菌治療過，來自這種免疫動物的脾細胞在體外對卵清蛋白的反應中不能釋放IL-5，而來自以生理鹽水治療的免疫動物的脾細胞，在對卵清蛋白反應中釋放了大量的IL-5。此結果顯示在圖2中。在未加卵清蛋白培養(yǎng)的對照孔中未檢測出IL-5(數(shù)據(jù)未顯示)。結論即使在如下情況下給予母牛分枝桿菌，都將降低反應的Th2模式(i)在以強有力的過敏原(在此情況下是卵清蛋白)免疫接種之后，以及(ii)沒有Th2-誘導性分子的抗原表位。
因此，存在不依賴于佐劑對過敏原本身直接作用的Th2反應模式的全身非特異性下調(diào)作用。實施例2不同的母牛分枝桿菌制劑對血清IgE的作用在另一個為了確定偶聯(lián)的母牛分枝桿菌-OVA對血清IgE滴度影響的實驗中，用在IFA中的OVA免疫BALB/c小鼠二次，以便誘發(fā)IgE反應，然后以如下制劑治療2次生理鹽水，未修飾的母牛分枝桿菌，偶聯(lián)的母牛分枝桿菌-OVA，或相應的不含OVA，NaCl-洗，過碘酸處理的假偶聯(lián)母牛分枝桿菌制劑(NaCl-Mv)。第46天OVA免疫的小鼠具有IgE 112.9±10(S.E)ng/ml，相比之下未免疫的動物為55.4±1.7(S.E)ng/ml(p＜0.01)。對于每只小鼠，都用第46天的數(shù)值使數(shù)據(jù)標準化成起始(即第46天)值0，將它從以后的每個數(shù)值中扣除。因此，作圖的數(shù)值是相對于第46天的改變值ng/ml。
在實驗期間對照小鼠(以生理鹽水治療的)血清總IgE穩(wěn)步增加(圖3A-C)。在以未修飾的母牛分枝桿菌治療的小鼠血清總IgE受到抑制(圖3A)。相反，NaCl洗，過碘酸處理的制劑對IgE-抑制沒有效果，無論是偶聯(lián)于OVA(圖3B)或者是未偶聯(lián)的(圖3C)都沒有效果，雖然有一次對照NaCl-Mv給藥顯示出對血清總IgE的短暫抑制作用(圖3C)。這些結果表明，通過NaCl洗，或者通過偶聯(lián)處理過程，下調(diào)IgE的能力被消除了。
相反，不論是未修飾的母牛分枝桿菌或者是對照的NaCl-Mv，都不能下調(diào)OVA特異性IgE(圖4A和4C)。并且，通過以偶聯(lián)的Mv-OVA治療，OVA特異性IgE反應實際上是增強了(圖4B)。實施例3不同的母牛分枝桿菌制劑對脾細胞產(chǎn)生IL-2的影響在第109天從以OVA免疫的小鼠獲得脾細胞，在體外與OVA共同培養(yǎng)。來自OVA致敏的，接受生理鹽水治療的小鼠脾細胞，在體外對OVA的反應中不能產(chǎn)生IL-2。來自以不含OVA成分的母牛分枝桿菌制劑治療的免疫小鼠脾細胞，在對OVA的反應中產(chǎn)生了可檢測水平的IL-2，但是增加沒有顯著性。相比之下，來自以偶聯(lián)的含OVA的母牛分枝桿菌制劑治療的小鼠脾細胞，在對OVA的反應中釋放了高水平的IL-2(與接受生理鹽水的小鼠相比較p＜0.05)(圖5)。這些結果表明，將OVA偶聯(lián)于母牛分枝桿菌，使細胞在對OVA的反應中IL-2的產(chǎn)生增加了。
因此，除非使卵清蛋白包含(偶聯(lián)于)在母牛分枝桿菌中，否則對卵清蛋白的Th1反應沒有顯著的增加。而且如所顯示的，當含有卵清蛋白時，雖然Th1反應變成高度顯著性，但是對Th2的抑制作用沒有改善，并且可能降低(見在此后其它實驗)。實施例4不同的母牛分枝桿菌制劑對脾細胞產(chǎn)生IL-5的影響來自OVA致敏小鼠的脾細胞在對OVA的反應中產(chǎn)生了高水平的IL-5(圖6)。但是，來自已用母牛分枝桿菌制劑治療的OVA免疫小鼠的脾細胞，在對OVA反應中都釋放顯著較少的IL-5，不論所用的母牛分枝桿菌制劑是未修飾的，NaCl洗過的對照，或者OVA-偶聯(lián)的都是如此。因此，與測定IgE時所看到的結果大不相同，偶聯(lián)處理過程本身，或者存在OVA對母牛分枝桿菌的偶聯(lián)，對IL-5釋放的下調(diào)都沒有任何影響。只不過是通過將此過敏原偶聯(lián)于母牛分枝桿菌，降低了關閉IL-5的能力，因為對Mv-OVA的相關對照是NaCl-Mv(假偶聯(lián)的)。實施例5不同劑量母牛分枝桿菌對動物中血清IgE的影響為了測定不同劑量母牛分枝桿菌對血清總IgE的影響，用在IFA中的OVA免疫BALB/c小鼠2次(0天和第21天)，以便誘導IgE反應。在第32天對小鼠采血，然后在第42天用生理鹽水或者107，108，或109母牛分枝桿菌治療。
在第32天，OVA免疫的小鼠具有117.09±35.81(S.D)ng/ml的IgE，相比之下未免疫的小鼠為69.27±6.09(S.D)ng/ml(p＜0.001)。對于每只小鼠，都用第32天的數(shù)值使數(shù)據(jù)標準化成起始(即第32天)值0，將它從以后的每個數(shù)值中扣除。因此，作圖的數(shù)值是相對于第32天的改變值ng/ml。
當在第52天和70天進一步采樣時(即在第42天治療后的10天和28天)，對照小鼠(用生理鹽水治療的)的IgE反應已進一步增加了(圖7)。相比之下，在用107，108和109母牛分枝桿菌治療的小鼠，IgE水平的增加受到了抑制(圖7)。以生理鹽水治療的小鼠和以不同劑量母牛分枝桿菌治療的小鼠之間，相比較的p值都小于0.01。實施例6母牛分枝桿菌處理對脾細胞產(chǎn)生細胞因子的影響以用于實施例5的同樣實驗方案處理BALB/c小鼠。然后在第82天收集它們的脾細胞，在體外與OVA，母牛分枝桿菌和ConA共同培養(yǎng)。來自生理鹽水治療組小鼠的脾細胞，在對OVA的反應中產(chǎn)生了IL-4，但不產(chǎn)生IL-2(圖8A/B)。來自已用107經(jīng)高壓滅菌的母牛分枝桿菌治療的OVA免疫小鼠的脾細胞，在對OVA的反應中顯示出IL-2合成和減少產(chǎn)生IL-4。用來自以108或109母牛分枝桿菌治療的小鼠脾細胞，也觀察到在對OVA反應中的IL-2合成。
注意，對于母牛分枝桿菌治療小鼠的脾細胞，IL-2產(chǎn)量增加沒有顯著性(SD大于反應量)，僅涉及該組中的某些小鼠。絕大多數(shù)被治療的小鼠不產(chǎn)生IL-2。實施例7二次給予母牛分枝桿菌對血清IgE的影響因為前面已經(jīng)顯示107母牛分枝桿菌是引發(fā)對其本身抗原Th1反應的最佳劑量，并且是中試中最有效的劑量(圖7)，所以選擇此劑量作進一步研究。在0天和第24天用OVA免疫BALB/c小鼠2次，以便誘導IgE反應，并在第46天采血樣，然后在第53天和81天用生理鹽水或者用107母牛分枝桿菌治療小鼠2次。在第46天，OVA免疫的小鼠具有112.9±10(S.E)ng/ml的IgE，相比之下，未免疫的小鼠是55.4±1.7(S.E)ng/ml(p＜0.01)。對于每只小鼠，都用第46天的數(shù)值使數(shù)據(jù)標準化成起始(即第46天)值0，將它從以后的每個數(shù)值中扣除。因此，作圖的數(shù)值是相對于第46天的改變值ng/ml。
在實驗期間，對照小鼠(以生理鹽水治療的)血清總IgE穩(wěn)步增加。相反，對于用107經(jīng)高壓滅菌的母牛分枝桿菌治療的小鼠，IgE的增加被抑制了(圖9A)。同時，在此測定中，通過母牛分枝桿菌處理對抗-OVA IgE的抑制作用不顯著(圖9B)。但是，進一步實驗表明，接受母牛分枝桿菌4次的OVA致敏BALB/c小鼠，具有顯著較低的OVA特異性IgE滴度。
對OVA的IgG 1和IgG 2抗體未受母牛分枝桿菌治療的影響。實施例8母牛分枝桿菌處理對脾細胞產(chǎn)生IFN-γ，IL-2和IL-5的影響以用于實施例7的同樣實驗方案處理BALB/c小鼠。然后在第109天收集它們的脾細胞，在體外與OVA共同培養(yǎng)。來自生理鹽水治療組小鼠的脾細胞，在對OVA的反應中產(chǎn)生了高水平的IL-5，但是不產(chǎn)生IL-2。然而，來自已用107經(jīng)高壓滅菌的母牛分枝桿菌治療2次的OVA免疫小鼠的脾細胞，在對OVA的反應中不能釋放IL-5(圖10A)。來自已接受2次107母牛分枝桿菌的小鼠的脾細胞，在對OVA反應中IL-4的產(chǎn)生似乎減少了，但是這種細胞因子的含量水平太接近于本免疫測定法的檢測極限而不可靠。如前面所顯示(圖8A)，在某些用母牛分枝桿菌治療的小鼠的脾細胞上清液中，同樣可檢測出OVA誘導產(chǎn)生的IL-2(圖10B)，雖然統(tǒng)計學沒有顯著性。在沒有顯示IL-2增加的動物中，觀察到Th2降低。來自不同組動物的脾細胞，在OVA誘導的IFN-γ合成中沒有差異(圖10C)。討論用在IFA中的OVA給予2次免疫接種的BALB/c小鼠發(fā)展了典型的Th2型反應。出現(xiàn)了血清IgE水平升高，來自這些小鼠的脾細胞在體外對OVA的反應中釋放IL-5，但不釋放IL-2。最引人注目的是，通過用低劑量殺死的母牛分枝桿菌治療，可下調(diào)這種正在BALB/c小鼠中進行的過敏原特異性反應，而不需要在母牛分枝桿菌制劑中有任何OVA或OVA抗原表位。
類似的情況是，我們的實驗已揭示，通過應用廣泛劑量范圍的母牛分枝桿菌，可抑制由OVA誘導的高水平血清IgE。這點是未預料到的，因為以前對小鼠的劑量-反應研究，把107作為誘導對包含在母牛分枝桿菌內(nèi)的分枝桿菌抗原的Th1反應的最佳劑量，沒有可檢測的Th2反應成分，而109激發(fā)混合的Th1+Th2反應。根據(jù)所有的這些理由可認為，在這種模型中母牛分枝桿菌很可能不是通過對Th1細胞因子的抑制劑性作用而發(fā)揮其功能。對IgE水平的更進一步調(diào)節(jié)可歸于對IgE結合因子的誘導。
除非使卵清蛋白包含在(偶聯(lián)于)母牛分枝桿菌中，否則對卵清蛋白的Th1反應不會有顯著增加，并且當含有卵清蛋白時，雖然Th1反應變成高度顯著性，但對Th2的抑制作用沒有改善，并可能降低。實施例9對Th2和Th1細胞因子模式的測定已有一些關于CFS和海灣戰(zhàn)爭綜合征細胞因子模式的資料，但是它們顯得不一致，并且采用的方法也不可靠，雖然總體臨床表現(xiàn)暗示存在如上面所述的Th2/Th1比率增加(Strans，1996)。
為了證明這點，最優(yōu)選的技術是，用流式細胞儀精確地計數(shù)外周血液中T細胞的數(shù)目和百分數(shù)，這種T細胞能自發(fā)地分泌IL-2(Th1細胞因子)或者IL-4或IL-5(二種Th2細胞因子)，或者在體外用鈣離子載體和佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)刺激之后，能夠誘導這種T細胞分泌這些細胞因子。(實際上用一種抑制劑(莫能菌素)可阻斷分泌，可使細胞因子累積在細胞內(nèi)，在此可用適當?shù)臒晒馊玖蠘擞浀膯慰寺】贵w對它進行檢測(對細胞固定和滲透之后))。
應用這種技術可見，正常人外周血中Th2細胞極端稀少，但是，慢性感染或癌癥病人循環(huán)血中可常見這種細胞(未公布的觀察)。
第二種技術是直接測定血漿或血清中細胞因子的水平。白介素13(IL-13)可作為代表性Th2細胞因子檢測，γ-干擾素(IFNγ)可作為代表性Th1細胞因子檢測。
應用其中一種技術對海灣戰(zhàn)爭退伍軍人的細胞因子模式進行了檢測。確定Th1-＞Th2偏移是指示出母牛分枝桿菌給藥對改善癥狀的適應性。實施例10制備用于給藥的母牛分枝桿菌將母牛分枝桿菌培養(yǎng)在包含改良的Sauton′s培養(yǎng)基(Boyden etal)，并用1.3％瓊脂固化的固體培養(yǎng)基上。以這種細菌接種培養(yǎng)基，并在好氧條件下32℃培養(yǎng)10天，使細菌生長繁殖。然后收獲此細菌，并稱重和懸浮于稀釋劑中，形成100mg細菌/ml稀釋劑。然后用緩沖生理鹽水將此懸液進一步稀釋，形成含有細菌凈重10mg(約1010個細胞)/ml稀釋劑的懸液，并分裝于5ml的多劑給藥的小瓶內(nèi)。然后將裝有活細菌的小瓶在69kPa下高壓滅菌(115℃-125℃)10分鐘，以便殺死此細菌。將這樣制備的治療劑存放在4℃?zhèn)溆?。實施?1應用母牛分枝桿菌治療以Th1/Th2細胞固子偏移為特征的疾病取實施例3中制備的懸液0.1ml，其中含有母牛分枝桿菌凈重1mg(約109個細胞)，劇烈振搖后立即在左側三角肌上通過皮內(nèi)注射給藥。
可定期地測定病人的Th1和Th2細胞因子水平，以便證實從Th2向Th1的偏移，特別是Th2活性的下調(diào)，同時觀察病人癥狀的改善。實施例12應用母牛分枝桿菌治療患有慢性疲勞綜合征的病人(1)對一名70歲的病人用SRL-172治療鱗狀上皮細胞肺癌，同時診斷患有慢性疲勞綜合征，注射2次SRL-172之后，病人興奮地報告它后一種疾病的癥狀消失了。她自我感覺非常好，感覺她的“痛苦都消失了”。作為一名教師，她已接收了額外的幾名學生-表明她癥狀的改善。這名病人已用SRL 172治療了一年多，情況仍然良好。
(2)一名病人有7-8年CFS病史，癥狀包括全身性疲勞，周期性偏頭痛，押郁，食物過敏反應和淋巴結病。注射SRL 172 2次之，她報告了病情改善。她的咽喉痛和腺體腫脹，以及食物過敏反應改善更明顯，她只需要較小劑量的甲狀腺素了。她說話的神志更加明快了，說她較少感到抑郁了。
(3)一個病人的癥狀主要是頭痛，抑郁，和多種食物過敏反應。在用SRL 172治療之前，已試驗了其它很多治療方式都無效。為了控制癥狀，她按規(guī)定服用了大量Nalcron(每天飯前和飯后服用100mgNalcron膠囊80粒)。自從她每隔2個月接受1次SRL 172以來，她的CFS癥狀以及食物過敏反應都有相當明顯的改善，她相信自己只要堅持按規(guī)定注射，將會更好。
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權利要求
1.從母牛分枝桿菌獲得的抗原物質和/或免疫調(diào)節(jié)物質，在制備一種藥物中的用途，此藥物可用于下調(diào)病人免疫系統(tǒng)的Th2活性，而不上調(diào)病人免疫系統(tǒng)的Th1活性。
2.權利要求1的用途，其中的病人患有慢性疲勞綜合征。
3.權利要求1的用途，其中的病人患有海灣戰(zhàn)爭綜合征。
4.權利要求1的用途，其中的病人串有總體過敏反應綜合征。
5.權利要求1-4中任何之一的用途，其中從母牛分枝桿菌獲得的抗原物質和/或免疫調(diào)節(jié)物質包括母牛分枝桿菌的死亡細胞。
6.權利要求5的用途，其中的細胞已用高壓滅菌法殺死。
7.權利要求權利要求1-6中任何之一的用途，其中的藥物不包含任何非母牛分枝桿菌抗原，免疫原或過敏原。
8.一種包含從母牛分枝桿菌獲得的抗原物質和/或免疫調(diào)節(jié)物質的組合物，可用于下調(diào)病人免疫系統(tǒng)的Th2活性，而不上調(diào)病人免疫系統(tǒng)的Th1活性。
9.權利要求8的組合物，其中的病人患有慢性疲勞綜合征。
10.權利要求8的組合物，其中的病人患有海灣戰(zhàn)爭綜合征。
11.權利要求8的組合物，其中的病人患有總體過敏反應綜合征。
12.權利要求8-11中任何之一的組合物，其中從母牛分枝桿菌獲得的抗原物質和/或免疫調(diào)節(jié)物質包括母牛分枝桿菌的死亡細胞。
13.權利要求12的組合物，其中的細胞已用高壓滅菌法殺死。
14.權利要求8-13中任何之一的組合物，其中的藥物不包含任何非母牛分枝桿菌抗原，免疫原或過敏原。
15.一種下調(diào)病人免疫系統(tǒng)Th2活性而不上調(diào)病人免疫系統(tǒng)Th1活性的方法，此方法包括對病人給予從母牛分枝桿菌獲得的抗原物質和/或免疫調(diào)節(jié)物質。
16.權利要求15的方法，其中的病人患有慢性疲勞綜合征。
17.權利要求15的方法，其中的病人患有海灣戰(zhàn)爭綜合征。
18.權利要求15的方法，其中的病人患有總體過敏反應綜合征。
19.權利要求15-18中任何之一的方法，其中從母牛分枝桿菌獲得的抗原物質和/或免疫調(diào)節(jié)物質包括母牛分枝桿菌的死亡細胞。
20.權利要求19的方法，其中的細胞已用高壓滅菌法殺死。
21.權利要求15-20中任何之一的方法，其中的藥物不包含任何非母牛分枝桿菌抗原，免疫原或過敏原。
全文摘要
用從母牛分枝桿菌(Mycobacterium vaccae)獲得的抗原物質和/或致免疫物質下調(diào)免疫系統(tǒng)的Th2活性,而不上調(diào)Th1活性。可治療如慢性疲勞綜合征,海灣戰(zhàn)爭綜合征和總體過敏反應綜合征等疾病。這種物質優(yōu)選地包括在一個組合物中的母牛分枝桿菌的死亡細胞,此組合物不含有非母牛分枝桿菌抗原,免疫原或過敏原。
文檔編號A61P37/00GK1246056SQ9718176
公開日2000年3月1日 申請日期1997年12月17日 優(yōu)先權日1996年12月18日
發(fā)明者G·A·W·羅克, J·L·斯坦福特, A·I·朱姆拉 申請人:斯坦福魯克有限公司