山羊結(jié)核病pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種山羊結(jié)核病PCR檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明的實(shí)施例：山羊結(jié)核病PCR檢測(cè)試劑盒，它包括250μL的PCRpremix緩沖液，150μL超純水，50μL的MarkerDL2000，40μL濃度為10μmol/L的上引物及40μL濃度為10μmol/L的下引物，20μL陰性對(duì)照以及20μL陽(yáng)性對(duì)照。本發(fā)明根據(jù)牛結(jié)核分枝桿菌特異性基因片段設(shè)計(jì)引物，利用該引物建立了快速、敏感、特異的診斷山羊結(jié)核病的PCR檢測(cè)方法。將其應(yīng)用在PCR快速檢測(cè)試劑盒中，可快速檢測(cè)出山羊結(jié)核病，并且具有良好的特異性及敏感性。本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，并且快捷、靈敏，操作簡(jiǎn)單，使用效果好。
【專利說明】山羊結(jié)核病PCR檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其是一種山羊結(jié)核病PCR檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病(Tuberculosis)是由結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起人、畜、禽共患的一種慢性傳染病。山羊結(jié)核病是由牛分枝桿菌(M.bovis)引起的一種人畜共患慢性傳染病，該病被國(guó)際獸疫局(OIE)列為B類動(dòng)物疾病，其傳播和流行影響著畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展和人類的健康。傳統(tǒng)的牛結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法主要是細(xì)菌學(xué)檢查，但由于繁瑣費(fèi)時(shí)、檢出率低、靈敏度差，已不能滿足當(dāng)前疫病檢疫的需要。分離培養(yǎng)需要周期長(zhǎng)，一般需要廣2個(gè)月。而傳統(tǒng)的結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)(PPD)檢測(cè)方法，不斷有報(bào)道存在非特異性反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是:提供一種山羊結(jié)核病PCR檢測(cè)試劑盒，它可以快速檢測(cè)山羊結(jié)核病，并且簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)。
[0004]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:山羊結(jié)核病PCR檢測(cè)試劑盒，它包括250 μ L的PCR premix緩沖液，150 μ L超純水，50 μ L的Marker DL2000，40 μ L濃度為10Mmol/L的上引物及40 μ L濃度為lOMmol/L的下引物，20 μ L陰性對(duì)照以及20 μ L陽(yáng)性對(duì)照；上游引物的序列為:5’_ATCAGCGACTACCTGGCCGAAG-3’ ；下游引物的序列為:5’ - GTGGCGTGCCGTTCTCGTCG-3’。
[0005]陰性對(duì)照為超純水。
[0006]陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)山羊`結(jié)核桿菌的PCR產(chǎn)物。
[0007]PCR premix 緩沖液由 3 mmol/ul 的 MgCl2, 500pmol/ul 的 dNTP 2.0 μ L, 25mmol/μ L 的 Tris-HCl 及 0.2 μ L Taq 酶組成，其 PH 值為 ρΗ8.3。
[0008]為了驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)效果，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn):
山羊結(jié)核病PCR診斷方法的建立
1、材料與方法
1、I 材料
1、1、I 病料病料來(lái)自貴州省貴陽(yáng)市、遵義市、安順市、六盤水市、銅仁地區(qū)、黔南、黔東南、甕安縣等幾個(gè)規(guī)?；B(yǎng)羊場(chǎng)和養(yǎng)羊?qū)I(yè)戶的送檢材料及采集的山羊血清(或全血)。
[0009]1、1、2菌株牛分枝桿菌參考菌株[編號(hào)為93006(4)]購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(北京)。羊大腸桿菌，羊鏈球菌，羊魏氏梭菌，金黃色葡萄球菌，羊多殺性巴氏桿菌為貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽重大疫病監(jiān)測(cè)防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。
[0010]1、1、3 主要試劑 Goldview、Tris、EDTA、DL2000、Taq DNA Polymerase (5U/μ L)及相應(yīng)10 X TaqBuffer、dNTP等購(gòu)自寶生物(大連)工程有限公司；TIANamp細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；引物由寶生物(大連)工程有限公司合成。改良羅氏培養(yǎng)基，本實(shí)驗(yàn)室吳位?行同志惠贈(zèng)。[0011]1、2 方法
1、2、1引物設(shè)計(jì)與合成
參照GenBank中牛分枝桿菌的pnca基因序列，應(yīng)用DNAStar軟件，遵循引物設(shè)計(jì)的基本原貝IJ，設(shè)計(jì)I對(duì)引物。5 ’ -ATCAGCGACTACCTGGCCGAAG-3 ’；下游引物的序列為:5’ -GTGGCGTGCCGTTCTCGTCG-3’。
[0012]預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段大小為241 bp，引物由寶生物(大連)工程有限公司合成。
[0013]1、2、2山羊結(jié)核病細(xì)菌培養(yǎng)
[0014]取新鮮全血接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)約15~30d，收集菌體進(jìn)行抗酸染色鏡檢及PCR擴(kuò)增。
[0015]1、2、3 核酸的提取取待檢病料樣品共約500mg，加入500 μ LPBS緩沖液，待檢樣品研磨后12000r/min離心取上清用于細(xì)菌基因組的提取。細(xì)菌基因組的提取參照TIANamp細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，將提取的DNA — 20°C保存。
[0016]1、2、4 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)在 25 μ L 體系中進(jìn)行，Primerl/2 各 2 μ L、10 X TaqBuffer5 μ L>dNTP mixture4 μ L、Taq DNA polymerase0.5 μ L、ddH20加至 25 μ L,反應(yīng)程序:94°C 5min ；94°C 30s,55°C lmin，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 lOmin。取 5 μ LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。
[0017]1、2、5 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
[0018]對(duì)PCR反應(yīng)條件，包括退火溫度(53°C、55°C、58°C、60°C )，引物濃度(5 μ mol/L、10 μ mol/L、20 μ mol/L), Taq DNA polymerase濃度(0.5U、1U、2U、3U3.5U),以確定最佳反應(yīng)條件，同時(shí)以雙蒸水作為空白對(duì)照。多重PCR反應(yīng)在50 μ L反應(yīng)體系中進(jìn)行，包括上下游引物各 2 μ L, IOXTaq BufferlO μ L, dNTP mixture8 μ L ；Taq DNA polymerasel μ L 用雙蒸水補(bǔ)足至 50 μ L0 反應(yīng)條件為:94°C 5min ；94°C lmin, 54 ~60°C lmin, 72°C lmin, 30 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。取5 μ LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。
[0019]1、2、6敏感性試驗(yàn)
[0020]將提取的牛分枝桿菌基因組用TU — 1800蛋白質(zhì)核酸儀測(cè)定濃度后，經(jīng)10倍系列稀釋的核酸用于PCR反應(yīng)，以確定建立的PCR的敏感性。
[0021]1、2、7特異性試驗(yàn)
[0022]以牛分枝桿菌、羊大腸桿菌，羊鏈球菌，羊魏氏梭菌，金黃色葡萄球菌，羊多殺性巴氏桿菌，空白水對(duì)照為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，以確定建立的PCR的特異性。
[0023]1、2、8重復(fù)性試驗(yàn)
[0024]應(yīng)用建立的PCR方法，重復(fù)檢測(cè)DNA樣品3次以檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
[0025]1、2、9PCR對(duì)臨床樣品的檢測(cè)
[0026]對(duì)2009~2012年貴州省貴陽(yáng)市、遵義市、安順市、六盤水市、銅仁地區(qū)、黔南、黔東南、甕安縣等幾個(gè)規(guī)模化養(yǎng)羊場(chǎng)和養(yǎng)羊?qū)I(yè)戶采集的154份病料及864份山羊血清(或全血)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。
[0027]2、結(jié)果與分析
2、1山羊結(jié)核病細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
取新鮮全血接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)約15~30d，可觀察到米黃色、粗糙、隆起、不透明、邊緣不整齊、呈顆粒結(jié)節(jié)的菌落，菌體進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2、2山羊結(jié)核病PCR檢測(cè)方法的建立以
牛結(jié)核分支桿菌的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段約為241bp，與預(yù)期擴(kuò)增的目的片段大小相吻合；陰性對(duì)照樣本未擴(kuò)增出條帶(見圖1)。結(jié)果與預(yù)期一致，此方法可用于山羊結(jié)核病的擴(kuò)增。
2、3敏感性檢測(cè)
將提取的牛分枝桿菌基因組用TU — 1800蛋白質(zhì)核酸儀測(cè)定濃度后，經(jīng)10倍系列稀釋的用于PCR反應(yīng)，當(dāng)稀釋度為10_6時(shí)仍可見清晰目的擴(kuò)增條帶，該方法可以檢出的羊結(jié)核病目的基因最低DNA模板量為0.62ng/L (見圖2)，說明該方法有較好的敏感性，病毒含量極少的情況下也可被檢出。
2、4特異性檢測(cè)
以牛分支桿菌、羊大腸桿菌，羊鏈球菌，羊魏氏梭菌，金黃色葡萄球菌，羊多殺性巴氏桿菌的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，除牛分支桿菌擴(kuò)增出I條約241bp的條帶外，其它細(xì)菌及陰性對(duì)照均未見特異性片段(見圖3)，說明建立的方法具有較好的特異性，如病料中含其它病菌也不受影響。
2、5重復(fù)性檢測(cè)
應(yīng)用建立的PCR方法，重復(fù)檢測(cè)牛分枝桿菌細(xì)菌基因組3次結(jié)果均一致，說明建立的PCR方法具有良好的重復(fù)性。
2、6PCR的應(yīng)用
對(duì)從貴州養(yǎng)羊場(chǎng)(專業(yè)戶)采`集的154份臨床病料利用建立的山羊結(jié)核病PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出57份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為53.2% (82/154)，細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)陽(yáng)性48份，血清(或全血)864份，檢測(cè)出361份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為41.8%( 361/864)，平均陽(yáng)性率為43.5%(443/1018)，高于細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果，說明臨床檢出率高，適合于臨床診斷。
3、討論
3.1
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR方法已經(jīng)成為眾多病原檢測(cè)和分析的主要手段。本發(fā)明建立的山羊結(jié)核病PCR檢測(cè)方法能夠?qū)εR床樣品進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)及鑒定，結(jié)果表明，該診斷方法敏感性好、特異性高，具有廣闊的應(yīng)用前景。
3.2試驗(yàn)結(jié)果表明，采用PCR反應(yīng)系統(tǒng)，敏感性結(jié)果顯示最低核酸檢測(cè)量為為0.62ng/L，特異性試驗(yàn)表明，除牛結(jié)核分枝桿菌的特異擴(kuò)增帶(241bp)外，同時(shí)檢測(cè)羊大腸桿菌，羊鏈球菌，羊魏氏梭菌，金黃色葡萄球菌，羊多殺性巴氏桿菌，結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明，該P(yáng)CR方法具有很好的特異性和敏感性，可用于臨床山羊結(jié)核病的早期快速診斷。
[0028]由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明根據(jù)牛結(jié)核分枝桿菌特異性基因片段設(shè)計(jì)引物，利用該引物建立了快速、敏感、特異的診斷山羊結(jié)核病的PCR檢測(cè)方法。將其應(yīng)用在PCR快速檢測(cè)試劑盒中，可快速檢測(cè)出山羊結(jié)核病，并且具有良好的特異性及敏感性。本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，并且快捷、靈敏，操作簡(jiǎn)單，使用效果好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]附圖1為牛分支桿菌PCR擴(kuò)增；
M: DL2000 ；1:牛分支桿菌PCR結(jié)果，2:陰性對(duì)照；附圖2為PCR敏感性試驗(yàn)；
M: D2000 ;1~7:10-1~I(T7倍比稀釋的DNA PCR結(jié)果；
附圖3為PCR特異性試驗(yàn)；
M: DL2000 ；1:牛分枝桿菌PCR產(chǎn)物；2:大腸桿菌PCR產(chǎn)物；3:羊鏈球菌PCR產(chǎn)物；4:羊魏氏梭菌PCR產(chǎn)物；5:金黃色葡萄球菌PCR產(chǎn)物；6:羊多殺性巴氏桿菌PCR產(chǎn)物；7:空白水對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0030]本發(fā)明的實(shí)施例:山羊結(jié)核病PCR檢測(cè)試劑盒，它包括250 μ L的PCR premix緩沖液，150yL超純水，50yL的Marker DL2000，40 μ L濃度為10Mmol/L的上引物及40yL濃度為lOMmol/L的下引物，20 μ L陰性對(duì)照以及20 μ L陽(yáng)性對(duì)照；；上游引物的序列為:5’ -ATCAGCGACTACCTGGCCGAAG-3’；下游引物的序列為:5’ - GTGGCGTGCCGTTCTCGTCG-3’；陰性對(duì)照為超純水；陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)山羊結(jié)核桿菌的PCR產(chǎn)物；PCR premix緩沖液由3 mmol/ul的MgCl2，500pmol/ul 的 dNTP 2.0 μ L，25mmol/μ L 的 Tris-HCl 及 0.2 μ L Taq 酶組成，其 PH值為ρΗ8.3。`
【權(quán)利要求】
1.一種山羊結(jié)核病PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:它包括250 μ L的PCR premix緩沖液，150yL超純水，50yL的Marker DL2000，40 μ L濃度為10Mmol/L的上引物及40yL濃度為lOMmol/L的下引物，20 μ L陰性對(duì)照以及20 μ L陽(yáng)性對(duì)照；；上游引物的序列為:5’ -ATCAGCGACTACCTGGCCGAAG-3’ ；下游引物的序列為:5’ - GTGGCGTGCCGTTCTCGTCG-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山羊結(jié)核病PCR診斷試劑盒，其特征在于:陰性對(duì)照為超純水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山羊結(jié)核病PCR診斷試劑盒，其特征在于:陽(yáng)性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)山羊結(jié)核桿菌的PCR產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山羊結(jié)核病PCR檢測(cè)試劑盒,其特征在于:PCRpremix緩沖液由 3 mmol/ul 的 MgCl2, 500pmol/ul 的 dNTP 2.0 μ L, 25mmol/μ L 的 Tris-HCl 及 0.2 μ LTaq酶組成，其PH值為ρΗ8. 3。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103509859SQ201310346637
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月9日
【發(fā)明者】冉懋韜, 余波, 譚詩(shī)文, 王凡, 艾玉萍 申請(qǐng)人:貴州省畜牧獸醫(yī)研究所