專利名稱：酶制劑的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用微生物技術(shù)制備工業(yè)用酶制劑，更具體指采用微生物的技術(shù)制備酶制劑。
背景技術(shù)：
酶制劑工業(yè)是知識密集型的高科技產(chǎn)業(yè)，酶制劑的應(yīng)用領(lǐng)域極為廣泛，酶具有高效、專一反應(yīng)條件溫和的特點(diǎn)，由于它具有如此的特性可以有選擇、有控制地通過特定的方式，例水解、氧化還原、裂解、化學(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)移等使被作用對象按預(yù)定設(shè)想發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生所需產(chǎn)品，酶是一種蛋白質(zhì)，可完全生物降解，它是一種具有專一性和高效性的生物催化劑，酶法工藝可替代傳統(tǒng)的化學(xué)、物理工藝，因此它具有污染少、簡便、成本低的優(yōu)點(diǎn)，例如取代化學(xué)試劑、減少工業(yè)用水、減少能源消耗、減少原材料消耗、提高生產(chǎn)效能。據(jù)美國化學(xué)協(xié)會統(tǒng)計(jì)，除醫(yī)藥用酶制劑外，全世界工業(yè)用酶制劑市場約20億美元，世界酶制劑市場以平均15％的速度逐年增長，就酶制劑的應(yīng)用來說，食品加工、淀粉工業(yè)、飼料工業(yè)、保健食品的用量最大，占45％，其次為洗滌劑占32％、紡織業(yè)占11％、造紙業(yè)占7％、化學(xué)工業(yè)占5％，而中國酶制劑市場以平均35％的速成度逐年增長，目前我國每年需要進(jìn)口大量昂貴的工業(yè)用酶制劑，主要從丹麥、日本、美國等國家進(jìn)口。酶制劑應(yīng)用領(lǐng)域主要有紡織工業(yè)中淀粉酶應(yīng)用于織物的退漿，纖維素酶用于織物的磨洗上光、過氧化氫酶用于染色前的雙氧水的降解、淀粉糖工業(yè)中利用淀粉酶類從淀粉加工獲得葡萄糖、麥芽糖、高果糖漿等產(chǎn)品，洗滌劑方面，添加在洗滌劑中蛋白酶分解蛋白污物，飼料中添加酶制劑可使飼料轉(zhuǎn)化率提高，促進(jìn)飼料消化等，果汁加工業(yè)利用果膠酶來分解果實(shí)中的果膠，過濾得到清澄果汁。制備工業(yè)酶制劑通常采用硫酸銨鹽析的傳統(tǒng)工藝，應(yīng)用的菌種發(fā)酵單位不高，傳統(tǒng)工藝產(chǎn)生三廢污染(“生物學(xué)雜志”第17卷，第2期2000年4月；木霉T6木聚糖酶制劑研究等)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的提供采用微生物技術(shù)制備工業(yè)用酶制劑，該方法是利用微生物高產(chǎn)菌種，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中產(chǎn)生分泌酶活性生物物質(zhì)的特性，生產(chǎn)制造具有生物催化活性的酶制劑，該方法能克服現(xiàn)有技術(shù)不足，提供發(fā)酵活力高、生產(chǎn)工藝條件溫和、縮短生產(chǎn)周期、減少三廢。
本發(fā)明采用微生物發(fā)酵培養(yǎng)的方法分泌產(chǎn)生含有酶活性生物物質(zhì)，經(jīng)過精制、分離提取獲得各種酶制劑。本發(fā)明采用的發(fā)酵分固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種。本發(fā)明首先采用的菌種為米曲霉(Aspergillus oryxae)ATCC6061、ATCC2151和黑曲霉(Aspergillus Niger)ATCC2628、Trichodema KoringiiATCC7632，菌種由國外購得。經(jīng)物理、化學(xué)方法誘變菌種，先用X射線連續(xù)照射0-5次，每次離菌種20cm處照射，，照射時間為1-5分鐘，存活菌種培養(yǎng)后用γ射線照射時，同樣照射0-5次，每次離菌種30cm，照射時間為2-10分鐘，經(jīng)X、γ射線照射存活的菌種培養(yǎng)后再用紫外線照射0-5次，每次離菌種30cm處照射，照射時間為3-12分鐘，照射后與NTG(N-methyl-N-Nitro-N-Nitro Soguanidine)濃度為10-1000μg/ml浸泡處理，獲得高產(chǎn)菌種。
表1誘變技術(shù)數(shù)據(jù)

本發(fā)明是通過下列步驟完成獲得的高產(chǎn)菌種接種入已消毒的種子培養(yǎng)基中發(fā)酵，種子培養(yǎng)基為(重量％)葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母精0.5％，磷酸鹽0.01％(磷酸鹽可為磷酸胺、磷酸鈉、磷酸鉀、磷酸氫鈉、磷酸氫鉀等)，加水配成所需體積，0.1MP滅菌20分鐘，種子培養(yǎng)溫度為32-42℃，培養(yǎng)時間為16-40小時。種子培養(yǎng)發(fā)酵后將所得的菌種按需要接種到固體培養(yǎng)基中或接種到液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)。
現(xiàn)對固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)分述如下。
1、固體發(fā)酵a、種子罐培養(yǎng)的菌種接種到固體培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基成分以小麥麩皮為主要原料，再根據(jù)工業(yè)酶制劑的品種不同而添加米糠、豆餅粉、無機(jī)鹽等，0.1MP滅菌40分鐘，采用自動固體發(fā)酵機(jī)，按照接入微生物特性調(diào)節(jié)好水份、溫度、PH等進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)。溫度控制在32-42℃，PH5-8發(fā)酵培養(yǎng)96-120小時。
b、通過發(fā)酵后的麯用水浸泡，然后用板框壓濾，粗過濾后，再用微孔濾膜精過濾，然后用膜超過濾濃縮到一定倍數(shù)，通過無菌過濾獲得高濃度的濃縮液，再經(jīng)過氣流干燥成粉劑成品，或通過保存劑的配合獲得液體成品。
c、酶活性的測定與計(jì)算方法同液體發(fā)酵的酶活性測定與計(jì)算方法。
2、液體發(fā)酵采用液態(tài)罐式發(fā)酵方法，可控制發(fā)酵體系穩(wěn)定，生產(chǎn)量大、通過優(yōu)化培養(yǎng)條件提高目標(biāo)物產(chǎn)量。
a、菌種篩選種子罐培養(yǎng)與固體發(fā)酵相同。
b、液體發(fā)酵的培養(yǎng)基組分的選擇碳源多糖、淀粉、葡萄糖、麥芽糖等氮源蛋白胨、酵母浸膏、尿素以及NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NO3等。
無機(jī)鹽包括磷酸鹽、氯化鹽、鈉鹽、鎂鹽等，小麥麩皮等作添加輔料。
培養(yǎng)基(重量％)新型培養(yǎng)劑配方為麩皮水提取液3-8％、魚肉水提取液0.5-1％、葡萄糖2-5％、谷氨酸鈉0.1-0.5％、(NH4)2SO40.1-0.5％、KH2PO40.05-0.01％、MgSO4·7H2O 0.001-0.005％，加水配成所需體積，0.1MP滅菌30分鐘
c、培養(yǎng)條件和提取發(fā)酵溫度控制在32℃-42℃范圍內(nèi)，最佳溫度36-38℃，培養(yǎng)基的PH為5-8，發(fā)酵時間控制在68-80小時，當(dāng)培養(yǎng)完畢，用離心分離，培養(yǎng)液以及菌絲體中含大量的目的產(chǎn)物，過濾的殘?jiān)肏2O或?qū)γ钢苿┑幕盍o影響的PH范圍內(nèi)的緩沖液浸泡，抽提、濃縮，濃縮液可通過保存劑的配合，制成液體成品，也可通過氣流干燥工藝，制成粉狀成品。
d、酶制劑的理化性質(zhì)測定同固體發(fā)酵的酶制劑理化性質(zhì)的測定。
e、酶活性的測定與計(jì)算i、按酶反應(yīng)的最適PH范圍(通常范圍5-8)，配制緩沖液及配制一定濃度的底物。(如Casein酪蛋白)ii、調(diào)節(jié)酶反應(yīng)的最適溫度，通常為30-40℃，將所測樣品加入到反應(yīng)底物中進(jìn)行酶反應(yīng)，反應(yīng)時間為10-40分鐘iii、當(dāng)酶反應(yīng)進(jìn)行10-40分鐘后，加入酶失活劑，例CCl3COOH，Na2CO3等，仃止酶反應(yīng)。
iv、添加菲林(Folin)試劑，用比色法或用酸鹼滴定法等進(jìn)行酶活力的定量測定，在上述條件下，酶活性單位定義為每分鐘酶液水解底物生成分解物所需的酶量。
v、以標(biāo)準(zhǔn)液濃度曲線為基準(zhǔn)，換算出酶的單位活力。
本發(fā)明工藝的固體發(fā)酵和液體發(fā)酵工藝均采用全封閉連續(xù)提取法。
表1傳統(tǒng)提取工藝與本發(fā)明提取工藝比較。

表2本發(fā)明工藝與常規(guī)工藝比較

本發(fā)明方法適用制備的酶制劑有植酸酶、果膠酶、纖維素酶、淀粉酶等。
本發(fā)明的有益效果如下1、本發(fā)明采用酶作為獨(dú)特的生物催化劑，應(yīng)用于各類工業(yè)中，它的反應(yīng)條件溫和，具有分解力強(qiáng)，改善了生產(chǎn)的效率，提高產(chǎn)品的收率。
2、本發(fā)明的提取分離是在全封閉式中進(jìn)行，提高了產(chǎn)品收率，防止發(fā)生污染。
3、本發(fā)明應(yīng)用的培養(yǎng)基原料均是農(nóng)村中常用的，價格便宜的農(nóng)產(chǎn)物，所以成本較低，并且操作方便，極易工業(yè)化生產(chǎn)。
4、采用本發(fā)明的菌種誘變使其效價提高，促進(jìn)了酶制劑的產(chǎn)量及提高純度降低了成本。


圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步敘述，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1制備植酸酶種子培養(yǎng)經(jīng)誘變篩選、鑒定得到的Aspergillus niger ATCC 2628進(jìn)行植酸酶的制備。
1、種子培養(yǎng)基葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母精0.5％、磷酸鹽0.01％，0.1Mp滅菌20分鐘，將菌種接入種子培養(yǎng)基。
種子培養(yǎng)裝液量200ml/500ml三角瓶，箱式往復(fù)搖床200rpm，培養(yǎng)16小時，溫度32C。種子發(fā)酵液稀釋20倍，分光光度計(jì)430nm測定菌體光密度OD值為0.43-0.45。
2、30L液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)新型的培養(yǎng)基配方為麩皮提取液5％、魚肉提取液0.8％、葡萄糖3％、谷氨酸鈉0.3％、硫酸銨0.3％、磷酸二氫鉀0.03％、硫酸鎂0.003％，按需要體積配制消毒后，將上述種子發(fā)酵液接入培養(yǎng)基中。
30L液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件裝液量15L，轉(zhuǎn)速200rpm，通風(fēng)量0.05-1.0L/L-min，培養(yǎng)68小時，溫度為32℃。發(fā)酵液稀釋10倍，分光光度計(jì)270nm測定酶蛋白量3.10-3.40％。發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液，經(jīng)離心分離(3000-5000rpm)，獲得清液，再經(jīng)過微孔濾膜精過濾，再用超過濾濃縮方法濃縮6-10倍，最后用0.2μm膜進(jìn)行無菌過濾，獲得液體原體，此時可通過添加保存劑例甘油、一定的鹽類等，制備成液體成品或通過氣流干燥法脫水而成粉劑成品，產(chǎn)品收率70-80％，產(chǎn)品植酸酶的活性為2000μ/g。(SMAT法，日本“飼料安全法令要覽”飼料添加劑一般的試驗(yàn)法)。上述的處理均在全封閉條件下進(jìn)行分離提取。
3、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基以麩皮為主要培養(yǎng)基，加0.1-0.2％磷酸鹽，0.1Mp滅菌40分鐘。將種子發(fā)酵液接入培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)好水份，進(jìn)行培養(yǎng)。
固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件裝料量100g/500ml三角瓶，箱式恒溫培養(yǎng)箱，96小時，溫度32℃。發(fā)酵結(jié)束后，加200ml水進(jìn)行2小時，40℃浸泡，發(fā)酵液酶蛋白測定法同液態(tài)發(fā)酵法，測定數(shù)據(jù)為酶蛋白量10.5-11.2％。提取液經(jīng)過微孔膜精過濾，再用超過濾濃縮方法濃縮6-10倍，最后用0.2μm膜進(jìn)行無菌過濾，獲得液體原體，此時可通過添加保存劑，制備成液體成品，或通過氣流干燥脫水而成粉劑成品產(chǎn)品，植酸酶的活性為2000μ/g(SMAT法)，產(chǎn)品收率70-80％。同樣固態(tài)發(fā)酵處理時在全封閉條件下進(jìn)行分離提取。
實(shí)施例2制備工業(yè)用蛋白酶菌種采用誘變的Aspergillus S.P.ATCC2151進(jìn)行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)基為(重量％)葡萄糖1％、蛋白胨0.5％、酵母精0.5％、磷酸鹽0.01％。種子培養(yǎng)條件同上，種子培養(yǎng)后將種子接種到液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，成分為(重量％)為麩皮水提取液3-8％、魚肉水提取液0.5-1％、葡萄糖2-5％、谷氨酸鈉0.1-0.5％、(NH4)2SO40.1-0.5％、KH2PO40.05-0.01％、MgSO4·7H2O 0.001-0.005％，0.1MP滅菌30分鐘；培養(yǎng)溫度為30-32C，培養(yǎng)時間為68小時，處理同上，種子菌體光密度0.44-0.46，成品酶活力50000μ/g(蛋白酶活力測定采用Casein-Folin法，Estabilishment；June 29/1967)，產(chǎn)率60-85％固體發(fā)酵為發(fā)酵后的種子接種入固體培養(yǎng)基小麥麩皮加上0.1-0.2％的磷酸鹽即可，發(fā)酵溫度為30-32℃，發(fā)酵96小時。處理按實(shí)施例1。
實(shí)施例3制備果膠酶菌種采用誘變的Aspergills.SP.ATCC進(jìn)行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基為(重量％)為葡萄糖6.8％、蛋白胨0.5％、酵母精0.05％、磷酸鹽0.01％，培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)后種子接種入液態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)成分同實(shí)施例，培養(yǎng)溫度35℃，培養(yǎng)時間為68-72小時，種子菌體光密度0.40-0.42，成品酶活力測定為12000μ/g(酶活力測定法按照Establishment；July 20/1978，果膠酶PLA法)。應(yīng)用上述同樣方法還可以制備纖維素酶、淀粉酶等。
實(shí)施例4制備其它的工業(yè)酶采用不同的菌種誘變成高產(chǎn)菌種來制備不同的工業(yè)酶制品。
1、材料與方法1-1、誘變篩選技術(shù)通常應(yīng)用可購得的Aspergillus nigerATCC2628，Aspergillsp.ATCC2152，AspergillusoryzaeATCC6061，Trichoderma koringii ATCC7632.等原始菌種進(jìn)行物理與化學(xué)誘變的優(yōu)化篩選技術(shù)，已培育鑒定出具有高表達(dá)能力的生產(chǎn)菌種。
表1誘變技術(shù)數(shù)據(jù)

1-2、培養(yǎng)基1-2-1、斜面培養(yǎng)基葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母精0.5％，磷酸鹽0.01％，0.1mp滅菌15分鐘。
1-2-2、種子培養(yǎng)基葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母精0.5％，磷酸鹽0.01％，自然pH，0.1mp滅菌20分鐘。
1-2-3、30L發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉8-10％，酵母精0.5-0.8％，磷酸鹽0.01％，0.1mp滅菌30分鐘。
1-2-4、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基以麩皮為主要培養(yǎng)基，加0.1-0.2％磷酸鹽，0.1mp滅菌40分鐘。
1-1、培養(yǎng)條件1-3-1、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件裝液量200ml/500ml三角瓶，箱式往復(fù)搖床200rpm，培養(yǎng)16-40小時，溫度32-42℃。
1-3-2、30L液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件裝液量15L，轉(zhuǎn)速100-200rpm，通風(fēng)量0.05-1.0L/L-min，培養(yǎng)68-80小時，溫度為32-42℃1-3-3、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件裝料量100g/500ml三角瓶，箱式恒溫培養(yǎng)箱，96-120小時，溫度32-42℃。
1-2、全封閉式分離提取1-4-1、工藝流程

1-4-2、生產(chǎn)工藝條件發(fā)酵液經(jīng)離心取得上清液，離心速度3000-5000rpm。離心液經(jīng)過濾，去除所有不溶物后進(jìn)行6-10倍的超濾濃縮，最后用0.2um膜無菌過濾后配合成工業(yè)用酶制劑。也可通過離心噴霧干燥或酒精沉淀后真空干燥獲得工業(yè)用酶制劑。
1-5、分析方法1-5-1、菌體生長測定發(fā)酵液用0.5mol的磷酸鹽緩沖液稀釋20倍，分光光度計(jì)430nm測定菌體光密度。
1-5-2、酶蛋白含水量量測定發(fā)酵液用0.5mol的磷酸鹽緩沖液稀釋10倍，分光光度計(jì)270nm測定酶蛋白含量。
1-5-3、pH測定818型酸度計(jì)測定。
2、中試結(jié)果表-2種子發(fā)酵穩(wěn)定培養(yǎng)數(shù)據(jù)

表-3 30L發(fā)酵穩(wěn)定培養(yǎng)數(shù)據(jù)

表-4 固態(tài)發(fā)酵穩(wěn)定培養(yǎng)數(shù)據(jù)

3、質(zhì)量指標(biāo)工業(yè)用酶制劑已經(jīng)取得30L發(fā)酵和酶的分離，純化的工藝條件，該技術(shù)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可靠性高。
表-5 工業(yè)用酶制劑產(chǎn)品的國際水平質(zhì)量指標(biāo)

權(quán)利要求
1.一種由菌種發(fā)酵制備酶制劑的方法，其特征在于由下列步驟組成a、采用X射線、γ射線、紫外線照射及NTG混合誘變米曲霉(Aspergillus oryxae)和黑曲霉(Aspergillus Niger)菌種；b、種子發(fā)酵；c、培養(yǎng)發(fā)酵；d、封閉式連續(xù)提取、分離酶制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備酶制劑方法，其特征在于米曲霉、黑曲霉菌種的誘變采用X射線連續(xù)照射0-5次，照射時間為1-5分鐘，存活菌種培養(yǎng)后用γ射線照射0-5次，照射時間為2-10分鐘，經(jīng)X、γ射線照射存活的菌種培養(yǎng)后用紫外線照射，連續(xù)照射0-5次，照射時間為3-12分鐘，存活菌落再培養(yǎng)后，與NTG濃度為10-1000μg/ml組合處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備酶制劑方法，其特征在于照射后的菌種與NTG處理的更優(yōu)濃度為10-100μg/ml；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備酶制劑方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(重量％)麩皮水提取液 3-8％魚肉水提取液 0.5-1％葡萄糖 2-5％谷氨酸鈉 0.1-0.5％(NH4)2SO40.1-0.5％KH2PO40.05-0.01％MgSO4·7H2O 0.001-0.005％加水到所需體積；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備酶制劑方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度為32-42℃，最佳溫度為36-38℃，pH為5-8。發(fā)酵時間為68-80小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備酶制劑方法，其特征在于封閉式連續(xù)提取。
全文摘要
本發(fā)明提供工業(yè)酶制劑的制備方法，該方法公開了通過菌種選育、采用X、γ、紫外線以及一定濃度NTG的處理、誘變成高產(chǎn)菌，再在適合于該類微生物生長條件下進(jìn)行固體或液體發(fā)酵，并在全封閉的條件下進(jìn)行提取、分離獲得純度高，收率理想的工業(yè)酶制劑，該方法具有制備條件溫和，三廢少的特點(diǎn)。
文檔編號C12N1/14GK1515668SQ0215768
公開日2004年7月28日 申請日期2002年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月24日
發(fā)明者林再慶, 陳星 申請人:上海思米酵素科技有限公司