專利名稱：一種3-羥基丙酸高產(chǎn)菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種3-羥基丙酸高產(chǎn)菌株及其應(yīng)用，尤其是一種是經(jīng)物理化學(xué)復(fù)合誘變得到的酵母菌Candida sp.及其應(yīng)用于轉(zhuǎn)化丙酸為3_羥基丙酸。
背景技術(shù)：
3-輕基丙酸(3-Hydroxypropionic acid ；又稱 β-Hydroxypropionic acid ；縮寫為3-HP ；分子式C3H6O3 ；CAS號503-66-2 ；pK4. 51 ；分子量90 ；密度1. 08)是一個三碳無手性有機(jī)酸，與乳酸互為同分異構(gòu)體。3-ΗΡ具有羥基和羧基兩個官能團(tuán)，是很多光學(xué)活性物質(zhì)的前體。它脫水可以生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，還原生成1，3_丙二醇，聚合生成高分子材料，是一種重要的化工平臺產(chǎn)品。2004年美國能源部將其列為當(dāng)今世界12種最具潛力的化工廣品之一。目前，3-ΗΡ的生產(chǎn)方法是化學(xué)合成法，主要有水合丙烯酸法和丙烯腈轉(zhuǎn)化法。 但在碳末端引入功能團(tuán)有很大的難度，且其產(chǎn)品不易分離提純，生產(chǎn)成本較高，生產(chǎn)過程存在不安全因素，而微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)3-ΗΡ可以有效的避免這些不利因素。微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)3-ΗΡ的研究始于上世紀(jì)60年代但一直處于實驗室階段。主要包括構(gòu)建基因工程菌法和野生菌發(fā)酵法?；蚬こ谭ㄉa(chǎn)3-ΗΡ主要有兩條途徑以葡萄糖為底物和以甘油為底物的生物轉(zhuǎn)化路線。目前，已知的可發(fā)酵產(chǎn)3-ΗΡ的野生菌株主要有Hansenula miso ； Fusarium merismoides ；Candida rugosa ；Byssochlamys sp. ；Rhodococcus erythropolis LG12 ；Klebsiella terrigena。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種3-羥基丙酸高產(chǎn)菌株，為假絲酵母變種 (Candida sp.)，通過紫外-亞硝基胍-鈷60復(fù)合誘變獲得，于2011年10月14日保藏于中國微生物菌種保藏委員會管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5344，其催化丙酸轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酸的能力增強(qiáng)，同時，耐受丙酸的性能增強(qiáng)。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用所述菌株轉(zhuǎn)化丙酸為3-羥基丙酸的方法，菌株經(jīng)過種子培養(yǎng)活化后，以4-10%接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，在下發(fā)酵培養(yǎng)得到含有3-羥基丙酸的發(fā)酵液。為提高3-羥基丙酸的產(chǎn)率，控制發(fā)酵培養(yǎng)基PH為6. 5，不限于在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入濃度為10-30% (V/V)，pH為6. 5的磷酸鹽緩沖液；優(yōu)選20% (V/V)的磷酸鹽緩沖液 (6. 5)。為了進(jìn)一步提高3-羥基丙酸的產(chǎn)率，對發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵M小時后，流加含有葡萄糖/甘油的緩沖液或葡萄糖/甘油水溶液控制發(fā)酵過程中葡萄糖濃度在15_25g/ L ；其中優(yōu)選的添加為發(fā)酵48-84h內(nèi)補(bǔ)加含有葡萄糖/甘油的緩沖液或葡萄糖/甘油水溶液以維持發(fā)酵過程中葡萄糖濃度在20g/L。此外，發(fā)酵對小時后，流加丙酸-氫氧化鈉-氫氧化鉀-氫氧化銨(8 1 1 1)或丙酸溶液控制發(fā)酵過程中丙酸濃度為10-20g/L ；其中優(yōu)選的添加為在發(fā)酵4 后，流加丙酸-氫氧化鈉-氫氧化鉀-氫氧化銨(8 :1:1: 1)或丙酸溶液以維持發(fā)酵過程中丙酸濃度為15g/L。3-羥基丙酸的測定方法高效液相色譜法，色譜柱=Ecosile C18柱 (250mmX4. 6mm, 5 μ m)；流動相3 %甲醇，用H3PO4調(diào)pH至2. O ；檢測條件紫外檢測器，柱溫 350C，流速 0. 8mL/min,進(jìn)樣量 20 μ L0本發(fā)明提供的3-羥基丙酸產(chǎn)量較高的突變菌株，其產(chǎn)量高且遺傳性狀穩(wěn)定。此外，本發(fā)明還提供了一種該菌株以丙酸為底物生物轉(zhuǎn)化3-羥基丙酸的方法，利用此方法 3-羥基丙酸的產(chǎn)量達(dá)到23g/L，具有廣闊的前景。
具體實施例方式
實施例1新菌株CGMCC No. 5344的獲得(a)將野生菌Candida sp. CCTCC NO =M 93018用含有丙酸的培養(yǎng)基馴化，挑選得到的出發(fā)菌株a;(b)將出發(fā)菌株a經(jīng)紫外-亞硝基胍-鈷60復(fù)合誘變，得到混合種子液b ；(c)將b涂布完全培養(yǎng)，得到單菌落點(diǎn)種篩選培養(yǎng)基；(d)培養(yǎng)篩選單菌落，發(fā)酵檢測驗證，得到誘變高產(chǎn)株CGMCC No. 5344。步驟(a)中丙酸馴化的濃度為0. 5% -3%。步驟(b)中用15W的紫外燈輻照70s，加入亞硝基胍溶液使其終濃度為25mg/mL， 鈷60劑量為IOOOGy誘變效果最佳。步驟(c)中完全培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸膏10，瓊脂粉 20;篩選培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸膏10，瓊脂粉20，丙酸2%。步驟(d)中發(fā)酵檢測方法為高效液相色譜法，色譜柱Ecosile C18柱 (250mmX4. 6mm, 5 μ m)；流動相3 %甲醇，用H3PO4調(diào)pH至2. 0 ；檢測條件紫外檢測器，柱溫 350C，流速 0. 8mL/min,進(jìn)樣量 20 μ L0實施例2突變株CGMCC No. 5344發(fā)酵產(chǎn)3-ΗΡ(1)種子液培養(yǎng)將活化的菌落接種種子培養(yǎng)基，220r/min，3(TC培養(yǎng)20h。種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 / 甘油 20，酵母膏 10，(NH4) 2S0415，KH2P049，K2HP043, MgSO4 · 7H20 1. 5， FeSO4 · 7H20 0. 03，pH 6. 8 士 0. 2。(2)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)酵母膏10，(NH4) 2S0415，KH2P049，K2HP043, MgSO4 · 7H20 1· 5， FeSO4 · 7H20 0. 03，CaCl2O. 04，丙酸 15，TES 5mL，用 KOHAl2SO4 調(diào)節(jié) pH 至 6. 0士0. 2，115°C, 滅菌15min，與50g/L葡萄糖/甘油混合。以4%接種量接種，220r/min，30°C培養(yǎng)，發(fā)酵96h，將發(fā)酵液離心，稀釋，微孔濾膜過濾后，HPLC測定野生菌與突變株CGMCC No. 5344的3-羥基丙酸產(chǎn)量分別為3. Og/L和 23g/L0實施例3靜息細(xì)胞對3-羥基丙酸產(chǎn)量的影響無外源碳源存在的情況下，3-HP會被菌體反耗供能用于維持菌體的正常代謝，相比較而言野生菌Candida sp.的3_羥基丙酸降解速率要高于CGMCC No. 5344(如表1所示)°靜息細(xì)胞的制備與培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 后，離心收集菌體，用0. 2M磷酸鹽 緩沖液洗滌菌體兩次。轉(zhuǎn)接到含有1 %的3-羥基丙酸的磷酸鹽緩沖液中，回轉(zhuǎn)式搖床220r/ min, 30°C培養(yǎng)48h。每1 取樣檢測菌體濃度及3-HP的含量。表1出發(fā)菌Candida sp.與CGMCC No. 5344的靜息細(xì)胞對3-HP的降解
權(quán)利要求
1.一種3-羥基丙酸高產(chǎn)菌株，為假絲酵母變種(Candida sp.)，于2011年10月14日保藏于中國微生物菌種保藏委員會管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5344。
2.權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于催化丙酸轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酸的能力增強(qiáng)，同時， 耐受丙酸的性能由0. 2%增強(qiáng)到3%。
3.權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于通過紫外-亞硝基胍-鈷60復(fù)合誘變獲得。
4.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述菌株轉(zhuǎn)化丙酸為3-羥基丙酸的方法，其特征在于種子培養(yǎng)后，以4-10%接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，在下發(fā)酵培養(yǎng)96小時得到含有3-羥基丙酸的發(fā)酵液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基中加入濃度為10-30%，pH為 6. 5的磷酸鹽緩沖液控制發(fā)酵過程中的pH，所述百分比為體積百分比。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于發(fā)酵M小時后，流加含有葡萄糖/甘油的緩沖液或葡萄糖/甘油水溶液控制發(fā)酵過程中葡萄糖濃度在15-25g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于發(fā)酵M小時后，流加丙酸-氫氧化鈉-氫氧化鉀-氫氧化銨(8 1 1 1)或丙酸溶液控制發(fā)酵過程中丙酸濃度為10-20g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于優(yōu)選發(fā)酵48-84小時內(nèi)流加含有葡萄糖/ 甘油的緩沖液或葡萄糖/甘油水溶液控制發(fā)酵過程中葡萄糖濃度在20g/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于優(yōu)選發(fā)酵4 后，流加丙酸-氫氧化鈉-氫氧化鉀-氫氧化銨(8 :1:1: 1)或丙酸溶液控制發(fā)酵過程中丙酸濃度為15g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種3-羥基丙酸高產(chǎn)菌株，是Candida sp.的復(fù)合誘變菌株，所得菌株遺傳性狀穩(wěn)定，產(chǎn)量性狀穩(wěn)定，適合工業(yè)推廣，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.5344。本發(fā)明還公開了一種轉(zhuǎn)化丙酸為3-羥基丙酸的方法。通過在菌體生長達(dá)到穩(wěn)定期時，限制性補(bǔ)加葡萄糖使其濃度在15-25g/L，控制菌體濃度OD600為18-20，流加丙酸-氫氧化鉀-強(qiáng)氧化鈉-氨水(8∶1∶1∶1)，使丙酸濃度維持在10-20g/L，發(fā)酵培養(yǎng)96h，即可得到含有3-羥基丙酸的發(fā)酵液，在優(yōu)化后培養(yǎng)基上3-羥基丙酸的產(chǎn)量提高到30g/L。
文檔編號C12P7/42GK102382778SQ20111037160
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月21日
發(fā)明者方慧英, 范俊英, 諸葛健, 諸葛斌 申請人:江南大學(xué)