一種篩選乳酸生產(chǎn)率高的菌株的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種輔助篩選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌的方法。本發(fā)明方法包括如下步驟：1)培養(yǎng)待篩選樣品，挑取產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣的菌株，獲得產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株；2)培養(yǎng)所述產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株，挑取對數(shù)生長期內(nèi)生長速率高于0.2/h的菌株，獲得候選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌。本發(fā)明篩選方法實現(xiàn)了乳酸生產(chǎn)率高菌株的快速、高通量篩選，解決了目前工業(yè)乳酸菌株篩選過程中費(fèi)時、費(fèi)力、篩選效率不高的缺點(diǎn)，為乳酸發(fā)酵提供了大量的供選擇的菌種資源，為進(jìn)一步優(yōu)化改良提高乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)率、降低成本奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一種篩選乳酸生產(chǎn)率高的菌株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種篩選乳酸生產(chǎn)率高的菌株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著石油資源的不斷減少以及不可再生資源價格的節(jié)節(jié)攀升，開發(fā)利用環(huán)境友好的生物基產(chǎn)品已成為轉(zhuǎn)變經(jīng)濟(jì)增長方式、保障生態(tài)鏈良性循環(huán)、實現(xiàn)經(jīng)濟(jì)社會可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略需求。乳酸是一種重要的、多用途生物基平臺化合物，它有兩種旋光異構(gòu)體，其中L一乳酸可用作酸味劑、芳香劑、防腐劑、植物生長調(diào)節(jié)劑等，在食品、制藥、釀造、制革、紡織和農(nóng)業(yè)中具有廣泛用途。乳酸的兩個功能集團(tuán)可以進(jìn)行多種化學(xué)反應(yīng)，包括聚合、酯化、還原和取代反應(yīng)。利用這些反應(yīng)，乳酸可被用來生產(chǎn)多種在工業(yè)和消費(fèi)品領(lǐng)域中具有重要用途的產(chǎn)品，包括高聚物(如聚乳酸)、溶劑(如乳酸乙酯、乳酸丙酯、乳酸丁酯等)及含氧化學(xué)品(如丙二醇、環(huán)氧丙烷、丙烯酸等)，其中最重要、最大宗的工業(yè)應(yīng)用，是用于生產(chǎn)可降解聚合物一聚乳酸，聚乳酸具有生物相容性、生物可降解性及優(yōu)良的機(jī)械性能和物理性能，因而被產(chǎn)業(yè)界認(rèn)為是新世紀(jì)最有 發(fā)展前途的新型包裝材料，將有望逐步替代聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等材料。作為一種能夠由可再生碳水化合物轉(zhuǎn)化而來的重要平臺化合物，近年來乳酸受到了全世界研究人員和生產(chǎn)企業(yè)的極大關(guān)注。2005年全球乳酸產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到12萬噸，其中20-30%應(yīng)用在新的工業(yè)領(lǐng)域中。隨著乳酸新的、大宗的應(yīng)用不斷開發(fā)，全球乳酸的市場需求將持續(xù)增長。
[0003]根據(jù)預(yù)測，如果10-20年后全球范圍內(nèi)生物基塑料能夠替代石油基塑料消費(fèi)量的10-20%，聚乳酸的年需求量將達(dá)到1150-2300萬噸。目前全球乳酸產(chǎn)量只有這一預(yù)測值的1%，其核心問題是L一乳酸生產(chǎn)成本和市場價格仍然偏高。解決這一問題的關(guān)鍵之一是提高菌株的乳酸生產(chǎn)率，目前已知的大多數(shù)菌種的發(fā)酵生產(chǎn)率較低，導(dǎo)致發(fā)酵周期長，生產(chǎn)成本偏高，從而導(dǎo)致聚乳酸市場開拓受阻。在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上對已有菌株進(jìn)行簡單優(yōu)化或改良對進(jìn)一步提高乳酸生產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本貢獻(xiàn)甚微，因此需要從天然生境中篩選高乳酸生產(chǎn)率的優(yōu)良菌株，并通過正向、反向和進(jìn)化代謝工程等技術(shù)手段進(jìn)一步提高并改進(jìn)菌株的乳酸生產(chǎn)效率、對環(huán)境的脅迫能力，從而使菌株能夠高效、大量生產(chǎn)L一乳酸，突破聚合級L一乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的技術(shù)瓶頸，為以可再生生物質(zhì)為原料大規(guī)模、低成本地生產(chǎn)高純度L一乳酸奠定技術(shù)基礎(chǔ)。
[0004]菌種是乳酸發(fā)酵的主體和基本要素，能夠產(chǎn)生乳酸的微生物有很多，但就工業(yè)意義上來說，乳酸桿菌具有最大的工業(yè)應(yīng)用價值。乳酸桿菌包括兩種發(fā)酵類型，同型發(fā)酵和異型發(fā)酵。同型發(fā)酵菌株在發(fā)酵過程中只產(chǎn)生乳酸作為發(fā)酵產(chǎn)物，因此是理想的工業(yè)乳酸發(fā)酵菌株。目前在工業(yè)上獲得應(yīng)用的同型發(fā)酵菌株主要包括:鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、干釀乳桿菌(Lactobacillus casei)和德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)等。自然界中蘊(yùn)藏著大量有潛力的乳酸產(chǎn)生菌,從環(huán)境中篩選天然優(yōu)良菌株是提高乳酸發(fā)酵性能、降低乳酸發(fā)酵成本的第一步。美國阿貢國家實驗室Tsai等根據(jù)選擇合適碳源、乳酸發(fā)酵類型、對產(chǎn)物耐受能力、產(chǎn)物立體專一性、菌體細(xì)胞分離的難易程度、高溫耐受等篩選標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)2輪8套篩選，最終篩選獲得耐高溫、耐自身發(fā)酵產(chǎn)物的優(yōu)良菌種。CarlSOl]和Peters的專利公開了耐乳酸同型發(fā)酵的篩選方案，他們從玉米浸潰漿水中分離了近百株同型乳酸發(fā)酵菌種，得到一株在葡萄糖和不同量玉米漿水的培養(yǎng)基中47°C發(fā)酵6h產(chǎn)乳酸接近100g/L的耐酸菌種。上述方法雖然能有效篩選到目的菌株，但是其不足是不能高通量篩選，存在極大的局限性

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供一種輔助篩選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌的方法。
[0006]包括如下步驟:
[0007]I)培養(yǎng)待篩選樣品,挑取產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣的菌株,獲得產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株；
[0008]2)培養(yǎng)所述產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株，挑取對數(shù)生長期內(nèi)生長速率高于0.2/h的菌株，獲得候選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌；
[0009]所述對數(shù)生長期內(nèi)生長速率是按照如下公式計算的:V = (OD1-ODciVAt ;
[0010]OD0為對數(shù)生長期內(nèi)檢測起始時間點(diǎn)對應(yīng)的0D_值；
[0011]OD1為對數(shù)生長期內(nèi)檢測終止時間點(diǎn)對應(yīng)的0D_值；
[0012]At為終止時間點(diǎn)至起始時間點(diǎn)之間的時間段，
[0013]V為對數(shù)生長期內(nèi)生長速率。
[0014]所述挑取對數(shù)生長期內(nèi)生長速率高于0.2/h的菌株的方法包括如下步驟:將所述產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株接種子裝有培養(yǎng)基的孔板中，再將所述孔板置于酶標(biāo)儀中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)期的不同時間點(diǎn)直接讀取培養(yǎng)液的OD6c?值，按照所述公式計算得到所述菌的對數(shù)生長期內(nèi)生長速率，篩選獲得對數(shù)生長期內(nèi)生長速率高于0.2/h的菌株。
[0015]所述培養(yǎng)中所用到的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。
[0016]所述乳酸菌為同型發(fā)酵乳酸菌。
[0017]所述方法獲得候選菌后，再對候選菌的乳酸生產(chǎn)率進(jìn)行鑒定，如果所述候選菌的乳酸生產(chǎn)率大于等于3.9±0.lg/L.h，則所述候選菌為乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌同型發(fā)酵菌株在發(fā)酵過程中只產(chǎn)生乳酸，而且這一途徑是唯一的產(chǎn)能途徑，因此同型發(fā)酵菌株的產(chǎn)乳酸過程與菌株的生長和繁殖是直接相關(guān)的，因此通過篩選生長快速的同型發(fā)酵菌株可以獲得高乳酸生產(chǎn)率的菌株。本發(fā)明基于這一原理，建立了通過酶標(biāo)儀從天然環(huán)境中高通量篩選高生產(chǎn)率乳酸菌的方法。
[0018]本發(fā)明篩選方法將來自自然環(huán)境中的發(fā)酵樣品用生理鹽水連續(xù)10倍稀釋后涂布在含溴甲酚綠的MRS平板上培養(yǎng)，獲得產(chǎn)酸圈較大的產(chǎn)酸菌；通過在96深孔板倒置的杜氏小管中觀察是否產(chǎn)氣，篩選不產(chǎn)氣的細(xì)菌即為同型發(fā)酵菌株；然后通過酶標(biāo)儀測定菌株生長曲線，選取生長速率高的菌株即為乳酸生產(chǎn)率高的菌株。在本發(fā)明篩選方法的基礎(chǔ)上，可以通過生理生化試驗鑒定菌株的種類，建立高生產(chǎn)率乳酸菌株庫，為乳酸發(fā)酵的工業(yè)化提供更加充足的菌種資源；可以通過進(jìn)一步的耐高鹽、耐高糖等發(fā)酵性能的檢測，篩選出滿足工業(yè)化生產(chǎn)的潛在菌株；還可以對具有乳酸高生產(chǎn)率的菌株做進(jìn)一步的遺傳改造，獲得更優(yōu)良工業(yè)菌株。
[0019]本發(fā)明篩選方法實現(xiàn)了乳酸生產(chǎn)率高菌株的快速、高通量篩選，解決了目前工業(yè)乳酸菌株篩選過程中費(fèi)時、費(fèi)力、篩選效率不高的缺點(diǎn)，為乳酸發(fā)酵提供了大量的供選擇的菌種資源，為進(jìn)一步優(yōu)化改良提高乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)率、降低成本奠定了基礎(chǔ)【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為乳酸生產(chǎn)率高菌株的篩選流程圖。
[0021]圖2為51株同型發(fā)酵乳酸菌菌株的生長速率與乳酸生產(chǎn)率的關(guān)系圖。
[0022]圖3為L一乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。
【具體實施方式】
[0023]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。
[0024]下述實施例中所使用的培養(yǎng)基的組成如下篩選培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基均為MRS培養(yǎng)基，其組成為:20g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母提取物、2g/K2HP04、2g/L 檸檬酸銨、2g/L 醋酸鈉、0.58g/L MgSO4.7Η20、0.25g/L MnSO MgSO4.4H20、lml/LTween-80，其余為水，pH 為 6.2。
[0025]發(fā)酵培養(yǎng)基組成:150g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母提取物、3g/L K2HPO4,3g/L KH2PO4,2g/L 醋酸鈉、0.58g/MgS04.7Η20、0.25g/L MnSOMgSO4.4H20、Iml/L Tween-80o 以 6mol/L NaOH 為中和劑，調(diào)節(jié) pH 為 5.5。
[0026]實施例1、乳酸菌的生長速率與乳酸生產(chǎn)率的正相關(guān)性驗證
[0027]一、對51株同型發(fā)酵乳酸菌株進(jìn)行檢測
[0028]1、菌生長速率與乳酸生產(chǎn)率的測定:
[0029]將51株保存在_80°C冰箱中的同型發(fā)酵乳酸菌菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24h,得到發(fā)酵培養(yǎng)液；然后將培養(yǎng)液各分成兩份:一份用MRS液體培養(yǎng)基稀釋到光密度大約為0.05時，取200uL稀`釋液加到經(jīng)75 %酒精浸泡滅菌的96孔板中，放入酶標(biāo)儀中37°C培養(yǎng)6h (所有的菌株都完成對數(shù)生長期)，期間每隔0.5h檢測一次0D_值，計算對數(shù)生長期內(nèi)的生長速率；另一份培養(yǎng)液用MRS液體培養(yǎng)基稀釋到光密度大約為0.05，然后將稀釋液加入到MRSl培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24h，檢測24小時內(nèi)的平均乳酸生產(chǎn)率。
[0030]MRSl培養(yǎng)基的組成為:以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，其中的葡萄糖濃度變?yōu)?0g/L，同時含有4% CaCO:作為中和劑。
[0031]定量檢測乳酸含量的方法是高效液相色譜法(HPLC)，所用色譜柱為HPX-87H，柱溫40°C，檢測器為示差檢測器，流動相為0.05mm01/LH:S0+，流速為0.5ml/L。在此色譜條件下，L一乳酸標(biāo)準(zhǔn)晶的色譜圖如圖3所示，L一乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為14.974min。
[0032]其中，對數(shù)生長期內(nèi)菌的生長速率的計算公式如下:V = (OD1-ODciVAt ;
[0033]OD0為對數(shù)生長期內(nèi)檢測起始時間點(diǎn)對應(yīng)的0D_值；
[0034]OD1為對數(shù)生長期內(nèi)檢測終止時間點(diǎn)對應(yīng)的0D_值；
[0035]Δ t為終止時間點(diǎn)至起始時間點(diǎn)之間的時間段，
[0036]V為對數(shù)生長期內(nèi)生長速率。
[0037]實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。
[0038]結(jié)果表明，51株同型發(fā)酵乳酸菌菌株的乳酸生產(chǎn)率和生長速率均表現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系(圖2，橫坐標(biāo)為各菌株的對數(shù)生長期內(nèi)的生長速率，縱坐標(biāo)為各菌株的乳酸生產(chǎn)率)。因此可以通過檢測乳酸菌株的生長速率來篩選高生產(chǎn)率的乳酸菌。[0039]二、檢測植物乳桿菌NCMB 5105、鼠李糖乳桿菌CCUG 36679和植物乳桿菌NCIMB8826鼠李糖乳桿菌CCUG 36679購買自瑞典大學(xué)微生物菌種保減中心，植物乳桿菌NCIMB 5105購自英國國家工業(yè)、食品和海洋細(xì)菌菌種保藏中心和植物乳桿菌NCMB8826購自英國國家工業(yè)、食品和海洋細(xì)菌菌種保藏中心。
[0040]從已知的乳酸菌中選取2株生長速率高的菌株植物乳桿菌NCMB5105(Lactobacillus piantarum)> 鼠李糖乳桿菌 CCUG 36679(Lactobacillusprhamnosus)，以及I株生長速率較低的植物乳桿菌NCMB8826，將其分別接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中，37°C厭氧培養(yǎng)24h后，得到發(fā)酵培養(yǎng)液，然后按照一中所述方法稀釋發(fā)酵培養(yǎng)液及檢測菌的對數(shù)生長期內(nèi)生長速率、24h內(nèi)的乳酸含量及平均乳酸生產(chǎn)率。
[0041]實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。
[0042]對數(shù)生長期內(nèi)菌株的生長速率及乳酸的產(chǎn)量和乳酸生產(chǎn)率如表1所示，表明對數(shù)生長期內(nèi)菌株的生長速率和菌株的24小時內(nèi)平均乳酸生產(chǎn)率具有直接正相關(guān)性，進(jìn)一步驗證了圖2所示的實驗結(jié)果。
[0043]表1、不同生長速率菌株乳酸發(fā)酵結(jié)果
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種輔助篩選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌的方法，包括如下步驟: 1)培養(yǎng)待篩選樣品，挑取產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣的菌株，獲得產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株； 2)培養(yǎng)所述產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株，挑取對數(shù)生長期內(nèi)生長速率高于0.2/h的菌株，獲得候選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌； 所述對數(shù)生長期內(nèi)生長速率是按照如下公式計算的:V = (OD1-ODci)Mt ; OD0為對數(shù)生長期內(nèi)檢測起始時間點(diǎn)對應(yīng)的OD6tltl值； OD1為對數(shù)生長期內(nèi)檢測終止時間點(diǎn)對應(yīng)的OD6tltl值； At為終止時間點(diǎn)至起始時間點(diǎn)之間的時間段， V為對數(shù)生長期內(nèi)生長速率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述挑取對數(shù)生長期內(nèi)生長速率高于0.2/h的菌株的方法包括如下步驟:將所述產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株接種子裝有培養(yǎng)基的孔板中，再將所述孔板置于酶標(biāo)儀中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)期的不同時間點(diǎn)直接讀取培養(yǎng)液的0D_值，按照所述公式計算得到所述菌的對數(shù)生長期內(nèi)生長速率，篩選獲得對數(shù)生長期內(nèi)生長速率高于0.2/h的菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)中所用到的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于:所述乳酸菌為同型發(fā)酵乳酸菌。`
5.一種篩選乳酸生產(chǎn)率高的乳`酸菌的方法，是用權(quán)利要求1-4中任一所述方法獲得候選菌后，再對候選菌的乳酸生產(chǎn)率進(jìn)行鑒定，如果所述候選菌的乳酸生產(chǎn)率大于等于`3.9±0.lg/L.h，則所述候選菌為乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌。
【文檔編號】C12N1/20GK103756923SQ201110319206
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月20日
【發(fā)明者】劉念 申請人:劉念