專利名稱：短芽孢桿菌甲醛脫氫酶基因的原核表達載體和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程領域，具體涉及一種高效表達短芽孢桿菌甲醛脫氫酶蛋白(FALDH)的原核表達載體及其該原核表達載體在制備FALDH包涵體蛋白中的應用。
背景技術：
甲醛是一種無色，有強烈刺激氣味的氣體，易溶于水、醇和醚。它反應能力極強， 能與蛋白質，核酸和脂類產(chǎn)生非特異性的反應(Feldman等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1973，13:1-49)，是一種非?；顫姷幕衔?，因此對所有的生物來說都有很高的毒性。 甲醛被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)中，是制造樹脂、膠粘劑、油漆、塑料、人造纖維的原料，是膠粘劑工業(yè)應用最廣泛的化學原材料。隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，各種原料制成的建筑裝飾材料已走入各種室內公共場所和家庭，使甲醛成為室內空氣污染公認最具代表性的化學物質。人們入住新居都要進行室內裝飾和更新家具，其正是室內空氣甲醛污染的主要來源。甲醛污染危害嚴重的場所是居室、辦公室、會議室、賓館、KTV包房、家具商場、建材商場等。室內空氣中游離甲醛濃度在中國規(guī)定的允許值是0.08 (mg /立方米)，有調查表明新的賓館客房室內空氣中甲醛濃度最高達0. 36mg/立方米，平均為0. 173mg/立方米， 是室外對照的13倍。而家具商場最高達0. 873mg/立方米，平均為0. 432mg/立方米，是室外對照的33倍。建成一所經(jīng)過裝飾的實驗室，空氣中甲醛平均濃度高達0. 5mg/立方米，是室外的62.5倍。抽樣檢測發(fā)現(xiàn)單位及住戶室內環(huán)境污染嚴重，查了 11家只有1戶合格，其中竟有1戶甲醛超標25倍。甲醛為較高毒性物質，當室內空氣中甲醛含量為0. Img/立方米時，就有異味和不適感；達到0.5 mg/立方米時，可刺激眼睛，引起流淚；達到0.6 mg/立方米時，可引起咽喉不適或疼痛。濃度更高時，可引起惡心嘔吐，咳嗽胸悶，氣喘甚至肺水腫；達到30 mg/立方米時，會立即致人死亡。長期接觸低劑量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻煙癌、結腸癌、 腦瘤、月經(jīng)紊亂、細胞核的基因突變，DN A單鏈內交連和D N A與蛋白質交連及抑制D N A損傷的修復、妊娠綜合癥、引起新生兒染色體異常、白血病，這就是所謂的裝修綜合病 (sick_house)0相對于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、游離甲苯二異氰酸酯(TDI)、揮發(fā)性有機化合物(VOC)等有害物質來說，甲醛具有潛伏周期長(3-15年)、隱藏深、分布廣、易揮發(fā)、治理難、危害大等特性。目前清除污染甲醛通常使用的方法有三種一是使用環(huán)保材料；二是開窗通風；三是用植物或除污劑清除污染，使用除污劑有二次污染的可能。用室內栽培植物清除甲醛污染，是最自然、最環(huán)保的方式，科學研究證明確實有些植物能夠吸收分解甲醛，但吸收能力和速度非常有限(Giese 等，1994，Plant Physiol. 104: 1301-1309)。已有研究表明外源甲醛能夠作為碳源被整合入光合細胞的代謝產(chǎn)物中。比如，普通的掛蘭在1 標記的甲醛上生長時通過一碳代謝產(chǎn)生1V標記的產(chǎn)物，如絲氨酸和卵磷脂。甲醛可以和谷胱苷肽，精氨酸，天冬酰氨和四氫葉酸形成加合物后通過不同的途徑進行代謝(GIESE 等，/^wi Physiol, 1994，104(4) 1301-1309)。對幾種真核生物的生化和遺傳學研究表明谷胱苷肽依賴型甲醛脫氫酶(FALDH)是甲醛代謝的關鍵酶之一，此酶廣泛存在于植物體的所有組織中，它催化的反應以甲醛和谷胱苷肽的加合物硫代羥甲基谷胱苷肽(S-hydroxymethylglutathione)為底物產(chǎn)生硫代甲?；入总针?S-formylglutathione)。在植物中還有硫代甲酰谷胱苷肽水解酶，它能把 -formylglutathione分解為甲酸和谷胱苷肽，這兩個酶組成一條甲醛到甲酸的氧化途徑。Achkor等人為了檢測甲醛脫氫酶在植物中的功能，對源于擬南芥FALDH基因進行遺傳操作，得到了不同F(xiàn)ALDH水平的擬南芥轉基因株系。用組成型啟動子CaMV 35S過量表達此酶的擬南芥對外源甲醛的攝取效率提高25%，F(xiàn)ALDH水平降低的植物(由于共抑制表型或者反意表達)和野生型擬南芥相比，甲醛脫毒速率顯著減慢。這些結果表明植物吸收甲醛的能力與FALDH活力水平相關(Achkor等，Plant Physiol，2003, 132(4) 2248-225 。因此FALDH的過量表達可用于提高觀賞植物代謝甲醛能力的分子育種，把 faldh整合到植物基因組后，F(xiàn)ALDH蛋白在植物中的表達量是轉基因是否起作用的關鍵， 其中FALDH蛋白特異性抗體是檢測轉基因植物中FALDH蛋白表達水平的有效工具。有研究用PKK223-3載體和T^c啟動子(trp promoter和lac promoter的雜合體)在大腸桿菌JM109中表達FALDH蛋白，獲得有生物活性的FALDH蛋白(Dolferus等，Genetics, 1997，146:1131-1141)。Achkor等把/WA亞克隆于酵母表達載體(phs2)，然后在酵母菌中表達FALDH，從轉基因酵母中純化到FALDH蛋白，并用于制備FALDH的抗體(Achkor等， Plant Physiol, 2003, 132(4) 2248-2255)。但是在酵母表達系統(tǒng)中FALDH蛋白表達量不高，所以FALDH蛋白純化操作過程很復雜，通常用這種方法純化FALDH蛋白需要大規(guī)模培養(yǎng)酵母菌，過幾種性質不同的柱子，并用專業(yè)的儀器控制洗脫條件，蛋白純化的成本很高， 因此這種方法不方便重復使用。此外來源于植物的甲醛脫氫酶穩(wěn)定性差，很多研究結果說明來自耐熱性微生物的酶穩(wěn)定性好，應用范圍廣，作用效果好。至今還沒有研究用耐熱甲基營養(yǎng)短芽孢桿菌(BreviBaciIlus brevis)甲醛脫氫酶基因ifaldti)構建其原核表達載體。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種短芽孢桿菌甲醛脫氫酶基因/WA的原核表達載體 m^-faldh及其在制備FALDH包涵體蛋白中的應用，該載體含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點、T7啟動子的下游有可被IPTG誘導的操作子序列和/WA基因及一個 ■ faldh基因的起始密碼子上游的由6個氨基酸組成的組氨酸標簽序列，載體中的faldh 基因來源于短芽孢桿菌，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，其在GenBank中的登錄號為JN098517 ；利用該載體轉化大腸桿菌(BL21)，實現(xiàn)FALDH蛋白的高水平表達，表達的 FALDH蛋白80%以上形成包涵體，用高濃度的尿素溶解包涵體后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離FALDH蛋白，再從凝膠中回收FALDH蛋白可得到純度極高的FALDH蛋白，可作為抗原用于FALDH抗體的制備。FALDH重組蛋白表達量很高，因此不需要大規(guī)模培養(yǎng)細菌，純化FALDH 蛋白的操作相當簡單，成本也很低，極易重復使用。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案 1、/WA基因的克隆
faldh基因的擴增策略如圖1所示。
(1)從 GenBank 中查找相近物種(包括fecAericAia coli K-12, Paracoccus denitrificans, Photobacterium damseIae subsp. Piscicida, Pichia pastoris, Rhodobacter sphaeroides 2.4. 1)甲醛脫氫酶基因的氨基酸序列，根據(jù)氨基酸保守序列設計序列如下的一對簡并引物
fid 3: GGNCAYGARCCNATGGGNATNGTNGARGA fid 4: TCCATNCCNACRCARTCNATNACNACRTC
以短芽孢桿菌iBreviBacillus brevis )基因組DNA為模板擴增，得到faldh基因的部分片段/A/;
(2)回收并純化faldh基因的部分片段fld，并將其連接到pMD-18T載體上，采用堿裂解法提取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質粒pMD-/7i/，將正確的重組質粒送測序公司測序；
(3)將/WA基因的部分序列/A/在NCBI上進行比對，根據(jù)同源性最高的短小芽孢桿 ■ (Mcillus pumilus)的甲醛脫氫酶基因序列設計序列如下的一對特異性引物
fid 7 :GTGAGAGCTGTTACGTACCA fid 8 :TTATGGCTTTAAAATGACC
以短芽孢桿菌基因組DNA為模板擴增，得到faldh基因的全長片段；
(4)回收并純化/WA全長基因片段，并將其連接到pMD-18T載體上，采用堿裂解法提取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質粒pMD18-T-/WA。、原核表達載體pET3h-faldh的構建
原核表達載體pET3h- faldh的構建策略如圖4所示。根據(jù)faldh基因序列，設計了擴增全長faldh基因的一對引物FDHNcoI和 FDHXhoI，并在5’ -端引物加AfcoI酶切位點，3，-端引物加損ol酶切位點，序列如下
FDHNcoI :5’ -CCATGGGAGCTGTTACGTACCA-3’ FDHXhoI :5’ -CTCGAGTTATGGCTTTAAAATGACCTT-3’
以短芽孢桿菌基因組DNA為模板，本發(fā)明用引物FDHNcoI/FDHXhoI PCR擴增得到faldh 基因的全長片段(1. 2kb),回收并純化/WA全長基因片段，并將其連接到PMD-18T載體后得到重組質粒PMD18T-/WA ；根據(jù)重組質粒pMD18T-/WA中基因序列約750bp處和 PMD18-T載體多克隆位點都有5^1酶切位點，選擇限制性內切酶5^1對質粒進行單酶切， 其酶切片段大小和預期結果一致，說明構建載體成功。對檢測正確的PMD18T-/WA質粒用限制性內切酶AfcoI和損ol進行雙酶切，切割回收目的片段/WA。同樣用AfcoI和損ol將原核表達載體PET3M切開，回收pET3h載體片段。將回收的目的基因faldh片段分別和載體片段進行連接，獲得重組質粒命名為。對mUaldh進行酶切和PCR 檢測。、重組蛋白FALDH原核表達條件的優(yōu)化
將含有/WA基因的原核表達載體導入五coli BL2KDE3)中，在30°C 溫度下對目的蛋白進行不同IPTG濃度、不同時間的誘導表達，最終確定重組蛋白的最優(yōu)表達條件。和轉化空載體菌株相比重組菌在58kDa處有明顯的蛋白條帶出現(xiàn)，與理論上推定的重組蛋白值基本相符，初步說明FALDH重組蛋白在大腸桿菌中得到表達。在ImM IPTG、 30°C誘導Mi時，目的蛋白FALDH在總蛋白中所占比例最高，確定為該蛋白的最優(yōu)表達條件。
FALDH重組蛋白按初步摸索的蛋白表達最優(yōu)條件(ImM IPTG，30°C誘導他)進行表達，并對重組菌進行超聲波破碎，SDS-PAGE確定FALDH在重組菌中的表達形式，實驗結果顯示80%表達的重組蛋白是以包涵體的形式存在于菌體沉淀中。、FALDH重組蛋白的純化
根據(jù)最優(yōu)蛋白表達條件(30°C，ImM IPTG，6h)，對重組菌進行重組蛋白大量誘導表達， SDS-PAGE后經(jīng)0. 25M KCl染色進行目的蛋白割膠回收，回收目的蛋白。再次電泳和透析，檢測蛋白純度，同時利用BSA (0. 1%)定量，回收樣品濃度達2 μ g/μ 1。本發(fā)明現(xiàn)對于現(xiàn)有技術的優(yōu)點和效果
以上實驗結果表明利用faldh基因的原核表達載體mUaldh轉化大腸桿菌 (BL21)，可實現(xiàn)FALDH蛋白的高水平表達，表達的FALDH蛋白80%以上形成包涵體，用高濃度的尿素溶解包涵體后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離FALDH蛋白，再從凝膠中回收FALDH 蛋白可得到純度極高的FALDH蛋白，可作為抗原用于FALDH抗體的制備。FALDH重組蛋白表達量很高，因此不需要大規(guī)模培養(yǎng)細菌，純化FALDH蛋白的操作相當簡單，成本也很低，極易重復使用。


圖1是本發(fā)明faldh全長基因的擴增策略圖。圖2是本發(fā)明faldh部分基因TA克隆載體pMD_/7i/的電泳檢測圖。A是β. 知eris基因組電泳圖，基因組汲知eris基因組，M: Marker III ； B是PCR擴增/WA基因部分片段/7 /，M: Marker III，1_4 :PCR擴增產(chǎn)物；C是質粒 ρΜ 18- ~faldh電泳檢測，stopl 對照質粒-,fldl- fld6 :pMD-/7i/質粒；D是重組質粒 pMD18-T-/7i/的 PCR 檢測，M:MarkerIII ； 1-3,6-9 以 pMD18_T-/7i/為模板擴增的 PCR 產(chǎn)物； 4-5 負對照；E是重組質粒pMD18-T-/7i/雙酶切檢測，M: Marker III ； 1_3為feci和&0RI 雙酶切PMD18-T- /7 /產(chǎn)物。圖3是本發(fā)明faldh全長基因TA克隆載體pMD18_T-/WA的電泳檢測圖。A是召.brevis基因組電泳圖，M: Marker III, B. brevis基因組；B是PCR擴增 /aA/A基因全長片段，1-5 :PCR擴增產(chǎn)物，M: Marker III ；C是質粒pMD18_T-/aA/A電泳檢測，1-9 :pMD18-T-/a7i/A質粒，對照對照質粒；D是重組質粒pMD18_T-/WA的單雙酶切檢測，M: Marker III ；單為&0RI單酶切，雙為III和I雙酶切；E是重組質粒 pMD18 - -faldh 的 PCR 檢測，1-2 擴增產(chǎn)物，Μ: Marker III。圖4為本發(fā)明faldh基因原核表達載體構建策略圖。圖5為本發(fā)明原核表達載體的電泳檢測圖。A是pMD18T-/WA質粒單酶切檢測，1_2 為正向連接質粒，3_4為反向連接質粒，未切為原始質粒；B是AfcoI/iXoI雙酶切質粒pMD18T-/WA和ρΕΤ3^ι ；C是重組質粒 m^a-faldh 電泳檢測，1-12 重組質粒(7. lkb)，13 對照質粒(7. 4kb) ；D 是質粒mUaldh的酶切檢測，1-4 重組質粒mUaldh酶切產(chǎn)物，5 原始質粒，M: Marker III ；E是重組質粒的PCR檢測，1 擴增產(chǎn)物；2 陰性對照；M: Marker III。
圖6是本發(fā)明克隆的短芽孢桿菌FALDH重組蛋白SDS-PAGE電泳檢測分析圖。A是FALDH重組蛋白表達條件優(yōu)化的檢測圖，1-5 :30°C，ImM IPTG條件下分別誘導 0、2、4、6、8h ;M 蛋白 Marker #SM0431 ； 6-10 :30°C，0. 5 mM IPTG 條件下分別誘導 0、2、4、 6、8h ;11 :pET32a 空載體；
B是SDS-PAGE檢測FALDH重組蛋白的表達形式，1 :30°C、ImM IPTG誘導6h上清；2 30°C、lmM IPTG 誘導 6h菌體沉淀；3 :30°C、0. 5mM IPTG誘導 6h上清；4 :30°C、0. 5mM IPTG 誘導6h菌體沉淀；5 :pET32a空載體；M 蛋白Marker#SM0431。圖7是檢測FALDH重組蛋白純化的SDS-PAGE電泳1 未純化的重組蛋白；2-3 純化的重組蛋白；4 :3μ1 BSA ；5 :5μ1 BSA0
具體實施例方式本實施例中采用的試劑主要為分子生物學實驗試劑，各種限制性內切酶、Taq DNA 聚合酶和dNTP等為日本寶生物工程有限公司(大連)產(chǎn)品，質粒提取試劑盒購自博大泰克生物技術有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。儀器均為分子生物學以及基因工程實驗室常用儀器。所有引物序列均在大連寶生物公司合成。本發(fā)明實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1 -.faldh基因的擴增
從 GenBank 中查找相近物種(包鎮(zhèn) Escherichia coli K-12, Paracoccus denitrificans, Photobacterium damseIae subsp. Piscicida, Pichia pastoris, Rhodobacter sphaeroides 2.4. 1)甲醛脫氫酶基因的氨基酸序列，根據(jù)氨基酸保守序列設計一對簡并引物，序列如下
fid 3: GGNCAYGARCCNATGGGNATNGTNGARGA fid 4: TCCATNCCNACRCARTCNATNACNACRTC
用下述方法提取短芽孢桿菌(^r^ifeciBm力reris)基因組DNA 挑取生長良好的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中于30°C震蕩培養(yǎng)過夜；按1%接種量轉接到IOOml新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37°C震蕩培養(yǎng)4h(0D6QQ=2. 0)，6000rpm/min離心收集菌體；加入1/10菌液體積的 SI 溶液(0. 3M Sucrose, 25 uM Tris-HCL (ρΗ8· 0) 25mM EDTA)，混勻，37°C放置 1 2h ；加 Λ 9/10 菌液體積的 SII 溶液(0. IM NaCl，0. 1% (ff/V)SDS, 0. IM Tris-HCl )，輕輕混勻； 反復凍融裂解使溶液透明，加入等體積的Tris-飽和酚，抽提2次，取上清液；用等體積的氯仿/異戊醇(24 :1)抽提一次；用1/10體積3M NaAC，2倍體積無水乙醇沉淀DNA ； 12000rpm, 離心5min，用70%乙醇洗滌沉淀，干燥備用；用適量含有RNaseA的水溶解，37°C放置Ih ；電泳檢測，-20°C保存?zhèn)溆?；若提取基因組不純，可進一步純化。以基因組DNA為模板，用/7^/ 3 和/7^/4為引物進行PCR，擴增得到/WA基因的部分片段(約600bp，簡稱/7必(圖2Β)； 回收并純化/WA基因的部分片段/7A并將其連接到pMD-18T (大連寶生物公司)載體上 (連接方式見圖1)，轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5ci (天根生化科技)，采用堿裂解法提取質粒 DNA (圖2C)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，選取大小和理論值相符的重組質粒做進一步的PCR檢測和雙酶切檢測。以重組質粒為模板，用引物3和fid 4擴增到0. 6kb的PCR產(chǎn)物(圖 2D )。根據(jù)陽性重組質粒pMD-/7i/載體兩端的多克隆位點，用I和雙酶切重組質粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，連接成功的重組質粒pMD-/7i/酶切產(chǎn)物為2. 7kb 和0. 6kb左右的條帶(圖2E)，將正確的重組質粒送測序公司測序；將/7 /序列在NCBI上進行比對，根據(jù)同源性最高的短小芽孢桿菌OfeciBm的甲醛脫氫酶基因序列設計
序列如下的一對特異性引物
fid 7 :GTGAGAGCTGTTACGTACCA fid 8 :TTATGGCTTTAAAATGACC
以短芽孢桿菌基因組DNA為模板PCR，擴增得到/WA基因的全長片段約1.21Λ(圖:3B); 回收并純化/WA全長基因片段，并將其連接到PMD-18T載體上(大連寶生物公司)，轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5ci (天根生化科技)，采用堿裂解法提取質粒DNA(圖3C)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，選取大小和理論值相符的重組質粒做進一步的PCR檢測和雙酶切檢測。根據(jù)陽性重組質粒PMD18-T-/WA載體兩端的多克隆位點，用單酶切和歷力(1111和&01 1雙酶切重組質粒，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，連接成功的重組質粒PMD18-T-/WA 單酶切產(chǎn)物理論上為3. 91Λ，雙酶切產(chǎn)物為2. 7kb和1. 2kb左右的條帶(圖3D)。以重組質粒為模板，用引物fid 7和fid 8擴增到1. 2kb的PCR產(chǎn)物(圖3E)。實施例2 原核表達載體pET3h- faldh的構建 原核表達載體pET3h- faldh的構建策略如圖4所示。根據(jù)faldh基因序列，設計擴增全長faldh基因的一對引物FDHNcoI和FDHXhoI， 并在5’ -端引物加AfcoI酶切位點，3’ -端引物加損01酶切位點，序列如下
FDHNcoI :5’ -CCATGGGAGCTGTTACGTACCA-3’ FDHXhoI :5’ -CTCGAGTTATGGCTTTAAAATGACCTT-3’
以短芽孢桿菌基因組DNA為模板，用引物FDHNcoI/FDHXhoI PCR擴增得到faldh基因的全長片段(1.21Λ)，回收并純化/WA全長基因片段，并將其連接到pMD-18T載體后得到重組質粒pMD18T-/aA/A ；根據(jù)重組質粒pMD18T-/aA/A中基因序列約750bp處和pMD18_T 載體多克隆位點都有feci酶切位點，選擇限制性內切酶feci對質粒進行單酶切，酶切結果會產(chǎn)生兩條片段。如果是正向連接，酶切片段大小分別約為0. 751Λ和3. 15kb ；如果反向連接，酶切片段大小分別約為0. 45kb和3. 451Λ。結果如圖5A，其酶切片段大小和預期結果一致，說明PMD18T-/WA構建成功。用限制性內切酶AfcoI和煬ol雙酶切pMD18T-/WA質粒和原核表達載體pET3h， 通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，從凝膠中回收目的片段/WA (1.2 1Λ)和pET3h載體片段(圖5B)。然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒將回收的目的基因/WA片段和載體片段pET3h進行連接，用連接反應混合物轉化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5 α，天根生化科技)，把轉化好的大腸桿菌涂于加有氨芐霉素(Amp， 100 μ g/ml)的平板上，于37 0C過夜培養(yǎng)，篩選Amp抗性重組子菌落，從Amp抗性重組子菌落中提取質粒(圖5C)，用損al和feci進行雙酶切檢測，因損<31在載體處有單一識別位點， 而feci在/WA目的片段上有一個識別位點，故雙酶切質粒會產(chǎn)生5. 9 kb和1. 2 kb左右的兩個片段，瓊脂糖凝膠電泳和(圖5D)預測結果一致。說明目的片段已經(jīng)插入pET3h載體，原核表達載體構建成功；選取大小和理論值相符的重組質粒為模板進行 PCR檢測，上下游引物分別使用fid!和/7^/8，擴增產(chǎn)物大小約為1. 21Λ，和理論預期相符(圖 5Ε)。選出連接成功的質粒載體pET3h-/WA，轉化大腸桿菌DH5ci，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質粒pET3h-/WA。實施例3 重組FALDH蛋白的表達與表達條件的優(yōu)化
用原核表達載體轉化大腸桿菌BL21的感受態(tài)細胞(DH5a，天根生化科技)。挑取單菌落加入2mL LB (含有Amp 100mg/L)中，37°C過夜培養(yǎng)(0D_值約為1. 5)。 加1. OmM的IPTG于30°C誘導0_8小時后，離心收集菌體，去掉上清液，加入0. Iml SDS-PAGE 上樣緩沖液(Sample loading buffer),于95°C加熱10分鐘煮沸菌體。冰浴冷卻后于4°C離心(12000rpm)10分鐘，取上清作SDS-PAGE。根據(jù)文獻資料和軟件分析預測目的蛋白大小為 58kDa左右，采用1 分離膠。SDS-PAGE電泳參看《分子克隆實驗指南(第三版)》。SDS-PAGE 電泳結果(圖6)表明在ImM IPTG、30°C誘導《ι時，目的蛋白FALDH在總蛋白中所占比例最高，確定為該蛋白的最優(yōu)表達條件。實施例4 重組FALDH蛋白的純化
用原核表達載體轉化大腸桿菌BL21的感受態(tài)細胞，挑取單菌落入500mL LB (含有Amp 100mg/L)中，25°C培養(yǎng)至0D600值約為0. 6時，加1.0 mM IPTG誘導后6小時，離心收集菌體，用wash buffer (10 mM Tris-Cl，pH7. 5)洗2次，加入30ml蛋白抽提緩沖液(磷酸鈉緩沖液(PH7. 4)20 mmol/L)，懸浮菌體。于冰浴上超聲波破碎細菌細胞(工作 3秒，間歇9秒，功率30W,全程30分鐘)。于4°C離心(6000g) 30分鐘，得到上清和沉淀，沉淀用8M尿素(IOml)溶解。取適量上清和沉淀蛋白樣品加入適量上樣緩沖液作SDS-PAGE， 結果說明所表達的FALDH重組蛋白80%出現(xiàn)在包涵體蛋白部分(圖6B)。沉淀用8M尿素 (IOml)溶解，加入適量上樣緩沖液，用12%的分離膠跑SDS-PAGE，然后用0. 25M KCl于4 °C染色30分鐘，割出FALDH蛋白條帶，放入透析袋，加入aiil SDS-PAGE buffer，進行水平電泳4-5小時或過夜，將FALDH蛋白從凝膠中洗脫出來，可獲得純度達85%以上的FALDH蛋白樣品(圖6B)。最后在IXPBS溶液中透析過夜后可用于FALDH抗體的制備。本發(fā)明的實驗結果表明用ImM IPTG于37°C誘導6小時后可獲使FALDH重組蛋白達到很高的表達量，所表達的重組蛋白有80%會形成包涵體，包涵體蛋白含量很高，用高濃度的尿素溶解后進行聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)極易純化FALDH重組蛋白，然后割下含有FALDH重組蛋白的凝膠，通過透析從凝膠中回收獲得純度很高的FALDH重組蛋白，可用于FALDH特異性抗體的制備，為FALDH特異性抗體的制備提供了一條新途徑。FALDH重組蛋白表達量很高，因此不需要大規(guī)模培養(yǎng)細菌，純化FALDH蛋白的操作相當簡單，成本也很低，極易重復使用。
9
權利要求
1.短芽孢桿菌甲醛脫氫酶基因/WA的原核表達載體，其特征在于該載體含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點、T7啟動子的下游有可被IPTG誘導的操作子序列和 faldh基因，緊靠/WA基因的起始密碼子上游有一個由6個氨基酸組成的組氨酸標簽序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的原核表達載體，其特征在于載體中的/WA基因來源于短芽孢桿菌，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
3.權利要求1所述的原核表達載體在制備FALDH包涵體蛋白中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效表達短芽孢桿菌甲醛脫氫酶蛋白的原核表達載體pET32a-faldh，該載體是含有短芽孢桿菌(BreviBacillusbrevis)甲醛脫氫酶基因(faldh)的原核表達載體，本發(fā)明從短芽孢桿菌中擴增出faldh基因，亞克隆與原核表達載體pET32a中獲得其原核表達載體pET32a-faldh，用T7啟動子控制它在大腸桿菌中的表達，表達的重組蛋白質80%以上形成包涵體，從包涵體中很容易純化高純度的重組蛋白質。
文檔編號C12N15/53GK102344932SQ20111030649
公開日2012年2月8日 申請日期2011年10月11日 優(yōu)先權日2011年10月11日
發(fā)明者孟慶超, 年洪娟, 程琴, 陳麗梅 申請人:昆明理工大學