專利名稱：短芽孢桿菌甲醛脫氫酶基因及其植物表達(dá)載體與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及短芽孢桿菌甲醛脫氫酶基因及其甲醛脫氫酶基因植物表達(dá)載體V^aidh及該基因在提高植物吸收和耐受甲醛能力強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甲醛是一種無(wú)色，有強(qiáng)烈刺激氣味的氣體，易溶于水、醇和醚。它反應(yīng)能力極強(qiáng)， 能與蛋白質(zhì)，核酸和脂類產(chǎn)生非特異性的反應(yīng)(Feldman等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1973，13:1-49)，是一種非常活潑的化合物，因此對(duì)所有的生物來(lái)說(shuō)都有很高的毒性。 甲醛被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)中，是制造樹(shù)脂、膠粘劑、油漆、塑料、人造纖維的原料，是膠粘劑工業(yè)應(yīng)用最廣泛的化學(xué)原材料。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，各種原料制成的建筑裝飾材料已走入各種室內(nèi)公共場(chǎng)所和家庭，使甲醛成為室內(nèi)空氣污染公認(rèn)最具代表性的化學(xué)物質(zhì)。人們?nèi)胱⌒戮佣家M(jìn)行室內(nèi)裝飾和更新家具，其正是室內(nèi)空氣甲醛污染的主要來(lái)源。甲醛污染危害嚴(yán)重的場(chǎng)所是居室、辦公室、會(huì)議室、賓館、KTV包房、家具商場(chǎng)、建材商場(chǎng)等。室內(nèi)空氣中游離甲醛濃度在中國(guó)規(guī)定的允許值是0.08 (mg /立方米)，有調(diào)查表明新的賓館客房室內(nèi)空氣中甲醛濃度最高達(dá)0. 36mg/立方米，平均為0. 173mg/立方米， 是室外對(duì)照的13倍。而家具商場(chǎng)最高達(dá)0. 873mg/立方米，平均為0. 432mg/立方米，是室外對(duì)照的33倍。建成一所經(jīng)過(guò)裝飾的實(shí)驗(yàn)室，空氣中甲醛平均濃度高達(dá)0. 5mg/立方米，是室外的62.5倍。抽樣檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單位及住戶室內(nèi)環(huán)境污染嚴(yán)重，查了 11家只有1戶合格，其中竟有1戶甲醛超標(biāo)25倍。甲醛為較高毒性物質(zhì)，當(dāng)室內(nèi)空氣中甲醛含量為0. Img/立方米時(shí)，就有異味和不適感；達(dá)到0.5 mg/立方米時(shí)，可刺激眼睛，引起流淚；達(dá)到0.6 mg/立方米時(shí)，可引起咽喉不適或疼痛。濃度更高時(shí)，可引起惡心嘔吐，咳嗽胸悶，氣喘甚至肺水腫；達(dá)到30 mg/ 立方米時(shí)，會(huì)立即致人死亡。長(zhǎng)期接觸低劑量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻煙癌、 結(jié)腸癌、腦瘤、月經(jīng)紊亂、細(xì)胞核的基因突變，DNA單鏈內(nèi)交連和DNA與蛋白質(zhì)交連及抑制 DNA損傷的修復(fù)、妊娠綜合癥、引起新生兒染色體異常、白血病，這就是所謂的裝修綜合病 (sick-house)。相對(duì)于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、TDI、VOC等有害物質(zhì)來(lái)說(shuō)，甲醛具有潛伏周期長(zhǎng)(3-15年)、隱藏深、分布廣、易揮發(fā)、治理難、危害大等特性。植物具有凈化空氣，改善環(huán)境的作用。已有研究表明外源甲醛能夠作為碳源被整合入植物光合細(xì)胞的代謝中。比如，普通的掛蘭在mC標(biāo)記的甲醛上生長(zhǎng)時(shí)通過(guò)一碳代謝產(chǎn)生mC標(biāo)記的產(chǎn)物，如絲氨酸和卵磷脂。甲醛可以和谷胱苷肽，精氨酸，天冬酰氨和四氫葉酸形成加合物后通過(guò)不同的途徑進(jìn)行代謝。對(duì)幾種真核生物的生化和遺傳學(xué)研究表明谷胱苷肽依賴型甲醛脫氫酶(FALDH)是甲醛代謝的關(guān)鍵酶之一。甲醛脫氫酶廣泛存在于微生物和植物體的所有組織中，它催化的反應(yīng)以甲醛和谷胱苷肽的加合物硫代羥甲基谷胱苷肽(S-hydroxymethylglutathione)為底物產(chǎn)生硫代甲酰基谷胱苷肽(S-formylglutathione)。在植物中還有硫代甲酰谷胱苷肽水解酶，它能把^-formylglutathione分解為甲酸和谷胱苷肽。這兩個(gè)酶組成一條甲醛到甲酸的氧化途徑。 Achkor等人為了檢測(cè)甲醛脫氫酶的功能，對(duì)來(lái)源于擬南芥FALDH的基因進(jìn)行遺傳操作，得到了不同F(xiàn)ALDH水平的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系。過(guò)量表達(dá)此酶的擬南芥對(duì)外源甲醛的攝取效率提高25%，F(xiàn)ALDH水平降低的植物(由于共抑制表型或者反義表達(dá))和野生型擬南芥相比， 甲醛脫毒速率顯著緩慢，能力下降。這些結(jié)果表明植物吸收甲醛的能力與FALDH活力水平相關(guān)(Achkor 等，Plant Physiol, 2003，132(4) 2248-2255)。綜上所述，高等植物都擁有甲醛代謝途徑，但其甲醛代謝關(guān)鍵酶在高等植物中表達(dá)水平較低，穩(wěn)定性差，使植物無(wú)法應(yīng)對(duì)外界環(huán)境中高濃度甲醛的脅迫，如何提高植物吸收耐受及代謝甲醛的能力就成為本領(lǐng)域的技術(shù)人員尤為關(guān)注的問(wèn)題。很多研究結(jié)果說(shuō)明來(lái)自耐熱性微生物的酶穩(wěn)定性好，應(yīng)用范圍廣，作用效果好。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定性好，同時(shí)能提高植物吸收、代謝和耐受甲醛能力的短芽孢桿菌甲醛脫氫酶基因/WA序列及分離克隆該基因的引物序列，用該基因轉(zhuǎn)化植物，使之提高對(duì)甲醛的吸收、代謝和耐受能力，克服植物本身甲醛代謝關(guān)鍵酶表達(dá)水平較低，吸收代謝甲醛能力低的缺點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明從耐熱甲基營(yíng)養(yǎng)短芽孢桿菌iffreviBacillus brevis, 1.931)中克隆甲醛脫氫酶基因/WA，其編碼區(qū)由1134個(gè)堿基組成，具有序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的faldh基因編碼FALDH蛋白，它由377個(gè)氨基酸殘基組成，具有序列表SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的基因/WA在植物中表達(dá)的 FALDH蛋白可以提高其對(duì)甲醛的吸收、代謝和耐受性。本發(fā)明提供的上述基因序列是一種能氧化甲醛的新的甲醛脫氫酶基因，用該基因轉(zhuǎn)化植物，提高其甲醛吸收和代謝能力，并克服它們自身對(duì)甲醛耐受力低的缺點(diǎn)。本發(fā)明另一目的是提供甲醛脫氫酶基因的植物表達(dá)載體pK2-35S-/aA/A，所述載體含有甲醛脫氫酶/WA基因及卡那霉素篩選標(biāo)記基因K2和組成型啟動(dòng)子35S。本發(fā)明另一目的是將甲醛脫氫酶基因的植物表達(dá)載體VhHldh應(yīng)用在制備吸收和耐受甲醛能力強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物中。本發(fā)明更詳細(xì)的技術(shù)方案由下述描述揭示
1、在短芽孢桿菌1. 931菌株中進(jìn)行/WA基因的克隆
本發(fā)明所提供的甲醛脫氫酶基因來(lái)源于耐熱甲基營(yíng)養(yǎng)菌短芽孢桿菌，首先對(duì)相近微生物禾中(包括 Escherichia coli K-12, Paracoccus deni tr if leans, Pho tobac terium dams e Iae subsp. Piscicidaj Pichia ρ as tor is, Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1) 脫氫酶氨基酸序列比對(duì)找到氨基酸保守序列，根據(jù)該保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增得到甲醛脫氫酶基因的部分核苷酸序列，然后將得到的部分核苷酸序列在GenBank中比對(duì)，根據(jù)同源性最高物種的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增得到全長(zhǎng)基因的方法克隆得到，具體克隆方法如下
(1)從GenBank中查找相近物種甲醛脫氫酶基因的氨基酸序列，根據(jù)氨基酸保守序列設(shè)計(jì)序列如下的一對(duì)簡(jiǎn)并引物
fid 3: GGNCAYGARCCNATGGGNATNGTNGARGAfid 4: TCCATNCCNACRCARTCNATNACNACRTC 以短芽孢桿菌基因組DNA為模板擴(kuò)增，得到faldh基因的部分片段fid ；
(2)回收并純化/WA基因的部分片段/A/，并將其連接到PMD-18T載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過(guò)PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pMD-/7i/，將正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司測(cè)序；
(3)、將faldh基因的部分序列/7^/在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)同源性最高的短小芽孢桿 mBacillus pumiIus)的甲醛脫氫酶基因序列設(shè)計(jì)序列如下的一對(duì)特異性引物
fid 7 :GTGAGAGCTGTTACGTACCA fid 8 :TTATGGCTTTAAAATGACC
以短芽孢桿菌基因組DNA為模板擴(kuò)增，得到faldh基因的全長(zhǎng)片段；
(4)回收并純化faldh全長(zhǎng)基因片段，并將其連接到PMD-18T載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過(guò)PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-/WA。測(cè)定重組質(zhì)粒 PMD18-T-/WA所含的faldh序列，得到全長(zhǎng)/WA基因核苷酸序列，并推測(cè)出該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。利用DNAMAN軟件分析該基因全長(zhǎng)1134bp，編碼377個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。2、植物表達(dá)載體pK2-35S_/WA的構(gòu)建
(1)構(gòu)建入門載體 pENTR-2B-/WA，用 BatnH I 禾Π Xho I 酶切 pMD18_T_/WA 和 PENTR2B (hvitrogen)，得到目的基因片段faldh和載體片段pENTR_2B，回收后進(jìn)行連接、 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒PENTR-2B-/WA ；
(2 )構(gòu)建植物表達(dá)載體pK2_35S-/WA，通過(guò)Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)把faldh基因亞克隆到植物表達(dá)載體PK2GW7中，通過(guò)酶切檢測(cè)獲得/WA基因的植物表達(dá)載體本發(fā)明的植物表達(dá)載體對(duì)那些能實(shí)施轉(zhuǎn)基因操作的植物都適用，如煙草、擬南芥、 矮牽牛、非洲菊等。在本發(fā)明的實(shí)施例中以煙草為例說(shuō)明該表達(dá)載體的應(yīng)用。Lfaldh基因轉(zhuǎn)化植物及轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)
將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pK2-35S-/aA/A轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(C58C1 (pPMP90))中，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物，篩選卡那霉素抗性植株。通過(guò)基因組PCR擴(kuò)增檢測(cè)faldh是否插入植物基因組，通過(guò)RT-PCR分析檢測(cè)/WA基因在轉(zhuǎn)基因植物中的轉(zhuǎn)錄水平。選取轉(zhuǎn)基因株系葉片提取總蛋白，然后進(jìn)行Western Blot分析檢測(cè)FALDH的表達(dá)水平。檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)基因株系中有/WA基因編碼的FALDH條帶，而野生型植物中沒(méi)有該條帶，說(shuō)明FALDH已在轉(zhuǎn)基因植物中成功表達(dá)。4、轉(zhuǎn)基因植物的FALDH酶活性測(cè)定
從植物葉片中抽提可溶性蛋白，用Bradford方法測(cè)定植物上清中的蛋白質(zhì)濃度，通過(guò)測(cè)定FALDH酶活性，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植物酶活性比野生型植物提高約3 5倍左右。5、轉(zhuǎn)基因植物吸收甲醛的能力
取植物材料放入小三角瓶中，加入70ml甲醛處理液處理一定時(shí)間。測(cè)定處理液殘存甲醛濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植物吸收液體中甲醛的速率優(yōu)于野生型。6、轉(zhuǎn)基因植物代謝液體和氣體甲醛的能力
將轉(zhuǎn)/WA基因植物和野生型植物無(wú)菌苗置于H13CHO處理液中，處理一定時(shí)間后，用無(wú)菌吸水紙吸干葉片表面殘留水分，液氮速凍植物材料并研磨成粉，轉(zhuǎn)移至離心管中離心獲得上清，轉(zhuǎn)移至核磁管中作13C-NMR分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明通過(guò)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的FALDH有氧化甲醛的能力，且穩(wěn)定性好，能一直在植物中發(fā)揮作用。將H13CHO吸到一個(gè)小棉花團(tuán)上，置入植物培養(yǎng)瓶中，通過(guò)棉花團(tuán)上揮發(fā)出來(lái)的氣體甲醛處理轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物，液氮速凍植物材料并研磨成粉，轉(zhuǎn)移至離心管中離心獲得上清，轉(zhuǎn)移上清至核磁管13C-NMR分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FALDH在轉(zhuǎn)基因植物中的過(guò)量表達(dá)使其吸收和代謝氣體甲醛的能力大大提高。7、轉(zhuǎn)基因植物對(duì)甲醛的抗性
稱量選取長(zhǎng)勢(shì)良好，大小一致的植物組培苗分別轉(zhuǎn)移至含有不同濃度HCHO的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察植物表型變化。結(jié)果說(shuō)明FALDH的過(guò)量表達(dá)提高植物對(duì)于固體培養(yǎng)基中液體甲醛的抗性。上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明含有甲醛脫氫酶/WA基因的轉(zhuǎn)基因植物吸收液體甲醛的速率優(yōu)于野生型；通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的FALDH蛋白有氧化甲醛的能力，且穩(wěn)定性好，能一直在植物中發(fā)揮作用；FALDH蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的過(guò)量表達(dá)使其代謝氣體甲醛的能力大大提高；對(duì)甲醛的抗性增強(qiáng)，與野生型相比，在含有甲醛的培養(yǎng)上生長(zhǎng)時(shí)轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)受甲醛的影響較小。


圖1是本發(fā)明faldh全長(zhǎng)基因的克隆策略圖。圖2是本發(fā)明faldh基因部分DNA片段TA克隆pMD_/7i/的電泳檢測(cè)圖。A B.知eris基因組；B =PCR 擴(kuò)增 faldh 基因部分 DNA 片段/7i/，M: Marker III ； 1-4 =PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；C 質(zhì)粒pMD18-T-/WA電泳檢測(cè)，stopl 對(duì)照質(zhì)粒-,fldl- fld6 ρΜ -fld 質(zhì)粒；D 重組質(zhì)粒 pMD18-T-/7i/ 的 PCR 檢測(cè)，MiMarkerIII ； 1-3 和 6-9 是以 pMD18-T-/7i/為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；4_5 負(fù)對(duì)照；E 重組質(zhì)粒pMD18_T-/7i/雙酶切檢測(cè)， M: Marker III ； 1-3 為 Sacl ^PEcoRl 雙酶切 pMD18_T_ /7 /產(chǎn)物。圖3是本發(fā)明全長(zhǎng)基因TA克隆pMD18-T-/WA的檢測(cè)。A -.B. brevis 基因組；Μ: Marker III -,B. brevis 基因組；B :PCR 擴(kuò)增 faldh 基因全長(zhǎng)片段，1-5是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M: Marker III ；C 質(zhì)粒ρΜ)18~ ~falΛ電泳檢測(cè)，1-9 pMD Hfaldh質(zhì)粒；對(duì)照對(duì)照質(zhì)粒；D 重組質(zhì)粒pMD Hfaldh的單雙酶切檢測(cè)， M: Marker III ；單為單酶切，雙為III和I雙酶切；E 重組質(zhì)粒pMD18 - -faldh 的 PCR 檢測(cè)，1-2 擴(kuò)增產(chǎn)物；Μ: Marker III。圖4是本發(fā)明入門載體pENTR-2B-/WA的構(gòu)建策略圖。圖5是本發(fā)明入門載體PENTR-2B-/WA的電泳檢測(cè)圖。A :pENTR-2B-/a7i/A 質(zhì)粒電泳檢測(cè)，1 4 :pENTR-2B_/WA，5 對(duì)照質(zhì)粒 pENTR-2B-ccdB ； B -.BairMl ^WXhol 雙酶切檢測(cè) pENTR-2B-/a/o% ；M :DNA Marker III ；1 -4 :pENTR-2B-/a7i/A 酶切質(zhì)粒。圖6是本發(fā)明用faldh植物表達(dá)載體的構(gòu)建策略圖。圖7是本發(fā)明faldh植物表達(dá)載體pK2-35S_/WA的檢測(cè)及其農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子菌落的檢測(cè)。其中A 電泳檢測(cè)重組質(zhì)粒pK2-35S-/WA，1 =PK2Gff7, 2 4 :pK2-35S-/WA質(zhì)粒樣品。B 酶切檢測(cè)重組質(zhì)粒vhUfaldh, 1 原始質(zhì)粒，2-4 成2Hfaldh酶切質(zhì)粒樣品，M:DNA Marker III。C:菌落PCR檢測(cè)pK2-;35S-/WA的轉(zhuǎn)化效果，N:負(fù)對(duì)照(模板 % PK2Gff7 ) ； M: Marker III ；1 4:菌落 PCR 樣品。圖8是本發(fā)明faldh在轉(zhuǎn)基因煙草中的插入情況以及表達(dá)水平的檢測(cè)。A難faldh煙草基因組PCR擴(kuò)增，WT:野生型煙草；1 9:轉(zhuǎn)基因煙草株系；M: DNA Marker III ；10:正對(duì)照(模板為 pK2_35S_/aA/A 質(zhì)粒)。B 轉(zhuǎn)/aA/A 煙草RT-PCR擴(kuò)增， M: Marker III ； 1-3 野生型煙草；4_6 轉(zhuǎn)基因煙草株系；7 正對(duì)照(模板為pK2-35S_/WA 質(zhì)粒)；WT:野生型煙草；TT2，TT6，TT8 轉(zhuǎn)基因煙草株系。C 轉(zhuǎn)基因煙草flfestern Blot分析，CK -.B. brevis自然菌株總蛋白，TT-2 即轉(zhuǎn)/WA基因煙草2#株系，上樣量分別為25ng 和50ng，TT-6 即轉(zhuǎn)faldh基因煙草6#株系，上樣量為50ng，TT-8 即轉(zhuǎn)faldh基因煙草8# 株系，上樣量為50ng，K 無(wú)樣品(野生型WT-I飄溢蛋白)，WT-l，WT-2 即野生型煙草株系對(duì)照，上樣量為50ng。圖9是本發(fā)明FALDH在轉(zhuǎn)基因煙草中的酶活性測(cè)定分析圖，WT:野生型煙草，TT2， TT6, TT8 轉(zhuǎn)基因煙草株系。圖10是本發(fā)明轉(zhuǎn)基因煙草吸收液體甲醛(2mM)速率的測(cè)定分析圖，WT:野生型煙草；TT2, TT6，TT8 轉(zhuǎn)基因煙草株系。圖11是煙草代謝液體和氣體H13CHO能力的檢測(cè)圖，A 液體H13CHO在煙草中的代謝分析。處理時(shí)間如譜右端所表示，CK 未處理煙草，Ref 甲酰胺，WT-2h 野生型煙草處理 2h，TT-6-2h 轉(zhuǎn)faldh基因煙草處理2h，WT_48h 野生型煙草處理48h，TT_6_48h 轉(zhuǎn)faldh 基因煙草處理48h;
B 氣體H13CH0在煙草中的代謝分析。處理時(shí)間如譜右端所表示，CK 未處理煙草，Ref 馬來(lái)酸，WT-2h 野生型煙草處理2h，TT-6-2h 轉(zhuǎn)faldh基因煙草處理2h。圖12是本發(fā)明轉(zhuǎn)/WA基因煙草在含甲醛培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況。A 轉(zhuǎn)基因煙草在2mM甲醛培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況，WT:野生型煙草；TT_6:轉(zhuǎn)基因煙草；B 轉(zhuǎn)基因煙草在4mM甲醛培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況；WT:野生型煙草；TT-6:轉(zhuǎn)基因煙草。C:不同濃度HCHO對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草生物量的影響；WT:野生型煙草；TT-6:轉(zhuǎn)基因煙草。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例中采用的試劑主要分為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑、植物遺傳轉(zhuǎn)化所需的培養(yǎng)基以及轉(zhuǎn)基因植物鑒定和檢測(cè)所需的各種試劑。各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為寶生物工程有限公司(大連)產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自博大泰克生物技術(shù)有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取試劑盒、Gateway LR clonase Enzyme Mix kit購(gòu)自invitrogen公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器。所有引物序列均在大連寶生物公司合成。本發(fā)明實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。 實(shí)施例1 -.faldh基因的克隆/WA基因的克隆策略如圖1所示。從GenBank中查找相近微生物種(包括fecAericAia coli K-12, Paracoccus denitrificans, Photobacterium damselae subsp. Piscicida, Pichia pas tor is, Rhodobacter sphaeroides 2.4. 1)甲醛脫氫酶基因的氨基酸序列,根據(jù)氨基酸保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，序列如下
fid 3: GGNCAYGARCCNATGGGNATNGTNGARGA fid 4: TCCATNCCNACRCARTCNATNACNACRTC 用下述方法提取基因組DNA 挑取生長(zhǎng)良好的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中于30°C 震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；按1%接種量轉(zhuǎn)接到IOOml新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37 °C震蕩培養(yǎng)4h (0D_=2· 0),6000rpm/min離心收集菌體；加入1/10菌液體積的SI溶液(0. 3M Sucrose, 25 uM Tris-HCL (pH8. 0) 25mM EDTA)，混勻，37°C放置廣2h ；加入9/10菌液體積的SII溶液 (0. IM NaCl，0. 1% (ff/V)SDS, 0. IM Tris-HCl )，輕輕混勻；反復(fù)凍融裂解使溶液透明，加入等體積的Tris-飽和酚，抽提2次，取上清液；用等體積的氯仿/異戊醇(24 :1)抽提一次； 用1/10體積3M NaAC, 2倍體積無(wú)水乙醇沉淀DNA ； 12000rpm,離心5min，用70%乙醇洗滌沉淀，干燥備用；用適量含有RNaseA的水溶解，37°C放置Ih ；電泳檢測(cè)(圖2A)，-20°C保存?zhèn)溆?。以基因組DNA為模板，用/7 / 3和/7 /4為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到/WA基因的部分片段(約600bp，簡(jiǎn)稱/7必(圖2Β)；回收并純化/WA基因的部分片段/A/，并將其連接到 PMD-18T (大連寶生物公司)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α (天根生化科技)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA(圖2C)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，選取大小和理論值相符的重組質(zhì)粒做進(jìn)一步的PCR檢測(cè)和雙酶切檢測(cè)。以重組質(zhì)粒為模板，用引物/A/ 3和/7 /4擴(kuò)增到0.61Λ 的PCR產(chǎn)物(圖2D )。根據(jù)陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD-/7i/載體兩端的多克隆位點(diǎn)，用I和雙酶切重組質(zhì)粒，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，連接成功的重組質(zhì)粒pMD-/7i/酶切產(chǎn)物為2. 7kb和0. 6kb左右的條帶(圖2E)，將正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司測(cè)序；將/A/序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)同源性最高的短小芽孢桿菌OfeciBm pumiIus^的甲醛脫氫酶基因序列設(shè)計(jì)序列如下的一對(duì)特異性引物 fid 7 :GTGAGAGCTGTTACGTACCA fid 8 :TTATGGCTTTAAAATGACC
以短芽孢桿菌基因組DNA為模板PCR，擴(kuò)增得到/WA基因的全長(zhǎng)片段約1.21Λ(圖:3B); 回收并純化/WA全長(zhǎng)基因片段，并將其連接到PMD-18T載體上(大連寶生物公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5ci (天根生化科技)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA(圖3C)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，選取大小和理論值相符的重組質(zhì)粒做進(jìn)一步的PCR檢測(cè)和雙酶切檢測(cè)。根據(jù)陽(yáng)性重組質(zhì)粒PMD18-T-/WA載體兩端的多克隆位點(diǎn)，用單酶切和歷力(1111和&01 1雙酶切重組質(zhì)粒，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，連接成功的重組質(zhì)粒PMD18-T-/WA 單酶切產(chǎn)物理論上為3.91Λ，雙酶切產(chǎn)物為2. 71Λ和1.21Λ左右的條帶(圖3D)。以重組質(zhì)粒為模板，用引物/W 7和/7 / 8擴(kuò)增到1.21Λ的PCR產(chǎn)物(圖3E)。測(cè)定重組質(zhì)粒 PMD18-T-/WA積,faldh基因序列，得到全長(zhǎng)/WA基因核苷酸序列，推測(cè)出該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，見(jiàn)SEQ ID NO 1。通過(guò)分析該基因編碼的蛋白質(zhì)，得知該基因的編碼區(qū)是3-1128bp，由377個(gè)氨基酸組成。
實(shí)施例2 構(gòu)建入門載體pENTR-2B-/WA
入門載體PENTR-2B-/WA的構(gòu)建如圖4所示。用Bamm和損οI 雙酶切PMD18-T-/WA和PENTR-2B*，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離已切開(kāi)的載體和插入片段，分別回收PMD18-T-/WA被切割后產(chǎn)生的/WA基因片段(1. 2kb)和通路克隆(Gateway)的入門載體pENTR-2B*被切割后產(chǎn)生的載體片段pENTRT-2B*，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接PENTRT-2B*和faldh基因的DNA片斷產(chǎn)生入門載體pENTR-2B_/WA (圖4)。 用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞φΗδα，購(gòu)自天根生化科技公司)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有卡那霉素(Km，50 μ g/ml)的平板上，于37 0C過(guò)夜培養(yǎng)，篩選Km抗性重組子菌落，從Km抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，選出連接成功的質(zhì)粒載體 PENTR-2B-/WA，進(jìn)行電泳檢測(cè)，其大小為4. 0 kb,已有質(zhì)粒pENTR_2B*作為對(duì)照(圖5A)。 用Bamm (TaKaRa)和Xho I (TaKaRa)雙酶切檢測(cè)，連接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上只產(chǎn)生兩條帶，分別為2. 7 1Λ和1.2 kb (圖5B)。確認(rèn)是連接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒pENTR-2B-/WA。實(shí)施例3 植物表達(dá)載體pK2-35S_/WA的構(gòu)建
植物表達(dá)載體pK2-35S_/aA/A的構(gòu)建策略如圖6所示。通過(guò)Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)把 faldh亞克隆到植物表達(dá)載體PK2GW7 (Gateway的目的載體，比利時(shí)VIB/Gent公司)中。具體的做法是用質(zhì)粒抽提試劑盒純化(Gateway的目的載體pK2GW7，在(Gateway的LR反應(yīng)體系中力口 pENTR-2B-/aA/A 禾口 PK2GW7 #150ng，ly 1 LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen), 混均于25 0C反應(yīng)過(guò)夜，通過(guò)整合酶的作用把/WA整合到PK2GW7中獲得faldh的植物表達(dá)載體質(zhì)粒PK2-35S-/WA，其構(gòu)建流程見(jiàn)附圖9。用反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5ci (購(gòu)自天根生化科技公司)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有壯觀霉素 (Spe, 50 μ g/ml)的平板上，于37 0C過(guò)夜培養(yǎng)，篩選Spe抗性重組子菌落。從Spe抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，選出大小和對(duì)照質(zhì)粒PK2GW7相似的整合成功的質(zhì)粒PK2-35S-/WA(圖 7A)。然后用酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確性，用及和損ol雙酶切檢測(cè)pK2-35S-/WA，酶切產(chǎn)物為1.21Λ的條帶(目的基因大小)和11. 1 1Λ條帶(PK2GW7載體大小)(圖7B)。確認(rèn)是整合成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒。PK2GW7攜帶的篩選標(biāo)記基因?yàn)榭敲顾乜剐曰?Knf)，這樣可用加有卡那霉素的平板篩選轉(zhuǎn)基因植物。實(shí)施例4 用含faldh基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
制備農(nóng)桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，用電脈沖法將上述構(gòu)建好的植物表達(dá)載體mnidh 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(C58Cl(pPMP90))中，在加有壯觀霉素的平板上篩選轉(zhuǎn)化子。取少量質(zhì)粒加入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻；將混合物加入到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，輕輕敲擊杯身使混和液落至杯底；將電轉(zhuǎn)化杯置于電轉(zhuǎn)化儀(BIO-RAD)滑槽中，用Imm的電擊杯和200歐姆，2. 5kV/0. 2cm的參數(shù)進(jìn)行電擊，電擊后立即取出電轉(zhuǎn)化杯，迅速加入0. 5mlS0C培養(yǎng)基， 混勻，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中J8°C，200rpm搖床培養(yǎng)3 — 5h ；室溫下，7500rpm離心 Imin,棄大部分上清，保留100 μ 1將細(xì)胞懸??；把農(nóng)桿菌涂布于有壯觀霉素(Spe，50 μ g/ ml)的LB固體培養(yǎng)基上二8°C培養(yǎng)2天獲得單菌落；首先用牙簽挑取農(nóng)桿菌菌落放入 20 μ 1 ddH20中，98°C處理5分鐘后取出10 μ 1農(nóng)桿菌裂解液作為PCR反應(yīng)的模板。PCR檢測(cè)pK2-35S-/aA/A轉(zhuǎn)化結(jié)果，上下游引物分別為/7 / 7和/7 / 8，正對(duì)照擴(kuò)增體系模板使用 PENTR-2B-/WA質(zhì)粒，負(fù)對(duì)照模板使用PK2GW7質(zhì)粒，擴(kuò)增片斷理論長(zhǎng)度為1. 2 kb,PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析顯示其片段大小與理論預(yù)測(cè)值相符，表明質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(圖7C)實(shí)施例5 用含有/WA基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草
挑取攜帶有質(zhì)粒pK2-35S-/aA/A的農(nóng)桿菌單菌落接種于50ml的LB培養(yǎng)基中(含Spe， 10(^8/1111)，180卬111，沘1培養(yǎng)2411，待菌液00_至 1.0 左右，離心 IOmin (3000rpm)，沉淀菌體。再用IOml左右的MS液體培養(yǎng)基懸浮，離心IOmin (3000rpm)，沉淀菌體。重復(fù)以上操作2 3次。最后加入一定體積的MS液體培養(yǎng)基重懸浮，使菌體的OD6tltl值為0. 5。制備煙草OVicoiiaz7a tabacum cv. Xanth)的無(wú)菌苗，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，然后通過(guò)組織培養(yǎng)獲得小苗，進(jìn)一步篩選獲得所需的轉(zhuǎn)基因植物。把無(wú)菌煙草的葉片切成小片葉盤，在制備好的農(nóng)桿菌菌液中浸染15 - 20min，用無(wú)菌吸水紙吸干后，平鋪于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSl (MS+NAA02. 1 μ g/ml+BAP 0. 02 μ g/ml)上黑暗共培養(yǎng)2天，將外植體轉(zhuǎn)移至含潮霉素(25 μ g/ml)的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS4 (MS+NAA0. 53 μ g/ml+BAPO. 5 μ g/ml)上進(jìn)行芽的誘導(dǎo)，約15天繼代一次。待有芽生成后，轉(zhuǎn)入卡那霉素(50ug/ml)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行根的誘導(dǎo)。實(shí)施例6 -.faldh基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的插入情況及表達(dá)水平的檢測(cè)
為了確認(rèn)通過(guò)卡那霉素篩選的轉(zhuǎn)基因煙草株系確實(shí)含有導(dǎo)入的目的基因的DNA片段， 用PCR方法對(duì)篩選到的轉(zhuǎn)基因煙草作進(jìn)一步的鑒定。首先采用CTAB法提取植物基因組 稱取植物葉片IOOmg左右置于1.5ml離心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末狀；加入 90(^1預(yù)熱到651的2\07^緩沖液(111^8-!1(1 pH 7.5 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1.4 M, CTAB ^0，65°C度水浴加熱20分鐘后取出冷卻；加入500 μ 1氯仿一異戊醇混合液(24 1)搖勻，4°C離心IOmin (7500rpm)后轉(zhuǎn)移上清至1. 5ml EP管；再次加入500 μ 1氯仿一異戊醇混合液(24 :1)搖勻，4°C離心IOmin (7500rpm);取出上清置于新的EP管中，加入1/10 體積3M pH5. 2醋酸鈉和等體積異丙醇，搖勻后4°C離心20min( 12000rpm);棄上清，用75% 乙醇清洗兩次后，干燥，用含RNase的TE緩沖液溶解并降解RNA，獲得的基因組DNA樣品。 以轉(zhuǎn)/WA煙草抗性苗基因組作為模板，上下游引物分別為/A/ 7和/A/ 8進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)/WA是否插入煙草基因組。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1.2 1Λ左右，和預(yù)期推測(cè)一致，說(shuō)明目的基因均已插入這些轉(zhuǎn)基因株系的基因組，野生型煙草基因組PCR產(chǎn)物未出現(xiàn)目標(biāo)條帶(圖 8A)。為了考察目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草株系中的轉(zhuǎn)錄情況，從轉(zhuǎn)基因植物中抽取總RNA， 反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用于RT-PCR分析，檢測(cè)/WA基因在轉(zhuǎn)基因植物中的轉(zhuǎn)錄水平。采用 TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取 RNA,取植物嫩葉約 0. Ig,加入 Iml 的 TRIzoL 提取液在研缽中研磨，室溫靜置5min后移入離心管，再加入0. 2ml氯仿，振蕩混勻，離心15min (12000rpm),轉(zhuǎn)移上清液至新管，加入0. 5ml異丙醇，混勻室溫放置lOmin，4°C離心IOmin (12000rpm)，棄上清，沉淀用75%乙醇Iml清洗，4°C離心5min (7500rpm)，棄乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20 μ 1焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解RNA。所獲得的RNA樣品用凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量和濃度。使用Reverse Transcriptase進(jìn)行cDNA的合成，取植物總RNA 約 0. 1 μ g-5 μ g, oligo (dT) 50ng, IOmM dNTP mix 1 μ 1，用 DEPC 處理水補(bǔ)足至 10 μ 1，混勻后，短暫離心將之收集于管底，置于65°C加熱5min，冰浴lOmin，加入反應(yīng)混合物9 μ 1 (5 Xreaction buffer 4 μ l,25mM MgCl2 4μ 1,0. IM DTT 2μ 1, RNA 酶抑制劑 1 μ 1 )，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25°C保溫anin，加入1μ 1 M-MuLV Reverse Transcriptase,將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25°C保溫20min，然后42V保溫70min，合成cDNA。以cDNA為模板，用faldh基因的上下游引物進(jìn)行RT-PCR分析，考察轉(zhuǎn)基因煙草中是否有目的基因的轉(zhuǎn)錄物，結(jié)果證明轉(zhuǎn)基因煙草植株均有目的基因的轉(zhuǎn)錄物，而野生型的煙草則沒(méi)有(圖8B)。選取野生型和轉(zhuǎn)基因株系葉片提取總蛋白，然后進(jìn)行Western Blot分析檢測(cè) FALDH的表達(dá)水平。蛋白樣品上樣量為50 μ g，一抗為耐熱甲基營(yíng)養(yǎng)菌召.brevis中FALDH的鼠抗體，二抗為過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG (KPL，USA)。結(jié)果(圖8C)說(shuō)明轉(zhuǎn)基因株系TT2， TT6，TT8中有/WA基因編碼的FALDH條帶，而野生型煙草中沒(méi)有該條帶，說(shuō)明FALDH已在轉(zhuǎn)基因煙草中成功表達(dá)。實(shí)施例7 轉(zhuǎn)基因煙草甲醛脫氫酶(FALDH)的酶活性分析
從煙草葉片中抽提可溶性蛋白，取0.2g煙草葉片，加1 ml蛋白抽提液(100 mM Tris-HCl (pH 7.5) ；10% (V/V)甘油；10 mM 巰基乙醇；1 mM PMSF ；5% (ff/V) PVP)研磨， 轉(zhuǎn)移至EP管中，13000 rpm離心25 min (4 °C )。將上清移到新的EP管中，用Bradford方法測(cè)定植物上清中的蛋白質(zhì)濃度。FALDH酶活性在25°C通過(guò)檢測(cè)NADH的產(chǎn)生量確定(Koivusalo等，F(xiàn)EBS Lett, 1989，257:105-109)。反應(yīng)體系(800 μ 1)為0. IM sodium phosphate (pH8. 0), ImM HCHO， ImM glutathione，2. 4mM NAD，蛋白樣品。一個(gè)活力單位對(duì)應(yīng)每分鐘生成IMmol NADH的酶量。轉(zhuǎn)faldh煙草株系在25°C持續(xù)光照培養(yǎng)15天后，檢測(cè)FALDH酶活性(圖9)。轉(zhuǎn)基因煙草酶活性比野生型煙草提高約3 5倍左右，這表明faldh已在煙草中過(guò)量表達(dá)具有活性的FALDH。實(shí)施例8 轉(zhuǎn)基因煙草吸收液體甲醛速率測(cè)定
甲醛可與Nash試劑(醋酸氨15%，冰醋酸0. 3%，乙酰丙酮0. 2%)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生有顏色的物質(zhì)，該物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)為410nm，因此可以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)HCHO-Nash標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出反應(yīng)液中甲醛的含量，利用該方法可以測(cè)定植物對(duì)甲醛的吸收速率。取 2 g左右植物材料放入小三角瓶中，加入70ml處理液(HCH0 2mM, KHCO3 5mM, MES 0.1%)， IOOrpm搖床震蕩培養(yǎng)，25°C持續(xù)光照，處理一定時(shí)間。取出20 100 μ 1處理液，加水至1 ml，再加入1 ml Nash試劑在30°C保溫30分鐘后，測(cè)定0D·，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出處理液殘存甲醛濃度(圖10)。結(jié)果表明，3個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系在2 mM甲醛溶液中處理48小時(shí)后殘余甲醛的比率為60%左右，而野生型剩余甲醛的比率為90%左右，這說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草吸收液體中甲醛的速率優(yōu)于野生型。實(shí)施例9 轉(zhuǎn)基因煙草代謝液體和氣體甲醛能力分析
將轉(zhuǎn)/WA基因煙草和野生型煙草無(wú)菌苗(2g)置于70ml的H13CHO處理液(H13CHO 2mM, KHCO3 5mM, MES 0. 1%)中，25°C持續(xù)光照振蕩培養(yǎng)，另外需未處理樣品作為對(duì)照；處理時(shí)間結(jié)束后，將植物材料迅速轉(zhuǎn)移到4°C預(yù)冷的無(wú)菌水中清洗植物材料表面殘留的游離H13CHO, 至少3、次。無(wú)菌吸水紙吸干葉片表面殘留水分，液氮速凍，研磨；轉(zhuǎn)移液體至EP管中，室溫離心(12000rpm)20min ；轉(zhuǎn)移上清至新5mm核磁管，用封在毛細(xì)管中的甲酰胺作為內(nèi)參作 13C-NMR分析(圖11A)。對(duì)處理時(shí)間不同的樣品和未經(jīng)任何處理樣品的H13CHO代謝譜進(jìn)行比較，結(jié)果說(shuō)明用H13CHO處理池后，轉(zhuǎn)基因植物出現(xiàn)一個(gè)H13COOH信號(hào)峰，長(zhǎng)達(dá)4 后轉(zhuǎn)基因植物中出現(xiàn)較強(qiáng)的H13COOH信號(hào)峰，在未轉(zhuǎn)基因的野生型植物中在H13CHO處理池后有一個(gè)很弱的H13COOH信號(hào)峰，但在4 后未檢測(cè)到H13COOH信號(hào)峰，說(shuō)明通過(guò)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的FALDH 有氧化甲醛的能力，且穩(wěn)定性好，能一直在植物中發(fā)揮作用。將20μ 1 H13CHO吸到一個(gè)小棉花團(tuán)上，置入植物培養(yǎng)瓶中，通過(guò)棉花團(tuán)上揮發(fā)出來(lái)的氣體甲醛處理轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物池后，用液氮速凍，研磨；轉(zhuǎn)移液體至EP管中， 室溫離心(12000rpm)20min ；轉(zhuǎn)移上清至5mm核磁管，用封在毛細(xì)管中的甲酰胺作為外參作 1V-NMR分析(圖11B)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草吸收的甲醛是野生型煙草的3. 58倍。轉(zhuǎn)基因煙草中甲酸的生成量是野生型煙草的1. 5倍，檸檬酸的生成量是野生型煙草的21倍，蘋果酸的生成量是野生型煙草的3. 6倍，半胱氨酸的生成量是野生型煙草的1. 89倍，只有甘氨酸的生成量略有減少(為野生型煙草的57. 1%)，轉(zhuǎn)基因煙草生成"C代謝產(chǎn)物的總量是野生型的2倍，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明FALDH在轉(zhuǎn)基因煙草中的過(guò)量表達(dá)使其代謝氣體甲醛的能力大大提尚。實(shí)施例10 轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)于培養(yǎng)基中甲醛的抗性分析
稱量選取長(zhǎng)勢(shì)良好，大小一致(約1. 2g左右)的煙草組培苗分別轉(zhuǎn)移至含有2 mM和4 mM HCHO的MS基本培養(yǎng)基上，25°C，光周期為IMi光照/ 黑暗的溫室條件下培養(yǎng)10 d，觀察煙草表型變化。結(jié)果說(shuō)明在2 mM HCHO的MS基本培養(yǎng)基上兩種煙草的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯差別(圖12A)，但在含有4 mM HCHO的MS基本培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)/WA基因煙草長(zhǎng)勢(shì)明顯要好于野生型煙草(圖12B)。這表明FALDH非常有助于提高煙草對(duì)于固體培養(yǎng)基中液體甲醛的抗性， 與野生型相比，轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)受甲醛的影響很小。在含有相同濃度HCHO的固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草(TT-6)的生物量比野生型植物高(圖12C)。
權(quán)利要求
1.短芽孢桿菌甲醛脫氫酶基因，其特征在于甲醛脫氫酶基因具有如SEQID NO. 1所示核苷酸序列或編碼如SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲醛脫氫酶基因，其特征在于基因來(lái)源于短芽孢桿菌。
3.權(quán)利要求1所述甲醛脫氫酶基因的植物表達(dá)載體pK2-35S-/aA/A，所述載體含有甲醛脫氫酶/WA基因及卡那霉素篩選標(biāo)記基因K2和組成型啟動(dòng)子35S。
4.權(quán)利要求3的所述的植物表達(dá)載體在制備吸收和耐受甲醛能力強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了短芽孢桿菌甲醛脫氫酶基因faldh及其植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法和應(yīng)用，提供了能提高甲醛耐受能力的短芽孢桿菌faldh基因的核苷酸序列和其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，用該基因構(gòu)建植物表達(dá)載體pK2GW7-35S-faldh，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入植物中，使植物提高對(duì)甲醛的吸收、代謝和耐受能力，克服植物本身甲醛代謝關(guān)鍵酶表達(dá)水平較低，吸收代謝甲醛能力低的缺點(diǎn)；實(shí)驗(yàn)證明含有甲醛脫氫酶faldh基因的轉(zhuǎn)基因植物吸收液體中甲醛的速率優(yōu)于野生型；通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的FALDH蛋白有氧化甲醛的能力，且穩(wěn)定性好，能一直在植物中發(fā)揮作用；FALDH蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的過(guò)量表達(dá)使其代謝氣體甲醛的能力大大提高。
文檔編號(hào)C12N9/02GK102337280SQ20111030649
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者孟慶超, 年洪娟, 程琴, 陳麗梅 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)