一種基因敲除載體在臍孢木霉菌基因功能研究中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學和生物【技術領域】，特別是涉及一種基因敲除載體在臍孢木霉菌（ Trichodermabrevicompactum ）基因功能研究中的應用。本發(fā)明從臍孢木霉菌0248菌絲體中提取基因組，利用融合PCR方法構建 tri14 基因敲除載體，并將該載體應用于 tri14 基因的敲除以及該基因功能的研究。本發(fā)明提供一種基因敲除載體在臍孢木霉菌基因功能研究中的應用，為木霉菌中基因功能的研究提供了新的方法和技術。CGMCC No. 69852012.12.12
【專利說明】一種基因敲除載體在臍孢木霉菌基因功能研究中的應用
[0001]

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明涉及分子生物學和生物【技術領域】，特別是涉及一種基因敲除載體質粒在臍 孢木霉菌（/ricAoofe/ma )基因功能研究中的應用。

【背景技術】
[0003] 臍孢木霉菌是一種廣泛存在于土壤、植物中的木霉菌。木霉菌主要通過拮抗作 用、競爭作用以及抗生作用等，對常見的多種病原真菌具有抑制作用，如黃瓜立枯病菌 (TPAizocioflia5·〇7<3/?Υ)、番爺灰霉病菌ciflerea)和黃瓜枯萎病菌 等，因而具有良好的生防應用前景。木霉素（Trichodermin)-單端孢霉烯 類化合物的一種，它對常見9種植物病原真菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)均有不同程度的抑制 作用，對黃瓜立枯病和番茄灰霉病等真菌病害有良好的生防效果。據(jù)報道，木霉素主要由臍 孢木霉菌合成，但目前木霉素在臍孢木霉菌中的合成途徑尚未明確。探明木霉素的合成途 徑，對木霉素的工業(yè)生產(chǎn)和應用具有重要意義。
[0004] 研究發(fā)現(xiàn)單端孢霉烯類化合物代謝途徑中的相關基因大多位于iri基因簇 中。鐮刀菌中iri基因簇的研究較多，該基因簇中大多基因的功能已經(jīng)知 曉，然而tri#基因功能尚未明確。華狀木霉（7：a/Y/flt/iflacew?)也能合成單端孢霉 烯類化合物Harzianum A (HA)。木霉素和HA的結構非常相似，唯一區(qū)別在于C-4位側 鏈基團的不同，木霉素C-4位是乙?；鶊F，HA上是octa-2,4,6_trienedioic acid。在 T1.a/Y/flt/iflacew?中，trichodiene經(jīng)加氧、環(huán)化、輕基化和乙?；?步反應最終合成 HA。催化3步氧化反應，rairiii編碼的酶催化C-4輕基化反應（Cardoza R E, Malmierca MG, Hermosa MR, AlexanderNJ, McCormick SP, Proctor RH, Tijerino AM, Rumbero A, Monte E, Gutierrez S. Identification of Loci and Functional Characterization of Trichothecene Biosynthesis Genes in Filamentous Fungi of the Genus fricAoofe/ma· Appl Environ Microb, 2011,77(14): 4867-4877)。胳抱木 霉菌中相關基因的功能研究報道很少，除了 基因外，其他基因的功能均有待研究 (Tijerino A, Cardoza RE, MoragaJ, Malmierca M G, Vicente F, AleuJ, Collado I G, Gutierrez S, Monte E, Hermosa R. Overexpression of trichodiene synthase genetri5increases trichodermin production and antimicrobial activity in Trichoderma brevicompactum.Fungal Genet Biol, 2011,48:285-296)。
[0005] 基因敲除是基因功能研究中最具有說服力的方法之一。傳統(tǒng)基因敲除質粒載體構 建方法是將待敲除基因上游，下游DNA片段和抗生素抗性基因片段分別通過酶切和連接的 方法克隆到基因敲除骨架載體的多克隆位點上。傳統(tǒng)構建基因敲除質粒，有兩個弊端：（1) 構建一個完整的基因敲除質粒，至少要做三次克隆，每一次克隆都需要重復酶切和連接轉 化等繁瑣步驟，降低了工作效率；（2)只能選擇在骨架載體多克隆位點中所對應的限制性 內切酶，且選擇的內切酶不能在待敲除基因的上、下游DNA片段和抗生素抗性基因中存在 相應的酶切位點。而在實際操作中，在基因的上、下游DNA片段和抗生素抗性基因中可能存 在較多的酶切位點序列，導致在多克隆位點中很難找到相對應的內切酶，限制了其應用。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明從臍孢木霉菌0248菌絲體中提取基因組，利用融合PCR方法構建基 因敲除載體，并將該載體應用于基因的敲除以及該基因功能的研究。
[0007] 本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供了一種基因敲除載體質粒的構建方法； 本發(fā)明的另一目的是提供了這種基因敲除載體質粒在木霉菌基因功能研究中的應用，為木 霉菌中基因功能的研究提供了新的方法和技術。
[0008] 本發(fā)明臍孢木霉菌（fricAoofe/maA/wico聲》acia?)，定名為臍孢木霉菌0248。該 菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號院3號，保藏日期2012年12月12日，保藏登記號CGMCCNo. 6985。
[0009] 本發(fā)明目的通過以下技術方案來實現(xiàn)： 一種基因敲除載體在臍孢木霉菌基因功能研究中的應用，按以下步驟進行： 1.基因全長的克隆以及敲除片段的構建 (1) 根據(jù)我們前期測的臍孢木霉菌0248轉錄組數(shù)據(jù)和信息，得到基因的DNA序 列信息； (2) 用DNAWalking試劑盒分別擴增得到基因上游和下游同源片段； (3) 設計帶接頭的引物，從質粒pUC-Hyg上克隆得到潮霉素抗性基因片段； (4) 利用融合PCR克隆技術將基因上游片段、潮霉素抗性基因片段、基因 下游片段首尾連接，構建敲除片段。
[0010] 2.基因敲除載體的構建及農桿菌介導轉化至臍孢木霉菌0248 (1) 根據(jù)限制性酶切位點上的粘性末端將步驟1 (4)中獲得的敲除片段連接到基因敲 除載體質粒PCAMBIA0380上； (2) 將步驟2 (1)中敲除載體質粒轉化至農桿菌感受態(tài)細胞； (3) 利用農桿菌介導技術將基因敲除片段轉化至臍孢木霉菌0248中； 3. 基因敲除轉化株的驗證 使用PCR檢測轉化菌株中基因，以驗證陽性轉化株，并檢測基因敲除后對 與單端孢霉烯類化合物合成相關的基因表達的影響。
[0011] 本發(fā)明的有益效果：一是提供了一種基因敲除載體質粒的構建方法；二是提供了 這種基因敲除載體質粒在木霉菌基因功能研究中的應用，為木霉菌中基因功能的研究提供 了新的方法和技術。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1胳抱木霉0248廣木霉素相關基因cDNA全長序列。
[0013] 圖2質粒構建圖，將融合PCR產(chǎn)物通過酶切位點連接到基因敲除骨架質粒上，形成 新的敲除質粒PCAMBIA0380H。
[0014] 圖3得到的19株轉化株中基因PCR檢測電泳圖第6泳道和第16泳道為陽 性克隆，第20泳道為DL2000Marker。

【具體實施方式】
[0015] 實施例I 基因全長的克隆以及敲除片段的構建） 按以下步驟進行： (1) 根據(jù)臍孢木霉菌0248轉錄組提供的基因序列信息，設計特異性引物：tril4-F：GGATAACCCAATCTTCA tril4-R：GTTACCCCTCAATCAGA 提取臍孢木霉菌0248總DNA，使用TaqPCRMasterMix(2X,bluedye)進行PCR擴 增基因片段，反應體系為50yL:Mix25yL，正引物IyL，反引物IyL，DNA模 版1μL，ddH20 22μL。反應程序如下：

【權利要求】
1. 一種基因敲除載體在臍孢木霉菌基因功能研究中的應用。
2. 權利要求1所述的應用，其中基因敲除載體利用融合PCR方法構建。
3. 權利要求1所述的應用，其中臍孢木霉菌（定名為 臍孢木霉菌0248,該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏 地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期2012年12月12日，保藏登記號CGMCC No. 6985。
4. 權利要求1所述的應用，其特征在于敲除的基因為臍孢木霉菌0248中的基 因。
【文檔編號】C12Q1/68GK104357471SQ201410543570
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月15日 優(yōu)先權日:2014年10月15日
【發(fā)明者】袁小楓, 申屠旭萍, 俞曉平, 湯谷 申請人:中國計量學院